CN108384760B

CN108384760B - 携带cd20/cd19双特异性嵌合抗原受体的人t淋巴细胞及制备方法和应用

Info

Publication number: CN108384760B
Application number: CN201810220005.3A
Authority: CN
Inventors: 赵欣; 黄欣欣; 高志慧; 朱永波; 盖丽云; 李刚毅
Original assignee: Beijing Doing Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing win win Technology Co., Ltd
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2038-03-16
Also published as: CN108384760A

Abstract

本发明公开了携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞及制备方法和应用，所述人T淋巴细胞是经过抗体活化的，所述CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体是将抗人CD20抗体和抗人CD19抗体串联起来的，该发明可显著提高T淋巴细胞中CD3+CD8+T细胞的比例，显著提高病毒转导效率，可提高CART细胞对肿瘤的覆盖率，防止CD19或CD20单靶点CART治疗后的肿瘤复发。

Description

携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞及制备方法和应用。

背景技术

经嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的靶向免疫细胞肿瘤治疗技术(主要是T淋巴细胞(CART))是近年来经大量临床前研究及部分临床试验验证有效的新型肿瘤细胞免疫治疗技术，也是目前的研究热点；该技术是用包含靶向肿瘤表面抗原的scfv的嵌合抗原受体基因修饰免疫细胞，使其具有靶向性和杀伤活性，其中最常使用的是T淋巴细胞，其中发挥杀伤作用的主要是CD8+T淋巴细胞，嵌合抗原受体遗传修饰的靶向免疫细胞肿瘤治疗技术为肿瘤的过继性细胞免疫治疗提供了新的有效解决方案：其制备及治疗方式是将患者自体外周血经体外分离活化后得到T淋巴细胞，使用病毒载体将CAR基因转导入淋巴细胞，使其在淋巴细胞表面表达，CART细胞在体外扩增后回输到患者体内。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)主要包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区：胞外区主要是抗原特异性单克隆抗体单链可变区序列，包括重链可变区和轻链可变区，二者以铰链区连接；跨膜区是CD3、CD4、CD8、CD28等蛋白分子的跨膜区；胞内区主要是T细胞受体TCR/CD3复合物中的CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，通常具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)，负责信号转导；CAR胞外区为配体，肿瘤相关抗原(TAA)本身则为受体，CAR一旦与TAA结合，即可通过由CD3ζ或高亲和性受体FcεRIγ的胞内区使T细胞活化发挥效应功能，输入体内的CAR-T细胞CARs与TAA结合后引起CAR-T细胞活化，表现为CAR依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放，输注的CAR-T细胞在患者体内持续存在与潜在的疗效相关，目前临床研究中所输注的CAR-T细胞多为第二代CAR-T细胞，在第二代CAR-T细胞中加入共刺激信号4-1BB可增强CAR-T细胞在体内的存活时间、以及抗肿瘤能力提高，通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域在体外进行基因重组，生产重组质粒，在体外通过转染技术，将CAR基因转导到T淋巴细胞，使CAR分子在T淋巴细胞表面表达，成为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。

目前CAR-T细胞的制备所常用的慢病毒载体是将CAR整合到T细胞基因组中，使其长期稳定地表达CAR分子，CAR-T细胞中发挥作用的主要是CD8+T淋巴细胞，所以通过特定的细胞活化和培养方法提高T淋巴细胞中CD3+CD8+T淋巴细胞的比例有助于提高CAR-T细胞的效能，在制备CART的过程中，T淋巴细胞活化是一个关键环节，现有的T淋巴细胞活化多采用商业化的包被或偶联有抗人CD3和抗人CD28单抗的磁珠，如Invitrogen公司的Dynabeads，美天旎公司的Transact beads等，使用方便但价格昂贵，其中Dynabeads还受专利保护，只能用于Novartis公司的CAR-T生产，采用磁珠方法活化的T淋巴细胞中CD3+CD8+T淋巴细胞的比例往往不高。

