CN111088253A - 针对hbb-28地中海贫血基因的crispr单碱基供体修复体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对HBB‑28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系以及该修复体系在制备HBB‑28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。所述CRISPR单碱基供体修复体系包含：(1)CRISPR/Cas表达质粒、和(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。本发明的修复体系能用于HBB‑28地中海贫血的治疗。

Description

针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系
技术领域
本发明涉及CRISPR(Clustered Regularly Interspersed Short PalindromicRepeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列)基因治疗领域，本发明公开了针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系以及该修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。
背景技术
β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(a2β2)的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成a与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。β地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白转录启示区的TATA盒-28点突变(A→G)是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一。
据报道，全世界约有4亿地中海贫血症基因携带者。在我国，该疾病好发于南方地区，尤其是广东省境内发生率远远高于其他省份。2012年对广东省21个地市共14332个户籍住院分娩孕妇的筛查研究发现，地贫基因携带率为16.8％，即高达1/6育龄人群携带地贫基因。每例重症地贫患儿的出生给社会和家庭带来的经济负担高达100万到300万元。目前可通过终生输血治疗地中海贫血症，然而绝大多数患儿在积极治疗的情况下仍在成年前死亡。另一种治疗方法则是通过骨髓或造血干细胞移植，但要找到相匹配的异体捐赠者非常困难，且费用不菲。目前只能通过胚胎植入前行遗传学诊断技术或通过胎儿脐血细胞基因检测技术筛选正常的胚胎或胎儿来阻断地贫致病基因的传播。随着基因编辑技术的出现与发展，如何利用基因编辑技术对基因突变类型遗传性疾病进行预防与治疗是目前新兴的疾病临床治疗模式。
从2011年美国率先提出“迈向精准医学”的倡议后，中国的精准医学也不断向前推进。“精确的基因编辑”是基因编辑技术的核心，也是精准医学的重要体现。开展基于特异性基因突变所致疾病的基因编辑精准治疗，获得更加精准高效的基因编辑是未来疾病治疗的创新方向。CRISPR技术自2012年面世以来，极大地促进了基因编辑在多种疾病包括恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗作用，获得了广泛的临床应用，诸如此类：2016年美国国立卫生研究所批准了从癌症患者体内提取出免疫系统的T细胞，利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因修饰后的T细胞输回病人体内，基因修饰后的T细胞将靶向摧毁肿瘤细胞；2018年5月，NATURE杂志报道了通过CAR-T治疗治愈一例患者白血病的病例；在中国，2016年10月首次批准了利用CRISPR开展人体临床试验，来治疗化疗、放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者等等。
