CN109111525A - 一种hla-g嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种HLA‑G特异性嵌合抗原受体及其编码序列和表达载体以及应用。其中抗人HLA‑G抗原的嵌合抗原受体，由抗HLA‑G单链抗体、CD8Hinge嵌合受体铰链区、CD28Transmembrane嵌合受体跨膜区、4‑1BB嵌合受体共刺激因子、CD3胞内信号传导结构域一次串联组成。此外，还公开了该抗HLA‑G嵌合抗原受体的编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用。本发明提供的嵌合抗原受体能够稳定的表达于T淋巴细胞，能够特异性地杀伤表面HLA‑G阳性的肿瘤细胞，有望在肿瘤治疗中得到广泛应用。

Description

一种HLA-G嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用
技术领域
本发明属于生物与医药技术领域，涉及一种HLA-G特异性嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用。
背景技术
癌症是当今危害人类健康的主要疾病。2018年2月，国家癌症中心最新统计数据显示，我国平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。癌症已成为最急需攻克的难题。
治疗肿瘤的方法主要包括传统和新型的治疗手段，传统的包括手术治疗、放射治疗、化疗，新型的治疗手段—精准治疗包括：单抗、CAR-T细胞免疫治疗、基因编辑等。其中，细胞免疫疗法是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗肿瘤的“第五大疗法”，是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗肿瘤。
2013-2015年，连续三年成为Nature、Science的热点；2015年-2017年，连续成为美国临床肿瘤学会(ASCO)、欧洲癌症大会(ECC)的亮点，嵌合抗原T细胞(CAR-T)疗法在2017年ASCO上被评选为肿瘤领域内最具影响力的技术。
嵌合抗原Chimeric antigen receptor(CAR)修饰的T细胞(CAR-T)是将能识别肿瘤特异性抗原的scFv片段通过基因工程化改造，与T细胞活化基序相结合。修饰后的T细胞以抗原依赖，但非MHC限制方式结合特异识别肿瘤细胞标志物，具有更强的肿瘤靶向和杀伤活性。
经历了近十多年的研究探索和摸索，CAR-T的结构设计也经历了CAR第一代、二代、三代、四代不同的设计。
第一代CAR由scFv和ITAM(免疫受体酪氨酸活化基序)组成，但ITAM发出的激活信号只能引起T细胞短暂的分裂和较低水平的细胞因子分泌，不能提供长时间的多克隆扩增和持续的体内抗肿瘤效应。
第二代CAR增加了一个共刺激分子信号(如CD28、CD27、CD134、CD137、CD244等)，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性、T细胞存活时间，增加抗原诱导的细胞因子释放，上调抗细胞凋亡蛋白。这些作用增强了T细胞对目标肿瘤细胞的杀伤作用。
第三代CAR是在第二代基础上增加了一个共刺激分子信号，即将两个共刺激基序(如4-1BB/CD28、CD28/OX-40)和CD3ζ结合，进一步提高T细胞的信号转导功能。
第四代CAR，与前三代不同，引入了促炎症细胞因子(目前主要是IL-12，IL-23、IL-27)和共刺激配体(4-1BB和CD40L),可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中通过释放促炎性因子，招募固有免疫细胞-巨噬细胞等杀伤不被识别的肿瘤细胞；患者免受回输前预处理治疗(全身照射或大剂量化疗)的不良反应，减少回输细胞总量。
在CAR-T免疫治疗中，CAR的作用非常重要。CAR-T细胞将抗体-抗原特异性结合的能力以及T细胞介导的杀伤功能结合于一体，核心在于能够发挥特异性抗原活性的肿瘤相关抗原。
人类白细胞抗原G(HLA-G)是近年发现的一种非经典性的MHC-Ib类抗原分子。生理情况下，HLA-G在体内高表达于胎盘绒毛膜外滋养细胞，具有免疫抑制功能，参与保护母胎免受母体淋巴系统的攻击。随着研究深入发现，HLA-G与肿瘤免疫逃逸反应有关，如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、食管癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌等肿瘤组织中均可检测到较高水平的HLA-G表达。此外在白血病肿瘤细胞也检测到HLA-G的表达。因此HLA-G是一种肿瘤特异性高表达，胎儿出生后正常组织不表达或很少表达，并在各类肿瘤细胞中广谱表达的较为理想的肿瘤靶抗原，能够用于肿瘤的靶向治疗。
CAR-T疗法是对病人自身T细胞进行基因工程改造，使其能够特异性地识别靶细胞并对其杀伤。其难点在于要求其靶点在肿瘤细胞表面特异性的表达，且只高表达于靶细胞表面，在正常细胞表面无表达或者低表达。否则引起严重的临床副作用，包括细胞因子风暴、脱靶效应等。
发明内容
为解决以上问题，本发明目的在于提供一种HLA-G特异性嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用。
本发明的技术方案为：一种HLA-G特异性嵌合抗原受体，其自氨基端至羧基端由抗人HLA-G的scFv、CD8α的铰链区、CD28跨膜区、4-1BB胞内区、CD3ζ胞内区结合结构域依次串联而成；其中所述抗人HLA-G的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD8α的铰链区的氨基酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.2所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如序列中SEQ ID NO.4，所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
进一步，所述抗人HLA-G特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中序列如SEQID NO.6所示。
更进一步地，所述序列6共由470个氨基酸组成，其中第1-245位为所述抗人HLA-G的scFv的氨基酸序列；第246-290位为所述CD8α的铰链区；第291-316位为CD28跨膜区的氨基酸序列；第317-358位为所述4-1BB胞内区的氨基酸序列；第359-470位为所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列。
