CN112746071B - 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品 - Google Patents

一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种造血干细胞HBB基因修复的方法及产品，所述方法利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术靶向敲除β‑地中海贫血(地贫)中缺失位点密码子41/42(‑TCTT)的技术，通过设计并合成能识别引导Cas9蛋白至目标基因靶序列的sgRNA，将其与Cas9蛋白混合电转导入β‑地贫密码子41/42(‑TCTT)造血干细胞中，同时引入同源重组供体高效修复该突变位点处氨基酸的正常编码功能，恢复β‑珠蛋白基因的正常表达。本发明利用现有基因编辑技术编辑输血依赖型β‑地贫密码子41/42(‑TCTT)，修复效率高，修复后的患者造血干细胞在自体移植后可以重建患者血液系统并治疗地中海贫血疾病。

Description

一种造血干细胞HBB基因修复的方法及产品
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种造血干细胞HBB基因修复的方法及产品。
背景技术
近年细菌和古细菌中一种用来抵御噬菌体和质粒等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制得到了阐释。该系统由Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats(CRISPR)和CRISPR-associated(CAS)基因组成。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。适应阶段，CRISPR系统会将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，该前体在Cas蛋白和反式编码小RNA(trans-encoded smallRNA，tracrRNA)的存在下会在重复序列处被进一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成Cas/crRNA复合体。干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas/crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA断裂，从而使靶标DNA失去原有功能。其中与靶点3′端紧邻的3个碱基必须是5′-NGG-3′的形式，从而构成Cas/crRNA复合体识别靶点所需的PAM(protospacer adjacent motif)结构。
CRISPR系统分为I，II，III型三个家族，其中II型系统仅需要Cas9蛋白即可在tracrRNA的协助下将pre-crRNA加工成与tracrRNA结合的成熟crRNA。人们发现通过人工构建模拟crRNA：tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA，又称sgRNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割，从而为在目标物种中利用CRISPR系统对目标DNA进行修饰提供了广阔的前景。
β-地中海贫血是一种常见的由于β-珠蛋白基因(HBB基因)缺陷导致成人血红蛋白异常的遗传性疾病，我国“地贫”基因携带者约3000万人，涉及近3000万家庭、1亿人口，其中重型和中间型“地贫”患者约30万人。其中，密码子(Codon)41/42(-TCTT)基因型是我国“地贫”中最为多见的一种，发病机制为HBB基因密码子41/42(-TCTT)移码突变造成氨基酸编码异常并形成终止密码子导致蛋白翻译的提前终止，最终使得HBB基因的功能丧失。目前，中间型和重型患者需要长期输血和去铁治疗来维持生命，唯一根治方式为异体造血干胞移细植术，但主要实施障碍是我国血液资源的紧缺、异体造血干细胞配型困难及移植相关并发症等。其中，利用慢病毒载体进行基因治疗，表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具致癌风险。同时慢病毒中的表达元件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，即有可能无法达到终身治愈的目的。另外，临床所需的高浓度、高质量的慢病毒对设备和技术的要求极高，因此成本很难降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的临床方案是非常有必要的。
