CN108300693A - 一种自然杀伤细胞体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自然杀伤细胞体外扩增方法，通过构建表达CD86和4‑1BBL的慢病毒载体，将其感染K562细胞，从而构建新型人工抗原递呈细胞CD86‑4‑1BBL‑aAPC，在细胞膜表面稳定表达CD86和4‑1BBL，以此作为扩增NK的饲养细胞。本发明显著减少细胞因子的加入，能够刺激NK细胞增殖上千倍，并且增强其杀伤肿瘤细胞的毒性作用，为肿瘤或慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种自然杀伤细胞体外扩增方法。
背景技术
肿瘤是机体在各种理化因素、生物因素刺激下导致的细胞克隆性增生而形成的异常病变。肿瘤发展到一定程度，会经淋巴管道、血管等途径，从原位转移至整个机体，形成恶性肿瘤。目前，除了部分良性肿瘤的治疗以手术切除为主之外，治疗肿瘤的手段主要是放射疗法和化学药物疗法，然而放、化疗对肿瘤细胞选择性不强，在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体正常的细胞也造成一定的损伤，很多化疗药还会影响心血管系统，甚至抑制骨髓造血功能。在此背景下，肿瘤生物治疗应运而生，成为第四大肿瘤治疗技术。肿瘤生物治疗除细胞因子治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体治疗等众多方法之外，淋巴细胞过继免疫疗法的效果和应用的前景尤其美好。
NK 细胞是机体天然免疫的主要效应细胞，也是获得性免疫的核心调节细胞，故其杀伤靶细胞不受MHC限制，通过使用穿孔素和颗粒酶以及其它机制，能够快速杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；在杀伤肿瘤细胞过程中，NK细胞无须预先致敏，是一种广谱的、安全的抗肿瘤细胞。越来越多的研究报道了过继性转移自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞能诱导更有效的抗肿瘤、抗感染免疫反应。但是NK细胞在外周血中比例小（5%～10%），体外扩增难，扩增后细胞毒活性弱，都是限制其应用于临床免疫治疗的瓶颈。
抗原呈递细胞（APC）是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给T、B淋巴细胞的一类免疫细胞。专职APC必须表达MHC-Ⅱ类分子、协同刺激信号分子和各种粘附分子，但因大量制备的技术困难等原因限制了其临床应用。人工抗原递呈细胞（aAPC）是新兴起的一种免疫治疗新策略，是在一定的载体表面展现pMHC及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体等，模拟天然抗原递呈细胞。目前常规使用 IL-2、IL-15 和 IL-18等对NK细胞进行体外扩增和激活。在体外培养过程中，NK细胞的增殖时间过长，容易导致细胞衰竭及细胞功能的丧失。另外，大量细胞因子的加入增加了回输风险和生产成本。通过aAPC，能够显著减少细胞因子的加入，与此同时，众多研究小组己经从不同侧面证实了aAPC是在体外有效扩增抗原特异性T细胞、NK细胞的强有力工具，增强并保持其杀伤肿瘤细胞的毒性作用，具有简化操作流程、重复性好、成本低的优点，为肿瘤或慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗提供了新方法，并已应用于临床，产生令人鼓舞的应用前景。
CD28/CD86和4-1BB/4-1BBL是关键的共刺激信号，广泛参与多种免疫细胞的激活。在哺乳类动物受到病毒感染或者肿瘤侵袭的时候，NK 细胞会非常迅速地产生反应。NK细胞的活化是由激活性受体和抑制性受体之间的平衡所决定的，如果激活信号占主导地位NK细胞就会被活化，反过来如果抑制信号占主导那么NK细胞将受到抑制。B7是表达在抗原提呈细胞（antigen-present cell，APC）表面的重要共刺激分子，主要包括B7-1（又称 CD80）和B7-2（又称CD86）两个分子。CD86的编码基因为1120bp，由306个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。CD86 分子在NK 细胞表面起到了类似激活性受体的作用。 4-1BBL分子又名CD137L，是4-1BB（CD137）的配体，为Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，属于肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor，TNF）超家族成员。4-1BB/4-1BBL是除CD28/B7之外的另一对关键的共刺激信号，广泛参与多种免疫细胞的激活。活化的NK细胞表达TNF家族成员的配体，包括TNF，TL-α，LT-β，FasL，CD27L，CD30L，CD40L，4-1BBL和TRAIL。活化的NK细胞不仅可以通过穿孔素蛋白和颗粒酶杀死肿瘤靶细胞，还可通过TNF家族配体诱导表面表达相应受体的肿瘤靶细胞凋亡从而杀伤肿瘤细胞。另外，研究表明，在人的抗肿瘤过程中，4-1BB是NK细胞激活性受体，4-1BB和4-1BBL刺激NK细胞增殖和分泌 INF-γ，提高NK细胞的杀伤活性，在NK细胞介导免疫应答过程中起十分重要的调控作用。