本发明还提供第二种技术方案：一种编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因，编码所述抗人HLA-G的scFv中的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.7所示；编码所述CD8α的铰链区的基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.8；编码所述CD28跨膜区的基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.9所示；编码所述4-1BB胞内区共刺激信号分子基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.10所示；编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列如序列表中序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，编码所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.12所示；
更进一步地，所述序列SEQ ID NO.12共由1413个核苷酸组成，其中第1-735位为编码所述抗人HLA-G的scFv的基因的核苷酸序列；第736-870位为编码所述CD8α的铰链区基因的核苷酸序列；第871-948位为编码所述CD28跨膜区基因的核苷酸序列；第949-1074位为编码所述4-1BB共刺激因子的核苷酸序列；第1075-1413位为编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列。
本发明提供第三种技术方案：一种含有编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因的重组表达载体。
进一步，所述重组表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。
进一步地，所述慢病毒表达载体能够表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的重组慢病毒表达载体，具体为所述嵌合抗原受体HLA-G-scFv-CD8v--合抗原
-4-1BB-CD3B基因序列即序列SEQ ID NO.12插入到慢病毒表达载体
pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的多克隆位点XbaI和BamHI之间后得到的重组质粒HLA-G-CAR表达质粒。
其中所述重组细胞为能够表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞。所述重组病毒为能够表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体且能够侵染免疫效应细胞的病毒。
具体的，所述免疫效应细胞可为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞。所述病毒为慢病毒、孢疹病毒、巨噬细胞病毒等。
本发明还提供以下技术方案：一种HLA-G特异性CAR-T细胞的制备方法，包括在T细胞上表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的步骤：将能够表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的重组表达质粒与慢病毒的包装质粒pSPAX2质粒和pMD2.G质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达HLA-G嵌合抗原受体，获得表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的T细胞。
本发明还提供以下技术方案：一种HLA-G特异性嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞用于治疗肿瘤的应用。
本发明还提供以下技术方案：一种HLA-G特异性嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞用于杀伤表达HLA-G蛋白的肿瘤细胞的应用。
其中所述肿瘤具体为与HLA-G蛋白表达异常(如HLA-G蛋白高表达)相关的肿瘤。具体可选自如下任一：黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌等实体瘤细胞以及某些血液肿瘤。在本发明中，所述肿瘤细胞具体为HLA-G阳性的肿瘤细胞，如Hela(宫颈癌)、KVO-3(卵巢癌)细胞等。
在本发明中，所述产品具体可为药物。
本发明的有效效果：本发明采用抗人HLA-G scFv基因序列是通过噬菌体展示文库构建和筛选获得。从NCBI GenBank数据库中搜索到人CD8α铰链肽基因、人CD28跨膜区基因，人4-1BB共刺激因子基因以及人CD3ζ胞内基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体HLA-G
scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ(HLA-G-CAR)基因片段，插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP中，构成抗人HLA-G-CAR表达质粒(pCDH-CAR质粒)，利用该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G在293T细胞中包装病毒并感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。获得的CAR-T细胞在体外与HLA-G阳性的肿瘤细胞MDA-MB-468、EC109和K562/HLA-G共培养，通过流式细胞术、细胞毒性分析实验以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，以证实该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。利用该技术，可以将CAR分子精确地整合到人T细胞基因组特定的位点，不影响任何人体正常基因的给功能，因此本发明所述的嵌合抗原受体HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ可在肿瘤治疗中得到广泛应用。
附图说明
图1：pCDH-HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ慢病毒表达载体图谱；
图2：荧光显微镜观察慢病毒包装的绿色荧光图；
图3：流式细胞仪检测HLA-G-CAR在T细胞表面的表达；
图4：流式细胞仪检测慢病毒感染后修饰T细胞表面CAR的表达；
图5：CAR-T细胞的体外杀伤作用的测定结果；
图6：ELISA检测各靶细胞与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、IFN-α、IFN-2的水平。其中，图6A为IFN-α检测结果；图6B为IL-2检测结果；图6C为IFN-γ检测结果。