理想的基因治疗方法，是修复或破坏患者造血干细胞DNA中传统的地贫突变，使之重新恢复基因功能，并在内源转录控制因子的作用下永久产生野生型成体β-珠蛋白，从而正常分化为红系细胞。DNA序列在基因编辑后的修复方式以非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)修复为主，同源重组介导的修复(Homology directedrepair，HDR)所占的比例较低，而修复点突变需要高效的HDR效率。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种造血干细胞HBB基因修复的方法及产品。所述方法利用CRISPR-Cas9系统对密码子41/42(-TCTT)导致的氨基酸编码异常进行修复。
发明人针对密码子41/42(-TCTT)移码突变导致的氨基酸编码异常进行了深入的研究，发现密码子41/42(-TCTT)的突变使得编码HBB基因的第42个密码子处缺失TCTT从而造成氨基酸编码的紊乱，并在缺失位点后不远处形成终止密码子使得蛋白翻译提前终止，导致基因功能的丧失。
理论上，CRISPR-Cas9系统切割目标DNA位点产生双链断裂，会出现大概率的移码突变，其中在致病位点处indel后碱基数的改变若为3n+4(n为整数)，即有可能修复患者基因型中的氨基酸编码紊乱，发明人采用的策略大大增加了DNA修复过程中同源重组的概率，可增加基因组区域正常转录产生的β-珠蛋白mRNA比例，并翻译产生正常的β-珠蛋白。
本发明针对致病位点的移码突变，靶向切割目标DNA并引入供体实现高效HDR。在临床上，只需将基因编辑后大幅提高HDR方式修复的自体造血干细胞移植回体内，便可达到治愈的目的。
在一个实施方式中，可以采用CRISPR-Cas9靶向目标DNA造成双链断裂并同时引入长链供体(ssODN)。
优选的，采用CRISPR-Cas9系统时，所设计的sgRNA的靶向序列在密码子41/42(-TCTT)位点前1bp。
本发明中，所述CRISPR-Cas系统是指适合被人工改造的CRISPR-Cas系统、源于古细菌II型(CRISPR)-CRISPR-associated protein(Cas)系统的核酸酶体系，与ZFN和TALEN相比，该体系更简单、操作更方便。
本发明采用RNA引导的核酸内切酶(RNA-guided endonucleases，RGENs)实现对目标基因序列的特异性切割。RGENs由嵌合型的引导RNA和Cas9蛋白组成，其中前者是将天然存在的II型CRISPR-Cas系统中的CRISPR RNAs(crRNAs)与trans-activating crRNA(tracrRNA)融合成一条单链引导RNA(sgRNA)，从而与Cas9蛋白结合并引导后者对目标DNA序列进行特异性的切割，切割将形成双链断裂(double strand break,DSB)，该损伤通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)进行修复可高效修复目标基因的突变，以同源重组方式对致病位点处进行完全修复。
所述Cas9可以选自Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus或N.meningitidis来源的Cas9。所述Cas9可以选自野生型的Cas9，也可以选自突变型的Cas9；所述突变型的Cas9不导致Cas9的切割活性和靶向活性丧失。
在其他的实施方式中，还可以采用其他的Cas酶替换Cas9。
在实施方式中，采用sgRNA进行目标序列的切割，所述sgRNA的靶向序列分别为TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)，sgRNA可以引导Cas9在密码子41/42(-TCTT)位点上游1个碱基处切割DNA造成双链断裂，同时引入正常供体进行同源重组，从而最大概率修复氨基酸编码的紊乱。
在一个实施方式中，采用正常基因型长链供体(ssODN)进行同源重组，所述ssODN序列为TCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGG(SEQ ID No.8)，ssODN作为健康供体引入同源重组。
采用CRISPR-Cas9靶向目标DNA造成双链断裂并同时引入供体ssODN，可在DNA修复过程中引入同源重组，进一步使得基因组区域转录产生正常的HBB基因的mRNA，并翻译产生正常的β-珠蛋白。
发明详述：
一方面，本发明提供了一种修复细胞中HBB(β-珠蛋白基因)密码子移码突变的方法，包括利用核酸酶和sgRNA引入细胞、对HBB基因进行基因编辑的步骤，所述sgRNA引导核酸酶对HBB基因进行切割并形成断裂位点；所述密码子移码突变为密码子41/42(-TCTT)的突变所导致的移码突变；所述sgRNA靶向HBB基因的靶向序列包括密码子41/42(-TCTT)位点的上游1bp；