以慢病毒为骨架的载体主要是从人免疫缺陷病毒HIV改进而来，在体内能够感染非分裂细胞和分裂细胞，在基因治疗领域有着非常广阔的应用前景，目前以慢病毒为基因转导载体的临床实验在一定程度上证明了其作为基因治疗载体的安全性，虽然慢病毒能够感染非分裂和分裂细胞，但原代T细胞的慢病毒感染效率一直比较低，平均不到20％，这在一定程度上限制了慢病毒在嵌合抗原受体免疫细胞治疗技术中的广泛临床应用，另外，目前慢病毒转导淋巴细胞多采用添加聚凝胺并离心的方法，该方法费时费力，提高聚凝胺浓度有细胞毒性，长时间离心对细胞损伤较大，对含有较大外源片段的慢病毒转导效率并没有显著提高。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞及制备方法和应用，从而可有效活化T淋巴细胞，CD3+CD8+T细胞所占比例提高，还能够提高CAR的覆盖率，增加CAR的使用范围，有助于增加患者的治愈率，且能有效防止疾病复发。

为实现上述目的，本发明提供了一种携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞，所述人T淋巴细胞是经过抗体活化的，所述CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体是将抗人CD20抗体和抗人CD19抗体串联起来的，其中所述人T淋巴细胞是通过使用抗人CD3单抗和人纤连蛋白片段包被培养板，培养基中添加抗人CD28单抗和细胞因子复合物的淋巴细胞活化方法进行活化的。

优选地，上述技术方案中，所述CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体包括信号肽、抗人CD20单链抗体、间隔区、抗人CD19单链抗体，铰链区，跨膜区和胞内信号区。

优选地，上述技术方案中，信号肽选用CD8a信号肽或GMCSF信号肽，间隔区选用(GGGS)1-n或(EAAK)1-n或SEQ ID No.1序列，铰链区选用IgG4铰链或CD8铰链，跨膜区选用CD8跨膜区或CD28跨膜区，胞内信号区选用CD28或4-1BB共刺激分子的胞内信号区及CD3ζ胞内区，CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体构成示意图如图7所示。

本发明还提供了一种携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取活化的人T淋巴细胞；

(2)构建携带有CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体基因序列的慢病毒载体、重组包装出慢病毒颗粒；以及

(3)将所述慢病毒颗粒转导经过活化的人T淋巴细胞，即得。

优选地，上述技术方案中，获取活化的人T淋巴细胞包括以下步骤：

(1)从患者体内分离外周血单个核细胞；

(2)用无血清培养基分离得到的外周血单个核细胞，置于培养瓶中于37℃孵育2h，取未贴壁细胞，计数后离心；

(3)活化：用无血清培养基重悬外周血单个核细胞，添加抗人CD28单抗、自体血浆和细胞因子复合物，调整细胞密度为(1-2.5)×10⁶个/ml，接种于经过包被的6孔板中，每孔1.5-2.5ml，37℃继续培养；以及

(4)取培养24-60h的外周血单个核细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，即得活化的T淋巴细胞。

上述技术方案中，步骤(1)中，使用淋巴细胞分离液从患者体内分离外周血单个核细胞，所述淋巴细胞分离液可采用GE公司的Ficollpaque plus或Ficollpaque premium。

上述技术方案中，步骤(2)中，所述无血清培养基中还加入血浆(即，自体血浆)，使血浆在无血清培养基中的浓度为2-10％，所述血浆与外周血单核细胞来源于同一血液供体，即如果外周血单个核细胞来源于某一特定患者的外周血，血浆也来源于该特定患者的外周血。

上述技术方案中，步骤(2)使用的无血清培养基可选用AIM-V(Invitrogen)，X-Vivo 15(Lonza)和GT-T551(Takara)中的一种。

上述技术方案中，步骤(2)中用无血清培养基分离得到的外周血单个核细胞，使其在无血清培养基中的密度为(1-9)×10⁶个/ml。

上述技术方案中，步骤(3)中添加的抗人CD28单抗的浓度为2-15ug/ml，自体血浆在无血清培养基中的浓度为2-10％，细胞因子复合物包括重组白细胞介素2或重组白细胞介素7和重组白细胞介素15，其中重组白细胞介素2浓度范围为100-1000U/ml，重组白细胞介素7和重组白细胞介素15浓度范围均为5-50ng/ml，该细胞因子复合物可提高体外培养T细胞中记忆性T细胞的比例，对细胞治疗非常有益。

