CN112626028A - 一种激活nk样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL‑21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。本发明的工程化细胞表达活化NK样细胞的膜蛋白，提高了NK样细胞的扩增能力和肿瘤细胞毒性，提供了一种标准化体外扩增NK样细胞的策略。

Description

一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用。

背景技术

NK样细胞为利用CRISPR/Cas9技术对T细胞进行重编程而获得的细胞，NK样细胞具有T细胞和NK细胞的双重功能，不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)，相较于T细胞或NK细胞具有显著提高的肿瘤杀伤功能，在癌症治疗中展现出了巨大的潜力。

将NK样细胞应用于免疫治疗的一大障碍是难以生产大量功能完全的NK样细胞，同时缺少体外扩增NK样细胞的标准方法。目前常用的NK细胞的培养方法包括血液细胞分离法、细胞因子或化学药品刺激法和饲养细胞法，但是这些方法普遍存在着操作繁琐、成本高、周期长、数量无法满足需求的问题，且不十分适用于NK样细胞的培养。

近年来，使用基因工程技术构建的人工抗原呈递细胞(滋养层细胞)越来越多地应用于NK细胞的体外扩增。但是NK样细胞不同于NK细胞，其具有T细胞和NK细胞双重功能，目前尚无有效的体外扩增和活化NK样细胞的方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用，所述工程化细胞表面表达有活化NK样细胞的膜蛋白，通过与NK样细胞受体结合，实现了激活NK样细胞的效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种激活NK样细胞的工程化细胞，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL-21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。

本发明中，将MICA、IL-12、CD64和CD86表达于哺乳动物细胞表面构建激活NK样细胞的工程化细胞，通过与NK样细胞表面的受体结合用于活化NK样细胞，显著提高了NK样细胞的扩增数量和肿瘤细胞毒性。

优选地，所述MICA包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA。

优选地，所述IL-12通过与CD28跨膜区形成融合蛋白、表达在所述工程化细胞表面。

优选地，所述IL-12包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAGGGGSMCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYY。

优选地，所述CD28跨膜区包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGV LACYSLLVTVAFIIFWV。

优选地，所述CD64包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

MWFLTTLLLWPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWVDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNTSVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVLFYLAVG。

优选地，所述CD86包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：

MGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF。

优选地，所述哺乳动物细胞包括K562细胞。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括MICA编码基因、IL-12和CD28跨膜区融合蛋白编码基因、CD64编码基因和CD86编码基因。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的工程化细胞的制备方法，所述方法包括将第三方面所述的重组慢病毒导入K562细胞，利用抗生素和流式细胞仪筛选阳性克隆的步骤。

第五方面，本发明提供了一种培养基，所述培养基包括第一方面所述的工程化细胞。

优选地，所述培养基还包括血清。

优选地，所述培养基的培养液包括Eagle培养液、RPMI-1640培养基或Ham’s F-10中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了一种NK样细胞的培养方法，所述培养方法包括采用第五方面所述的培养基培养NK样细胞的步骤。

优选地，所述培养方法还包括对NK样细胞进行辐照的步骤。

优选地，所述辐照的剂量为50～500Gy，例如可以是50Gy、100Gy、150Gy、200Gy、250Gy、300Gy、350Gy、400Gy、450Gy或500Gy。

优选地，所述NK样细胞的制备方法为将靶向Bcl11b基因的CRISPR/Cas9质粒电转入活化的T细胞制备得到。

第七方面，本发明提供了一种NK样细胞，所述NK样细胞采用第六方面所述的培养方法培养得到。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用MICA、IL-12、CD64和CD86的组合工程化细胞用于培养激活NK样细胞，提高了NK样细胞的增殖能力，细胞数量在短时间内呈指数型增长；

(2)本发明的工程化细胞提高了NK样细胞的肿瘤杀伤能力，NK样细胞不仅保留有T细胞和NK细胞的固有属性，而且相较于T细胞和NK细胞具有显著增强的杀瘤能力强，在肿瘤靶细胞远多于NK样细胞的情况下，也具有显著的肿瘤细胞毒性，在免疫治疗领域具有应用前景。

附图说明

图1为NK样细胞的增长曲线；

图2为NK样细胞的杀瘤能力。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1NK样细胞的构建

(1)根据Bcl11b基因设计sgRNA(SEQ ID NO:6：gaccatgaactgctcacttg)，人工合成后在序列的5’端和3’端添加限制性酶切位点EcoRI和SalI；

合成的序列片段经过EcoRI和SalI酶切后，连接到含有T7启动子的PX458-gBCL11b载体上，测序验证重组质粒构建成功。

(2)将1×10⁷个T细胞重悬于3mL T细胞培养基，接种于6孔板的一个孔中，加入100ng/mL抗人CD3抗体和100ng/mL抗人CD28抗体的组合进行活化；

3天后，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min，用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL Opti-MEM中，加入浓度为40μM的CRISPR/Cas9质粒，混匀后转移至电Lonza电击杯，将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为800V，时间为4ms；

将电转后的细胞采用含有1ng/mL IL-12、1ng/mL IL-15和1ng/mL IL-18的T551-H3完全培养基培养72h，低速离心细胞，更换新鲜的T551-H3完全培养基继续培养12h，得到NK样细胞。

