CN111607569A - 一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，所述方法通过电转化将RNP复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞。所述方法将RNP复合物通过电转的方法转入T细胞中，使其分化成为ITNK细胞，所述方法能够提高体外重编程效率，且得到ITNK细胞具有较好的体外扩增能力，在电转后第14天，其细胞扩增倍数为26.8～62.2倍，且所述ITNK细胞具有较强的体外杀伤功能。本发明提供的方法能够整体提升重编程ITNK细胞的制备能力，使更多临床患者获益。

Description

一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法。
背景技术
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律成簇间隔短回文重复系统)，CRISPR/Cas是一种具有核酸内切酶活性的复合体，其中Cas是CRISPR相关的蛋白质。CRISPR/Cas能够识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ),造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除。
CRISPR/Cas系统是一种原本存在于自然界原核生物中的免疫防御系统，用来抵抗噬菌体或者病毒等外来遗传物质的入侵。它为细菌提供了获得性免疫(类似于哺乳动物的二次免疫)，当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，使外源基因的表达沉默，从而达到抵抗病毒干扰的目的。
由于CRISPR/Cas系统精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种。其中，Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA：crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。目前，已经能够将这两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。不过，尽管这种技术已经成功应用于多种细胞系，它对原代细胞的编辑效率却非常低，严重限制了CRISPR技术在原代细胞上的应用。
T细胞是适应性免疫系统中非常重要的调节和效应细胞，近年来基于T细胞的免疫治疗技术受到了越来越多的关注。同时，人们也在不断尝试对T细胞进行基因编辑以研究其激活分化机制或者增强其抗肿瘤功能。Li等人在2010年首次提出且成功将小鼠T细胞重编程成NK样细胞(induced T-to-natural killer cells，ITNK细胞)(具体参见Li,P.etal.Reprogramming of T cells to natural killer-like cells upon Bcl11bdeletion.Science 329,85-89(2010).)，并于近年采用CRISPR/Cas9技术成功地将人T细胞重编程成为ITNK细胞。
为进一步提高重编程效率，有研究者尝试将Cas9和gRNA通过病毒载体或者电转的方式对原代T细胞进行基因编辑，但是打靶效率非常低，而且直接电转DNA会对T细胞造成较高毒性。还有研究者尝试电转Cas9和体外转录或合成的单链gRNA的复合物来提高对原代T细胞的编辑效率(参见Rutz,S.&Seki,A.Optimized RNP transfection for highlyefficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.Journal ofExperimental Medicine 215,985-997(2018).)。但是，使用CRISPR/CAS9技术重编程ITNK细胞仍然面临效率低且毒性大等问题。
因此，如何进一步提高重编程效率、降低对细胞的毒性，同时提高重编程后细胞的功能，得到打靶效率较高且能有效识别和杀伤肿瘤细胞的重编程ITNK细胞，是本领域急需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，该方法操作步骤较为简单，重编程效率较高，且能够获得扩增能力较好、杀伤肿瘤细胞效率高的重编程ITNK细胞。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，所述方法通过电转化将RNP复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞；所述RNP复合物包括crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。
本发明中，采用电转化的方式将RNP复合物转入T细胞当中，所述T细胞为原代T细胞，通过此方法可以实现对原代T细胞的基因编辑，将其转化成NK样细胞，即ITNK细胞，且该方法重编程效率较高；同时，通过该方法制备得到的ITNK细胞的体外扩增能力较强，对肿瘤细胞的杀伤能力也较好。
本发明中，所述crRNA表示CRISPR RNA，tracrRNA表示trans-activating crRNA，crRNA和tracrRNA结合能够实现Cas9的靶向切割。
作为本发明优选的技术方案，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)，例如可以是1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5等。
优选地，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)，例如可以是1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.15或1:1.2等。