优选的，所述sgRNA靶向HBB基因的靶向序列包含SEQ ID No.1-7中任一所示的序列；更优选的，所述sgRNA靶向HBB基因的靶向序列包含SEQ ID No.1所示的序列。
所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为Cas9；更优选的，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
所述sgRNA还包括碱基的化学修饰；优选的，所述化学修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。
在一个实施方式中，所述sgRNA包括碱基的化学修饰。在优选的实施方式中，所述sgRNA包括5’末端第1-n位碱基的任意一个或任意几个碱基的化学修饰，和/或3’末端第1至n位碱基的任意一个或任意几个碱基的化学修饰；所述n选自2、3、4、5、6、7、8、9或10。优选的，sgRNA包括5’末端一个、两个、三个、四个或五个碱基的化学修饰，和/或3’末端一个、两个、三个、四个或五个碱基的化学修饰。例如，在sgRNA的5’末端第1位碱基、第2位碱基、第3位碱基、第4位碱基、第5位碱基或第1-2位碱基、第1-3位碱基、第1-4位碱基、第1-5位碱基进行化学修饰；和/或，在sgRNA的3’末端第1位碱基、第2位碱基、第3位碱基、第4位碱基、第5位个碱基或第1-2位碱基、第1-3位碱基、第1-4位碱基、第1-5位碱基进行化学修饰。在优选的实施方式中，所述化学修饰为甲基化修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。
所述方法还包括提供供体修复模板以及将供体修复模板引入细胞的步骤；优选的，所述供体修复模板包括所述HBB密码子41/42(-TCTT)对应的正常序列。
在优选的实施方式中，所述供体修复模板的序列如SEQ ID No.8所示，优选的，所述供体修复模板采用hPAGE纯化。
在上述方法中，所述细胞为造血干细胞，优选的，所述细胞为CD34+的造血干祖细胞。
在上述方法中，所述将核酸酶、sgRNA或供体修复模板引入细胞的方式包括：载体转化、转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射；优选的，采用电穿孔的方式；更优选的，将核酸酶和sgRNA形成复合物，或者将核酸酶、sgRNA和供体修复模板形成复合物，再将复合物通过电穿孔的方式引入到细胞中。
在优选的实施方式中，采用电转化的方法向细胞中引入包含Cas9和sgRNA及供体修复模板的复合物。
进一步的，所述Cas9和sgRNA的摩尔比为1:(0.5-3)，优选的，1:(1-2)，更优选1:1，优选的，供体修复模板的引入量为100μM。
进一步的，所述Cas9和sgRNA通过温育形成复合物；优选的，所述温育的温度为20-50℃，优选，25-37℃；优选的，所述温育的时间为2-30分钟，优选，5-20分钟。
进一步的，所述包含Cas9和sgRNA的复合物与细胞的用量比例为20-100μg复合物：(1×102-1×106个)细胞，优选的，为30μg复合物：(1×103-1×105个)细胞。
进一步的，将电转后的细胞在CD34+EDM-1分化体系中培养7天，提取上述步骤所得细胞的基因组DNA进行基因型鉴定，确定突变效率；待确定突变后进行EDM-2阶段分化4天，EMD-3阶段分化7天，分化结束后提取RNA,反转录为cDNA，qPCR检测HBB基因的mRNA。
本发明保护以上任一所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。进一步的，所述细胞为造血干细胞，优选的，所述细胞为CD34+的造血干祖细胞；更优选的，所述细胞为离体细胞。
另一方面，本发明提供了一种用于修复由HBB密码子移码突变导致氨基酸编码异常的sgRNA，所述密码子移码突变为密码子41/42(-TCTT)的突变所导致的移码突变；所述sgRNA的靶向序列为SEQ ID No.1-7所示；优选的，所述sgRNA的靶向序列为SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明保护以上任一所述sgRNA或所述细胞在制备治疗和/或预防β地中海贫血症的产品中的应用。
有益效果：
本发明针对HBB基因的密码子41/42(-TCTT)的靶向区域设计了sgRNA，为在基因组上进行更为精确和灵活的编辑提供了可能。将上述sgRNA与Cas9蛋白引入β-地贫密码子41/42(-TCTT)的造血干细胞，能高效切割致病位点，通过DNA双链断裂(double strand break,DSB)以及引入外源正常供体进行同源重组能最大可能修复目标基因的移码，快速高效恢复HBB基因的表达，使β地贫病人的β-珠蛋白表达得到了极大提高。本发明的修复效率最高可达24％，显著高于采用ZFN、TALEN所能达到的效率，且能够高效修饰自体造血干细胞持久平衡造血系统，大大节省实验时间以及人力物力的投入。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为CRISPR/Cas9系统作用原理示意图。