上述技术方案中，步骤(3)中，在T细胞的活化扩增过程中，每隔2-3天补充新鲜的上述无血清培养基、血浆及细胞因子复合物，以保证其在体系中的浓度。

上述技术方案中，外周血单个核细胞体外活化扩增的条件均为在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行。

上述技术方案中，人T淋巴细胞经活化40-60h后进行病毒转导，其转导效率明显高于24h和72h。

优选地，上述技术方案中，所述6孔板包被了抗人CD3单抗和人纤连蛋白片段，包被步骤如下：将25-35μl的抗人CD3单抗与550-650μl的人纤连蛋白片段混合，进而用PBS稀释至6ml，混匀后加至各孔，每孔1ml，置于4℃冰箱中过夜或37℃孵育2小时，其中，所述抗人CD3单抗的浓度为0.5-1.5mg/ml，人纤连蛋白片段的浓度为450-550μg/ml。

优选地，上述技术方案中，携带有CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体基因序列的慢病毒载体的构建方法包括以下步骤：采用全基因合成的方法合成可与肿瘤表面抗原特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列，如SEQ ID No.3所示，将该嵌合抗原受体的基因序列亚克隆到慢病毒表达载体中，经测序验证序列无误后，得到携带CAR序列的重组慢病毒载体，优选的，所述慢病毒载体为pLVX-EF1a-MCS或pSin-EF2-MCS-IRES-Puro或其他任何一种慢病毒过表达载体，其中pLVX-EF1a-MCS是本发明人由美国Clontech公司的pLVX-EF1a-MCS-IRES-Puro载体改造而成，pSin-EF2-MCS-IRES-Puro由pSin-EF2-EGFP-IRES-Puro载体改造而成。

上述技术方案中，需使用慢病毒表达载体与包装质粒在293T细胞中重组包装出携带CAR基因且具有感染能力的慢病毒颗粒，病毒经浓缩后用PBS重悬并保存于-80℃。

优选地，上述技术方案中，慢病毒载体转导经过活化的人T淋巴细胞包括以下步骤：

取(1-10)×10⁶个的活化的人T淋巴细胞，加入20-200ul慢病毒浓缩液及转导增强剂，置培养箱中孵育10-90分钟，然后向细胞中补加淋巴细胞培养基至细胞密度为(1-5)×10⁶个/ml，培养基中加入浓度为2-10％的自体血浆、细胞因子复合物以及转导增强剂，置培养箱中继续培养3-24小时，然后更换新鲜培养基，每隔一天进行细胞计数，更换培养基，调整细胞密度为(1-9)×10⁶个/ml，连续培养8-14天。

优选地，上述技术方案中，所述转导增强剂为硫酸鱼精蛋白和DEAE-葡聚糖，优选的，所述硫酸鱼精蛋白的用量为5-50ug/ml，所述DEAE-葡聚糖的用量为0.1-10ul，转导增强剂可显著提高细胞转导效率，但具有细胞毒性，故和细胞共孵育时间不宜过长，所述细胞因子复合物包括重组白细胞介素2和重组白细胞介素15，其中重组白细胞介素2浓度范围为100-1000U/ml，重组白细胞介素15浓度范围均为5-50ng/ml。

本发明还提供了上述携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了一种T淋巴细胞活化方法，该方法采用抗人CD3单抗及人纤连蛋白片段联合包被细胞培养板，并在无血清培养基中添加抗人CD28单抗、自体血浆以及细胞因子复合物等T淋巴细胞活化方法，与美天旎公司生产的Transact CD3CD28T细胞活化磁珠比较，可显著提高T细胞中CD3+CD8+T细胞的比例以及记忆性T细胞的比例，增强CART细胞对靶细胞的杀伤效果，提高CART细胞效能，另外，中央记忆型T细胞(Tcm)具有归巢性，由于其表达CD62L+，在淋巴结更易接受APC*递呈的抗原信息而二次活化；Tcm还具有记忆性，回输到体内可被肿瘤抗原再激活起到直接杀伤肿瘤的作用；Tcm细胞具有自我更新及复制能力，在体内存活时间长，可起到长期抗肿瘤作用；在体外能够高效率扩增保证T细胞的回输数量，因此使用本方法活化及培养的淋巴细胞制备CART后具有更好的治疗效果；