具体实施方式：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。
慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP：普如汀生物技术(北京)有限公司产品。该质粒能表达GFP，产生绿色荧光。该载体的质粒图谱如图1所示。
实施例1：HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-CD3ζ表达质粒的构建
一、HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ基因序列的确定
本发明人通过噬菌体展示文库筛选获得抗HLA-G人源性scFv基因序列。从美国国立医学数据图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜基因、人4-1BB胞内区基因以及人CD3ζ胞内基因序列信息，以保证在编码氨基酸序列不变情况下更适合人类细胞表达。
其中，抗人HLA-G人源性scFv基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.7所示。人CD8α铰链区基因的核苷酸序列如序列表中序列如SEQ ID NO.8所示。人CD28跨膜区基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.9所示。人4-1BB胞内区基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.10。人CD3ζ胞内区基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.11所示。
将上述基因序列依次按抗人HLA-G scFv基因、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人4-1BB胞内区基因以及人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，形成最终完整的HLA-G-CAR基因序列信息，具体如序列表中序列SEQ ID NO.12所示。SEQ ID NO.12共由1413个核苷酸组成，其中第1-735位为编码所述抗人HLA-G的scFv的基因的核苷酸序列；第736-870位为编码所述CD8α的铰链区因的核苷酸序列；第871-948位为编码所述CD28跨膜区基因的核苷酸序列；第949-1074位为编码所述4-1BB胞内区的基因的核苷酸序列；第1075-1413位为编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列。
二、HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ表达质粒的构建
全基因合成上述“步骤一”中完整的HLA-CAR(SEQ ID NO.12)，克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP(简称pCDH-空载体)中，获得抗人HLA-G-CAR表达质粒(命名为pCDH-CAR质粒)和含有该质粒的DH5α菌液。具体操作如下：
用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切HLA-G-CAR序列(“TCTAGA+序列12+GGATCC”)，与经过同样双酶切的慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP相连，得到重组质粒。将重组质粒送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的HLA-G-CAR序列比对以证实序列正确。测序引物为pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP载体上的通用引物：Sense和Anti-sense。将经测序证明正确，在慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切位点XbaI和BamHI之间插入序列表中序列SEQ ID NO.12所示DNA片段的重组质粒命名为pCDH-CAR。构建的慢病毒载体信息见图1
Sense：5’ctccacgctttgcctgaccctgctt3’
Anti-sense：5’ggtgatgcggcactcgatctccatg3’
三、包装质粒和目的质粒的提取
将pCDH-CAR质粒、pCDH-空载体质粒、以及pSPAX2(购自TronoLab公司)和pMD2.G包装质粒(购自TronoLab公司)的菌株在LB培养基中大量培养，采用北京天根生化科技有限公司的无内毒素质粒提取试剂盒(DP117)提取质粒，以备感染。具体操作步骤如下:
1、柱平衡步骤:向吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。用平衡液处理过的柱子最好立即使用)。
2、取100ml(用平衡液处理过的柱子最好立即使用)过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时候可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。
3、尽量吸除上清，为确保上清液全部吸收，请用干净的吸水纸吸去水瓶壁上的水滴。
4、向留有菌体的沉淀的离心管中加入8ml溶液P1(先检查是否已加入RNase A),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
5、向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5min.注意温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
6、向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm离心5-10min，使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。
7、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱CP6的最大容积为15ml，所以需要分2次过柱。
8、室温8000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。
注意：将第7步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。
9、向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW(先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心2mim，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10、重复操作步骤9。
11、向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。
