CN110564695A - 靶向前列腺癌的增强型car-t细胞及其制备方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向前列腺癌的增强型CAR‑T细胞及其制备方法和药物，涉及免疫治疗技术领域。该CAR‑T细胞的细胞膜上表达有第一受体和第二受体，第一受体为嵌合抗原受体，嵌合抗原受体具有结合前列腺癌抗原的抗原结合结构域；第二受体包括位于胞外的特异性结合TGFβ的TGFβ结合结构域和位于胞内的持续激活IL‑7信号通路的IL‑7激活信号传导结构域。本发明提供的CAR‑T细胞可以靶向前列腺癌，中和肿瘤微环境中TGFβ对T细胞的抑制作用，同时激活IL‑7‑STAT 5信号通路促进T细胞的增殖和存活，该CAR‑T细胞具有增强的抗肿瘤活性，可用于前列腺癌的治疗。

Description

靶向前列腺癌的增强型CAR-T细胞及其制备方法和药物
技术领域
本发明涉及免疫治疗技术领域，具体而言，涉及一种靶向前列腺癌的增强型CAR-T细胞及其制备方法和药物。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CAR-T)的过继细胞疗法是目前最有前景的免疫治疗方法，尤其是针对难治性白血病和淋巴瘤，取得了巨大的成效。但是在实体癌例如前列腺癌方面，治疗效果却不尽人意。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向前列腺癌的增强型CAR-T细胞及其制备方法和药物。本发明提供的CAR-T细胞可以靶向前列腺癌，并具有抑制TGFβ信号通路同时激活IL-7信号通路的特点，该CAR-T细胞具有增强的抗肿瘤活性。
本发明是这样实现的：
前列腺癌是男性中发病率和死亡率都很高的疾病。并且易复发和转移。利用免疫疗法虽有一定的效果，但疗效不好的原因之一是：在恶性肿瘤微环境中，有多种机制能够抑制免疫细胞反应，如抑制细胞和细胞结合的可溶性因子，抑制这些因子如PD-1和CTLA-4在一定程度可以清除部分肿瘤细胞，但后期若发展为去势抵抗性前列腺癌则对这些抑制剂的效果不响应。但在很多肿瘤特别是前列腺癌中，发现转化生长因子(TGFβ)大量表达。TGFβ在肿瘤组织中大量积聚，诱导许多细胞外变化介质的表达。TGFβ在调节免疫反应的起始，发展，维持和消退方面具有重要作用，是一种有效的免疫抑制剂。大多数恶性肿瘤细胞可以通过TGFβ的过量产生逃避宿主免疫监视和促进自身发展。
TGFβ大量表达会抑制IL-2的表达，因此抑制IL-2引起的T细胞的扩增。IL-7可以替代IL-2调节TGFβ抗性。IL-7信号传导是T细胞在其整个生命过程中赖以生存的必须因素，且所有淋巴细胞的早期发育阶段都需要通过IL-7的介入来完成。在T细胞中，IL-7是促使T细胞成熟和分化的非冗余细胞因子，并且它对于外周淋巴组织中成熟T细胞存活仍然是必需的。
前列腺特异性膜抗原(prostrate specific membrane antigen，PSMA)其在前列腺癌中高表达，在正常组织中不表达或者低表达，已有多种证据表明是免疫治疗前列腺癌的理想靶点，利用靶向PSMA的CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中显示出极大的特异性，靶向性和较少的主要组织相容性复合物限制，在临床前研究及临床实验中证明了CAR-T细胞的有效性和安全性，但其应用仍有局限，所以还需要进一步的研究和探索。
基于此，第一方面，本发明实施例提供一种增强型CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的细胞膜上表达有第一受体和第二受体；
所述第一受体为嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有结合前列腺癌抗原的抗原结合结构域；
所述第二受体包括位于胞外的特异性结合TGFβ的TGFβ结合结构域和位于胞内的持续激活IL-7信号通路的IL-7激活信号传导结构域IL-7。
本发明提供的增强型CAR-T细胞通过结合前列腺癌抗原的抗原结合结构域靶向前列腺癌，利用TGFβ结合结构域结合TGFβ，减少TGFβ对肿瘤细胞的促进和其对T细胞的免疫抑制作用；利用IL-7激活信号传导结构域持续传导IL-7信号以代替IL-2，促进CAR-T细胞的增殖存活，进而增强其对前列腺癌的杀伤能力。
在可选的实施方式中，所述TGFβ结合结构域选自TGFβII型受体的胞外段。
在可选的实施方式中，所述TGFβII型受体的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
利用TGFβII受体的胞外段与TGFβ结合却不激活信号通路来降低了TGFβ对肿瘤细胞的促进和对T细胞的免疫抑制作用，进而提高CAR-T细胞的抗癌效果。
在可选的实施方式中，所述IL-7激活信号传导结构域具有不依赖于配体结合的自主持续传导IL-7信号的功能。
在可选的实施方式中，所述IL-7激活信号传导结构域由IL-7受体突变体的跨膜区和胞内区组成。
在可选的实施方式中，所述IL-7受体突变体的跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。
在可选的实施方式中，所述IL-7受体突变体的胞内区的氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示。
正常情况下IL-7受体和其配体IL-7结合后是依赖IL-7Rα(CD127)和其共同受体γc链异二聚化传递IL-7信号。而使用上述IL-7受体突变体的跨膜区和胞内区构成IL-7激活信号传导结构域可以实现不依赖于配体结合的自主持续传导IL-7信号的效果。即在不需要配体的情况下传递IL-7信号，实现IL-7信号通路持续性激活且针对肿瘤细胞的CAR-T细胞，可大大提高该CAR-T细胞在实体瘤中的治疗效率。
需要说明的是，实现持续传导IL-7信号的功能的IL-7激活信号传导结构域并不限于使用上述的IL-7受体突变体，也可以采用其他的蛋白结构实现。同样，所述IL-7受体突变体的跨膜区序列也不限于SEQ ID NO.16所示的序列，也可以是其他的突变序列，只要其具有持续传导IL-7信号的功能即可。述IL-7受体突变体的胞内区序列也不限于SEQ ID NO.18所示的序列，也可以是其他的突变序列，只要其具有持续传导IL-7信号的功能即可。