迄今为止多数的体外刺激扩增培养也只能使NK细胞在体外扩增数十到百倍，且纯度也不理想。
发明内容
本研究提供了一种扩增效率高、纯度高和细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应的自然杀伤（NK）细胞体外扩增方法。
本发明采用如下技术方案：
一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其包括如下步骤：
（1）CD86和4-1BBL慢病毒过表达载体的构建；
（2）表达CD86和4-1BBL的慢病毒载体的包装；
（3）双表达CD86和4-1BBL的人工抗原提呈细胞的制备；
（4）NK细胞的刺激培养。
进一步的，所述步骤（1）包括如下步骤：
（a）获取4-1BBL基因片段；
自阳性质粒pORF-h4-1bbl中PCR扩增4-1BBL片段，上游引物如SEQID No.1所示，下游引物如SEQID No.2所示；
PCR扩增体系为：pORF-h4-1bbl质粒 1μl、dd H2O 7.5μl、10×PCR buffer 2.5 μl、上游引物SEQID No.1 1μl、下游引物SEQID No.2 1μl、Taq酶 3μl、Mg2+ 2.5μl、10mM dNTP 2μl；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；（4℃变性50s、55℃退火50s，70℃延伸90s），34个循环；70℃延伸10min；16℃ forever；
（b）获取CD86基因片段；
自阳性质粒pORF-h4-CD86中PCR扩增CD86片段，上游引物如SEQID No.3所示，下游引物如SEQID No.4所示；
PCR扩增体系为：pORF-h4-CD86质粒 1μl、dd H2O 9.5μl、10×PCR buffer 2.5 μl、上游引物SEQID No.3 1μl、下游引物SEQID No.4 1μl、Taq酶 3μl、Mg2+ 2.5μl、10mM dNTP 2μl；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；（94℃变性30s、55℃退火50s，72℃延伸1min），34个循环；72℃延伸20min；16℃ forever；
（c）PCR产物纯化；
（d）将PCR产物CD86、4-1BBL及载体PHBLV-CMVIE-IRES-Puro 、PHBLV-CMVIE-IRES-Neo用Xba I和BamH I酶切及回收；
（e）将步骤（d）处理好的CD86与PHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接，将步骤（d）处理好的4-1BBL基因片段与PHBLV-CMVIE-IRES-Neo 载体连接；得到pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体；
（f）pLV-Puro-hCD86和pLV-Neo-hTNFSF9载体的转化；
（g）转化后的 pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体平板挑菌鉴定。
进一步的，所述步骤（c）包括如下步骤：
经步骤（a）和（b）获得的PCR 产物以1％琼脂糖电泳，恒压 50V，电泳1h后在紫外灯下用干净的刀片割下含目的基因片段的琼脂糖块，放入 1.5ml Eppendorf 管中，用电子天平称重；用Gel Extraction Kit 进行纯化。
所述纯化步骤为：称重后加入3倍凝胶体积的溶液 QG，50ºC 水浴 10min，待凝胶充分溶解后加入1倍凝胶体积的异丙醇，混匀后将液体转入 QIAquick spin column 中，13000rpm 离心 1min，弃废液，加 Buffer QG 500μl，13000rpm 离心 1min，弃废液，加 750μl Buffer PE，离心1min，弃废液，再以13000rpm，离心1min，将 QIAquick spin column放在Eppendorf管中，加 30μl Buffer EB，室温放置 5min 后，13000rpm 离心 1min，收集离心液，贮于-20ºC 备用。
进一步的，所述步骤（d）为：
酶切载体：配置40μl 酶切体系，在37ºC条件下反应2小时， 酶切体系为：400ng/μl载体2μl、Xba I 2μl、BamH I 2μl、10ｘbuffer 4μl、H2O 31μl；反应完成后使用DNA回收试剂盒进行酶切片段胶回收；
酶切 PCR 片段 ：配置50μl 酶切体系，在37ºC条件下反应1小时， 酶切体系为：100ng/μl PCR产物 5μl、10 U/µl Xba I 1μl、10 U/µl BamH I 1μl、10ｘbuffer 5μl、100×BSA0.5 µl 、H2O 40.5μl。