本发明公开了一种采用硫酸鱼精蛋白和DEAE-葡聚糖作为转导增强剂的独特的慢病毒转导方法，硫酸鱼精蛋白为阳离子聚合物，可通过中和细胞表面以及病毒间的负电荷来提高慢病毒的转导效率，DEAE-葡聚糖是一种高分子量的多聚阳离子试剂，可以促使DNA结合到细胞膜上，然后通过内吞作用(endocytosis)进入细胞，使慢病毒对原代T淋巴细胞的转导效率显著增强，尤其对于携带2kb以上大片段的慢病毒的转导效率显著增强，可达到60％以上，甚至超过90％，该技术可节省病毒用量，提高CART细胞中CAR阳性的细胞比例，显著提高CART细胞对靶细胞的杀伤以及临床治疗效果；

本发明公开了一种双特异嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体将抗人CD20scFV和抗人CD19scFV串联起来，采用二代CAR设计，使用CD8a或GMSCF信号肽、CD8或CD28跨膜区和4-1BB或CD28胞内信号区以及CD3ζ胞内信号区，构建了双特异嵌合抗原受体，与CD19或CD20单靶点相比，该双特异嵌合抗原受体可提高CAR的覆盖率，增强治疗效果，有效防止单靶点CART治疗后的肿瘤复发。

附图说明

图1是根据本发明的Transact Beads活化后8天后流式检测淋巴细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞比例以及后者中中央记忆淋巴细胞比例；

图2是根据本发明的抗人CD3单抗+人纤连蛋白片段包被活化8天后流式检测淋巴细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞比例以及后者中中央记忆淋巴细胞比例；

图3是根据本发明的采用DEAE-葡聚糖作为转导增强剂制备的CAR-T细胞中CAR的阳性率，CD3+CD4+细胞中CAR+细胞的比例以及CD3+CD8+中CAR+细胞的比例；

图4是根据本发明的采用硫酸鱼精蛋白作为转导增强剂制备的CAR-T细胞中CAR的阳性率；

图5是根据本发明的采用实施例3中所得CART细胞对Nalm-6，K562，K562-G-CD19和K562-G-CD20细胞的体外杀伤实验的效果图；

图6是根据本发明的采用实施例4中所得CART细胞Nalm-6和K562细胞的体外杀伤实验的效果图；

图7是根据本发明的CD20-CD19双特异嵌合抗原受体的组成示意图；

图8是根据本发明的NSG小鼠白血病模型体内杀伤试验结果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例1：慢病毒表达载体plvx-EF1a-CD20CD19CAR的构建

将构成二代双特异嵌合抗原受体各部分的氨基酸序列进行连接，组成嵌合抗原受体氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示，对所述嵌合抗原受体的核酸序列进行优化，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID No.3所示，引入酶切位点SpeI和BamHI后进行人工全基因合成，克隆到慢病毒载体中得到plvx-EF1a-CD20CD19CAR重组慢病毒表达载体质粒，将重组质粒送生工生物工程公司进行测序，测序结果与拟合成的序列比对证实完全正确。

实施例2：外周血单个核细胞(PBMC)分离培养

在分离PBMC之前，在GMP实验室的生物安全柜中用抗人CD3单抗和人纤连蛋白片段包被6孔板，取浓度为1mg/ml的抗人CD3单抗(OKT-3，Acrobiosystem)30ul以及500ug/ml的人纤连蛋白片段(Novoprotein)600ul，用PBS稀释至6ml，混匀后分别加至各孔中，每孔1ml，用封口膜将板封好后，置于4度冰箱过夜。