12、将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
13、将吸附柱CP6置于一个干净的50ml，向吸附膜的中间部位悬空滴加1l2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。
实施例2、嵌合抗原受体HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备及其鉴定
一、嵌合抗原受体HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备
1、将实施例1构建的pCDH-CAR质粒以及包装质粒pSPAX2和pMD2.G按4:2:1比例用聚乙烯亚胺转染试剂(PEI,来自Sigma公司)转染293T细胞(来自ATCC)，具体方法见PEI转染试剂说明书。分别于72小时收取病毒上清，于4℃，3000rpm离心10分钟后经0.45μm滤器过滤后，与PEG8000/NaCl按4:1体积混匀，4℃静置2～3h后高速离心30min。弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬溶解，即获得病毒浓缩液，-80℃保存备用。
2、T淋巴细胞的制备
采取健康供者新鲜外周血约60ml，与PBS1：1混匀稀释，用Ficoll-Paque Plus分离液和人T细胞富集抗体混合物(StemCell公司)分离获得较纯的CD3+T cell(约占95％以上)，具体操作步骤详见RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书。用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度至1×106/ml于37℃、5％CO2条件下培养。T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的珠(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)进行刺激激活，用量为5μg/ml)包被的24孔板，共刺激培养18-24后进行病毒转染。
3、慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养
病毒转染采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导:在24-孔板中，每孔铺有0.5×106T淋巴细胞，向每孔细胞中加入0.75ml的步骤一中获得的病毒浓缩液和Polybrene(浓度为8μg/ml)，于37℃、5％CO2条件下培养，每隔2～3天向T淋巴细胞培养液中加入人重组白细胞介素-2(IL–2，购自Novartis,Basel,Switzerland)，IL-2的终浓度为100-IU/ml,在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×106～1×106/ml。
感染后96h，选用慢病毒本身携带的绿色荧光蛋白(GFP)用于荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况并照相，最终得到慢病毒包装的绿色荧光图，结果见图2。
二、流式细胞仪检测HLA-G-CAR在T细胞表面的表达
离心收集感染后96h的待检测细胞及对照组(以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒)，PBS洗涤1次后弃上清,按照抗体说明书加入相应检测量的单抗(CD3由APC-anti-human CD3标记，购自ebioscience，CAR由Biotin-anti-humanIgG,F(ab’)2和APC/Cy7Streptavidin(购自sigma-aldroqin)标记，其中CAR即为序列SEQ ID NO.6所示的嵌合抗原受体HLA-G scFv-hinge-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ)，用于流式细胞仪检测感染后修饰T淋巴细胞表面CAR蛋白的表达情况。
结果见图3，由图可见经重组慢病毒表达载体pCDH-CAR表达产物刺激后的T淋巴细胞成功获得了表达HLA-G特异性嵌合抗原受体的T细胞，即为CAR-T细胞
实施例3、嵌合抗原受体HLA-G-CAR慢病毒修饰T细胞的体外杀瘤活性检测
一、多种肿瘤细胞系中HLA-G表达水平
供试肿瘤细胞系:KVO-3、Hela、K562、K562/HLA-G(转染了HLA-G的K562细胞)(均来自ATCC产品)
将各供试肿瘤细胞系分别培养后，各取5×105个细胞的细胞悬液，PBS洗涤2次后，加入APC标记的抗人HLA-G单抗(Santa Cruz公司)，以标记APC-isotype(Santa Cruz公司产品)为对照组，冰上孵育30min，采用流式细胞术检测各种细胞系的HLA-G表达的水平。实验重复三次，结果取均值。
结果如图4所示:KVO-3(图4A)、Hela(图4B)、K562/HLA-G(图4C)细胞系均表达HLA-G的百分率分别为85.13％、92.56％、87.78％；而K562不表达HLA-G。
根据不同的靶细胞分为四个实验组:KVO-3、Hela、K562/HLA-G组(转染了HLA-G的K562细胞)和K562细胞组，设置效应细胞对照组和靶细胞对照组。调整效应细胞CAR-T(实施例2制备)和各组相应的靶细胞密度，分别为1×107/ml和1×106/ml，设置各实验组效靶比为(E/T)10:1，往96孔板中加入效应细胞悬液和靶细胞悬液，总体积为200μL，放入37℃，5％CO2培养箱中培养48h后每孔加入20μLCCK-8(购自MCE)，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。
实验同时设置以pCDH-空载体替代实施例1构建的pCDH-CAR质粒的对照组(NTD-T组)
结果如图5所示，由图可见以KVO-3、Hela、K562/HLA-G(转染了HLA-G的K562细胞)为靶细胞时，CAR-T细胞对其杀伤作用明显高于NTD-T组。而以K562为靶细胞时，CAR-T细胞对其杀伤作用与NTD-T组类似，均较低。
二、ELISA检测各靶细胞与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平
实验分组同上，每组设3个复孔。取出已包被抗体(IFN-γ，TNF-α,IL-2均购自Abcam公司)的酶标板，设置TMB空白显色孔，依次加入0.1ml按一定倍数稀释的标准品及用样品稀释液稀释的样品。酶标板加上盖，37℃反应90min。反应后用自动洗板机吸弃酶标板内的液体。分别将生物素化的抗人IFN-γ、TNF-α、IL-2抗体(同上)工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应60min，0.01M PBS洗涤3次。将ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)，37℃反应30min，0.01MPBS洗涤5次。按每孔90μl依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25min，按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，15min内用酶标仪在450nm波长处测定OD值。根据标准曲线计算共培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子水平。实验重复三次，结果取均值。