进一步的，所述步骤（e）中，反应体积为20μl，并在16ºC下过夜保存，反应体系为：酶切后 hCD86或4-1BBL片段2μl、酶切后PHBLV-CMVIE-IRES-Puro或Neo载体 150ng、ligasebuffer 2μl、T4 ligase 1μl、H2O定容至20 μl。
进一步的，所述步骤（f）为：取100 μl处于感受态的E.coli DH5α，加入5μl 载体，所述载体为pLV-Puro-hCD86或pLV-Neo-hTNFSF9，冰浴30min后立即42℃热激100s，随后放回冰上冰浴2min；加入400 μl LB培养基，放在37℃摇床振荡培养60min；取100μl 涂在含有氨苄青霉素的固体 LB培养基上，37℃ 培养过夜。
进一步的，所述步骤（2）包括如下步骤：
1）质粒扩增：将pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9重组质粒及辅助质粒pSPAX2、pMD2G进行抽提；
2）转染293T细胞：将培养293T细胞瓶中的培养基吸净，5min 后取出 ，将细胞全部从瓶底晃下，加入3ml 37℃水浴中预热的10%DMEM，用移液管进行充分吹打；随后将所有细胞吸出，移至15ml离心管中，取50μl混匀后的细胞于1.5ml离心管中，加入450 μl 10%DMEM后混匀，取10μl 细胞于计数板中计数；
3）做脂转复合物：Opti MEM在37℃水浴中预热后使用，将LipofiterTM转染试剂恢复室温后摇匀；转染体系如下： pSPAX2 10μg 、pMD2G 10μg 、pLV-Puro-hCD86或pLV-Neo-hTNFSF9载体 10μg；转染后6h换新鲜培养液；
4）病毒收集：经步骤3）转染后 48h 和72h分别两次收集病毒上清，收集后使用 0.45μm滤器进行过滤置于40ml 离心管中，4℃下 72000g/min离心120 min。
进一步的，所述步骤（3）为：用步骤4）收集的病毒感染K562细胞；感染前一天以1×105/ml 的密度接种 K562细胞于6 孔板中，1ml/孔，放入培养箱中继续培养 12h；加入5×105 pfu/ml病毒上清、终浓度为8μg/ml的polybrene及培养液至 2ml，放入培养箱中继续培养24h 后换液，继续培养至第三天，于荧光显微镜下观察绿色荧光，流式细胞仪检测感染率；所述K562细胞应用前，用γ射线灭活；所述病毒感染后的K562细胞使用新霉素、嘌呤霉素进行抗性筛选，得到双表达CD86和4-1BBL的K562细胞。
进一步的，所述步骤（4）包括如下步骤：
I）将50ml成人外周血放置离心管中，800g/min、15min离心后小心吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；管底血细胞用生理盐水稀释后加到装有Ficoll溶液的离心管，800g/min，快升慢降离心15min，收集白膜层细胞，并用生理盐水洗涤2次，计数备用；
II）用20mL GT-T551培养基将（2~3）×107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，按照1:2的比例加入aAPC，然后加入IL-15及自体血浆，所述IL-15为1000U/ml，血浆浓度为5%；37℃、5% CO2条件下体外共培养，21d后收获细胞并用流式细胞术进行细胞分类分析。
进一步的，所述步骤II）的培养过程中每天对NK细胞计数，当NK细胞密度大于3×106/ml时补充培养基，密度维持在1×106/ml，补充的培养基为含有1000U/ml IL-15、5%自体血浆的GT-T551培养基。
本发明的有益效果在于：本发明克服了NK细胞在PBMC中所占比例很少（5%～10%），目前常规使用 IL-2、IL-15 和 IL-18等对NK细胞进行体外扩增和激活，分离获得的NK细胞处于非活化状态，而且多数的体外刺激扩增培养也只能使NK细胞在体外扩增数十到百倍，且纯度也不理想等问题。将NK细胞活化因子CD86、4-1BBL转染K562细胞，制备成人工抗原提呈细胞，与PBMC共培养，显著减少细胞因子的加入，并且能够刺激NK细胞增殖上千倍，增强并保持其杀伤肿瘤细胞的毒性作用，为肿瘤或慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗提供了新方法。
附图说明
图1流式细胞术分析K562细胞感染率结果示意图。
图1中，A：空载体对照组；B：venus-CD86组；C：venus-4-1BBL组；D：venus-CD86-4-1BBL组。
图2为流式细胞术检测NK细胞纯度结果示意图。
图2中，A：d0天PBMCs；B：对照组；C：CD86 组；D：4-1BBL组；E：CD86-4-1BBL组。
图3为扩增的NK细胞杀伤率的比较示意图。
图4为NK细胞治疗后小鼠肿瘤体积变化示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
实施例1 目的基因片段的获取
1.1 4-1BBL基因片段的获取
自阳性质粒pORF-h4-1bbl中PCR扩增4-1BBL片段，引物序列为：
上游引物（SEQID No.1）：5’-tgctctagaatggaatacgcctctg-3’
下游引物（SEQID No.2）：5’-cgcggatccttattccgacctcg -3’
