CN108165581B - 采用单链核苷酸片段体外修复hba2基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用单链核苷酸片段体外修复HBA2基因突变的方法，包括以下步骤：根据HBA2基因突变位点上下游的序列设计sgRNA和ssODN；sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，ssODN的序列如SEQ.ID.NO.2所示；构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，提取质粒并沉淀浓缩；通过电转仪将上述质粒和ssODN转入患者iPS细胞；利用流式仪分选EGFP荧光阳性克隆并接种细胞；测序鉴定单克隆，获得打靶修复成功的细胞系。CRISPR/Cas9在基因定点修饰方面应用广泛，且制作简单、作用高效。另外，利用长度为100bp的单链核苷酸片段合成简易，而且能成功实现同源重组。

Description

采用单链核苷酸片段体外修复HBA2基因突变的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因编辑技术，特别涉及一种采用单链核苷酸片段体外修复HBA2基因突变的方法。

背景技术

基因编辑是指对基因序列进行编辑，实现对目标DNA片段的敲除、插入等操作。基因打靶技术属于基因编辑的一种方式，是指通过外源基因与基因组之间进行同源重组，从而实现目标DNA片段的基因定点修饰。这种方法是研究基因功能的重要手段之一，也被用于治疗人类遗传性疾病，是一种重要且热门的生物技术。

早在20世纪70年代，在酵母的研究中人们就提出了基因打靶技术。1985年，Smithies等人在肿瘤细胞中第一次实现基因打靶，成功对β球蛋白基因进行定位编辑。之后这项技术开始被应用于各个领域，但是此时同源重组的效率是很低的，直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)的出现。

ENN利用特异性的核酸序列定位，通过核酸内切酶对目标DNA进行切割，并产生双链断裂(double strand breaks，DSB)。此时，基因组会启动DNA自我修复机制：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端重组(Non-homologous end joining，NHEJ)，通过这两种方式实现对断裂的双链修复，从而达到基因编辑的目的。

目前有三类应用较为广泛的ENN。锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代ENN。锌指是能够结合DNA的一类蛋白质，存在于许多转录因子中。ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。

类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effectornuclease，TALEN)是第二代ENN，也是由DNA结合蛋白与核酸内切酶Fok I融合而成。相对于ZFN，TALEN构建简单，特异性高。

2013年初，一种全新的第三代ENN，clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9出现，其优势为制作简单、耗时短、成本低、作用高效，很快被运用广泛。

CRISPR来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制，是规律成簇间隔短回文重复。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。在噬菌体或是质粒中，与间隔序列对应的序列被称为原间隔序列(protospacer)，而原间隔序列5′或是3′端延伸的几个碱基序列非常保守，被称为原间隔序列临近基序(protospacer adjacentmotifs，PAM)，一般常见的形式为NGG。在基因编辑中，Type II系统为常用的CRISPR/Cas9类型，其原理是首先转录并剪切为成熟的cr-RNA，和tracRNA组成sgRNA，再与特异的Cas9蛋白形成核糖核蛋白复合物，通过识别NGG，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对，引导Cas9蛋白对DNA实现定点双链切割。

早在1987年日本一课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现此串联间隔重复序列。直到2008年，Marraffini等人首次利用实验验证了CRISPR系统的功能。2012年Martin等改造Type II型CRISPR/Cas9。紧接着2013年张锋研究组首次报道利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Ner02A细胞的Th基因实现了定点突变，从而开启了在各个领域运用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶的时代。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌等的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDel突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。

地中海贫血是一类致死致残的遗传性疾病，是由于珠蛋白基因发生缺陷，导致珠蛋白链合成降低或者缺失，使血红蛋白的α链与非α链比例失衡，导致的溶血性疾病。HBA2基因的突变或者缺失会导致α珠蛋白的产量下降，从而导致α地中海贫血。如果染色体4个α基因全部发生缺失，在胎儿体内，会产生过多的γ珠蛋白，形成Hb Bart's胎儿水肿综合征而致死。若其中一条染色体α2-珠蛋白基因终止密码子CD142(UAA＞CAA)突变，只存在一个正常的α1基因，属于Hb CS病，此突变导致产生了31个氨基酸的α珠蛋白链，并降低了mRNA的稳定性，引起表达水平降低，从而造成α地中海贫血。因此，对HBA2基因突变的修复尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外修复HBA2基因突变的方法，该方法运用CRISPR/Cas9系统和单链核苷酸片段(ssODN)体外修复HBA2基因突变，可用于HBA2基因功能的研究，同时为α地中海贫血的基因修复提供一种策略。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种体外修复HBA2基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)根据HBA2基因突变位点上下游的序列设计sgRNA和单链核苷酸片段(ssODN)；