结果表明:各靶细胞与CAR-T细胞共培养上清中TNF-α(图6中A)、IL-2(图6中B)、IFN-γ(图6中C)细胞因子水平比不表达HLA-G的K562细胞与CAR-T细胞的共培养上清中的IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子水平相比较有显著性升高(均P<0.01)。该结果表明，嵌合抗原受体HLA-G scFv-hinge-TM-CD8α-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ修饰的T细胞(即CAR-T细胞)在表达HLA-G细胞系刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请的保护范围内。
序列表
<110> YING LU
<120> 一种HLA-G嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Leu Gln Gly Thr Val Glu Gly Leu Thr Arg Lys Pro Arg Val
1 5 10 15
Phe Arg Pro Pro Val His Gln Phe Gly Ser Arg Gly Ile Pro Arg Asn
20 25 30
Glu Arg Ala Arg Ala Gln His Thr Cys Gly Asp Gly Lys Gly Pro Gly
35 40 45
Arg Ser Met Gly His Thr Trp Tyr Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Ile Arg
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Pro Tyr Cys Ala Gln Gly Thr Ala Val Asp Gly Ser
65 70 75 80
Gly Ser Asn Gly Ser Gly Gln Met Gly Thr Ser Cys His Pro Ile Arg
85 90 95
Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Ser Glu Gly Leu Trp Arg Asp Ile Arg Ser
100 105 110
Ala Ile Arg Lys Arg Ser Met Arg Leu Gln Pro Ser Lys Gln Thr Val
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile His Val Leu Thr Gln Pro Pro Glu Thr Cys Gly Ser Arg
145 150 155 160
Leu Pro Arg Ser Gly Arg Asp Ala Arg Gly His Gly Val Asp Val Gly
165 170 175
Arg Gln Leu Val Arg Thr Arg Gly Leu Val Thr Gly Thr Pro Lys Asp
180 185 190
Arg Gly Ser Asn Thr Glu Cys Trp Ala Asp Leu Lys Arg Gln Thr Asp
195 200 205
Thr Leu Cys Tyr Thr Ser Cys Gly Glu Lys Thr Ala Leu Ser Arg Asn
210 215 220
Arg His Met Ala Pro Arg Val Ser Glu Leu Arg Ser Ala Cys Ala Lys
225 230 235 240
Arg Leu Gly Ile Thr
245
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
1 5 10 15
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 4
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 6
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Leu Gln Gly Thr Val Glu Gly Leu Thr Arg Lys Pro Arg Val
1 5 10 15
Phe Arg Pro Pro Val His Gln Phe Gly Ser Arg Gly Ile Pro Arg Asn
20 25 30
Glu Arg Ala Arg Ala Gln His Thr Cys Gly Asp Gly Lys Gly Pro Gly
35 40 45
Arg Ser Met Gly His Thr Trp Tyr Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Ile Arg
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Pro Tyr Cys Ala Gln Gly Thr Ala Val Asp Gly Ser
65 70 75 80
Gly Ser Asn Gly Ser Gly Gln Met Gly Thr Ser Cys His Pro Ile Arg
85 90 95
Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Ser Glu Gly Leu Trp Arg Asp Ile Arg Ser
100 105 110
Ala Ile Arg Lys Arg Ser Met Arg Leu Gln Pro Ser Lys Gln Thr Val
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile His Val Leu Thr Gln Pro Pro Glu Thr Cys Gly Ser Arg
145 150 155 160
Leu Pro Arg Ser Gly Arg Asp Ala Arg Gly His Gly Val Asp Val Gly
165 170 175
Arg Gln Leu Val Arg Thr Arg Gly Leu Val Thr Gly Thr Pro Lys Asp
180 185 190
Arg Gly Ser Asn Thr Glu Cys Trp Ala Asp Leu Lys Arg Gln Thr Asp
