具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
实验例1
验证该试剂盒对HBB基因的切割效率
1、改造SpCas9蛋白
将SpCas9蛋白(GI:81533697)的第848位赖氨酸突变成丙氨酸及第1003位赖氨酸突变成丙氨酸及第1060位精氨酸突变成丙氨酸,获得的改造后的SpCas9蛋白命名为SpCas9-SZ1蛋白。
将SpCas9蛋白(GI:81533697)的第848位赖氨酸突变成丙氨酸及第925位精氨酸突变成脯氨酸及第1003位赖氨酸突变成丙氨酸及第1060位精氨酸突变成丙氨酸,获得的改造后的SpCas9蛋白命名为SpCas9-SZ2蛋白。
2、构建pSpCas9-SZ(BB)载体
突变pSpCas9(BB)(Addgene plasmid ID:42230)载体中SpCas9的编码序列,使其编码步骤1所述的SpCas9-SZ1酶,新载体命名为pSpCas9-SZ1载体。
突变pSpCas9(BB)(Addgene plasmid ID:42230)载体中SpCas9的编码序列,使其编码步骤1所述的SpCas9-SZ2酶,新载体命名为pSpCas9-SZ2载体。
3、合成特异性靶向HBB基因的sgRNA寡核苷酸序列
合成4组sgRNA序列(HBB-sgRNA1-4),这四组sgRNA序列分别包括如SEQ ID NO.1-4所示的核苷酸序列或其反向互补序列。这四组sgRNA序列(HBB-sgRNA1-4)的命名及核苷酸序列分别见表1:其中,每组sgRNA序列包括两条序列,其中一条为正义链DNA(S),另一条为反义链DNA(AS)。
表1
4、构建psgRNA-HBB-SpCas9-SZ1和psgRNA-HBB-SpCas9-SZ2载体
将sgRNA的序列克隆到pSpCas9-SZ1中,获得sgRNA和SpCas9-SZ1蛋白共表达的重组载体:psgRNA-HBB-SpCas9-SZ1载体。
将sgRNA的序列克隆到pSpCas9-SZ2中,获得sgRNA和SpCas9-SZ2蛋白共表达的重组载体:psgRNA-HBB-SpCas9-SZ2载体。
psgRNA-HBB-SpCas9-SZ1和psgRNA-HBB-SpCas9-SZ2重组载体的结构示意图见图1。其中,U6为驱动sgRNA的启动子,CAG为CMV early enhancer/chickenβactin(CAG)启动子,用于驱动SpCas9-SZ1或SpCas9-SZ2蛋白的表达。
以psgRNA1-HBB-SpCas9-SZ1载体的构建方法为例描述psgRNA-HBB-SpCas9-SZ1和psgRNA-HBB-SpCas9-SZ2重组载体的构建:
(1)配置上述步骤3所述的第1组sgRNA的正义链HBB-sgRNA1-S(SEQ ID NO.5)和第1组sgRNA的反义链HBB-sgRNA1-As(SEQ ID NO.6)的悬液,使其终浓度分别为100μM,按下述体系进行退火:
其中,退火条件为:37℃,30min;95℃,5min;以5℃·min-1的速度降至25℃。退火后的产物命名为HBB-sgRNA1。
(2)将上述步骤4-(1)获得的HBB-sgRNA1用ddH2O按1:200稀释至总体积为200μl。
(3)用BbSI酶酶切步骤2获得的pSpCas9-SZ1载体,所用酶切体系如下:
(4)将步骤4-(2)获得的稀释后的HBB-sgRNA1连接入BbSI酶酶切后的pSpCas9-SZ1载体中:
在步骤(3)所用酶切体系的基础上添加下述组分,
(5)鉴定克隆:将上述步骤4-(4)的连接产物取2μl热转化至Stbl3感受态细胞中,涂布平板,37℃过夜培养。挑取单克隆,37℃摇菌过夜,抽提质粒并进行测序,鉴定HBB-sgRNA1是否插入pSpCas9-SZ1载体的U6启动子和CAG启动子之间。测序结果显示,HBB-sgRNA1正确插入。获得的新载体命名为psg RNA1-HBB-SpCas9-SZ1。
psgRNA2-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA3-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA1-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA2-HBB-SpCas9-SZ2、psgRN A3-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ2载体的构建方法同上述psgR NA1-HBB-SpCas9-SZ1的构建。
测序结果显示,psgRNA2-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA3-HBB-SpCas9-SZ1、p sgRNA4-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA1-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA2-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA3-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ2载体均构建成功。
以下所称psgRNA-HBB-SpCas9-SZ载体为psgRNA1-HBB-SpCas9-SZ1、psg RNA2-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA3-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA1-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA2-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA3-HBB-SpCas9-SZ2、psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ2载体的统称。
5、共表达重组载体转染HEK293T细胞:
按1.5×105个细胞/孔将HEK293T细胞接种于24孔板中,细胞悬液总体积为500μl;
种板24h后进行细胞转染:(1)用无血清培养基将2μg psgRNA-HBB-SpCas9-SZ载体和1μg EGFP载体稀释至250μl,温和混匀;(2)用培养基将脂质体稀释至250μl,室温孵育5min;(3)将上述5-(1)步骤和5-(2)步骤获取的混合物混匀,室温孵育20min;(4)吸去HEK293T细胞中的培养液,将步骤5-(3)获得的混合物加入细胞,细胞置于细胞恒温培养箱37℃孵育6h后换成含10%FBS的DMEM培养基,转染48h后观察转染效率。