所述sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，合成时需添加Bbs I酶切位点；

所述单链核苷酸片段的序列如SEQ.ID.NO.2所示；

患者一条染色体的α2-珠蛋白基因终止密码子CD142(UAA＞CAA)发生突变，只存在一个正常的α1基因；根据突变位点上下游的序列设计sgRNA，识别NGG；利用ssODN进行基因打靶，根据突变位点上下游的序列设计正确序列的ssODN，长为100bp；

(2)构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，提取质粒并沉淀浓缩；

所述构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，是将sgRNA与其反向互补序列退火，与已经过Bbs I线性化的PX458质粒进行连接；

(3)通过电转仪将上述质粒和ssODN转入患者iPS细胞；

步骤(3)的具体操作是：在生长密度为70-80％的患者iPS细胞(诱导型多能干细胞)中提前加入抗凋亡因子，然后消化细胞并收集，离心后再重复洗涤一遍；将混匀好的质粒、ssODN及电转液对细胞沉淀进行充分重悬，使其处于单细胞均匀状态后利用电转仪进行电击；再将细胞种于已经被基质胶处理过的培养皿中，加入抗凋亡因子继续培养；

所述的抗凋亡因子优选Y-27632；

(4)利用流式仪分选EGFP荧光阳性细胞并将其接种；

步骤(4)的具体操作是：将电转48h后的细胞消化成单细胞，通过流式分选仪将EGFP阳性细胞分选出来，随后将细胞以低密度种于已经被基质胶处理过的培养皿中，使其之后长成单克隆细胞团；

所述的低密度优选600个细胞/cm²的密度；

PX458质粒中含有EGFP序列，电转入细胞后可以表达EGFP荧光蛋白，通过流式分选带荧光的细胞可以收集阳性细胞；

(5)测序鉴定单克隆，获得打靶修复成功的细胞系；

步骤(5)的具体操作是：在流式分选十余天后，单克隆细胞团长得足够大，挑取每个克隆团块的部分细胞，以其为模板进行PCR，将得到的PCR产物进行测序，突变位点C恢复成T的克隆则为阳性细胞系，表示成功体外修复HBA2基因CD142(UAA＞CAA)突变。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的体外修复HBA2基因突变的方法，是构建针对HBA2基因突变的CRISPR/Cas9系统和ssODN，通过sgRNA定位到特异的突变位点，通过Cas9蛋白将DNA双链切开产生缺口，最后以ssODN为模板，进行同源重组而实现体外HBA2基因修复。对比其他人工核酸内切酶，CRISPR/Cas9在基因定点修饰方面应用广泛，且制作简单、耗时短、成本低、作用高效。另外，相较于构建复杂的同源臂等结构进行同源重组，利用长度为100bp的单链核苷酸片段合成简易，而且能成功实现同源重组。具体的方法、参数是通过反复实验摸索得到的。

附图说明

图1是电转后分选EGFP阳性细胞的流式分选结果图。

图2是基因打靶前后患者iPS细胞HBA2基因突变位点测序图；其中，上图为电转前iPS细胞，下图为电转后iPS细胞。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明涉及的试剂和材料如下：诱导型多能干细胞培养液为Essential 8^TM培养基(Life，A15169-01)；Accutase购自Stem cell公司；0.25％胰蛋白酶购于Gibco公司；基质胶Matrigel购自Corning公司；抗凋亡因子Y-27632购自Sigma公司。高温灭菌的D-PBS缓冲液实验室配制。2×Pfu PCR MasterMix和质粒中提试剂盒购自天根公司。引物合成于捷瑞公司。限制性内切酶购自NEB公司，T4DNA连接酶购自TAKARA公司。电转仪及电转液购自Invitrogen公司，流式仪购自BD公司。

实施例

一种体外修复HBA2基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)本发明的iPS细胞来自广州医科大学附属第三医院的α地中海贫血HbH-CS型CD142(UAA＞CAA)的患者，其HBA2基因突变为c.427T＞C，属于其中一条染色体α2-珠蛋白基因终止密码子CD142(UAA＞CAA)突变，只存在一个正常的α1基因。

