CN112724262A - 一种prlr特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PRLR特异性嵌合抗原受体及其应用。涉及具有特异性识别PRLR抗原的CAR分子，以及编码此分子的核酸、表达载体及表达其的细胞，以及其在实体瘤治疗方面的潜在应用。本发明在提供一种全新的肿瘤表面抗原PRLR的基础上，设计此抗原的嵌合抗原受体分子至T细胞上，赋予T细胞一种全新的肿瘤识别和特异性结合能力，并增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，为实体瘤特别是乳腺癌和前列腺癌的免疫细胞治疗又提供了一种新的途径。

Description

一种PRLR特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫细胞治疗领域，提供了一种PRLR特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
目前，目前全球癌症发病率中，90％为实体瘤。但自1993年以来启动的939项免疫细胞疗法实验中，只有大约一半(453项)是针对实体瘤。而且，相比对于血液肿瘤表现出的良好疗效，对实体瘤的治疗效果始终难以有效突破。近年来，在与肿瘤的抗争中，肿瘤免疫治疗因其独特的疗效和多癌种适应性，具有不可比拟的优势，受到越来越多研究机构和制药企业的青睐。鉴于免疫系统的复杂性，肿瘤免疫治疗涵盖了多种作用机制和药物形式，发展情况各不相同。免疫细胞治疗实体瘤的技术真正能应用于临床估计还尚需时日。随着对免疫细胞治疗技术的不断改进，对相关免疫抑制机理相关研究的逐步深入，相信免疫细胞治疗攻破实体瘤已经不再遥远。
LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种细胞治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞的攻击。
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞能够识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。
因此，如何避免肿瘤免疫逃逸的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗实体瘤的治疗效果，仍然是CAR-T治疗技术亟待解决的问题。
催乳素(PRL)由脑垂体及某些垂体外组织器官如乳腺、泪腺、子宫、胸腺和脾脏等所分泌。PRL以内分泌、旁分泌及自分泌的方式与靶细胞膜表面的催乳素受体(PRLreceptor,PRLR)结合而发挥非常广泛的生物学作用。PRL除了由垂体前叶分泌之外，许多垂体外组织亦能分泌，PRLR亦分布广泛，人体大部分组织细胞几乎都已检测到PRLR的存在，如乳腺、中枢神经系统、肾上腺、肾脏、皮肤、骨组织、肺、肝、心脏、肌肉、膀胱、胰腺、卵巢、睾丸、淋巴组织、胃肠道、前列腺等等。大量证据表明，催乳素受体的异常，如长、短比例失调或受体的氨基酸序列变异与某些肿瘤尤其是乳腺癌的发病及预后等有密切的关联。PRLR作为一种新的实体瘤靶向治疗的位点，为实体瘤的治疗提供了全新的治疗思路，有望大大改善实体瘤的预后。
目前，国内尚未见有关能靶向PRLR的CAR-T细胞治疗实体瘤的方案。
发明内容
本发明针对以上问题，提供一种新的通过靶向PRLR的CAR分子及其在实体瘤治疗中的潜在应用。具体的说，本发明提供一种PRLR特异性嵌合抗原受体(CAR)，这种CAR分子通过靶向肿瘤细胞表面的PRLR蛋白，从而激活T细胞下游的信号通路，赋予T细胞杀伤带有PRLR靶点的肿瘤细胞的能力。
为实现上述目的，本发明采用的技术手段如下：
一种PRLR特异性嵌合抗原受体及其应用，
本发明的第一个目的：
提供一种PRLR特异性嵌合抗原受体，其包括胞外引导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区；其中，胞外识别区为抗PRLR抗体结构。
为进一步优化上述PRLR特异性嵌合抗原受体，本发明所采取的技术措施还包括：
所述抗-PRLR抗体序列为一种可结合PRLR的单链可变区(scFv)序列，scFv的可变重链VH部分可由3种VH1,VH2,VH3中的一种构成，VH1、VH2、VH3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示；scFv的可变轻链VL部分可由3种VL1,VL2,VL3中的一种构成，VL1、VL2、VL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6所示。
更优选地，在本发明一实施例中的单链抗体序列由SEQ ID NO.1所示的重链可变区(VH)氨基酸序列和如SEQ ID NO.4所示的轻链可变区(VL)氨基酸序列构成。
进一步地，根据scFv的过程规则，VH和VL序列通过一段柔性linker氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS连接在一起，形成scFv序列。
优选地，所述引导肽序列为CD8引导肽区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述铰链区为CD8hinge区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述跨膜区为CD8跨膜区，其中所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
优选地，所述胞内信号区包含CD28、4-1BB、CD3ζ。其中所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明的第二个目的：
提供一种编码上述PRLR特异性嵌合抗原受体的核酸。
优选地，所述核酸的核苷酸由SEQ ID NO.13所示。
本发明的第三个目的：
提供一种含有编码上述PRLR特异性嵌合抗原受体的重组核酸表达载体。
优选地，所述重组表达载体包括慢病毒、逆转率病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等；更优选地，在本发明一实施例中，原始重组表达载体为慢病毒。具体地，在该实施案例中所使用的病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-puro改造后的NV4-dpuro质粒，其与PRLR-CAR连接后的图谱见图2。在该载体中，CAR分子的表达由CMV启动子驱动转录表达，Kana抗性提供质粒筛选印记。CAR慢病毒载体质粒在辅助包装质粒pSPAX2和pVSV-G包膜质粒pMD2G存在的情况下，共转染HEK293T细胞，即可包装为带有CAR分子的慢病毒。