6、T7endonucleaseⅠ酶切法检测插入/缺失效率,以验证psgRNA-HBB-SpCas9-SZ对HBB基因切割效率:
(1)收取转染后的细胞;400g离心5min;弃去上清液,用1×PBS重悬细胞。
利用细胞基因组DNA提取试剂盒提取其细胞基因组DNA。
(2)以基因组DNA为模板,利用针对HBB基因的特异性引物按如下程序进行PCR扩增;所述HBB基因的特异性正向引物为SEQ ID NO.13所示核苷酸序列;特异性反向引物为SEQ ID NO.14所示核苷酸序列;
所述PCR扩增程序为:95℃,3min;95℃,30s,66℃,30s,72℃,30s,26个循环;72℃,5min。
(3)扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳;
利用胶回收试剂盒回收目的DNA片段。
(4)取步骤(3)所得纯化的DNA 17μl,加入2μl T7核酸内切酶Ⅰ(T7endonucleaseⅠ)缓冲液,按下述程序进行变性退火处理:
于上述退火产物中加入1μl T7endonucleaseⅠ,混匀后37℃孵育酶切30min。
(5)酶切产物于2%琼脂糖凝胶中电泳;比较被T7endonucleaseⅠ酶切及未被酶切的片段的比例即可检测出psgRNA-HBB-SpCas9-SZ载体对HBB基因的切割效率。电泳结果见图2,其中,泳道1为未含sgRNA的对照组,泳道2~6分别为psgRNA1-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA2-HBB-SpCas9-SZ1、psgRNA3-HB B-SpCas9-SZ1、psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ1和psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ2的酶切结果。
psgRNA-HBB-SpCas9-SZ载体酶切效率的统计结果见图3。结果表明,本发明的试剂盒中所提供的4组sgRNA均有较好的编辑效率,其中以第4组sgRNA的编辑效率最高;在sgRNA序列相同的情况下,SpCas9-SZ2蛋白的酶切效率略优于,SpCas9-SZ1蛋白。
实验例2
验证该试剂盒的脱靶效率
1、将HBB-sgRNA4-S的序列和人类基因组序列进行比对,从中挑选了与其最为接近的靶点(图4A),我们针对这些靶点区域设计特异性的引物进行PCR扩增,然后对扩增产物进行测序,测序结果表明,psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ1载体在这些位点上都无剪切(图4B)。即利用本发明试剂盒提供的sgRNA序列和改造后的Cas9蛋白构建的psgRNA4-HBB-SpCas9-SZ1载体无脱靶,特异性强,安全性高。
实验例3
验证该试剂盒的基因重组效率
1、验证EF1迷你(EF1mini)启动子的驱动效率
腺相关病毒是目前基因治疗中最常用的病毒载体之一,但其装载容量有限,限制了其包装CRISPR-Cas9系统用于将来的应用之中。为此我们对启动Cas9的启动子进行了改造,采用了新型的EF1mini启动子用于我们的系统当中。该迷你启动子大小仅为500bp,其核苷酸序列如Seq ID NO.16所示,能够很好的驱动Cas9的表达。
(1)用化学合成方法,合成EF1mini启动子,将其连接入psgRNA-HBB-SpCas9-SZ载体。为验证该EF1mini启动子的活性,先用该启动子驱动报告基因EGFP的表达,构建pAAV-sgRNA4-HBB-EF1mini-EGFP载体,载体结构图见图5A。
(2)利用HEK293T细胞,通过三质粒共转染方法,包装出AAV病毒,如图5B所示。
(3)包装好的AAV病毒感染HEK293T细胞:
按1.5×105个细胞/孔将HEK293T细胞接种于24孔板中,细胞悬液总体积为500μl。种板24h后加入AAV病毒悬液进行细胞感染。图5C所示为感染后96h,不同浓度的AAV病毒感染HEK293T细胞的荧光照片。
该结果表明,该EF1迷你启动子能够很好地驱动目的基因的表达。
2、构建pAAV-sgRNA4-HBB-EF1mini-SpCas9-SZ1腺相关病毒载体
用PCR扩增SpCas9-SZ1基因,替代上述步骤1-(1)所述pAAV-sgRNA4-HBB-EF1mini-EGFP载体的EGFP基因后的载体即为pAAV-sgRNA1-HBB-EF1mini-SpCas9-SZ1载体,该载体的结构示意图见图6A。
3、构建包含用于修复β-地中海贫血HBB基因的供体基因序列的载体:pAAV-HBB-Donor载体
用PCR扩增HBB同源臂,插入至pAAV-EF1mini-EGFP载体的EF1mini-EGFP序列的两侧后,将整个序列放入AAV载体中,得到pAAV-HBB-Donor载体,pAAV-HBB-Donor载体结构图见图6A。
4、以上述步骤1-(2)所述AAV病毒包装方法包装的pAAV-HBB-Donor和pAAV-sgRNA4-HBB-EF1mini-SpCas9-SZ1的病毒感染HEK293T细胞。重组后的细胞表达EGFP的荧光图片见图6B。
5、分析同源重组修复后的基因型:
以流式细胞仪分选EGFP阳性的细胞,提取细胞基因组DNA,然后以特异性引物扩增同源臂之间的序列,将PCR产物送测序。测序结果见图6C。其中,阴影区域1和4为HBB基因同源臂序列,阴影区域2为EF1mini启动子序列,阴影区域3为EGFP基因序列。结果显示,HBB基因同源臂序列被成功重组到了受体细胞中。
序列表
<110> 深圳三智医学科技有限公司
<120> 一种用于编辑或修复HBB基因的试剂盒
<130> 20170926
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 1
aaggttacaa gacaggttta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 2
taaggagacc aatagaaact 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 3
accaatagaa actgggcatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 4