上游引物和下游引物中，下划线为酶切位点。
PCR 扩增体系：
pORF-h4-1bbl 质粒 1 μl
dd H2O 7.5 μl
10×PCR buffer 2.5 μl
上游引物 1 μl
下游引物 1 μl
Taq 酶 3 μl
Mg2+ 2.5 μl
d NTP(mix) （10 毫摩尔）2 μl。
PCR 扩增程序：
。
基因片段的获取
自阳性质粒pORF-h CD86中PCR扩增CD86片段，引物序列为：
上游引物（SEQID No.3）：5’- tgctctagaatggatccccagtgcactatggga-3’
下游引物（SEQID No.4）：5’- cgcggatccttaaaaacatgtatcacttttg-3’
上游引物和下游引物中，下划线为酶切位点。
PCR扩增体系：
p ORF-h4-CD86 质粒 1 μl
dd H2O 9.5 μl
10×PCR buffer 2.5 μl
上游引物 1 μl
下游引物 1 μl
Taq 酶 3 μl
Mg2+ 2.5 μl
d NTP(mix) （10 毫摩尔）2 μl 。
PCR 扩增程序：
。
产物的纯化
PCR 产物以1%琼脂糖电泳，恒压50V，电泳1h后在紫外灯下快速用干净的刀片割下含目的基因片段的琼脂糖块，放入1.5ml Eppendorf 管中，用电子天平称重。
用Qiagen 公司的 Gel Extraction Kit 进行纯化。纯化步骤如下：称重后加入3倍凝胶体积的溶液 QG，50ºC 水浴 10min，待凝胶充分溶解后加入 1 倍凝胶体积的异丙醇，混匀后将液体转入 QIAquick spin column 中，13000rpm 离心 1min，弃废液，加Buffer QG 500μl，13000rpm 离心 1min，弃废液，加 750μl Buffer PE，离心1min，弃废液，再以13000rpm，离心1min，将 QIAquick spin column放在 Eppendorf管中，加 30μlBuffer EB ，室温放置 5min 后，13000rpm 离心 1min，收集离心液，贮于-20ºC 备用。
实施例2 pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体构建
2.1 将PCR产物CD86、4-1BBL及载体PHBLV-CMVIE-IRES-Puro 、PHBLV-CMVIE-IRES-Neo用Xba I和BamH I酶切及回收
酶切载体：配置40μl 酶切体系，在37ºC条件下反应2小时， 酶切体系如下：
载体 （400ng/μl） 2μl
Xba I 2μl
BamH I 2μl
10 ｘbuffer 4μl
H2O 31μl
酶切PCR片段：配置50μl 酶切体系，在37ºC条件下反应1小时， 酶切体系如下：
PCR 产物（100ng/µl） 5 µl
10×buffer 5 µl
100×BSA 0.5 µl
Xba I （10 U/µl） 1 µl
BamH I （10 U/µl） 1 µl
H2O 40.5 µl
反应完成后按照DNA回收试剂盒说明书进行酶切片段胶回收。
2.2 pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体构建
将处理好的 hCD86、4-1BBL片段分别与PHBLV-CMVIE-IRES-Puro、PHBLV-CMVIE-IRES-Neo 载体进行连接。反应体积为20μl，并在16ºC 下过夜保存，反应体系如下：
试剂 体积
酶切后 CD86 或4-1BBL片段 2μl
酶切后 PHBLV-CMVIE-IRES-Puro或Neo 载体 150ng
ligase buffer 2μl
T4 ligase 1μl
H2O 定容至20μl。
2.3 pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体的转化
取100 μl 处于感受态的E.coli DH5α，加入5μl 载体（pLV-Puro-hCD86或pLV-Neo-hTNFSF9），冰浴30min后立即42℃热激100s，随后放回冰上冰浴2min。加入400 μl LB培养基，放在37℃摇床振荡培养 60min； 取 100μl 涂在含有氨苄青霉素的固体 LB培养基上，37℃ 培养过夜。
2.4 转化后的 CD86、4-1BBL平板挑菌
37℃条件下，250r/min 摇菌 14h，利用菌液进行PCR 鉴定，将结果为阳性的克隆菌液送赛业（苏州）生物科技有限公司测序。
实施例3 包含pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体的慢病毒包装
3.1 质粒扩増
将pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9重组质粒及辅助质粒pSPAX2，pMD2G进行大量抽提， 抽提步骤按照天根公司质粒大量提取纯化试剂含说明书进行操作。
3.2 转染 293T细胞