首先根据突变位点上下游的序列设计识别NGG的sgRNA，长度为20bp，并在其5′端添加碱基G，以提高转录效率，序列如下：gaccuccaaauaccgucaagc(SEQ.ID.NO.1)；合成时需添加Bbs I酶切位点；

设计ssODN，长度100bp，序列如下：ctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagcttgagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaac(SEQ.ID.NO.2)。

(2)将所合成的添加了Bbs I酶切位点的sgRNA双向引物进行退火，合成的双链01igo与已经过Bbs I线性化的载体骨架PX458(CRISPR/Cas9系统质粒)于16℃下进行连接，转化至Dh5a感受态中，进行涂板(氨苄抗性)，放置于37℃培养箱过夜后挑单克隆菌，在含氨苄抗性的LB培养基中，培养16h，测序鉴定阳性克隆。

测序正向引物为：ccccaccaccaagaccta(SEQ.ID.NO.3)；

反向引物为：cactccagccacctaccct(SEQ.ID.NO.4)。

使用试剂盒将鉴定正确的菌液进行质粒抽提。提取后，加入其体积1/10的3M乙酸钠，再加入3倍体积的无水乙醇，置于-80℃。电转细胞前将质粒沉淀浓缩，步骤如下：4℃12000g离心30分钟，去上清。加入1ml 75％乙醇，上下颠倒后，4℃12000g离心5分钟，重复一次75％乙醇清洗沉淀。尽量弃尽上清，晾干乙醇，10ul双蒸水溶解沉淀，测浓度后用于电转。

(3)在生长密度为70-80％的患者iPS细胞中提前加入抗凋亡因子；Accutase消化细胞并进行收集，离心后再重复洗涤一遍。将混匀好的质粒、ssODN及电转液对细胞沉淀进行充分重悬，使其处于单细胞均匀状态后利用电转仪进行电击。将细胞种于已经Matrigel处理过的培养皿中，加入抗凋亡因子继续培养。电转后48h，将细胞消化成单细胞，通过流式分选仪将EGFP阳性细胞分选出来(结果如图1所示)，随后将细胞以600个/cm²的密度种于已经Matrigel处理过的培养皿中，使其之后长成单克隆。

(4)流式分选十余天后，单克隆细胞团长得足够大时，挑取每个克隆团块的部分细胞，以其为模板进行PCR，将得到的PCR产物进行测序(结果如图2所示)，突变位点C恢复成T的克隆则为阳性细胞系，表示成功体外修复HBA2基因CD142(UAA＞CAA)突变。

测序上游引物：caagacctacttcccgcacttc(SEQ.ID.NO.5)；

测序下游引物：ctcactccagccacctaccct(SEQ.ID.NO.6)。

并进行STR测序，打靶前后的细胞以及病人外周血单个核细胞均一致，表明是同一株细胞。

以上结果证明应用本发明的方法可以成功体外修复HBA2基因突变，并且简易、耗时短。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种体外修复HBA2基因突变的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据HBA2基因突变位点上下游的序列设计sgRNA和单链核苷酸片段；

所述sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述单链核苷酸片段的序列如SEQ.ID.NO.2所示；

(2)将sgRNA与其反向互补序列退火，与经过BbsⅠ线性化的PX458质粒进行连接，构建携带sgRNA和CRISPR/Cas9蛋白的质粒，提取质粒并沉淀浓缩；

(3)在生长密度为70-80％的患者iPS细胞中提前加入抗凋亡因子，然后消化细胞并收集，离心后再重复洗涤一遍；将混匀好的质粒、ssODN及电转液对细胞沉淀进行充分重悬，使其处于单细胞均匀状态后利用电转仪进行电击；再将细胞种于已经被基质胶处理过的培养皿中，加入抗凋亡因子继续培养；

(4)将电转48h后的细胞消化成单细胞，通过流式分选仪将EGFP阳性细胞分选出来，随后将细胞以低密度种于已经被基质胶处理过的培养皿中，使其之后长成单克隆；

(5)测序鉴定单克隆，获得打靶修复成功的细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的抗凋亡因子是Y-27632。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的低密度是指600个细胞/cm²。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(5)是：在流式分选十余天后，单克隆细胞团长得足够大，挑取每个克隆团块的部分细胞，以其为模板进行PCR，将得到的PCR产物进行测序，突变位点C恢复成T的克隆则为阳性细胞系，表示成功体外修复HBA2基因突变。

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