在可选的实施方式中，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区。
在可选的实施方式中，所述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域。
在可选的实施方式中，所述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域。
在可选的实施方式中，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在可选的实施方式中，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4－1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一种或多种。
在可选的实施方式中，所述共刺激信号传导区包括4－1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域。
优选地，4－1BB的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域所结合的前列腺癌抗原为PSMA。
在可选的实施方式中，所述抗原结合结构域选自scFv、Fab、Fab’和F(ab’)2中的任意一种。在可选的实施方式中，抗原结合结构域选自scFv，所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第二方面，本发明实施例提供如前述实施方式所述的增强型CAR-T细胞的制备方法，其包括：将表达所述第一受体和所述第二受体的病毒感染未经修饰的T细胞。
本发明所提供的制备方法可以制备出上述的增强型CAR-T细胞。
在可选的实施方式中，所述病毒为慢病毒。
在可选的实施方式中，所述未经修饰的T细胞分离自需要治疗肿瘤的主体的血液。
在可选的实施方式中，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
第三方面，本发明实施例提供一种治疗前列腺癌的药物，其含有作为活性成分的如前述实施方式所述的增强型CAR-T细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中的表达盒的结构示意图。
图2为PSMA-T7R质粒的结构示意图。
图3为CAR-T细胞的CAR的表达水平的流式图。
图4为病毒感染过的293T细胞中的CAR和TGFβ受体的表达水平的流式图。
图5为CAR-T细胞的TGFβ受体的表达水平的流式图。
图6为CAR-T细胞内磷酸化STAT 5的表达水平的流式图。
图7为CAR-T细胞在不同效靶比下的细胞毒性图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
构建含表达第一受体和第二受体的表达盒的质粒载体，表达盒上的各元件结构和位置关系参考图1，质粒载体原始骨架为Carl June。
其中，第一受体为嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括如下元件：scFv+CD8hinge+CD8αTM+4-1BB+CD3ζ；其前端具有CD8α信号肽。
其中，各元件的氨基酸序列和碱基序列如下：
CD8α信号肽的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
特异性结合PSMA的scFv的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
scFv的氨基序列序列如SEQ ID NO.4所示。
CD8 hinge(铰链区)的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
CD8 hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
CD8αTM(跨膜区)的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
CD8αTM的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4-1BB的胞内结构域的碱基序列SEQ ID NO.9所示。
4-1BB的胞内结构域的氨基酸序列SEQ ID NO.10所示。
CD3ζ的胞内结构域的碱基序列SEQ ID NO.11所示。
CD3ζ的胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
第二受体包括：TGFβII受体胞外段(TGFβ结合结构域)+IL-7受体突变体的跨膜区+IL-7受体突变体的胞内区。该受体以下简称为T7R受体。
其中，各元件的氨基酸序列和碱基序列如下：
TGFβII受体胞外段的碱基序列如SEQ ID NO.13所示。
TGFβII受体胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
IL-7受体突变的跨膜区的碱基序列如SEQ ID NO.15所示。
IL-7受体突变的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
IL-7受体突变体的胞内区碱基序列如SEQ ID NO.17所示。
IL-7受体突变体的胞内区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
第一受体和第二受体通过2A肽序列连接。
2A肽的碱基序列如下：
GCCACAAACTTCTCTCTGCTAAAGCAAGCAGGTGATGTTGAAGA AAACCCCGGGCCT；
2A肽的氨基酸序列如下：
ATNFSLLKQAGDVEENPGP。
质粒设计后图谱交给质粒公司合成从公司购买得到。得到的质粒载体命名为PSMA-T7R质粒，如图2所示。
实施例2
构建含表达上述嵌合抗原受体和T7R受体的病毒
方法如下：