本发明的第四个目的：
提供一种含有编码上述PRLR特异性嵌合抗原受体的核酸的重组表达载体的宿主细胞。
优选地，所述宿主细胞为T细胞或者含有T细胞的细胞群。
本发明还涉及一种上述宿主细胞的构建方法，其包括重组表达载体的构建步骤、重组表达载体的包装步骤及将重组表达载体转导至宿主细胞的步骤。
最后，本发明还提供一种上述PRLR特异性嵌合抗原受体，编码上述PRLR特异性嵌合抗原受体的核酸，上诉重组核酸表达载体以及宿主细胞在哺乳动物肿瘤治疗中的应用。
更具体的说，上述应用为一种PRLR-CAR-T细胞，通过慢病毒介导的转导使得T细胞表达PRLR-CAR重组蛋白，从而赋予了T细胞识别PRLR抗原分子的特定能力，从而具有了靶向杀伤PRLR阳性的哺乳动物实体肿瘤的能力。
在一个实施例中，证明了在一定的效靶比(CAR-T细胞：靶细胞)下，PRLR-CAR-T细胞能够有效杀伤PRLR阳性的肿瘤细胞；但对于PRLR阴性的肿瘤细胞没有特异性杀伤作用，同时非靶向PRLR的MSLN-CAR-T也不会杀伤PRLR阳性的肿瘤细胞。该实施案例说明了PRLR-CAR-T能够在体外有效的杀伤PRLR阳性肿瘤细胞而不影响PRLR阴性的细胞。
在另一个实施例中，将PRLR-CAR-T细胞与表达PRLR的肿瘤细胞系HCC1143共孵育，结果显示PRLR-CAR-T细胞能在靶细胞刺激下产生大量IFN-γ因子；但却不能与PRLR阴性细胞HCC1937共孵育时产生IFN-γ因子；同时非PRLR靶向的CAR-T细胞MSLN-CAR-T也不能在HCC1143细胞刺激下释放IFN-γ因子。该实施案例说明了PRLR-CAR-T细胞的良好的特异性靶向性，并能够在PRLR刺激下，具有增强T细胞识别并杀伤靶细胞的能力。
与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
当前CAR-T技术在实体瘤领域的应用并不成功，一个很重要的原因就是缺少合适的实体瘤靶点。本发明提供了一个通过CAR-T技术能够靶向实体瘤的新靶点PRLR，该基因在正常组织中不表达或者表达量很低，而在乳腺癌及前列腺癌上有明显的高表达特征。本发明所述的PRLR-CAR分子可以通过修饰T细胞，并使特异性CAR-T细胞具有高效特异性的治疗PRLR阳性实体肿瘤的能力。
附图说明
图1为PRLR特异性嵌合抗原受体(CAR)分子结构的说明示意图；
图2为慢病毒载体NV4-dpuro载体与PRLR-CAR连接后的质粒说明示意图；
图3为流式细胞术检测PRLR-CAR转导T细胞后转导效率的示意图；
图4为流式细胞术检测不同细胞上PRLR蛋白与MSLN蛋白的表达情况；
图5A和图5B为RTCA检测PRLR-CAR-T细胞体外杀伤PRLR阳性肿瘤细胞的结果示意图；
图6A和图6B为PRLR-CAR-T细胞IFN-γ分泌情况的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种PRLR特异性嵌合抗原受体(即靶向PRLR的CAR分子)，其结构包含引导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，其中引导肽序列为CD8引导肽(SEQ IDNO.7)，抗PRLR抗体序列(scFv序列由SEQ ID NO.1，及SEQ ID NO.4构成)，铰链区为CD8hinge区域(SEQ ID NO.8)，跨膜区为CD8跨膜区(SEQ ID NO.9)，胞内信号区为CD28(SEQID NO.10)、4-1BB(SEQ ID NO.11)、CD3ζ(SEQ ID NO.12)。
本发明的嵌合抗原受体PRLR-CAR由SEQ ID NO.13所示的核酸序列进行编码。
本发明在实施例一提供了构建上述CAR分子到慢病毒载体NV4-dpuro中的方法。实施例二中提供了将CAR分子包装成慢病毒，转导T细胞，测定转染效率的方法。实施例三提供了PRLR-CAR-T细胞杀伤PRLR阳性肿瘤细胞的能力。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能一次来限制本发明的保护范围。
实施例1：
本实施例提供了构建上述CAR分子到慢病毒载体NV4-dpuro中的方法。
通过本实施例构建PRLR-CAR分子，将如图1所示的分子结构，插入到经pCDH-CMV-MCS-EF1-puro改造后的NV4-dpuro载体中，构建好的PRLR-CAR的慢病毒包装质粒图谱如图2所示。
PRLR-CAR慢病毒包装载体构建：首先化学合成了PRLR-CAR核酸片段至pUC57载体上(上海生工生物有限公司)，使用XbaⅠ/NotⅠ双酶切得到PRLR-CAR片段。XbaⅠ/NotⅠ双酶切慢病毒载体NV4-dpuro，电泳后凝胶回收顶部6KB处的DNA片段，使用DNA回收试剂盒进行回收。然后通过T4DNA连接酶将两部分进行连接，随后转入到DH5α感受态细胞中。第二天挑取单菌落至LB培养基中扩增培养，并提取质粒，进行酶切验证，验证正确的进行测序。比对测序结果，正确无误后命名为NV4-dpuro-PRLR-CAR进行下一步实验。
实施例2：
本实施:例为PRLR-CAR-T细胞的构建
CAR慢病毒的包装：首先使用Omega无内毒素大提质粒试剂盒提取实施例1中构建的慢病毒包装质粒NV4-dpuro-PRLR-CAR以及慢病毒系统辅助包装质粒pSPAX2、pVSV-G及pMD2G。在转染前一天将1.5*107HEK293T细胞铺至15mm培养皿中。将混合质粒使用PEI溶液共转至293T细胞中，转染6小时后更换新鲜培养基。48小时与72小时后分别收取上清液，使用0.45μm滤膜过滤，之后加入PEG8000溶液进行慢病毒浓缩，终体积浓缩500倍后加入PBS，分装后放入-80℃冰箱储存。
T细胞转导：采用梯度密度分离液将外周血进行分离，并收集PBMC细胞。使用100IU/ml IL2的X-VIVO15培养基，并使用CD3/CD28单克隆抗体刺激。激活24h后，将慢病毒从冰箱取出，并按照MOI＝10进行感染。T细胞每两天进行细胞计数同时维持细胞密度在1*106cells/ml的浓度，在感染5天后，使用PRLR靶点蛋白(购买于ACRO)进行流式检测CAR+率。MSLN-CAR-T的培养过程同上。最终结果如图3所示。
实施例3：