tggtatcaag gttacaagac 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 5
caccgaaggt tacaagacag gttta 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 6
aaactaaacc tgtcttgtaa ccttc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 7
caccgtaagg agaccaatag aaact 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
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<400> 8
aaacagtttc tattggtctc cttac 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
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<400> 9
caccgaccaa tagaaactgg gcatg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
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aaaccatgcc cagtttctat tggtc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 11
caccgtggta tcaaggttac aagac 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 12
aaacgtcttg taaccttgat accac 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 13
cctgaggaga agtctgccgt tac 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 14
ttgaggttgt ccaggtgagc c 21
<210> 15
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus
<400> 15
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser
1025 1030 1035 1040
Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu
1045 1050 1055
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile
1060 1065 1070
Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser
1075 1080 1085
Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1090 1095 1100
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile
1105 1110 1115 1120
Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser
1125 1130 1135
Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly
1140 1145 1150
Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile
1155 1160 1165
Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
1170 1175 1180
Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1185 1190 1195 1200
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1220 1225 1230
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val
1265 1270 1275 1280
Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys
1285 1290 1295
His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu
1300 1305 1310
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp
1315 1320 1325
Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1330 1335 1340
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile
1345 1350 1355 1360
Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1365
<210> 16
<211> 493
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 16
gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60
cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc 240
cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc 300
cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca 360
ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct 420
ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc 480
gccgttacag atc 493