CN106754730A - 一种高效扩增nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效扩增NK细胞的方法，具体是一种使用高表达膜蛋白CD19、CD137L、CD86、CD64及跨膜蛋白IL‑21的K562工程细胞联合人IL‑2突变体高效扩增NK细胞的方法。本发明方法操作简单，成本低，获得的NK细胞数量大、纯度高、杀伤效果好，适合NK细胞的大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。

Description

一种高效扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其涉及一种高效扩增NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK cell)是T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，是人体免疫系统的第一道防线，在机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫中起重要作用。NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞。同时，还可以产生一系列的细胞因子进而对机体的获得性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和特异性免疫的桥梁。NK细胞由于具有直接杀伤活性和免疫调节活性，而一度成为免疫细胞过继疗法的新热点。此外，还有越来越多的报道将原代NK细胞或NK细胞系进行基因改造以提高其杀伤肿瘤细胞的特异性和活性，进而进行过继免疫治疗，在动物实验和临床试验中均取得了良好的效果。可见，NK细胞在肿瘤的生物治疗中具有广阔的应用前景。
NK细胞的杀伤功能及疗效与其数量直接相关，然而NK细胞在外周血中比例小，约占外周血PBMC的5％～10％，传统的使用的野生型IL-2扩增NK细胞的方案，不仅NK扩增倍数有限，端粒酶活性降低，而且扩增后NK细胞的各种活化受体或CD16分子表达丢失导致NK细胞毒性减弱；最近的研究发现，野生型IL-2还可以扩增Treg细胞，而Treg细胞能够显著抑制NK细胞的杀伤作用，从而影响NK细胞的临床疗效。尽管国外已有商品化的NK细胞分离试剂盒，利用这些试剂，通过FACS分选或MACS法纯化可获得90％以上纯度的NK细胞。但操作复杂，费用昂贵，且高度纯化的NK细胞不能在体外大量扩增，难以满足临床试验的需求。之前有文献报道，采用K562细胞转染跨膜IL-21和CD137复合体与体外PBMC共培养扩增NK细胞，使得NK细胞数量、纯度和活性显著增强。然而，肿瘤微环境是一个复杂的综合系统，在肿瘤微环境中存在有大量的肿瘤相关巨噬细胞和CD19+B细胞，这些细胞为肿瘤细胞的生长提供营养因子。用仅转染跨膜IL-21和CD137复合体的K562细胞激活扩增NK细胞虽然对肿瘤细胞有很强的杀伤能力，但是对肿瘤微环境中的肿瘤细胞相关巨噬细胞和B细胞的杀伤能力却很弱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用人IL-2突变体联合K562细胞高效扩增NK细胞的方法。该方法操作简单，扩增的NK细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于NK细胞大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。
本发明的一种利用人IL-2突变体联合K562细胞高效扩增NK细胞的方法，包括：
(1)使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同时转染K562细胞；载体中含有病毒启动子和选择标记基因；
(2)当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，体外培养K562细胞一段时间后，经流式细胞术分选，获得稳定表达跨膜蛋白CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞；
(3)将稳定表达CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞经过γ射线照射灭活，作为NK细胞的滋养细胞；
(4)分离并提取外周血单个核细胞(即PBMC)并计数，按一定的比例(K562:PBMC)加入灭活的K562滋养细胞，在IL-2突变体协同作用下，与PBMC共培养2～3周，即可得到纯度较高的NK细胞。
其中，步骤(1)所述的CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接IL-21基因后使得IL-21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64为膜蛋白。
步骤(2)所述的纯化后的K562工程细胞其跨膜CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的表达量在85％以上。
步骤(3)所述的灭活K562工程细胞的γ射线剂量为100Gy，辐照时间为20～30min。
步骤(4)所述的IL-2突变体是通过对氨基酸定点替代，将其IL2α受体结合点突变，突变的位点在IL-2的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位点。不仅能够其降低诱导调节性T细胞的功能，同时还保留了其对NK细胞的免疫活性，可用于刺激免疫系统，从而提高其临床疗效和应用范围。
步骤(4)所述的PBMC重悬密度为1～2×106，白介素-2突变体的使用浓度为50～100ng/ml，加入K562滋养细胞与PBMC的比例为0.1：1～1：1，作为更佳选择，上述方法中K562:PBMC＝0.1:1或0.2:1。