已有报道利用CRISPR治疗地中海贫血：通过利用基因编辑工具CRISPR精确特异性修复患者体细胞β珠蛋白基因(hemoglobin subunit beta，HBB)缺陷基因，然后将基因编辑与修复后的体细胞诱导成多能干细胞，最后移植入体内，从而分裂和分化为相应有功能的红细胞，来治疗和缓解β-地中海贫血患者症状。目前，针对β型地中海贫血的基因治疗，着手对象已从诱导型多能干细胞(iPS)和造血干细胞(HSC)过渡到人类胚胎，直接阻断该遗传性疾病的垂直传播。
2015年本发明的申请人在世界上首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异常授精的人类3PN受精卵进行HBB基因编辑修复，观测到CRISPR/Cas9对人胚胎中靶基因切割效率达到51.9％，但同时发现脱靶明显。2017年，本发明的申请人再次利用单碱基编辑系统(APOBEC1)以及核移植技术，第一次在人类胚胎中实现了单碱基编辑，成功地对导致β-地中海贫血的一种单核苷酸突变-28位突变进行校正。这种单碱基编辑系统由CRISPR-Cas9的变体与胞嘧啶脱氨酶构成，通过导向RNA直接指向正确DNA位置，用胸腺嘧啶(T)替换鸟嘌呤(C)。基因修复效率仅仅只有23％，并且修复后得到胚胎仍然是嵌合体，被修复的卵裂球也只有20％，很难实现完全治愈，且操作起来复杂繁琐。除此之外，该方法也存在较高的脱靶率。以上几种特征将极大地限制该技术在基因编辑治疗β地中海贫血中的使用。
发明内容
基于以上申请者的前期研究，本发明的主要目的是提供一种修复效率更高的针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系。
本发明基于CRISPR/Cas9的基因组编辑框架，利用氨基酸的简并性及密码子优化，设计合成了新的高效精准修复的供体(donor)——在修饰型修复模板(ssODN)上引入无义突变，即突变的碱基并不会引起相应氨基酸的改变，它能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变，极大地促进精确修复的提高。
本发明第一技术方案，是一种针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系，其包含：(1)CRISPR/Cas表达质粒、和(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。
进一步，根据第一技术方案所述的CRISPR单碱基供体修复体系，所述CRISPR/Cas表达质粒包括针对HBB-28型突变位点的sgRNA序列和Cas9序列。
所述HBB-28型突变为A到G的单碱基点突变。
根据以上所述的CRISPR单碱基供体修复体系，所述CRISPR/Cas表达质粒是将Cas9序列和sgRNA序列克隆到真核表达载体上而构建的真核表达载体质粒。
具体的，所述真核表达载体包括PX330、pCDNA3.1、pMXs-IRES和pCDH-EF1-MCS。
具体的，所述sgRNA序列由序列表中SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示。
进一步，第一方案所述的CRISPR单碱基供体修复体系中，所述供体是5’和3’端2个碱基被硫代修饰的单链寡核苷酸ssDNA。
具体的，所述供体的序列由序列表中SEQ ID No:3所示。
本发明的第二技术方案是所述的CRISPR单碱基供体修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。
进一步，第二方案所述的CRISPR单碱基供体修复体系应用于真核细胞。
具体的，所述真核细胞包括293TT细胞、SiHa细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、MCF7细胞和U2OS细胞。
本发明利用CRISPR/Cas9技术及修饰型ssDNA(单链寡核苷酸)，结合阻断再次编辑的氨基酸简并性无义突变，高效精准地靶向治疗人类疾病基因突变。
采用以上技术方案，本发明针对HBB-28突变的地中海贫血这一转录起始区点突变的常染色体隐性遗传病，构建相应的靶向地中海贫血中该突变位点的CRISPR/Cas表达质粒，进而采用5’和3’端2个碱基硫代修饰的ssDNA(单链寡核苷酸)，并在其中利用氨基酸简并性原理引入阻断再次编辑的无义突变，合成为供体，将CRISPR/Cas表达质粒和供体二者共同转染到细胞中，在以293TT细胞为代表的真核细胞中特异性地诱导HBB-28地中海贫血中基因突变位点的无痕定向改造。本发明针对HBB-28地中海贫血基因点突变致病这一单基因遗传病，试验了该高效基因编辑治疗方法的高效性和实用性，显示本发明能用于基于单基因点突变疾病的基因编辑精准治疗，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1是CRISPR/Cas9介导的双链断裂之后的基因修复方式的说明图。