在GMP实验室的生物安全柜内用人淋巴细胞分离液Ficollpaque plus(GE)从健康供者的60ml外周血中分离PBMC，用淋巴细胞培养基重悬后置于T150培养瓶中于37度孵育2h，保留未贴壁细胞，计数细胞用无血清淋巴细胞培养基重悬，取一半细胞分装于六孔板各孔中培养，每孔1×10⁷个细胞，培养基中加入10％自体血浆，抗人CD28单抗(终浓度5ug/ml)，300U/ml hIL-2和10ng/ml hIL-15；另一半细胞调整细胞密度为2×10⁶个/ml，分装于24孔板中，每孔1ml，每孔中加入美天旎T cell Transact磁珠20ul，培养基中还加入10％自体血浆，300U/ml hIL-2和10ng/ml hIL-15，将两组细胞置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中继续培养。每隔2-3天补充或更换一次培养基，使细胞密度保持在2×10⁶个/ml。

在培养的第8天，取两组细胞分别检测CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞所占比例，以及CD8+细胞中中央记忆淋巴细胞(CD45RO+CD62L+)所占的比例。总结如下表，流式结果请见请见图1(Transact活化的结果)和图2(CD3+纤连蛋白片段活化的结果)，通过图1可知CD3+CD4+(％)为67.5％，CD3+CD8+(％)为32.8％，CD8+中央记忆淋巴细胞(CD8+CD45RO+CD62L)比例(％)为18.82％，通过图2可知CD3+CD4+(％)为38％，CD3+CD8+(％)为53.1％，CD8+中央记忆淋巴细胞(CD8+CD45RO+CD62L)比例(％)为23.95％，即通过CD3+纤连蛋白片段活化的方法可提高CD3+CD8+T细胞比例，具体数值见表1。

表1 T细胞活化对比结果

实施例3：CART细胞制备

取CD3+Fibronectin(纤连蛋白片段)活化48h的淋巴细胞2×10⁶个，加入病毒液40ul，及DEAE-葡聚糖0.5ul，37℃孵育10min，然后加入AIM-V培养基(即，无血清培养基)(含10％自体血浆，300U/ml hIL-2和10ng/ml hIL-15)400ul，37℃孵育3.5h后换新鲜培养基AIM-V(含10％自体血浆，300U/ml hIL-2和10ng/ml hIL-15)，调节细胞密度为1×10⁶个/ml，然后每2-3天补充或更换一次培养基，使细胞密度保持在(1-3)×10⁶个/ml。

培养第8天，流式检测CAR+阳性率以及CAR在CD4+和CD8+T淋巴细胞中的阳性率，结果总结见表2，流式结果请见图3，通过图3可知CAR+(％)为91.9；CD4+CAR+(％)为48.4％，CD8+CAR+(％)为42.5％。

表2CAR+阳性率以及CAR在CD4+和CD8+T淋巴细胞中的阳性率

活化方式	CAR+(％)	CD4+CAR+(％)	CD8+CAR+(％)
				CD3+Fibronectin包被	91.9	48.4	42.5

实施例4：CART细胞制备

取CD3+Fibronectin活化48h的淋巴细胞2×10⁶个，加入病毒浓缩液40ul，及0.7ul硫酸鱼精蛋白(浓度为1mg/ml)，37℃孵育30min，然后加入AIM-V培养基(含10％自体血浆，300U/ml hIL-2和10ng/ml hIL-15以及6ul硫酸鱼精蛋白)400ul，37℃孵育12h后换新鲜培养基AIM-V(含10％自体血浆，300U/ml hIL-2和10ng/ml hIL-15)，然后每2-3天补充或更换一次培养基，使细胞密度保持在(1-3)×10⁶个/ml。

培养第8天，流式检测CAR+阳性率以及CAR在CD4+和CD8+T淋巴细胞中的阳性率，流式结果请见图4，通过图4可知，采用硫酸鱼精蛋白作为转导增强剂制备的CAR-T细胞中CAR的阳性率为66.4％。