优选地，所述crRNA的靶基因包括Bcl11b基因。本发明中将原代T细胞中的Bcl11b基因敲除，可以诱导原代T细胞分化为具有NK样细胞活性，称为ITNK细胞。
为了更加直观地凸显出电转RNP复合物的重编辑效率，重编辑后细胞的扩增能力与杀伤能力，本发明以含有cas9蛋白和敲除Bcl11b gRNA的PX458质粒(记为PX458-gBCL11b)为阳性对照组与电转RNP复合物的实验组进行了比较，实验中为了提高基因编辑的成功率，使用了多种不同的sg-RNA的序列，其中，所使用的sg-RNA的序列包括SEQ IDNO.1～6：
sgRNA1：gaccctgacctgctcacctg(SEQ ID NO.1)
sgRNA2：gaccatgaactgctcacttg(SEQ ID NO.2)
sgRNA3：gaagcagtgtggcggcagct(SEQ ID NO.3)
sgRNA4：gaagcattgtggcttcagct(SEQ ID NO.4)
sgRNA5：ggtcagacggaggctccctt(SEQ ID NO.5)
sgRNA6：ggtcatccggaggctcgatt(SEQ ID NO.6)。
通过mMESSAGE mMACHINETM T7 Transcription Kit试剂盒体外获得靶向基因的gRNA的mRNA产品。与直接电转质粒PX458-gBCL11b得到ITNK细胞相比，本发明提供的重编程方法的效率较高，重编辑后细胞的扩增能力与杀伤能力都较好。
优选地，所述RNP复合物的摩尔浓度为40～120μM，例如可以是40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM或120μM等。
优选地，电转时所述RNP复合物与细胞的使用量比例为(2～100)μL:106个细胞，例如可以是2μL:106个、5μL:106个、10μL:106个、15μL:106个、20μL:106个、25μL:106个、30μL:106个、50μL:106个、60μL:106个、70μL:106个、80μL:106个、90μL:106个或100μL:106个等。
作为本发明优选的技术方案，所述crRNA的核苷酸序列为25～35bp，例如可以是25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp或35bp等。
优选地，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示。
crRNA1：gaccctgacctgctcacctggttttagagcta(SEQ ID NO.7)
crRNA2：gaccatgaactgctcacttggttttagagcta(SEQ ID NO.8)
crRNA3：gaagcagtgtggcggcagctgttttagagcta(SEQ ID NO.9)
crRNA4：gaagcattgtggcttcagctgttttagagcta(SEQ ID NO.10)
crRNA5：ggtcagacggaggctcccttgttttagagcta(SEQ ID NO.11)
crRNA6：ggtcatccggaggctcgattgttttagagcta(SEQ ID NO.12)
作为本发明优选的技术方案，所述tracrRNA的核苷酸序列为50～60bp，例如可以是50bp、51bp、52bp、53bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、59bp或60bp等。
优选地，所述tracrRNA的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO.13和14所示的核苷酸序列。
tracrRNA1：tagcaagttaaaataaggctagtcatttatcacattgaaaatctggcaccgagtcggtg(SEQ ID NO.13)
tracrRNA2：tagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtg(SEQ ID NO.14)。
作为本发明优选的技术方案，所述电转化的电压为1.5～2.5kV，时间为3～5ms。
优选地，所述电转化结束后，所得细胞悬液置于完全培养基中培养。
优选地，所述完全培养基包括T551-H3完全培养基，所述T551-H3完全培养基中含有质量分数为3～8％自体血清(例如可以是4％、5％、6％或7％等)，所述自体血清为T细胞来源中的血清，所述T551-H3完全培养基中还包括400～800IU/mL(例如可以是500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL或750IU/mL等)hIL-2以及10～30μg/mL(例如可以是15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL或28μg/mL等)的硫酸庆大霉素。
作为本发明优选的技术方案，所述T细胞采用Ficoll密度梯度离心法进行分离。优选地，所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选。
本发明中所述Ficoll密度梯度离心法与磁珠分选方法均为本领域常用的实验方法。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)将crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白制成RNP复合物，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示，所述tracrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示，所述crRNA的靶基因为Bcl11b基因；