实施例2工程化细胞的构建

(1)人工合成T2A连接的含有MICA编码基因、IL-12和CD28跨膜区、CD64和CD86的编码基因的核酸分子，并在两端分别添加Pme1和Spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶Pme1和Spe1对核酸分子进行双酶切，37℃水浴中孵育30min，使用1.5％琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物；

将酶切产物连接入经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到慢病毒载体。

(2)采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液，pWPXLd-表达质粒包括含有MICA-IL-12-CD64-CD86编码基因的慢病毒载体、含有MICA编码基因的慢病毒载体、含有IL-12编码基因的慢病毒载体、含有CD64编码基因的慢病毒载体或含有CD86编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有外源编码基因的空载体；

表1

将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；将表1所示的质粒混合液与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达外源基因的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒，4℃保存待用。

(3)将野生型K562细胞重悬于10mL Opti-MEM中，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL缓冲液中，加入步骤(2)的重组慢病毒，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mLIL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬细沉淀，即得工程化细胞。

实施例3 NK样细胞的体外扩增

本实施例将NK样细胞培养于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养24小时后进行细胞计数，调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，在第0天向培养基中加入等比例的工程化细胞，随后采用含2×10⁶个/mL工程化细胞、10％胎牛血清和50U/mL的IL-2的RPMI-1640培养基继续培养14天，37℃、5％CO₂培养箱中500Gy辐照条件下共培养。

如图1所示，NK样细胞与MICA-IL-12-CD64-CD86工程化细胞共培养后，细胞数量明显增加，培养2周后，NK样细胞数量增长约100倍，明显高于对照组。

实施例4 NK样细胞的体外杀伤

将实施例3的培养14天的NK样细胞、T细胞和NK细胞在不同的E:T比例下分别与5×10³个卵巢癌细胞系SKOV3共培养于U型96孔板中，每组实验重复3次；

经过18小时的共培养后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较不同NK样细胞对SKOV3的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2所示，NK样细胞的杀伤效率高于T细胞和NK细胞，而与MICA-IL-12-CD64-CD86-K562细胞共培养获得的NK样细胞的杀伤效率更高，在E:T很小的情况下，即肿瘤细胞数量远大于NK样细胞数量，NK样细胞也具有较强的肿瘤杀伤作用。

综上所述，本发明采用表达膜固定MICA/IL-12/CD64/CD86的工程化细胞与NK样细胞共培养，得到的NK样细胞保留有T细胞和NK细胞的固有属性，同时具有增强的杀瘤能力，在细胞免疫治疗领域具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> 一种激活NK样细胞的工程化细胞及其制备方法和应用

<130> 202012

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe

1 5 10 15

Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu

20 25 30

Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu

35 40 45

Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys

50 55 60

Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys

65 70 75 80

Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu

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Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser

100 105 110

Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg

115 120 125

Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn

130 135 140

Leu Glu Thr Lys Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr

165 170 175

Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg

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Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met

195 200 205

Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr

210 215 220

Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg

225 230 235 240

Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val

245 250 255

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260 265 270

Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly

275 280 285

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Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Ile

305 310 315 320

Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser

325 330 335

Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His

340 345 350

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355 360 365

Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala

370 375 380

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala

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Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg

20 25 30

Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val

35 40 45

Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr

85 90 95

Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn

180 185 190

Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser

195 200 205

Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys

210 215 220

Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe

245 250 255

Ser Leu Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys

260 265 270

Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly

275 280 285

Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr

290 295 300

Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu

305 310 315 320

Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His

325 330 335

Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys

340 345 350

Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro

355 360 365

Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg

370 375 380

Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser

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Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val

485 490 495

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Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr

545 550 555

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

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20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 4

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Pro Val Asp Gly Gln Val

1 5 10 15

Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Val

20 25 30

Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu Pro

35 40 45

Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln Thr

50 55 60

Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser Gly

65 70 75 80

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Leu Asn Thr Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu

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Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val

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Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro

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Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr

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Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp

180 185 190

Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met

195 200 205

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Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile

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Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val

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Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln

275 280 285

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290 295 300

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaccatgaac tgctcacttg 20

Claims (10)

1.一种激活NK样细胞的工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞为表达膜蛋白MICA、IL-21、CD64和CD86的哺乳动物细胞。

2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述MICA包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述IL-12通过与CD28跨膜区形成融合蛋白、表达在所述工程化细胞表面；

优选地，所述IL-12包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

优选地，所述CD28跨膜区包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

优选地，所述CD64包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

优选地，所述CD86包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的工程化细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括K562细胞。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括MICA编码基因、IL-12和CD28跨膜区融合蛋白编码基因、CD64编码基因和CD86编码基因。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求4或5所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。

7.一种权利要求1-3任一项所述的工程化细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述的重组慢病毒导入K562细胞，利用抗生素和流式细胞仪筛选阳性克隆的步骤。

8.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括权利要求1-3任一项所述的工程化细胞；

优选地，所述培养基还包括血清；

优选地，所述培养基的培养液包括Eagle培养液、RPMI-1640培养基或Ham’s F-10中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种NK样细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括采用权利要求8所述的培养基培养NK样细胞的步骤；

优选地，所述培养方法还包括对NK样细胞进行辐照的步骤；

优选地，所述辐照的剂量为50～500Gy；

优选地，所述NK样细胞的制备方法为将靶向Bcl11b基因的CRISPR/Cas9质粒电转入活化的T细胞制备得到。

10.一种NK样细胞，其特征在于，所述NK样细胞采用权利要求9所述的培养方法培养得到。

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