图2为β-地贫密码子41/42(-TCTT)移码突变位点及sgRNAs的示意图。
图3为不同sgRNAs结合外源模板ssODN修复HBB基因的效率。
图4为Sanger测序结果示意图。其中，上图是空白对照组1；中图是空白对照组2；下图是实验组(电转sgRNA+ssODN)。
图5为患者造血干细胞致病位点修复分化后珠蛋白qPCR示意图。
图6为患者造血干细胞致病位点编辑分化为红细胞时的去核率分析。结果显示编辑过后的细胞具有更高的去核率。
图7为患者造血干细胞致病位点编辑分化为红细胞后的细胞体积分析。结果显示编辑过后的细胞具有更大的体积。
图8为编辑过后的造血干细胞在移植免疫缺陷小鼠四个月后成功归巢，并且具有和未编辑细胞相似的归巢效率。
图9为编辑过后的造血干细胞在移植免疫缺陷小鼠四个月后可以在小鼠骨髓中成功分化为包括B细胞和Myeloid在内的各种血液细胞。
图10为被移植小鼠骨髓中人源细胞的修复效率分析。其中，I表示移植前的CD34阳性细胞，E表示移植后小鼠骨髓中的人源细胞。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。
如图1所示，本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向破坏β-地中海贫血中异常突变位点密码子41/42(-TCTT)，构建能识别并引导Cas9蛋白至目标基因靶序列的引导RNA序列(sgRNA)，是一种靶向致病目标DNA并使其发生改变的方法，该方法包括：向缺陷造血干细胞引入识别目标基因的sgRNA编码核酸及Cas9蛋白，从而对目标基因组DNA序列进行识别和切割并引入外源供体进行同源重组。然后，将细胞进行体外培养，使核酸酶表达并在致病位点附近的目标基因组DNA发生双链断裂，接着对该DNA断裂位点进行修复。
其中，修复方式包括：(a)非同源末端连接修复：导致基因突变(碱基插入、缺失)被引入到目的基因组序列中。(b)同源重组修复：使外源供体序列引入到目标基因组DNA序列中，导致内源目标基因序列的改变。本实施方式中，引入ssODN作为外源供体。
实施例1、在β-地贫密码子41/42(-TCTT)造血干细胞同源重组高效恢复基因功能
本实施例中患者为β-地贫双重杂合子，基因型为CD41-42/CD71-72。
1、sgRNA的设计
基于密码子41/42(-TCTT)致病位点前1bp处有合适的PAM靶向切割，在致病位点处设计多条sgRNA，各条sgRNA的靶向序列(图2)如下：
sgRNA-1：TCCCCAAAGGACTCAACCTC(SEQ ID No.1)，
sgRNA-2：CCCCAAAGGACTCAACCTCT(SEQ ID No.2)，
sgRNA-3：GGACTCAACCTCTGGGTCCA(SEQ ID No.3)，
sgRNA-4：GACTCAACCTCTGGGTCCAA(SEQ ID No.4)，
sgRNA-5：GACCCAGAGGTTGAGTCCTT(SEQ ID No.5)，
sgRNA-6：ACCCAGAGGTTGAGTCCTTT(SEQ ID No.6)，
sgRNA-7：CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG(SEQ ID No.7)。
2、sgRNA、Cas9蛋白的制备
3、同源重组供体的设计和制备
所述同源重组供体为正常基因型长链供体(ssODN)，序列为TCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTG AGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGG(SEQID No.8)，采用hPAGE纯化。
4、sgRNA以及Cas9蛋白复合物的制备和电转
a实验组
将经由化学修饰合成的sgRNA-1～7分别与Cas9蛋白按摩尔比1:1混合室温孵育10min后形成复合物，加入1μl浓度为100μM的步骤3制备的供体；制备得到7种sgRNA、Cas9蛋白和同源重组供体复合物；分别按照如下方式电转：
按电转试剂盒比例混合电转液，取患者来源造血干细胞，电转数量不超过105个，将细胞离心后使用电转液重悬，再与上述孵育的sgRNA和Cas9蛋白、同源重组供体复合物轻轻混匀(sgRNA和Cas9蛋白的复合物与造血干细胞的用量之比为30μg复合物：1×105个细胞)后转移至电转杯，操作过程中避免产生气泡；使用CD34细胞电转程序EO-100进行电转(Lonza-4D电转仪)；
确认电转成功后待细胞室温静置孵育5min，重新离心去除Cas9蛋白和电转液，CD34+EDM-1培养基重悬细胞后加入细胞培养板37℃分化培养，完成对患者缺陷型造血干细胞致病突变位点的破坏。