实施例5：体外杀伤实验

使用Promega公司的CytoTox

Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒进行体外细胞毒性检测，取实施例3中培养8-14天的CAR-T细胞，PBS清洗一次后，用无血清淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×10⁶个/ml、6×10⁵个/ml、2×10⁵个/ml，取带有luciferase标记的Nalm6细胞、K562细胞以及分别表达人CD19和CD20蛋白的K562-CD19和K562-CD20细胞作为靶细胞，其中K562细胞因为其表面不表达CD19和CD20抗原，作为阴性对照，用含5％胎牛血清的无酚红1640培养基调整靶细胞密度为2×10⁵个/ml，使用Promega公司的按照效靶比10、3、1分别将CART细胞与靶细胞混合，每孔靶细胞数为1×10⁴个，体积为50ul。具体操作步骤如下：

其中，实验96孔板的设置如下：

1.使用圆底96孔板用于效应细胞和靶细胞共同孵育；

2.板的设置应包括效应细胞自发释放对照、靶细胞自发释放对照、培养基空白对照、添加细胞裂解液的培养基空白对照。每个对照组设4个复孔；

3.向每个实验孔中加入固定量的靶细胞和不同比例的效应细胞；

4.向靶细胞自发LDH释放对照孔中加入50ul靶细胞；

5.向靶细胞最大释放孔中加入50ul靶细胞；

6.向效应细胞自发LDH释放对照孔中加入50ul不同浓度的效应细胞；

7.向各实验孔中分别加入50ul靶细胞和50ul不同浓度的效应细胞；

8.向培养基孔板对照孔中加入两种培养基各50ul；

9.向体积校正对照孔中加入培养基各50ul以及10ul裂解液(10X)；

10.将96孔板250×g离心4分钟；

11.将96孔板置于细胞培养箱中37℃孵育4小时；

12.孵育结束前45分钟，向靶细胞最大释放孔中加入10ul细胞裂解液(10X)。将96孔板置于细胞培养箱中37℃孵育4小时。

测量LDH值

1.孵育结束后将96孔板250g离心4分钟；

2.取50ul上清转移到一块新的平底96孔板中；

3.用检测缓冲液配制底物溶液，每孔加入50ul底物液；

4.盖盖后室温避光30分钟；

5.每孔加入50ul终止液；

6.于490nm波长读取吸光度。

计算结果

1.计算校正后的吸光度值；

2.用下列公式计算每个效靶比的细胞毒性百分比

实验结果总结请见图5，图5中，每个实施例左边的柱状代表CART细胞的杀伤效果，每个实施例右边的柱状代表未转导病毒的淋巴细胞的杀伤效果，具体数值见表3：

表3实施例3所得CART细胞对Nalm-6，K562，K562-G-CD19和K562-G-CD20细胞的体外杀伤效果

实施例6：体外杀伤实验

使用Promega公司的CytoTox

Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒进行体外细胞毒性检测，取实施例4中培养8-14天的CAR-T细胞，PBS清洗一次后，用无血清淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×10⁶个/ml、6×10⁵个/ml、2×10⁵个/ml。取带有luciferase标记的Nalm6细胞和K562细胞作为靶细胞，其中K562细胞因为其表面不表达CD19和CD20抗原，作为阴性对照。用含5％胎牛血清的无酚红1640培养基调整靶细胞密度为2×10⁵个/ml。使用Promega公司的按照效靶比10、3、1分别将CART细胞与靶细胞混合，每孔靶细胞数为1×10⁴个，体积为50ul，具体操作步骤及结果计算方法同实施例5，实验结果如表4，总结请见图6，图6中每个实施例左边的柱状代表CART细胞的杀伤效果，每个实施例右边的柱状代表未转导病毒的淋巴细胞的杀伤效果。