将培养293T细胞瓶中的培养基吸净， 加入2ml 4℃ 冰箱保存的浓度0.25％ 胰酶，均匀覆盖于瓶底，在37℃培养箱中5min 后取出，将细胞全部从瓶底晃下，加入3ml 37℃ 水浴中预热的10%DMEM，用移液管进行充分吹打。随后将所有细胞吸出，移至15ml离心管中，取50μl 混匀后的细胞于1.5ml离心管中，加入450 μl 10%DMEM后混匀，取10μl 细胞于计数板中计数。计数板上共4大格， 每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为细胞实际浓度。
3.3 做脂转复合物
Opti MEM在37℃水浴中预热后使用，将LipofiterTM转染试剂恢复室温后摇匀。 转染体系如下：
pSPAX2 10μg
pMD2G 10μg
pLV-Puro-hCD86/pLV-Neo-hTNFSF9载体 10μg
转染后6h换新鲜培养液。
3.4 病毒收集
转染后48和 72h 分别两次收集病毒上清（24h 收集后更换培养液），收集后使用 0.45μm滤器进行过滤置于40ml 离心管中，4℃下 72000g/min离心120 min。
3.5 病毒滴度测定
取生长良好的 293T细胞消化计数， 稀释到 1ｘ105/ml， 置入96 孔板， 100μl/孔， 每个病毒准备6个孔。 置于37℃， 5%CO2 培养箱中进行培养。
24h后在EP管中做3倍的梯度稀释，保证6个稀释度。 稀释方法如下：
1） 准备6个 1.5 ml的 EP管， 第一管中加入105μl的培养液及15 μl 的病毒原液；
2）充分混匀后从第一管中吸取40 μl 加入第二管中（80μl 的培养液）；
3）充分混匀后从第二管中吸取40 μl 加入第H管中（80μl的培养液）；
4）做6个稀释度（10-3.3ｘ10-2），稀释完毕将每管液体置入相对应的96孔中 。
24 小时后，将培养液更换为含有2.5 μg/ml的嘌呤霉素的培养液。
第五天，于显微镜下观察结果，用活细胞10-30％的孔计算病毒滴度。
滴度（YU/ml）＝细胞数x百分比ｘMOI（l）ｘ病毒稀择倍数ｘ103 。
实施例4 表达CD86-4-1BBL的人工抗原提呈细胞的制备
4.1 新霉素、嘌呤霉素最佳筛选浓度的确定
转染前确定 K562 细胞对新霉素、嘌呤霉素耐受的最佳浓度，具体过程如下：
1） 用无血清的1640 培养基将 K562 细胞浓度调整为1×105/ml，于 96 孔板中，按每孔 100μL 加入细胞悬浮液，培养 6h；
2）配制含新霉素浓度分别为 400ng/ml，600ng/ml， 200μg/ml，400μg/ml，600μg/ml 5个梯度的 1640 培养基，对照孔为不含抗生素的 1640 培养基；
配制含嘌呤霉素浓度分别为 0.2μg/m L，0.5μg/m L，1μg/m L，2μg/m L，3μg/m L，5 个梯度的 1640 培养基，对照孔为不含抗生素的 1640 培养基；
3）吸弃 96 孔板中培养基（K562 细胞比重大，在 96 孔板底部）；
4）分别加入含有不同浓度新霉素、嘌呤霉素 的含 10％胎牛血清的 1640 培养基；
5）观察培养基颜色以及细胞生长状况，每 1~2 天更换一次抗性培养基；
6）14 天后，确定杀死全部 K562 细胞的最小新霉素或嘌呤霉素浓度，定为新霉素或嘌呤霉素筛选转染后的 K562 细胞的最佳浓度。
4.2 表达CD86-4-1BBL的人工抗原提呈细胞的制备
K562 细胞分组：根据感染病毒的不同，将细胞分为 5组：空白对照组（未感染任何病毒）、LV空载组（感染空载体慢病毒）、LV-CD86组（感染慢病毒，过表达 CD86）、LV-4-1BBL组（感染慢病毒，过表达4-1BBL）、LV-CD86-4-1BBL（感染慢病毒，过表达 CD86和4-1BBL）。
1）用无血清的 1640 培养液调整 K562 细胞浓度至 1×106/ml，于 6 孔板中每孔加入 0.2ml 细胞悬液。取对数生长的 K562 细胞加入 6孔细胞培养板中（2 × 105/孔）；
2）加人浓缩的慢病毒颗粒，并加入聚凝胺至终浓度为8 μg / ml ，以促进病毒吸附；
3）30 ℃ 、2000 × rpm 离心30 min；
4）37℃，5％CO2培养箱内，孵育 12h；
5）加入4ml完全培养基，继续培养 48h；
6）待细胞状态良好，可以传代时，将转染孔扩大到四个孔中，并加入最佳浓度的新霉素进行抗性筛选。感染2天后开始用嘌呤霉素1μg/ml，2天，之后G418 600ng/ml 5天，继续培养72 h后用流式细胞仪检测感染率；
7）观察细胞状态，每 2～3 天进行半换液，补充新霉素、嘌呤霉素。经过 14 天筛选后，存活的细胞即为转染成功的新霉素和嘌呤霉素抗性的 K562 细胞。
4.3 流式细胞术鉴定抗性细胞目的蛋白表达率
以未转染的 K562 细胞为对照组，对表达CD86-4-1BBL 的 K562 细胞进行流式细胞术测定表达率。
1）收集细胞，调整细胞浓度为 1×106/ml；
2）取 1ml 细胞悬液，2000rpm，离心 5min；
3）弃上清，用 100μL PBS 重悬细胞沉淀；
4）加入 5μL PE-4-1BBL 抗体、5μL FITC-CD86抗体，轻柔混匀，室温下避光放置30min；
5）1000rpm，离心 5min，弃上清。加入 500μL PBS 洗涤细胞两次；
6）弃上清，加入 500μL PBS 重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测。