195 200 205
Thr Leu Cys Tyr Thr Ser Cys Gly Glu Lys Thr Ala Leu Ser Arg Asn
210 215 220
Arg His Met Ala Pro Arg Val Ser Glu Leu Arg Ser Ala Cys Ala Lys
225 230 235 240
Arg Leu Gly Ile Thr Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
260 265 270
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Cys Asp Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
290 295 300
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg
305 310 315 320
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
325 330 335
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
340 345 350
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
355 360 365
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
370 375 380
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
385 390 395 400
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
420 425 430
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
450 455 460
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 7
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggtgctgc agggcaccgt ggaaggcctg acccgcaaac cgcgcgtgtt tcgcccgccg 60
gtgcatcagt ttggcagccg cggcattccg cgcaacgaac gcgcgcgcgc gcagcatacc 120
tgcggcgatg gcaaaggccc gggccgcagc atgggccata cctggtatat ttatcagcag 180
aaatatattc gctatcagca gaaaccgtat tgcgcgcagg gcaccgcggt ggatggcagc 240
ggcagcaacg gcagcggcca gatgggcacc agctgccatc cgattcgcgg caactatgaa 300
gataccagcg aaggcctgtg gcgcgatatt cgcagcgcga ttcgcaaacg cagcatgcgc 360
ctgcagccga gcaaacagac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcgatat tcatgtgctg acccagccgc cggaaacctg cggcagccgc 480
ctgccgcgca gcggccgcga tgcgcgcggc catggcgtgg atgtgggccg ccagctggtg 540
cgcacccgcg gcctggtgac cggcaccccg aaagatcgcg gcagcaacac cgaatgctgg 600
gcggatctga aacgccagac cgataccctg tgctatacca gctgcggcga aaaaaccgcg 660
ctgagccgca accgccatat ggcgccgcgc gtgagcgaac tgcgcagcgc gtgcgcgaaa 720
cgcctgggca ttacc 735
<210> 8
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 9
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 60
tttattattt tctgggtg 78
<210> 10
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 11
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagatga 339
<210> 12
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgctgc agggcaccgt ggaaggcctg acccgcaaac cgcgcgtgtt tcgcccgccg 60
gtgcatcagt ttggcagccg cggcattccg cgcaacgaac gcgcgcgcgc gcagcatacc 120
tgcggcgatg gcaaaggccc gggccgcagc atgggccata cctggtatat ttatcagcag 180
aaatatattc gctatcagca gaaaccgtat tgcgcgcagg gcaccgcggt ggatggcagc 240
ggcagcaacg gcagcggcca gatgggcacc agctgccatc cgattcgcgg caactatgaa 300
gataccagcg aaggcctgtg gcgcgatatt cgcagcgcga ttcgcaaacg cagcatgcgc 360
ctgcagccga gcaaacagac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcgatat tcatgtgctg acccagccgc cggaaacctg cggcagccgc 480
ctgccgcgca gcggccgcga tgcgcgcggc catggcgtgg atgtgggccg ccagctggtg 540
cgcacccgcg gcctggtgac cggcaccccg aaagatcgcg gcagcaacac cgaatgctgg 600
gcggatctga aacgccagac cgataccctg tgctatacca gctgcggcga aaaaaccgcg 660
ctgagccgca accgccatat ggcgccgcgc gtgagcgaac tgcgcagcgc gtgcgcgaaa 720
cgcctgggca ttaccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 780