b空白对照组1(CK1)
电转靶细胞为健康人来源造血干细胞，按照a的方法进行，不同之处在于：将sgRNA、Cas9蛋白和同源重组供体复合物替换为等体积的水。
c空白对照组2(CK2)
电转靶细胞为患者来源造血干细胞，按照a的方法进行，不同之处在于：将sgRNA、Cas9蛋白和同源重组供体复合物替换为等体积的水。
5、目标基因编辑的鉴定
(1)基因组DNA的突变鉴定
将步骤4电转后的造血干细胞体外分化培养3-4天后，收集适量细胞，提取基因组，PCR扩增后Sanger测序检测修复效率(即HBB恢复正常的细胞数量占被检细胞数量的比例)，剩余细胞继续在EDM-1培养基中分化至第7天，检测结果如图3和图4所示。
其中，PCR扩增引物序列如下：
41/42-check-F：GCTTCTGACACAACTGTGTTC(SEQ ID No.9)；
41/42-check-R：CCACACTGATGCAATCATTCG(SEQ ID No.10)。
图3显示，电转后患者来源造血干细胞目标位点的修复效率足够高，均在15％以上，其中sgRNA-1最高，达24％。
图4显示，上图的空白对照组1(健康人来源造血干细胞，未导入任何RNP(核糖核蛋白))，测序峰图正常；中图的空白对照组2(CD41-42/71-72患者来源造血干细胞，未导入任何RNP)，测序峰图显示CD41-42(-TCTT)杂合突变；下图的实验组(电转sgRNA+ssODN)，测序峰图显示从sgRNA切割位点处由于随机数目的碱基丢失而产生杂峰。
(2)q-PCR分析致病位点突变后的造血干细胞中β珠蛋白含量变化
待Sanger测序后确定目标位点突变成功后即可在EDM-2培养基中继续分化4天，此阶段细胞可大量扩增，待EDM-2分化阶段结束，将细胞转移至EDM-3中继续分化7天，待分化结束后提取造血干细胞RNA反转录获得cDNA，q-PCR分析致病位点突变后的造血干细胞HBBmRNA含量变化。
其中，q-PCR特异检测HBA(内参)和HBB所用引物对序列如下：
HBA-S：GCCCTGGAGAGGATGTTC(SEQ ID No.11)；
HBA-AS：TTCTTGCCGTGGCCCTTA(SEQ ID No.12)；
HBB-S：TGAGGAGAAGTCTGCCGTTAC(SEQ ID No.13)；
HBB-AS：ACCACCAGCAGCCTGCCCA(SEQ ID No.14)。
结果：如图5所示，与CK1的健康人来源的造血干细胞相比，CK2的患者来源的造血干细胞的HBB与HBA的mRNA比值几近为零，而实验组中经sgRNA-1+ssODN编辑后的造血干细胞中，HBB与HBA的mRNA比值增加到了30％以上。此比例足以消除HBA水平过高导致的红细胞毒性，可以有效缓解地中海贫血症状。
(3)分化为红细胞时的去核率和细胞体积分析
检测患者造血干细胞致病位点编辑分化为红细胞时的去核率，结果如图6所示，实验组中经sgRNA-1+ssODN编辑过后的患者造血干细胞具有更高的去核率(Y轴为去核率，X轴为不同患者来源的造血干细胞)。
检测患者造血干细胞致病位点编辑分化为红细胞后的细胞体积，结果如图7所示，实验组中经sgRNA-1+ssODN编辑过后的患者造血干细胞具有更大的体积(Y轴为细胞体积，X轴为不同患者来源的造血干细胞)。
实施例2、编辑过后的造血干细胞
将实施例1实验组中经sgRNA-1+ssODN编辑过后的患者造血干细胞移植免疫缺陷小鼠，四个月后成功归巢，具有和未编辑细胞相似的归巢效率(如图8所示，Y轴显示小鼠骨髓中人源细胞比例)；且可以在小鼠骨髓中成功分化为包括B细胞和髓细胞在内的各种血液细胞(图9)；且小鼠骨髓中人源细胞的修复效率分析结果(图10)显示，有很大一部分细胞(Y轴)在移植后仍然拥有被修复的HBB基因。
以上结果表明，经sgRNA-1+ssODN编辑过后，患者造血干细胞功能正常，并未受到影响，且成功修复了能长期归巢的造血干细胞中的HBB基因。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
序列表
<110> 华东师范大学 上海邦耀生物科技有限公司
<120> 一种造血干细胞HBB基因修复的方法及产品
<130> JH-CNP191175
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccccaaagg actcaacctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccccaaagga ctcaacctct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggactcaacc tctgggtcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gactcaacct ctgggtccaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacccagagg ttgagtcctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acccagaggt tgagtccttt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccagaggtt gagtcctttg 20