本实施例为PRLR-CAR-T体外杀伤PRLR阳性肿瘤细胞的能力检测。
PRLR阳性肿瘤细胞鉴定：使用PRLR流式抗体与乳腺癌细胞系HCC1143，HCC1937进行孵育，流式细胞仪检测孵育结果。结果如图4所示，显示HCC1143是PRLR阳性细胞株，而不表达MSLN靶点；HCC1937是PRLR阴性细胞株。
细胞杀伤能力检测：本实施例中采用RTCA(实时无标记细胞分析技术)对靶细胞进行实时监控。在开始实验时，首先将靶细胞按照20000个/孔的数量铺种在RTCA检测板中，待细胞生长到一定状态时，按照效靶比5：1加入效应细胞PRLR-CAR-T及MSLN-CAR-T细胞到不同实验孔中。结果如图5A、5B所示，PRLR-CAR-T可以特异性有效杀伤PRLR阳性的肿瘤细胞；但对于PRLR阴性的肿瘤细胞没有特异性杀伤作用，同时非靶向PRLR的MSLN-CAR-T也不会杀伤PRLR阳性的肿瘤细胞。本实施案例可以证明PRLR-CAR-T可以杀伤PRLR阳性肿瘤细胞。
实施例4：
本实施例为PRLR-CAR-T细胞与靶细胞接触后细胞因子IFN-γ的释放检测。
在96孔板中将PRLR-CAR-T、MSLN-CAR-T与靶细胞以5：1的效靶比进行混合。在37℃培养24小时后，将样本上清提出，使用Elisa方法进行细胞因子检测。结果如图6A、6B所示，对于PRLR靶点阳性的肿瘤细胞系HCC1143，PRLR-CAR-T与其结合后可以释放大量的IFN-γ，而阴性的HCC1937及MSLN-CAR-T都不能释放如此大量的INF-γ因子，这证明了本发明所构建的CAR-T细胞具有良好的靶向特性。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海怡豪生物科技有限公司
<120> 一种PRLR特异性嵌合抗原受体及其应用
<141> 2021-02-10
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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50 55 60
Ser Met Thr Ile Ala Leu Ser Leu Pro Gly His Gly Thr Ala Pro Val
65 70 75 80
Pro Ser Thr Ala Pro Ala Ser Gly Ala Pro Val Ala Gly Ser Gly Cys
85 90 95
Ser Gly Thr Leu Gly Val Leu Leu Leu Pro Val Leu Ser His Ala
100 105 110
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Val Gly Leu Leu Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Gly Leu Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Pro Ala Gly Ala Leu Leu Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Leu Gly Ser Pro Val Ala Pro Ala Ile Thr Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Ser Val Leu Thr Gly Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Ala Ile Gly Gly Ala
20 25 30
Pro Val Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Ile Thr Gly Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser
50 55 60
Gly Ser Leu Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Ser Thr Ala Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Ser Val Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Ala Leu Val Leu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Leu Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Pro Thr Pro Ser Ser Thr
20 25 30
Gly Met Ser Thr Val Ala Gly Thr Pro Ala Leu Ala Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Pro Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ser Ser Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Met Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Ala His Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Met Ala
100 105 110
Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ala Ile Val Leu Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ala Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Leu Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Thr Thr Met His Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Gly Pro Pro
35 40 45
Leu Leu Leu Ile Thr Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Ala Ile His