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 840
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 900
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gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg 1080
aagttcagcc ggagcgccga cgcccctgcc taccagcagg gccagaacca gctgtacaac 1140
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cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggcggagg 1320
ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctacgac 1380
gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga tga 1413

Claims (12)

1.一种HLA-G特异性嵌合抗原受体，其特征在于，其自氨基端至羧基端由抗人HLA-G的scFv、CD8α的铰链区、CD28跨膜区、4-1BB胞内区、CD3ζ胞内区结合结构域依次串联而成；其中所述抗人HLA-G的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD8α的铰链区的氨基酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.2所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如序列中SEQ ID NO.4，所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的一种HLA-G特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗人HLA-G特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的一种HLA-G特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述序列6共由470个氨基酸组成，其中第1-245位为所述抗人HLA-G的scFv的氨基酸序列；第246-290位为所述CD8α的铰链区；第291-316位为CD28跨膜区的氨基酸序列；第317-358位为所述4-1BB胞内区的氨基酸序列；第359-470位为所述CD3ζ胞内区的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1-3所述的HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，编码所述抗人HLA-G的scFv中的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.7所示；编码所述CD8α的铰链区的基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.8；编码所述CD28跨膜区的基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.9所示；编码所述4-1BB胞内区共刺激信号分子基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.10所示；编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列如序列表中序列如SEQ ID NO.11所示。
5.根据权利要求4所述的编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，编码所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.12所示。
6.根据权利要求5所述的编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，所述序列SEQ ID NO.12共由1413个核苷酸组成，其中第1-735位为编码所述抗人HLA-G的scFv的基因的核苷酸序列；第736-870位为编码所述CD8α的铰链区基因的核苷酸序列；第871-948位为编码所述CD28跨膜区基因的核苷酸序列；第949-1074位为编码所述4-1BB共刺激因子的核苷酸序列；第1075-1413位为编码所述CD3ζ胞内区的基因的核苷酸序列。
7.一种含有编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因的重组表达载体。
8.根据权利要求7所述的含有编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。
9.根据权利要求8所述含有编码HLA-G特异性嵌合抗原受体的基因的重组表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体能够表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的重组慢病毒表达载体，具体为所述嵌合抗原受体HLA-G-scFv-CD8v--合抗原-4-1BB-CD3B基因序列即序列SEQ ID NO.12插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的多克隆位点XbaI和BamHI之间后得到的重组质粒HLA-G-CAR表达质粒。
10.一种HLA-G特异性CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括在T细胞上表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的步骤：将能够表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的重组表达质粒与慢病毒的包装质粒pSPAX2质粒和pMD2.G质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达HLA-G嵌合抗原受体，获得表达所述HLA-G特异性嵌合抗原受体的T细胞。
11.一种HLA-G特异性嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞用于治疗肿瘤的应用。
12.一种HLA-G特异性嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞用于杀伤表达HLA-G蛋白的肿瘤细胞的应用。
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