本发明的方法以稳定高表达膜蛋白CD19、CD137L、CD86、CD64及扩膜蛋白IL-21的K562工程细胞为滋养细胞，以白介素-2突变体为NK细胞扩增因子，以GT-T551培养基为基础培养基，在添加适量自体血浆的条件下，体外培养2～3周，成功制备了纯度高、体外杀伤活性好的NK细胞，该NK细胞高表达激活受体NKG2D，同时低表达抑制性受体CD158α。
本发明通过基因工程的方法，构建基因修饰的K562工程细胞，使其可以同时高表达膜蛋白CD19、CD64、CD86、CD137L和跨膜蛋白IL-21。将灭活的K562工程细胞在低浓度IL-2突变体存在的条件下与体外分离的外周血单个核细胞共培养，不仅可以高效地扩增人NK细胞，而且还可以增强NK细胞的杀伤功能。在K562细胞中转染CD19有助于激活NK细胞识别并杀伤肿瘤微环境中的B细胞；而CD137L为TNF超家族的新成员，与其配体结合后介导的共刺激信号，可促进T细胞和NK细胞增殖；转染CD86有助于提升NK细胞对肿瘤细胞、微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和B细胞的杀伤作用；CD64分布于单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞表面，参与调理吞噬作用及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，转染CD64可以增强NK细胞的ADCC效应。而培养过程中使用的人白细胞介素II突变体是通过对氨基酸定点替代，将其IL-2α受体结合点突变，不仅能够其降低诱导调节性T细胞的功能，同时还保留了其对NK细胞的增殖活性，可用于刺激免疫系统，从而提高其临床疗效和应用范围。较传统方法制备的NK细胞，该方法具有操作简单，扩增的NK细胞具有纯度高、数量大、杀伤活性好等优点，适合于NK细胞大规模制备，为NK细胞过继性免疫治疗应用于临床打下了良好的基础。本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
附图说明
图1为实施例一中CD19、CD137L、CD86、IL-21在K562基因工程细胞中的表达情况；
图2为实施例二中NK细胞体外扩增线性图，显示NK细胞在转染跨膜IL-21、CD19、CD137L、CD64和CD86的K562细胞与低剂量的IL-2突变体共同作用下线性增长，以该K562与低剂量的野生型IL-2扩增的NK细胞作为对照；
图3为实施例二中在K562工程细胞和IL-2突变体共同作用下，体外培养21天时NK细胞的纯度，以该K562工程细胞与低剂量的传统IL-2扩增的NK细胞作为对照；
图4为实施例二中在K562工程细胞和IL-2突变体共同作用下，体外培养21天时NK细胞表面Fc受体CD16的表达情况，以该K562工程细胞与低剂量的传统白介素-2扩增的NK细胞作为对照；
图5为实施例二中在K562工程细胞和IL-2突变体共同作用下，体外培养21天时NK细胞表面激活受体NKG2D的表达情况，以该K562工程细胞与低剂量的传统IL-2扩增的NK细胞作为对照；
图6为实施例二中在K562工程细胞和IL-2突变体共同作用下，体外培养21天时NK细胞表面抑制性受体CD158α的表达情况，以该K562工程细胞与低剂量的野生型IL-2扩增的NK细胞作为对照；
图7为实施例三中在K562工程细胞和白介素-2突变体共同作用下，体外培养21天后NK细胞对K562和MCF-7的杀伤作用统计对比结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
按照本发明的方法，以以下具体步骤扩增培养NK细胞：
(1)使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因同时转染到K562细胞，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；而CD19、CD137L、CD86、和CD64为膜蛋白，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，经培养一段时间后，K562细胞膜上可表达跨膜IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64。将上述细胞，经流式细胞术分选，获得稳定表达CD8αIL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562细胞，作为NK细胞的滋养细胞；
(2)将稳定表达CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基重悬，密度调至1×107cells/mL，100Gy的γ射线照射20min，灭活该K562细胞，再用生理盐水1500rpm离心5min，洗涤3次；
(3)抽取人外周血50ml，用淋巴分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，并用生理盐水1800rpm离心5min洗涤分离出来的PBMC，重复3次，并进行细胞计数；
(4)用GT-T551培养基重悬PBMC，调节密度至1～2×106cells/mL，把细胞转移至一T75的细胞培养瓶中，按0.2：1(K562:PBMC)的比例加入灭活的K562滋养细胞，并加入IL-2突变体100ng/mL及自体血浆10％(v/v)，将细胞培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中培养；
(5)细胞培养至第3天或第4天，根据细胞密度和激活情况，往培养瓶中补充新鲜GT-T551完全培养基(含100ng/mLIL-2突变体及10％自体血浆)；
(6)细胞培养至第7天进入扩增阶段，根据细胞生长密度和体积，每隔2～3天对细胞进行传瓶培养，并补充新鲜含100ng/mLIL-2突变体的GT-T551培养基及1％～5％的自体血浆，培养至第21天，收获NK细胞。
对上述步骤中构建的K562工程细胞进行流式检测，分析其表面CD19、CD137L、CD86和IL-21的表达情况，如图1所示。图1显示构建的K562细胞表面CD19的表达量为88.70％、CD137L的表达量为96.99％、CD86的表达量为98.30％及IL-21的表达量为88.89％，而且随着K562细胞体外传代次数增加，其表面膜蛋白的表达没有降低，由此说明构建的K562细胞可稳定高表达跨膜蛋白CD19、CD137L、CD86和IL-21。