(2)采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血得到外周血单个核细胞，采用磁珠分选方法进行分选得到T细胞，并激活所述T细胞；所述激活时可以采用MACS激活试剂盒激活T细胞24～48小时，再洗脱激活磁珠，得到激活的T细胞备用；
(3)通过电转化的方法将步骤(1)所述的RNP复合物电转入步骤(2)所述激活的T细胞中，之后再转入完全培养基中培养，培养18～24小时后，更换新鲜的完全培养基，培养一段时间后能够得到所述ITNK细胞。
第二方面，如第一方面所述的方法制备得到的ITNK细胞。
利用第一方面所述的电转化方法得到的ITNK细胞的体外扩增能力和体外杀伤能力都优于直接电转ITNK质粒获得的ITNK细胞。
本发明中，所述的ITNK细胞可以应用于治疗肿瘤的药物等多种研究当中。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的重编程方法将RNP复合物通过电转的方法转入T细胞中，使其分化成为ITNK细胞，所述方法能够提高体外重编程效率，电转RNP复合物得到的ITNK细胞中，CD8阳性细胞群的NKp30为40.6～61.6％；该方法能够从整体上提升重编程ITNK细胞制备能力，使更多的临床患者获益；
(2)本发明提供的重编程方法得到ITNK细胞具有较好的体外扩增能力，在电转后第14天，其细胞扩增倍数为26.8～62.2倍；且所述ITNK细胞具有较强的体外杀伤功能，在效靶比降低至1:2甚至更低时，电转RNP组对靶细胞的杀伤能力明显强于电转质粒组。
附图说明
图1为实施例2中不同组细胞的重编程效率散点图。
图2为实施例3中不同组细胞的体外扩增能力曲线图。
图3为实施例4中不同组细胞的体外杀伤能力曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，所述T551-H3完全培养基中含有5％自体血清、500IU/mL hIL-2以及20μg/mL硫酸庆大霉素；所用试剂、试剂盒若无特别说明，均可由常规厂商购得，所述试剂盒的使用方法均根据试剂盒的说明书记载的方法进行；未具体说明的实验步骤均可按照本领域常规的实验操作进行，例如酶切、连接等。
实施例1
本实施例提供一种重编程ITNK细胞的方法，具体步骤如下：
1、sgRNA、cr-RNA和tracr-RNA的基因序列。
(1)根据Bcl11b基因设计出三个靶向该基因的sgRNA，即SEQ ID NO.1～3，并送序列合成公司合成序列，并将三种sgRNA连接到含有T7启动子的PX458-gBCL11b载体上，通过测序验证载体构建成功，其中所用的sgRNA的具体序列如下：
sgRNA1：gaccctgacctgctcacctg(SEQ ID NO.1)
sgRNA2：gaccatgaactgctcacttg(SEQ ID NO.2)
sgRNA3：gaagcagtgtggcggcagct(SEQ ID NO.3)；
(2)通过mMESSAGE mMACHINETM T7 Transcription Kit试剂盒体外获得靶向基因的gRNA的mRNA产品；
(3)本实施例中使用的crRNA和tracrRNA的基因序列如下：
crRNA1：gaccctgacctgctcacctggttttagagcta(SEQ ID NO.7)
crRNA2：gaccatgaactgctcacttggttttagagcta(SEQ ID NO.8)
crRNA3：gaagcagtgtggcggcagctgttttagagcta(SEQ ID NO.9)
tracrRNA1：tagcaagttaaaataaggctagtcatttatcacattgaaaatctggcaccgagtcggtg(SEQ ID NO.13)。
2、T细胞的分选和激活
(1)将成人外周血在1000g离心10分钟后收集血浆，将剩余血液用医用生理盐水稀释一倍，采用Ficoll密度梯度离心法分离血液中的外周血单个核细胞(PBMC)，用MACS的PanT分选试剂盒富集PBMC中的T细胞；
(2)用MACS激活试剂盒激活T细胞24小时，洗脱激活磁珠，并用PBS洗涤得到T细胞备用；
3、诱导重编程
为了对试剂成分的加入量以及电转条件进行优化，本步骤中设计不同对照组和实验组，以提高重编程效率和重编程后细胞的功能。
(1)将crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白按照1:2:2的比例混匀，得到RNP混合溶液，然后室温静置10min；
(2)将激活的T细胞平均分成5个组，每组大约2.5×106个细胞，分别记为电转RNP组(包括RNP-A组、RNP-B组和RNP-C组)、电转质粒组(简称质粒组)和WT(野生)组，其中RNP-A组加入40μM混合溶液，RNP-B组加入100μM混合溶液，RNP-C组加入150μM混合溶液，质粒组加入PX458-gBCL11b质粒作为阳性对照组，WT组作为阴性对照组。
(3)通过电转化(T-023，LONZA Amaxa Nucleofector，Lonza)将各组成分转导入激活的T细胞，电转程序为Lonza 2B程序T0023，Lonza 4D；然后小心吸取电转后的细胞置于T551-H3完全培养基中培养。
(4)电转后18小时，低速离心细胞，更换新鲜的T551-H3完全培养基继续培养，电转后第9天，RNP-A组、RNP-B组、RNP-C组、质粒组中均出现了既表达T细胞标志物CD3又表达NK细胞标志物NKp46和NKp30的亚群，则确定获得了ITNK细胞。
实施例2
本实施例中对实施例1中各实验组细胞的生长状态和表型进行监测并比较。
电转后第9天，电转RNP组(RNP-A、RNP-B和RNP-C组)和质粒组中均出现了既表达T细胞标志物CD3又表达NK细胞标志物NKp46和NKp30的亚群。