表4实施例4中所得CART细胞Nalm-6和K562细胞的体外杀伤效果

实施例7：NSG小鼠白血病模型验证CART细胞体内杀伤效果

向5-8W龄NSG小鼠尾静脉注射2.5×10⁵个荧光素酶标记的Nalm6细胞，记为D1，D3天尾静脉注射4×10⁶个CART细胞、未转病毒的对照T细胞或PBS，D17和D23天分别进行小动物成像，每只小鼠注射luciferin底物200ul。注射底物后3min开始麻醉，注射底物后20min开始成像，曝光时间0.5S，试验结果如下表，见图8，其中T细胞对照组有2只小鼠分别于D21、D22天死亡，PBS对照组有1只小鼠于D23天死亡，CART组小鼠在D23天时仍状态良好，通过图8可知，左侧3只NSG小鼠为注射PBS组，中间2只小鼠为注射对照T细胞组，右侧2只小鼠为注射实施例4制备的CART细胞组。注射Nalm6肿瘤细胞后D17天和D23天分别成像，可见对照组有很强的生物发光信号，而CART组几乎检测不到信号，对照组小鼠逐渐死亡，至D23天时仅PBS对照组有一只小鼠存活，CART组2只小鼠在D23天时仍几乎检测不到生物发光信号，在D53天仍存活。

表5 NSG小鼠白血病模型体内杀伤试验结果

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 北京多赢时代转化医学研究院

<120> 携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞及制备方法和应用

<130> P180141DD1F

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(SEQ ID NO.1)

<400> 1

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 2

<211> 760

<212> PRT

<213> 人工序列(SEQ ID NO.2)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro

50 55 60

Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

100 105 110

Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

165 170 175

Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys

195 200 205

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

210 215 220

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val

245 250 255

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly

275 280 285

Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val

290 295 300

Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro

305 310 315 320

Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr

325 330 335

Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp

340 345 350

Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp

355 360 365

Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser

370 375 380

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

385 390 395 400

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

405 410 415

Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

420 425 430

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser

435 440 445

Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

450 455 460

Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

465 470 475 480

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu

485 490 495

Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

500 505 510

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe

515 520 525

Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro

530 535 540

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

545 550 555 560

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

565 570 575

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

580 585 590

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg

595 600 605

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

610 615 620

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

625 630 635 640

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

645 650 655

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

660 665 670

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

675 680 685

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

690 695 700

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

705 710 715 720

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

725 730 735

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

740 745 750

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

755 760

<210> 3

<211> 2280

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO.3)

<400> 3

atggccctcc ctgtgaccgc tctgctgctg cctctggccc tcctgctgca cgctgctagg 60

cctgacattg tgctgaccca atctccagct atcctgtctg catctccagg ggagaaggtc 120

acaatgactt gcagggccag ctcaagtgta aattacatgg actggtacca gaagaagcca 180

ggatcctccc ccaaaccctg gatttatgcc acatccaacc tggcttctgg agtccctgct 240

cgcttcagtg gcagtgggtc tgggacctct tactctctca caatcagcag agtggaggct 300

gaagatgctg ccacttatta ctgccagcag tggagtttta atccacccac gttcggaggg 360

gggaccaagc tggaaataaa aggcagtact agcggtggtg gctccggggg cggttccggt 420

gggggcggca gcagcgaggt gcagctgcag cagtctgggg ctgagctggt gaagcctggg 480

gcctcagtga agatgtcctg caaggcttct ggctacacat ttaccagtta caatatgcac 540

tgggtaaagc agacacctgg acagggcctg gaatggattg gagctattta tccaggaaat 600

ggtgatactt cctacaatca gaagttcaaa ggcaaggcca cattgactgc agacaaatcc 660

tccagcacag cctacatgca gctcagcagc ctgacatctg aggactctgc ggactattac 720

tgtgcaagat ctaattatta cggtagtagc tactggttct tcgatgtctg gggcgcaggg 780

accacggtca cagtaagtag cggtggtggc tccgggggcg gttccggtgg gggcggcagc 840

gaggtgaagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtggccc ccagccagag cctgagcgtg 900

acctgcaccg tgagcggcgt gagcctgccc gactacggcg tgagctggat ccggcagccc 960

cccaggaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggggca gcgagaccac ctactacaac 1020

agcgccctga agagccggct gaccatcatc aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcctg 1080

