CN111632135A - 靶向nkg2d的嵌合抗原受体t细胞在治疗前列腺癌中的应用、治疗前列腺癌的药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，与现有临床上所用的前列腺癌的治疗技术相比，靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在人体内的增殖速度快、活性高、半衰期长、能长效持久地发挥高效且特异性杀伤前列腺癌细胞的能力，对前列腺癌的治疗效果较好。本发明还提供了一种治疗前列腺癌的药物。

Description

靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在治疗前列腺癌中的应用、 治疗前列腺癌的药物

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗前列腺癌的药物中的应用、治疗前列腺癌的药物。

背景技术

前列腺癌是世界男性中的第二大常见癌症，也是导致男性癌症相关死亡的第五大原因。传统的放疗和化疗方式对前列腺癌患者的毒副作用较大，而且前列腺癌容易复发和转移。近来虽然有几种新的针对转移性激素抵抗前列腺癌治疗的药物已经获得批准，如醋酸阿比特龙、恩扎鲁胺和卡巴他赛，但这些药物都只能延长患者几个月的寿命。此外，肿瘤免疫治疗也已成为肿瘤学领域的热点，一些肿瘤免疫疗法也对前列腺癌展现出一定的效果，如：肿瘤疫苗sipuleucel-T、免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1抗体等，但是疗效不让人满意，且抗体药物在体内半衰期短，需要经常给药。因此，迫切需要可以提供持久疾病控制能力的治疗手段。

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活人体自身免疫系统，持续性对靶向肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。而NKG2D是一种凝集素样的II型跨膜糖蛋白，其在NK细胞、CD8+T细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的γδT细胞表面均有表达，很少会出现在健康细胞的表面。尽管NKG2D配体为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，但目前靶向NKG2D的CAR-T细胞的应用研究主要包括用于治疗肝癌、宫颈癌等，但未见有其在治疗前列腺癌方面的报道。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在治疗前列腺癌中的应用，以提供关于前列腺癌的一种新的持久有效的治疗手段，且其毒副作用小。

具体地，本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

其中，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)表达靶向NKG2D的嵌合抗原受体(CAR-NKG2D)，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向NKG2D的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本申请中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向NKG2D的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。

其中，所述靶向NKG2D的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应，具有较高的安全性。可选地，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列。

本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向NKG2D的单链抗体与前列腺癌细胞上表达的NKG2D结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。

本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。

在本发明一实施方式中，所述胞外铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD8跨膜区；所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。即，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的氨基酸序列。

可选地，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本申请中，所述CAR-NKG2D的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因。其中，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。

进一步可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

优选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。与SEQID NO：3所示的核苷酸序列相比，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中多了信号肽的编码基因。

其中，所述信号肽的编码基因可较好地指导所述CAR-NKG2D表达到细胞表面，但在嵌合抗原受体CAR-NKG2D表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的CAR-NKG2D的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中并未带有信号肽的氨基酸序列。

可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

其中，本申请所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞，可以采用以下制备方法制得，可以包括以下步骤：

(1)提供靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

(2)将所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因插入到基因传递载体中，得到重组基因传递载体；

(3)将所述重组基因传递载体进行包装并转染宿主细胞，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞。

可选地，将所述重组基因传递载体进行包装并转染宿主细胞，得到重组慢病毒，包括：将所述重组基因传递载体与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述重组慢病毒。所述重组慢病毒的包装可采用三质粒系统或四质粒系统，包膜质粒、包装质粒为本领域常用的物质。

可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞或COS7细胞等，但不限于此。

在本发明一实施方式中，所述基因传递载体可以为质粒载体，包括但不限于真核质粒载体、原核质粒载体、微环DNA、转座子等，例如为pWPXLD质粒、pLEX-MCS质粒。当以pWPXLD质粒为基因传递载体时，CAR-NKG2D的编码基因位于pWPXLD载体的BamHⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间。

在本发明一实施方式中，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。其中，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

本发明提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞在治疗前列腺癌中的新用途，对难治性、复发性的前列腺癌的治疗效果较好，靶向NKG2D的CAR-T可以专一性地靶向表达NKG2D的前列腺癌细胞，在其表达的CAR-NKG2D与NKG2D结合后，该CAR-T细胞的胞内信号区被激活，促进其在患者体内的扩增，长效持久地发挥高效且特异性杀伤前列腺癌细胞的能力，而对正常细胞几乎不会造成损伤。与现有临床上所用的前列腺癌的治疗技术(免疫检查点抑制剂)相比，靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞对前列腺癌的治疗效果更好，且能在人体内增殖速度快、半衰期长、疗效持久。

本发明还提供了一种治疗前列腺癌的药物，包括靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞。

可选地，所述治疗前列腺癌的药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

其中，所述载体包括水、生理盐水及其他非水性溶剂、白蛋白、血红蛋白、脂质体中的至少一种。所述辅料包括稀释剂、赋形剂和稳定剂中的至少一种。

可选地，所述药物的形式包括汤剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服剂和颗粒剂中的一种或多种。所述药物的形式取决于在实际中的施用方式。