实验结果如图1所示，CD8阳性细胞群中，质粒组NKp30阳性比例仅为39.6％(26.5％+13.1％)，而电转RNP-A、B、C三组的NKp30比例分别为51.42％、40.6％和61.6％，NKp46比例无较大差异；
而CD4阳性细胞群中，质粒组NKp30比例为40.35％，RNP-C组为41.46％，比例相似。
综合以上结果说明，和直接电转CRISPR/CAS9质粒相比，电转RNP复合物的第三组(即RNP-C组)中获得的ITNK细胞表型的T细胞比例更高，即RNP-C组的重编程效率更高。
实施例3
本实施例用于比较电转RNP复合物与直接电转质粒获得的重编程ITNK细胞的体外扩增能力。
在电转结束并更换新鲜培养基后，定期监测细胞的生长状态；每隔一天用台盼蓝进行细胞计数，得到图2所示的各组细胞体外扩增曲线图和表1中记载的不同组的细胞数量。
表1
组别 RNP-A组 RNP-B组 RNP-C组 质粒组
D2的细胞个数/(×10<sup>6</sup>个) 2.5 2.5 2.5 2.5
D3的细胞个数/(×10<sup>6</sup>个) 1.6 1.26 1.61 0.98
D7的细胞个数/(×10<sup>6</sup>个) 5.04 5.1 3.54 2.29
D9的细胞个数/(×10<sup>6</sup>个) 11.7 11.34 12.24 5.87
D11的细胞个数/(×10<sup>6</sup>个) 31.95 48.15 48.9 13.24
D14的细胞个数/(×10<sup>6</sup>个) 67 155.5 137 41.04
扩增倍数/倍 26.8 62.2 54.8 16.4
以上结果表明，结果表明，各组起始细胞数均为2.5×106个，以电转当天为D1，电转完第二天(D3)直接电转ITNK质粒组细胞仅剩0.98×106个，低于电转RNP的其他三组；培养完成后RNP电转三组的细胞扩增比例均高于电装质粒组。电转RNP复合物组的扩增倍数在D14时达到26.8～62.2倍，且其中RNP-B组细胞的扩增能力最高，远高于电转质粒组的扩增倍数，说明本发明提供的方法可以减少重编程后对细胞的毒性，更有利于细胞的体外扩增和培养。
实施例4
本实施例用于比较电转RNP复合物与直接电转质粒获得的重编程ITNK细胞的识别和杀伤肿瘤细胞的能力。
为确定本发明中通过电转RNP体系重编程得到的ITNK细胞是否和电转Cas9质粒重编程的ITNK细胞一样具有体外杀伤功能，将各组细胞按照不同的效靶比与K562-GL细胞共孵育，24小时后检测杀伤效率。
检测结果如图3所示，当效靶比较高时，各组均对靶细胞表现出了较强的杀伤能力，但当效靶比(E:T)，即ITNK和靶细胞的比例，降低至于1:2甚至更低时，如1:16，电转RNP组对靶细胞的杀伤能力明显强于电转质粒组。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法
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Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，其特征在于，所述方法通过电转化将RNP复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞；
所述RNP复合物包括crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)；
优选地，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNP复合物的摩尔浓度为40～120μM；
优选地，电转时所述RNP复合物与细胞的使用量比例为(2～100)μL:106个细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQID NO.7～12所示；
优选地，所述tracrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述crRNA的靶基因包括Bcl11b基因。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述电转化的电压为1.5～2.5kV，时间为3～5ms。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述电转化结束后，所得细胞悬液置于完全培养基中培养；
优选地，所述完全培养基包括T551-H3完全培养基。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞采用Ficoll密度梯度离心法进行分离；
优选地，所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白制成RNP复合物，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示，所述tracrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示，所述crRNA的靶基因为Bcl11b基因；
(2)采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血得到外周血单个核细胞，采用磁珠分选方法进行分选得到T细胞，并激活所述T细胞；
(3)将步骤(1)所述的RNP复合物电转入步骤(2)所述激活的T细胞中，再转入完全培养基中培养，培养18～24小时后，更换新鲜的完全培养基继续培养，得到所述ITNK细胞。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法制备得到的ITNK细胞。
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