65 70 75 80
Pro Val Gly Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys Gly His Ser Gly
85 90 95
Gly Leu Pro Pro Ser Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu Ala
100 105 110
Ala
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro
20
<210> 8
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys
35 40
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Thr Leu His Leu Gly Ala Leu Gly Ala Ala Leu Thr Gly Pro Ser Pro
1 5 10 15
Val Thr Gly Thr His Pro Leu Leu
20
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Ala Ser Leu Ala Ser Ala Leu Leu His Ser Ala Thr Met Ala Met Thr
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Gly Pro Thr Ala Leu His Thr Gly Pro Thr Ala Pro
20 25 30
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Thr Ala Ser
35 40
<210> 11
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met
1 5 10 15
Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro
20 25 30
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu
35 40
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Gly Pro Pro Ala Thr Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr
20 25 30
Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu
35 40 45
Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu
50 55 60
Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala
100 105 110
Glu
<210> 13
<211> 1533
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gttggagtct gggggcaggt ggaattggat tcacctttga tgattatggc aagagaggct 60
tggtacagct ggagtgggtg gcctgggggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctctg 120
ggtccgccaa gctccaggga aggggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaattccca 180
gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacaatacta tgcagactcc 240
gtgaagggcc gattcaccat caagagccga ggacactgcc gtgtattact gtgcgagtcc 300
cctagaaagt cccgtcgctt tagatatctg gggccaaggg acaatggtca tcgtgagctc 360
ataggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcggc caccctcagc 420
gtctgggacc cctgggcaga gggtcagata tcgtgctact caccatctct tgttctggaa 480
gcaactccaa catcggaagt aatcctgaaa ctggtattaa gcgaccctca ggggtccctg 540
accgattctc tggctccaag tctggccagc agctcccagg aacggccccc aaactcctca 600
tctatgacaa taaacctcag cctccctggc catcagtggg ctccggtccc aagttaccgt 660
cctaggtcag gggctccggt ccgaggatca ggctgttctg agtggttggg tgttctatta 720
ctgccagtcc tatcacaccg gaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 780
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 840
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 900
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttacaggag taagaggagc 960
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1020
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga 1080
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1140
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1200