4.4 有限稀释法克隆 K562-4-1BBL 细胞
1）取对数生长期的细胞，制备细胞悬液，反复轻柔吹打，细胞计数后，将细胞稀释成1个/100μL；
2）将稀释好的细胞悬液接种到 96 孔板中，每孔 100μL，倒置显微镜下观察，标记只含有单细胞的孔。37℃，5％CO2培养箱内培养；
3）待单细胞长成较大克隆，转移至 6 孔板继续扩大培养。
实施例5 NK细胞的刺激培养
K562细胞应用前，用γ射线灭活。
将50mL成人外周血放置离心管中，800g/min、15min离心后小心吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；管底血细胞用生理盐水稀释后加到装有Ficoll溶液的离心管，800g/min，快升慢降离心15min，收集白膜层细胞，并用生理盐水洗涤2次，计数备用。
用20mL GT-T551培养基将（2~3）×107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，按照1:2的比例加入aAPC，然后加入IL-15及自体血浆，其中IL-15为1000U/ml，血浆浓度为5%。37℃、5%CO2条件下体外共培养,21d后收获细胞并用流式细胞术进行细胞分类分析。培养过程中每天对NK细胞计数，当NK细胞密度大于3×106/ml时补充培养基，密度维持在1×106/ml，补充的培养基为含有1000U/ml IL-15、5%自体血浆的GT-T551培养基。同时设以下平行对照组：转染空载体的K562细胞刺激组、转染CD86的K562细胞刺激组、转染4-1BBL的K562细胞刺激组。
效果例1 K562细胞的感染率
分别用空载体慢病毒和重组载体病毒上清感染K562细胞，以未感染慢病毒的K562细胞作为对照，用流式细胞分析仪检测GFP+细胞百分率判断感染效率。结果表明，慢病毒感染K562细胞的感染率均达90%以上，如图1所示。
效果例2 NK细胞数量及纯度检测
分别在培养第5、7、9、11、13、15天时取20μl细胞于细胞计数仪进行计数。利用流式细胞术，用CD3、CD56抗体分别对扩增前的PBMC以及扩增培养21d后的细胞进行评估。
如表1所示，d0天，PBMCs的接种量均为5×107个，d0-d5天NK细胞生长较缓慢，d7天后（d7-d15）快速增殖，d15天细胞数量达到6.2×1010个，结果见表1。在扩增至d15天时取样进行流式细胞仪检测CD3-CD56+细胞比率。如图2所示，CD3-CD56+细胞比例达到99.4%，说明此培养方法既能有效诱导NK细胞扩增，又保证了细胞纯度。
表1 NK细胞数量的增加
。
效果例3 MTT法检测NK细胞的体外杀伤活性
取对数生长期的肺癌A-549细胞，经胰蛋白酶消化后收集细胞，用RPMI1640培养基洗涤3次，最终稀释成1×105cell/ml作为靶细胞。将靶细胞接种于96孔板中，1.0×104个/100μl/孔，培养12h，待其完全贴壁后，按照效应细胞和靶细胞数10:1比例加入培养21d的NK细胞。
同时设以下平行对照组：靶细胞对照孔、效应细胞对照孔、空载体刺激孔、CD86刺激孔、4-1BBL刺激孔、每组设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱孵育4h后，每孔加入MTT试剂（2.5g/L）20μl，继续培养4h后弃去含有MTT的培养液，加入200μl的DMSO，室温避光振荡15min， 用酶联仪检测各孔的A570值。
细胞杀伤活性（%）=（1- ）×100%
图3 为扩增的NK细胞杀伤率的比较，CD86-4-1BBL -K562细胞刺激组杀伤活性为96.27±1.27%，明显优于对照组46±1.72%，亦高于另外两组，差异有统计学意义（P＜0.05)。
效果例4 NK细胞的体内杀伤活性研究
每只小鼠背部相当于肺的位置，皮下注射4×106个对数生长期的肺癌A-549细胞，观察肿瘤生长情况，待瘤块体积达到30-40mm3随机分4组，每组4只。A组为对照组，B组为表达CD86的K562细胞刺激的NK细胞组，C组为表达4-1BBL的K562细胞刺激的NK细胞组，D组为双表达 CD86和4-1BBL 的K562细胞即aAPC刺激的NK细胞组。B组、C组和D组每组小鼠尾静脉注射1×107个NK细胞/200μl，A组小鼠尾静脉注射200μl RPMI1640。每间隔2天，测量一次瘤块大小，用游标卡尺分别测量肿瘤（包括皮肤厚度在内）短径（a）及长径（b），按以下公式计算瘤体体积：V=a2×b×0.52，绘制肿瘤生长曲线图。每间隔4天，尾静脉注射NK细胞一次。
NK细胞治疗肺癌模型小鼠后，治疗组与对照组相比，肿瘤大小出现差异。第12天开始，对照组肿瘤生长曲线陡直，所有治疗组的小鼠肿瘤生长较缓， 随后的治疗中，所有治疗组比对照组肿瘤体积减小，尤其是CD86-4-1BBL组随治疗天数延长，治疗效果更为明显，第21天时，对照组、CD86组、4-1BBL组和CD86-4-1BBL组肿瘤体积分别为1460.23±248.99mm3，408.56±40.78mm3，486.68±46.29mm3和210.99±26.89mm3，D组与对照组、B组和C组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图4）。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省健海生物芯片技术有限责任公司