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg agtcctttgg 60
ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg 90
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcttctgaca caactgtgtt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccacactgat gcaatcattc g 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gccctggaga ggatgttc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttcttgccgt ggccctta 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgaggagaag tctgccgtta c 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
accaccagca gcctgccca 19

Claims (13)

1.一种非疾病诊断治疗目的的修复细胞中HBB(β-珠蛋白基因)密码子移码突变的方法，其特征在于，所述方法包括利用核酸酶和sgRNA引入细胞、对HBB基因进行基因编辑的步骤，所述sgRNA引导核酸酶对HBB基因进行切割并形成断裂位点；所述密码子移码突变为密码子41/42(-TCTT)的突变所导致的移码突变；所述sgRNA靶向HBB基因的靶向序列包括密码子41/42(-TCTT)位点的上游1bp；
所述sgRNA靶向HBB基因的靶向序列为SEQ ID No.6所示的序列；
所述方法还包括提供供体修复模板以及将供体修复模板引入细胞的步骤；
所述供体修复模板的序列如SEQ ID No.8所示；
所述细胞为CD34+的造血干祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶选自Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1中的一种或任意几种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸酶为Cas9。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Cas9选自来源于肺炎链球菌、化脓性链球菌或嗜热链球菌的Cas9。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA还包括碱基的化学修饰。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学修饰为甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供体修复模板采用hPAGE纯化。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将核酸酶、sgRNA或供体修复模板引入细胞的方式包括：载体转化、转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将核酸酶、sgRNA或供体修复模板引入细胞的方式为采用电穿孔的方式。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将核酸酶和sgRNA形成复合物，或者将核酸酶、sgRNA和供体修复模板形成复合物，再将复合物通过电穿孔的方式引入到细胞中。
11.权利要求1-10中任一所述的方法制备得到的基因编辑的细胞。
12.一种用于修复由HBB密码子移码突变导致氨基酸编码异常的sgRNA，所述密码子移码突变为密码子41/42(-TCTT)的突变所导致的移码突变；所述sgRNA的靶向序列为SEQ IDNo.6所示。
13.权利要求12所述sgRNA或权利要求11所述细胞在制备治疗和/或预防β地中海贫血症的产品中的应用。
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