aagttcagca ggagcgcaga gccccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1260
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1320
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1380
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1440
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1500
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1533

Claims (7)

1.一种PRLR特异性嵌合抗原受体，其结构包括胞外引导肽、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞外识别区为抗PRLR抗体序列。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗PRLR抗体序列为一种结合PRLR的单链可变区序列，包括VH、VL及连接VH和VL的一段氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS的柔性linker；
所述VH氨基酸序列可由如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO2和SEQ ID NO.3所示中的一种构成，VL氨基酸序列可由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中的一种构成；
所述胞外引导肽为CD8引导肽区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述铰链区为CD8hinge区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述跨膜区为CD8跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述胞内信号区包含CD28、4-1BB、CD3ζ，其中所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码此嵌合抗原受体分子的核酸其序列如SEQ ID NO.13所述。
4.根据权利要求1或2所述的PRLR特异性嵌合抗原受体，其特征在于，编码此受体的重组核酸的表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等。
5.根据权利要求4所述的PRLR特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述的表达载体为慢病毒载体。
6.一种PRLR-特异性嵌合抗原受体在制备治疗实体瘤药物方面的应用。
7.根据权利要求6所述的PRLR特异性嵌合抗原受体在制备治疗实体瘤药物方面的应用，其特征在于，所述的肿瘤为乳腺癌和/或前列腺癌。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018064921A1 (en) * 2016-10-06 2018-04-12 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
CN108864288A (zh) * 2018-04-26 2018-11-23 上海怡豪生物科技有限公司 乳腺癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN109111525A (zh) * 2018-05-24 2019-01-01 卢英 一种hla-g嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用
CN109824781A (zh) * 2019-01-21 2019-05-31 卢英 抗人her 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用
CN110856724A (zh) * 2018-08-24 2020-03-03 杭州优善生物科技有限公司 包含核酸及car修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018064921A1 (en) * 2016-10-06 2018-04-12 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
CN108864288A (zh) * 2018-04-26 2018-11-23 上海怡豪生物科技有限公司 乳腺癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN109111525A (zh) * 2018-05-24 2019-01-01 卢英 一种hla-g嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用
CN110856724A (zh) * 2018-08-24 2020-03-03 杭州优善生物科技有限公司 包含核酸及car修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
CN109824781A (zh) * 2019-01-21 2019-05-31 卢英 抗人her 2抗原的特异性嵌合抗原受体、编码基因和表达载体以及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUEXIAN ZHOU ET AL.: "A novel bispecific antibody targeting CD3 and prolactin receptor (PRLR) against PRLR-expression breast cancer", 《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
姜丽翠等: "嵌合体抗原受体修饰的T细胞对CD19~+套式淋巴瘤细胞的杀伤", 《免疫学杂志》 *

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