<120> 一种自然杀伤细胞体外扩增方法
<130> 2018
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgctctagaa tggaatacgc ctctg 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcggatcct tattccgacc tcg 23
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctctagaa tggatcccca gtgcactatg gga 33
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcggatcct taaaaacatg tatcactttt g 31
Claims (10)
1.一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）CD86和4-1BBL慢病毒过表达载体的构建；
（2）表达CD86和4-1BBL的慢病毒载体的包装；
（3）双表达CD86和4-1BBL的人工抗原提呈细胞的制备；
（4）NK细胞的刺激培养。
2.根据权利要求1所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（1）包括如下步骤：
（a）获取4-1BBL基因片段；
自阳性质粒pORF-h4-1bbl中PCR扩增4-1BBL片段，上游引物如SEQID No.1所示，下游引物如SEQID No.2所示；
PCR扩增体系为：pORF-h4-1bbl质粒 1μl、dd H2O 7.5μl、10×PCR buffer 2.5 μl、上游引物SEQID No.1 1μl、下游引物SEQID No.2 1μl、Taq酶 3μl、Mg2+ 2.5μl、10mM dNTP 2μl；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；（4℃变性50s、55℃退火50s，70℃延伸90s），34个循环；70℃延伸10min；16℃ forever；
（b）获取CD86基因片段；
自阳性质粒pORF-h4-CD86中PCR扩增CD86片段，上游引物如SEQID No.3所示，下游引物如SEQID No.4所示；
PCR扩增体系为：pORF-h4-CD86质粒 1μl、dd H2O 9.5μl、10×PCR buffer 2.5 μl、上游引物SEQID No.3 1μl、下游引物SEQID No.4 1μl、Taq酶 3μl、Mg2+ 2.5μl、10mM dNTP 2μl；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；（94℃变性30s、55℃退火50s，72℃延伸1min），34个循环；72℃延伸20min；16℃ forever；
（c）PCR产物纯化；
（d）将PCR产物CD86、4-1BBL及载体PHBLV-CMVIE-IRES-Puro 、PHBLV-CMVIE-IRES-Neo用Xba I和BamH I酶切及回收；
（e）将步骤（d）处理好的CD86与PHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接，将步骤（d）处理好的4-1BBL基因片段与PHBLV-CMVIE-IRES-Neo 载体连接；得到pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体；
（f）pLV-Puro-hCD86和pLV-Neo-hTNFSF9载体的转化；
（g）转化后的 pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9载体平板挑菌鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（c）包括如下步骤：
经步骤（a）和（b）获得的PCR 产物以1％琼脂糖电泳，恒压 50V，电泳1h后在紫外灯下用干净的刀片割下含目的基因片段的琼脂糖块，放入 1.5ml Eppendorf 管中，用电子天平称重；用Gel Extraction Kit 进行纯化；
所述纯化步骤为：称重后加入3倍凝胶体积的溶液 QG，50ºC 水浴 10min，待凝胶充分溶解后加入1倍凝胶体积的异丙醇，混匀后将液体转入 QIAquick spin column 中，13000rpm 离心 1min，弃废液，加 Buffer QG 500μl，13000rpm 离心 1min，弃废液，加 750μl Buffer PE，离心1min，弃废液，再以13000rpm，离心1min，将 QIAquick spin column放在Eppendorf管中，加 30μl Buffer EB，室温放置 5min 后，13000rpm 离心 1min，收集离心液，贮于-20ºC 备用。