将实施例1的PSMA-T7R质粒和慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包膜质粒pMD2.G，利用转染试剂PEI将三质粒系统转染293T细胞，收获培养液上清，经超滤和超离浓缩后得到表达第一受体和第二受体的慢病毒。
得到的病毒，命名为PSMA-T7R病毒。
实施例3
构建表达嵌合抗原受体和T7R受体的T细胞
使用磁珠法从人血中分离出T细胞，经CD3/CD28复合物激活后，使用包装好的慢病毒感染，48h流式细胞术检测表达水平。具体流程如下：
(1)在50mL离心管中先加入淋巴细胞分离液，之后缓慢地保持界面清晰的状态下将血液加入到淋巴细胞分离液上层(淋巴细胞分离液与血液的体积比为2:1)，800g离心25分钟(期间离心机设定升速为1，降速为0)。
(2)离心结束后，小心吸取真核细胞层，加入PBS轻轻吹打混匀，500g离心10分钟。
(3)用PBS重悬细胞后，对细胞进行计数。计数后，300g离心10分钟后，弃去上清，加入含10％血清的x-vivo培养基的缓冲液(每1×107个细胞加入70μL)。
(4)按照1×107个细胞加入20μL CD4/CD8磁珠的用量加入磁珠后，4℃用细胞缓冲液清洗后，再次重悬细胞。
(5)将分离柱放入磁场，用缓冲液润洗柱子后，加入细胞悬液，待液体流尽后，用缓冲液冲洗柱子两次。
(6)将柱子移出磁场，加入缓冲液后，迅速用活塞将细胞推入离心管中，300g离心10分钟。
(7)离心结束后，弃去上清，加入x-vivo完全培养基(x-vivo培养基含有10％的血清，并按1:1000的比例加入IL-7、IL-15、IL-21)重悬细胞，对细胞进行计数。
(8)调整细胞密度为1×106个/mL，按1:100的比例加入CD3和CD28的复合物对细胞进行激活。
(9)激活48h后，可对细胞进行计数，用于后续慢病毒的感染。根据所制备病毒的滴度，在T细胞中加入慢病毒，32℃1800rpm离心1h，放于培养箱中培养，12h后换液，48h流式细胞术检测CAR的表达。
得到的细胞命名为T7R-CAR-T细胞。
实验例1
检测T7R-CAR-T细胞的CAR表达水平；
取被感染的CAR-T细胞，同批未感染的T细胞作为对照，细胞与偶联生物素的PSMA蛋白(b-PSMA)在4摄氏度避光共孵育40min，之后用含2％血清的PBS洗两遍，然后与APCStreptavidin共孵育20min，洗两次后使用流式细胞仪Fortessa检测，表达结果通过FlowJo分析得到。结果见图3。
图3结果显示，T7R-CAR-T和PSMA-CAR-T的表达水平分别为33.2％、47.9％。
实验例2
TGFβ结合结构域的表达水平的检测
用PSMA-T7R病毒分别感染293T细胞和T细胞，使用流式抗体检测对应CAR的表达和TGFβ结合结构域的表达。具体流程如下：
(1)取慢病毒感染的293T细胞或T细胞，计数后取30万细胞，用缓冲液(含2％血清的PBS)清洗一遍后，弃去上清。
(2)100μL缓冲液重悬细胞后，加入偶联生物素的PSMA蛋白(b-PSMA)在4摄氏度避光共孵育分钟。
(3)用缓冲液清洗两遍后，100μL缓冲液重悬细胞后，加入APC Streptavidin和TGFβR2的抗体孵育20分钟后，清洗两遍后，重悬转移至流式管中，使用流式细胞仪Fortessa检测，表达结果通过Flow Jo分析得到。
结果见图4和图5。结果显示，T7R慢病毒能明显提高细胞TGFβ结合结构域的表达。
实验例3
IL-7信号通路的检测
IL-7刺激T细胞后，可通过STAT 5的磷酸化信号通路发挥作用。经慢病毒感染T细胞后，使用流式抗体检测p-STAT 5。具体流程如下：
(1)取已经确认表达CAR的CAR-T细胞30万，用缓冲液(含2％血清的PBS)清洗一遍后，弃去上清。
(2)加入Fix&Perm液，4℃孵育30分钟。
(3)使用Washing Buffer洗三遍后，100μL Washing Buffer重悬，用p-Stat5的抗体染30分钟。
(4)缓冲液清洗两遍后，重悬转移至流式管中，使用流式细胞仪Fortessa检测，表达结果通过Flow Jo分析得到。
图6结果显示T7R-CART细胞的STAT 5的磷酸化水平明显增强。说明其IL-7信号通路在未结合IL-7的情况下得到持续激活。
实验例4
对前列腺癌细胞杀伤效果的检测
将两种CAR-T细胞的阳性率调成一致后，按2×104个/孔的比例在低吸附孔板中加入靶细胞PC3-PSMA(人前列腺癌细胞系，利用慢病毒稳定表达PSMA和荧光素酶)，按效靶比(效应细胞的数量：靶细胞的数量)4：1、2：1、1：1、0.5：1、0：1加入相应数量的CAR-T细胞，同时做不同梯度靶细胞孔(0、1、2、4、8、10万)。由于靶细胞可以表达荧光素酶，加入底物后，吸光值与细胞数量成线性关系，可以做出标曲，计算剩余靶细胞数量，从而计算出杀伤效果。
由图7结果看来，未经修饰的T细胞对靶细胞基本无杀伤功能，但CAR-T细胞杀伤效果明显，且随着效靶比的增加，杀伤效果也逐步上升，同时T7R-CAR-T细胞在不同效靶比的细胞毒性均显著优于传统PSMA CAR-T细胞，说明T7R-CAR-T细胞抗肿瘤活性的增强效果。
综上，本发明实施例提供的T7R-CAR-T细胞能够持续性激活IL-7信号通路且抑制TGFβ信号通路。将其应用到如前列腺癌等实体瘤的细胞免疫疗法当中能够对CAR-T技术具有更加有效的免疫调节作用，一方面CAR-T细胞在细胞增殖，存活，以及抗肿瘤活性得到显著提高。另一方面，降低了TGFβ对T细胞的免疫抑制作用。从而提高了CAR-T细胞在前列腺癌治疗的疗效。相比普通的CAR-T细胞具有更加有效的抗肿瘤效果。并且本发明所述T7R功能不仅局限于对前列腺癌的CAR-T调节作用，同时该受体可以为其他肿瘤的治疗提供参考，仅需要目标肿瘤特异性抗原替换PSMA抗原即可。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司
<120> 靶向前列腺癌的增强型CAR-T细胞及其制备方法和药物
<160> 18
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atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcg tgatgaccca gtccccctcc tccctgtctg cctccgtggg cgacagagtg 120