图2是在供体上引入无义突变的阻断碱基进行无痕修复的示意图，其中，B表示CRISPR/Cas阻断突变；M表示与致病基因突变修复有关的突变。WT-sgRNA靶向于野生型细胞系相应靶点；Re-sgRNA靶向于引入MB突变的细胞系相应靶点。NGG代表CRISPR/Cas9系统发挥作用所必须的PAM序列。
图3是ssDNA供体的修饰示意图，其中，星号※代表硫代修饰，上图显示在ssDNA的两末端进行2个碱基的硫代修饰。
图4是对临床样本中正常人(纯合无突变)、轻型HBB-28地贫患者(杂合突变)和重型HBB-28地贫患者(纯合突变)的血液DNA进行Sanger测序的结果图。
图5是依据图2的设计原理，在突变位点附近设计sgRNA，将正常293TT细胞定点突变为异常的纯合突变型HBB-28-293TT细胞的序列设计示意图，其中，垂直向上的箭头指示的方框中的相应碱基表示预期突变(intended mutation)，位于图中间一排碱基序列中的较大方框指示供体上引入无义突变同时可产生原本不具有的限制性酶切位点AatII，改良的供体整合后可通过此酶切位点快速鉴定是否整合，以及是否在基因组序列中引入阻断碱基进行了无痕修复；位于图中间一排碱基序列中右边的小方框指示阻断碱基，该阻断碱基可以避免供体整合修复后被同样的sgRNA再次靶向识别。
图6是CRISPR/Cas9质粒和donor-ssDNA共转染293TT细胞后，对抽提总细胞基因组DNA进行Sanger测序的结果图，其中，WT代表没有转染CRISPR/Cas9质粒；-28-g1和-28-g2分别代表在-28突变位点附近设计的两条sgRNA。左边的阴影框代表在293TT细胞的基因组上引入-28突变，A→G；右边的阴影框代表引入的无义突变碱基，A→C。
图7是CRISPR/Cas9质粒和donor-ssDNA共转染293TT细胞后，抽提总细胞基因组DNA进行PCR扩增包含突变的目的片段后，进行的酶切实验，对酶切片段进行电泳的琼脂糖凝胶电泳图，其中，T7E1酶切实验鉴定刀子的切割效率，AatII酶切实验鉴定donor-ssDNA整合的效率，两组酶切实验控制为同一批实验，并且模板量一致。
图8表示通过对图7的电泳图进行灰度分析，量化后所计算的效率值。
图9是将编辑后的细胞种单克隆细胞，挑选出单克隆细胞，提取DNA后进行PCR，对目标片段后进行Sanger测序的结果图，其中，左边的阴影框代表在293TT细胞的基因组上引入-28突变，A→G；右边的阴影框代表引入的无义突变碱基，A→C。。
具体实施方式
以下将对本发明做以详细说明。
根据本发明的一个方面，提供一种针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系，其包含：(1)CRISPR/Cas表达质粒、和(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。
在一个具体的实施方式中，上述CRISPR/Cas表达质粒包括针对HBB-28型突变位点的sgRNA序列和Cas9序列。
在一个具体的实施方式中，上述HBB-28型突变为A到G的单碱基点突变。
在一个具体的实施方式中，上述CRISPR/Cas表达质粒是将Cas9序列和sgRNA序列克隆到真核表达载体上而构建的真核表达载体质粒。构建CRISPR/Cas9的真核表达载体。选定位点后，即可将sgRNA和Cas9克隆到真核表达载体上，并通过测序确保碱基序列正确。其中，所有的真核表达载体在理论上都是可行的，并没有特别限定，例如真核表达载体可以为PX330、pCDNA3.1、pMXs-IRES和pCDH-EF1-MCS，优选为PX330。
在一个具体的实施方式中，上述sgRNA序列由序列表中SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示。
利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA(小向导RNA)设计工具，针对HBB-28型突变位点，设计致病突变点附近的sgRNA并通过细胞实验筛选出效果上述最优的sgRNA：SEQ ID No:1或SEQ ID No:2。