4.根据权利要求3所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（d）为：
酶切载体：配置40μl 酶切体系，在37ºC条件下反应2小时， 酶切体系为：400ng/μl载体2μl、Xba I 2μl、BamH I 2μl、10ｘbuffer 4μl、H2O 31μl；反应完成后使用DNA回收试剂盒进行酶切片段胶回收；
酶切 PCR 片段 ：配置50μl 酶切体系，在37ºC条件下反应1小时， 酶切体系为：100ng/μl PCR产物 5μl、10 U/µl Xba I 1μl、10 U/µl BamH I 1μl、10ｘbuffer 5μl、100×BSA0.5 µl 、H2O 40.5μl。
5.根据权利要求4所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（e）中，反应体积为20μl，并在16ºC下过夜保存，反应体系为：酶切后 hCD86或4-1BBL片段2μl、酶切后PHBLV-CMVIE-IRES-Puro或Neo载体 150ng、ligase buffer 2μl、T4 ligase 1μl、H2O定容至20 μl。
6.根据权利要求5所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（f）为：取100 μl处于感受态的E.coli DH5α，加入5μl 载体，所述载体为pLV-Puro-hCD86或pLV-Neo-hTNFSF9， 冰浴30min后立即42℃热激100s，随后放回冰上冰浴2min；加入400 μlLB培养基，放在37℃摇床振荡培养60min；取100μl 涂在含有氨苄青霉素的固体 LB培养基上，37℃ 培养过夜。
7.根据权利要求6所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（2）包括如下步骤：
1）质粒扩增：将pLV-Puro-hCD86、pLV-Neo-hTNFSF9重组质粒及辅助质粒pSPAX2、pMD2G进行抽提；
2）转染293T细胞：将培养293T细胞瓶中的培养基吸净，5min 后取出 ，将细胞全部从瓶底晃下，加入3ml 37℃水浴中预热的10%DMEM，用移液管进行充分吹打；随后将所有细胞吸出，移至15ml离心管中，取50μl混匀后的细胞于1.5ml离心管中，加入450 μl 10%DMEM后混匀，取10μl 细胞于计数板中计数；
3）做脂转复合物：Opti MEM在37℃水浴中预热后使用，将LipofiterTM转染试剂恢复室温后摇匀；转染体系如下： pSPAX2 10μg 、pMD2G 10μg 、pLV-Puro-hCD86或pLV-Neo-hTNFSF9载体 10μg；转染后6h换新鲜培养液；
4）病毒收集：经步骤3）转染后 48h 和72h分别两次收集病毒上清，收集后使用 0.45μm滤器进行过滤置于40ml 离心管中，4℃下 72000g/min离心120 min。
8.根据权利要求7所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（3）为：用步骤4）收集的病毒感染K562细胞；感染前一天以1×105/ml 的密度接种 K562细胞于6 孔板中，1ml/孔，放入培养箱中继续培养 12h；加入5×105 pfu/ml病毒上清、终浓度为8μg/ml的polybrene及培养液至 2ml，放入培养箱中继续培养24h 后换液，继续培养至第三天，于荧光显微镜下观察绿色荧光，流式细胞仪检测感染率；所述K562细胞应用前，用γ射线灭活；所述病毒感染后的K562细胞使用新霉素、嘌呤霉素进行抗性筛选，得到双表达CD86和4-1BBL的K562细胞。
9.根据权利要求8所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤（4）包括如下步骤：
I）将50ml成人外周血放置离心管中，800g/min、15min离心后小心吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；管底血细胞用生理盐水稀释后加到装有Ficoll溶液的离心管，800g/min，快升慢降离心15min，收集白膜层细胞，并用生理盐水洗涤2次，计数备用；
II）用20mL GT-T551培养基将（2~3）×107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，按照1:2的比例加入aAPC，然后加入IL-15及自体血浆，所述IL-15为1000U/ml，血浆浓度为5%；37℃、5% CO2条件下体外共培养，21d后收获细胞并用流式细胞术进行细胞分类分析。
10.根据权利要求9所述的一种自然杀伤细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤II）的培养过程中每天对NK细胞计数，当NK细胞密度大于3×106/ml时补充培养基，密度维持在1×106/ml，补充的培养基为含有1000U/ml IL-15、5%自体血浆的GT-T551培养基。
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