accatcacat gcaaggcctc ccaggattgt ggcaccgccg tggactggta tcagcagaag 180
cctggcaagg cccctaagct gctgatctac tgggcctcca ccagacacac cggcgtgcct 240
gacagattca ccggctccgg ctctggcacc gacttcaccc tgaccatctc cagcctgcag 300
cctgaggact tcgccgacta cttctgccag cagtacaact cctaccctct gaccttcggc 360
ggaggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggatcag gtggtggcgg atctggaggt 420
ggcggaagcg aagtgcagct ggtgcagtct ggcgccgaag tgaagaaacc tggcgcctcc 480
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accacctaca accagaagtt cgaggaccgg gccaccctga ccgtggacaa gtccacctcc 660
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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln
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Asp Cys Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
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accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
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Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
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Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60
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Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
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Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
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Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
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Leu Leu Val Ile Phe Gln
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Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
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Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val
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Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu
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<400> 15
cctatcttac taacttgtcc caccatcagc attttgagtt ttttctctgt cgctctgttg 60
gtcatcttgg cctgtgtgtt atgg 84
<210> 16
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Pro Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser
1 5 10 15
Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp
20 25
<210> 17
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aaaaaaagga ttaagcctat cgtatggccc agtctccccg atcataagaa gactctggaa 60
catctttgta agaaaccaag aaaaaattta aatgtgagtt tcaatcctga aagtttcctg 120
gactgccaga ttcatagggt ggatgacatt caagctagag atgaagtgga aggttttctg 180
caagatacgt ttcctcagca actagaagaa tctgagaagc agaggcttgg aggggatgtg 240
cagagcccca actgcccatc tgaggatgta gtcatcactc cagaaagctt tggaagagat 300
tcatccctca catgcctggc tgggaatgtc agtgcatgtg acgcccctat tctctcctct 360
tccaggtccc tagactgcag ggagagtggc aagaatgggc ctcatgtgta ccaggacctc 420