本发明针对的DNA序列为：HBB地贫基因碱基序列(NCBI数据库HGNC:4827 orGRCh38.p12,GCF_000001405.38)。本发明基于CRISPR/Cas9的基因组编辑框架，利用氨基酸的简并性及密码子优化，在修饰型修复模板(ssODN)上引入无义突变的高效精准修复的供体，即突变的碱基并不会引起相应氨基酸的改变，它能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变，极大地促进精确修复的提高。技术原理叙述如下：
CRISPR/Cas9基因编辑系统是来源于化脓性链球菌的细菌适应性免疫系统，由核酸酶Cas9和20bp的向导RNA(sgRNA)组成。CRISPR/Cas9的特异性切割是由sgRNA介导的，sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对，与基因组DNA上邻近有NGG protospacer-adjacentmotif(PAM)序列的位点相结合，将Cas9酶序列导向靶位点。这种由可编程sgRNA进行的简单目标导航，使CRISPR/Cas9系统有别于早期的技术(如锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)，这两种技术都需要复杂的DNA结合蛋白结构域的组装来进行位点特异性编辑)。Cas9序列需要有PAM和sgRNA结合才能在特异性位点引入双链断裂(DSB)，这种双链断裂发生在PAM上游3bp处。在大多数情况下，这些DSBs通过非同源末端连接(NHEJ)途径修复，导致非特异性插入、缺失或其他突变，通常称为‘indels’。这很容易在目标基因的开放阅读框产生突变导致密码子提前终止翻译或者错误翻译，从而达到基因敲除的目的。然而，NHEJ修复不允许引入特定的序列改变，对于维持正常生命功能必需的正常基因突变致病这一类型的精准基因治疗来说并不适用。
要产生特定的序列改变，例如，引入致病突变或纠正患者衍生细胞系中的突变，必须使用同源定向修复(HDR)，这是一种独特的细胞DNA修复途径。要做到这一点，最常见的方法是同时引入一个修改的DNA修复模板，例如单链寡核苷酸(ssODN)，其中包含与DSB周围基因组区域同源的两端侧翼序列，以及预期的序列变化。单链DNA常常作为“供体模板(donortemplate)”被广泛应用于基因编辑过程中，可实现定点修复和DNA片段敲入，研究表明长度为70-100bp的ssDNA作为同源臂具有更高的定点修复和片段敲入效率，更易筛选获得定点编辑和片段敲入的突变体。在哺乳动物细胞中，HDR相对少见，基因组被CRISPR编辑产生的双链断裂(double-strand break，DSBs)主要由NHEJ修复，但细胞周期调控、NHEJ组分抑制或引入修复模板可提高HDR的频率。然而，通过HDR生成所需的基因组编辑事件，也需要通过防止切割后sgRNA再次靶向结合来提高编辑的准确性，而这一点在早期的研究中并没有直接解决。这些“不准确”的编辑来源于CRISPR/Cas9复合体对先前编辑过的位点的重新编辑，这将重新出现目标位点，直到它们被充分修改(图1)。如图1所示，在CRISPR/Cas9介导的双链断裂(1)之后，大多数基因将通过易出错的NHEJ途径修复，导致随机基因突变(2)。在1-10％的病例中，引入了同源DNA修复模板产生了HDR(3)提供的预期序列改变。然而，仅在极少数情况下，这一序列变化是准确的(即没有被额外的CRISPR/Cas9再次编辑所破坏)(4)。在大多数DSB修复中，CRISPR/Cas9复合体将重新出现并结合到靶标位置(5)，并造成额外的indels(6)。
本发明通过在CRISPR/Cas9靶向的目标序列中，利用氨基酸的兼并性，引入无义突变(阻断碱基)到HDR-ssDNA修复模板中，可以在很大程度上防止不受欢迎的再次编辑(图2)，达到无痕修复的目的。其中图2中所示的B表示CRISPR/Cas阻断突变，位于HDR修复模板中sgRNA靶向的序列当中，以减少整合修复后的再次切割；M表示与致病基因突变修复有关的突变，同样位于HDR修复模板中，以引入需要的目的突变。
在一个具体的实施方式中，上述供体是5’的碱基和3’端的碱基被硫代修饰的单链寡核苷酸ssDNA。依据选定的sgRNA，将包含有正常HBB基因和相关无义突变碱基的序列，截取100bp作为donor，并进行5’和3’端2个碱基硫代修饰，予公司进行合成纯化。