aagatgaaca gcctgcagac cgacgacacc gccatctact actgcgccaa gcactactac 1140

tacggcggca gctacgccat ggactactgg ggccagggca ccagcgtgac cgtgagcagc 1200

ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa gggcgacatc 1260

cagatgaccc agaccacctc cagcctgagc gccagcctgg gcgaccgggt gaccatcagc 1320

tgccgggcca gccaggacat cagcaagtac ctgaactggt atcagcagaa gcccgacggc 1380

accgtcaagc tgctgatcta ccacaccagc cggctgcaca gcggcgtgcc cagccggttt 1440

agcggcagcg gctccggcac cgactacagc ctgaccatct ccaacctgga acaggaagat 1500

atcgccacct acttttgcca gcagggcaac acactgccct acacctttgg cggcggagcc 1560

ctgagcaatt ccatcatgta cttcagccac ttcgtgcccg tgtttctgcc tgccaaaccc 1620

accacaaccc ccgctcctag accccctaca cccgctccca ccattgccag ccaacctctg 1680

tccctgagac ccgaagctag caggcctgct gctggaggag ccgtgcacac caggggcctg 1740

gacttcgctt gcgacattta catctgggcc cccctggccg gcacatgcgg agtcctgctg 1800

ctgagcctgg tgatcacaaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1860

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1920

gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc 1980

taccagcagg gccagaatca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagaag ggaagagtac 2040

gacgtcctgg ataagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc tcggcggaag 2100

aacccccagg aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 2160

gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgg ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc 2220

ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gcccccaagg 2280

Claims

1.一种携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取活化的人T淋巴细胞；

(3)将所述慢病毒颗粒转导经过活化的人T淋巴细胞，即得；

其中，所述CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体是将抗人CD20抗体和抗人CD19抗体串联起来的；所述CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体包括信号肽、抗人CD20单链抗体、间隔区、抗人CD19单链抗体，铰链区，跨膜区和胞内信号区；

信号肽选用CD8a信号肽或GMCSF信号肽，间隔区选用(GGGS)1-n或(EAAK)1-n或SEQ IDNo.1序列，铰链区选用IgG4铰链或CD8铰链，跨膜区选用CD8跨膜区或CD28跨膜区，胞内信号区选用CD28或4-1BB共刺激分子的胞内信号区及CD3ζ胞内区；

获取活化的人T淋巴细胞包括以下步骤：

(1)从患者体内分离外周血单个核细胞；

(4)取培养24-60h的外周血单个核细胞，1000rpm离心5min，弃去上清液，即得活化的T淋巴细胞；

所述6孔板包被了抗人CD3单抗和人纤连蛋白片段，包被步骤如下：将25-35μl的抗人CD3单抗与550-650μl的人纤连蛋白片段混合，进而用PBS稀释至6ml，混匀后加至各孔，每孔1ml，置于4℃冰箱中过夜或37℃孵育2小时，其中，所述抗人CD3单抗的浓度为0.5-1.5mg/ml，人纤连蛋白片段的浓度为450-550μg/ml；

携带有CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体基因序列的慢病毒载体的构建方法包括以下步骤：采用全基因合成的方法合成可与肿瘤表面抗原特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列，如SEQ ID No.3所示，将该嵌合抗原受体的基因序列亚克隆到慢病毒表达载体中，经测序验证序列无误后，得到携带CAR序列的重组慢病毒载体，所述慢病毒载体为pLVX-EF1a-MCS或pSin-EF2-MCS-IRES-Puro；

慢病毒颗粒转导经过活化的人T淋巴细胞包括以下步骤：

取(1-10)×10⁶个活化的人T淋巴细胞，加入20-200ul慢病毒浓缩液及转导增强剂，置培养箱中孵育10-90分钟，然后向细胞中补加淋巴细胞培养基至细胞密度为(1-5)×10⁶个/ml，培养基中加入浓度为2-10％的自体血浆、细胞因子复合物以及转导增强剂，置培养箱中继续培养3-24小时，然后更换新鲜培养基，每隔一天进行细胞计数，更换培养基，调整细胞密度为(1-9)×10⁶个/ml，连续培养8-14天；

所述转导增强剂为硫酸鱼精蛋白和DEAE-葡聚糖，所述硫酸鱼精蛋白的用量为5-50ug/ml，所述DEAE-葡聚糖的用量为0.1-10ul。

2.权利要求1所述的携带CD20/CD19双特异性嵌合抗原受体的人T淋巴细胞的制备方法在制备抗肿瘤药物中的应用。