依照以上步骤体外培养NK细胞，分别在第0、3、6、9、12、15、18和21天进行细胞计数，绘制NK细胞扩增曲线，如图2所示，而利用传统IL-2和K562工程细胞扩增的NK细胞作为对照。图2显示，在上述方法中所述K562滋养细胞与IL-2突变体的共同作用下，NK细胞数量显著增加。NK细胞在前9天为激活并缓慢扩增阶段，12天开始进入对数生长期，21天时细胞数量达到8×109，明显高于对照组的4.5×109。
实施例二
将实施例1所制备的NK细胞进行流式检测，而利用传统IL-2和K562工程细胞扩增的NK细胞作为对照。分析NK细胞占总细胞的比例(如图3所示)、NK细胞表面Fc受体CD16的表达情况(如图4所示)、NK细胞表面激活受体NKG2D的表达情况(如图5所示)以及NK细胞表面抑制性受体CD158α的表达情况(如图6所示)。图3、图4、图5及图6显示，利用本发明所述方法制备的NK细胞，NK细胞的纯度(即CD3-CD56+的比例)为97.8％，明显高于对照组的86.1％；而利用本发明所述方法制备的NK细胞表面CD16的表达为88.7％，也明显高于对照组的76.3％；另外，利用本发明所述方法制备的NK细胞表面激活受体的表达为91.7％，明显高于对照组的78.1％，同时抑制受体的表达为10.1％，明显低于对照组的30.8％。
实施例三
按照以下操作进行NK细胞杀伤率的测定：
(1)靶细胞准备：取生长状态良好的K562和MCF-7细胞，1000rpm离心5min，细胞计数；用RPMI-1640完全培养基，调节细胞密度为2×105/mL，备用；
(2)效应细胞准备：取生长状态良好的NK细胞，1500rpm离心5min，细胞计数并用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2×106/mL，备用；
(3)靶细胞与效应细胞共培养：在96孔细胞培养板中加入10000个靶细胞(即50uL)，按1：1、5：1和10：1的比例加入效应细胞(即NK细胞)，至终体积100uL/孔；并设置空白对照、靶细胞对照孔及相应的效应细胞对照孔，每孔设置3个复孔，将细胞培养板放至37℃，5％CO2培养箱中培养8～12小时；
(4)每孔加入10uL CCK-8，37℃，5％CO2培养箱孵育4～6小时；
(5)在450nm波长下测定OD值。
按下述公式计算其杀伤率：
杀伤率(％)＝{1—(实验组OD值-相应效应细胞对照组OD值)/(对照靶细胞组OD值-空白组OD值)}x100％，不同效靶比条件下，NK细胞对K562细胞和MCF-7细胞的杀伤率如图7所示。图7显示，利用本发明所述方法制备的NK细胞在体外对K562细胞和MCF-7细胞都有很明显的杀伤作用，当效靶比为10：1时，杀伤率分别为89.97％和80.5％。
综合上述实施例本领域人员能够知晓，本发明的扩增方法具备以下优点：
1.本发明方法成本低，操作简单，无需第二次刺激，滋养细胞使用比例低，制备的NK细胞数量大、纯度高、杀伤活性好，可用于NK细胞的大规模生产；
2.本发明方法使用的IL-2突变体可减少对Treg细胞的诱导和扩增，从而降低Treg细胞对NK细胞杀伤活性的抑制作用，可有效地增强NK细胞的临床疗效；
3.本发明所制备的NK细胞，能够高表达激活受体NKG2D、Fc受体CD16并且低表达抑制性受体CD158α，具有应用其做后续相关临床应用的潜力。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤一，将CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的基因利用外源表达载体转染K562细胞；
步骤二，当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，体外培养K562细胞并分选获得稳定表达CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的K562工程细胞；
步骤三，将步骤二获得的K562工程细胞经过γ射线照射灭活，成为K562滋养细胞；
步骤四，分离并提取外周血单个核细胞，在IL-2突变体协同作用下，将步骤三获得的K562滋养细胞与外周血单个核细胞共培养，获得NK细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中外源表达载体中含有病毒启动子和选择标记基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中K562工程细胞的CD8α-IL-21、CD19、CD137L、CD86、和CD64的表达量在85％以上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中γ射线剂量为100Gy，辐照时间为20～30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中共培养的培养液为：GT-T551培养液加入10％人血清，或GT-T551H3培养液加入10％人血清，或RPMI 1640培养液加入10％胎牛血清。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中IL-2突变体是将组成多肽的氨基酸序列在白介素II02α受体结合点突变，突变的位点在IL-2的37，38，41，42，43，44，45，61，62，65，68和72氨基酸位点。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四所述的IL-2突变体的使用浓度为50～100ng/ml，K562滋养细胞与外周血单个核细胞共培养的体积比为(0.1～1)：1。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法制备得到的NK细胞。
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