可选地，所述药物通过口服或注射的方式施用。进一步地，所述注射通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式施用。

可选地，所述药物还包括其他具有或治疗前列腺癌的活性成分。例如，醋酸阿比特龙、恩扎鲁胺、卡巴他赛，肿瘤疫苗sipuleucel-T、免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1抗体等中的至少一种。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒的质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒感染T细胞后表达嵌合抗原受体CAR-NKG2D的流式检测结果图；其中，使用anti-CD3-FITC标记T细胞，用anti-NKG2D-APC抗体标记CAR-NKG2D，UTD代表未经病毒感染的T细胞，CAR-T代表表达CAR-NKG2D的CAR-T细胞。

图3为本发明实施例提供的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和未经病毒感染的T淋巴细胞(UTD)的体外杀伤PC-3前列腺癌细胞的效果图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

制备实施例

靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备，具体包括以下步骤：

(1)制备靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的基因序列

分别制备信号肽、靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，通过PCR的方法将上述信号肽、靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-NKG2D的编码基因，该CAR-NKG2D的编码基因如SEQ ID NO：4所示。其中，所述信号肽的编码基因序列如SEQ ID NO：7所示，靶向NKG2D的单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

(2)构建pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒

将上述CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD载体时，在所述CAR-NKG2D的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒。

将所获得的表达质粒与包膜质粒和包装质粒(psPAX2，pMD2.G)通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000共转染HEK293T包装细胞中，48小时后离心收获重组慢病毒。然后将所述重组慢病毒感染经CD3/CD28磁珠刺激的CD3阳性T淋巴细胞，获得NKG2D CAR-T细胞。

(3)重组慢病毒构建

将上述获得的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000共转染培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，于-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并后一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×10⁸个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒。

(4)靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备

a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离

PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞

取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。

c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞

取b)中经免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的步骤(3)中的所述重组慢病毒进行培养。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，同时经过流式细胞仪检测靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的表达，结果如图2所示。经检测，经上述重组慢病毒感染的T细胞中，CAR-NKG2D的阳性率约为70％。这表明成功制得得到靶向NKG2D的CAR-T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中，以供患者回输用。

效果实施例

为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向NKG2D的CAR-T细胞在杀伤前列腺细胞方面的效果，进行如下效果实施例。

采用实时细胞分析仪(xCElligence RTCA SP)进行前列腺细胞杀伤实验。首先在该仪器配套的E-Plate 96孔板中加入5000个PC-3靶细胞-前列腺癌细胞的完全培养基进行培养，培养24小时后，按照不同效靶比(E:T)分别加入相应数量的两组效应细胞，即，NKG2DCAR-T细胞和只经磁珠刺激、未加病毒感染的T细胞(简写为UTD细胞，即，实施例1步骤b)中的CD3阳性T淋巴细胞)，随后共培养24小时。24h后使用实时无标记细胞分析仪的细胞指数(cell index)值对细胞杀伤效果进行分析。

图3为本发明实施例提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞体外杀伤PC-3前列腺癌细胞的效果图。从图3可以看出，本发明提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞对体外前列腺细胞具有非常强的杀伤能力，且杀伤能力远远高于对照组，这表明本发明提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞在治疗前列腺癌方面具有非常可观的应用前景。

以上实施例的描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在治疗前列腺癌中的应用、治疗前列腺癌的药物

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

145 150 155 160

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

165 170 175

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

180 185 190

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

195 200 205

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

245 250 255

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

260 265 270

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

275 280 285

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

290 295 300

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

305 310 315 320

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

325 330 335

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

340 345 350

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360 365

<210> 3

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420

caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 480

tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 540

acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 600

ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 660

ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 720

tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 780

cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 840

cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 900

ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 960

aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1020

cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1080

atgcaggccc tgccgcctcg g 1101

<210> 4

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 120

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 180

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 240

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 300

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 360

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 420

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 480

caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 540

tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 600

acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 660

ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 720

ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 780

tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 840

cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 900

cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 960

ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1020

aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1080

cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1140

atgcaggccc tgccgcctcg g 1161

<210> 5

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420

caaaggactg tg 432

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro

20

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60

Claims (10)

1.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞表达靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其中，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向NKG2D的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.一种治疗前列腺癌的药物，其特征在于，包括靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞。

7.如权利要求6所述的治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述治疗前列腺癌的药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

8.如权利要求7所述的治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述载体包括水、生理盐水及其他非水性溶剂、白蛋白、血红蛋白、脂质体中的至少一种，所述辅料包括稀释剂、赋形剂和稳定剂中的至少一种。

9.如权利要求6所述的治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述药物通过口服或注射的方式施用。

10.如权利要求6所述的治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

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