ctgcttagcc ttgggactac aaacagcacg ctgccccctc cattttctct ccaatctgga 480
atcctgacat tgaacccagt tgctcagggt cagcccattc ttacttccct gggatcaaat 540
caagaagaag catatgtcac catgtccagc ttctaccaaa accag 585
<210> 18
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
1 5 10 15
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val
20 25 30
Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp
35 40 45
Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
50 55 60
Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val
65 70 75 80
Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser
85 90 95
Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala
100 105 110
Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu
115 120 125
Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu
130 135 140
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
165 170 175
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
180 185 190
Gln Asn Gln
195

Claims (10)

1.一种增强型CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞的细胞膜上表达有第一受体和第二受体；
所述第一受体为嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有结合前列腺癌抗原的抗原结合结构域；
所述第二受体包括位于胞外的特异性结合TGFβ的TGFβ结合结构域和位于胞内的持续激活IL-7信号通路的IL-7激活信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的增强型CAR-T细胞，其特征在于，所述TGFβ结合结构域选自TGFβII型受体的胞外段；
优选地，所述TGFβII型受体的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3.根据权利要求2所述的增强型CAR-T细胞，其特征在于，所述IL-7激活信号传导结构域具有不依赖于配体结合的自主持续传导IL-7信号的功能；
优选地，所述IL-7激活信号传导结构域由IL-7受体突变体的跨膜区和胞内区组成；
优选地，所述IL-7受体突变体的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
优选地，所述IL-7受体突变体的胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的增强型CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有跨膜结构域和共刺激信号传导区；
所述跨膜结构域选自：CD8、CD28、CD33、CD37、CD8α、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、和CD3ε中的一种或多种的跨膜结构域；
优选地，所述跨膜结构域选自CD8的跨膜结构域；
优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
优选地，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3中的一种或多种；
优选地，所述共刺激信号传导区包括4-1BB的细胞内结构域和CD3ζ的细胞内结构域；
优选地，4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
优选地，CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求4所述的增强型CAR-T细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域所结合的前列腺癌抗原为PSMA；
优选地，所述抗原结合结构域选自scFv、Fab、Fab’和F(ab’)2中的任意一种；
优选地，所述抗原结合结构域选自scFv，所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
6.如权利要求1-5任一项所述的增强型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，其包括：将表达所述第一受体和所述第二受体的病毒感染未经修饰的T细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述病毒为慢病毒。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述未经修饰的T细胞分离自需要治疗前列腺癌的主体的血液。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
10.一种治疗前列腺癌的药物，其特征在于，其含有作为活性成分的如权利要求1-5任一所述的增强型CAR-T细胞。
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