在一个具体的实施方式中，上述供体的序列由序列表中SEQ ID No:3所示。
单链DNA供体(ssDNA donor)已在多个实验体系中(包括在细胞实验和胚胎显微注射等等)被证实有强大的定点修复效率。末端核苷酸的部分硫代修饰可极大提高ODN抵抗核酸酶降解的能力,而不必对整个ODN均进行硫代修饰，硫代的寡聚核苷酸虽能与互补链的RNA或DNA片段杂交形成稳定的双链结构，但研究表明，比较其Tm值的变化发现,这种双链的稳定性和解链温度(Tm)与相应正常寡核苷酸的双链相比有一定减小,此外,硫代寡核苷酸常常对正常细胞有轻微毒性作用.寡核苷酸末端部分硫代修饰的方法既克服了完全硫代修饰的上述缺点,又大大提高了寡核苷酸的稳定性,是改进核酸治疗效果的一个好方法。目前我们采用了对5’和3’端2个碱基进行硫代修饰的修饰型修复模板(ssODN)，在实验中观察其达到了最佳的定点编辑效果。此种方法的运用和研究主要集中在细胞系或动物胚胎，在人类胚胎细胞中的运用鲜有报道。
在一个具体的实施方式中，CRISPR单碱基供体修复体系应用于真核细胞。由于靶向的DNA序列为各种细胞系共有，并不涉及不同的细胞之间的差异性所导致的体系作用失效，所以其中真核细胞为几乎所有真核细胞，例如293TT细胞、SiHa细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、MCF7细胞或U2OS细胞，优选为293TT细胞。
根据本发明的另一个方面，提供上述CRISPR单碱基供体修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。
本发明的CRISPR单碱基供体修复体系利用CRISPR/Cas9联合修饰型供体和无义突变来特异性诱导相应HBB-28地中海贫血致病位点的高效精准定点突变。上述特异性指只针对HBB-28致病位点的特异性，靶向其的CRISPR/Cas9和相应的供体，仅能特异性地诱导HBB-28致病性突变的修复，对HBB-β41-42等其他类型致病性突变和正常细胞无编辑治疗作用。
实施例
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本实施例中使用的引物设计均使用Primer3Plus在线引物设计工具(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)完成；由苏州金唯智生物科技有限公司合成，整合的硫代修饰型donor-ssDNA由苏州金唯智生物科技有限公司合成；鉴定刀子是否切割所使用的工程酶T7E1酶，购自NEW ENGLAND BIOLAB(货号为#M0302S)，鉴定donor整合修复的工程酶AatII酶以及配套的10×Buffer购自Thermo Scientific公司(货号：FD0994)。Sanger测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，依据专利申请者设计的序列进行质粒构建由苏州金唯智生物科技有限公司完成等。
实施例1
采取临床样本中正常人(纯合无突变)、轻型HBB-28地贫患者(杂合突变)和重型HBB-28地贫患者(纯合突变)的血液DNA进行Sanger测序，明确HBB-28突变为A→G致病。
使用采血针采取正常人(纯合无突变)、轻型HBB-28地贫患者(杂合突变)和重型HBB-28地贫患者(纯合突变)的血液样本，并使用全式金DNA抽提试剂盒(货号：#M10122)，依据操作说明提取血液中的DNA。
通过NCBI数据库，寻找HBB-28突变点的上下游序列，在Primer3Plus在线引物设计工具网站(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物，扩增目标突变点的上下游片段，PCR产物送上海生工生物技术公司进行Sanger测序，如图4所示，图示中由于测序从反义链方向开始，因此在峰图上表现为A→G，明确HBB-28突变特征为A→G单碱基点突变。引物序列为:
primer-F:GCAATTTGTACTGATGGTATGG
primer-R:ATAACAGCATCAGGAGTGGAC
所得的测序序列为：(带下划线粗体碱基为突变碱基)
Figure BDA0001839601910000081
Figure BDA0001839601910000091
实施例2
依据图2的设计原理，在根据实施例1测序所得序列的HBB-28突变位点附近设计sgRNA，设计并挑选2条最佳的sgRNA，据此构建CRISPR/Cas表达质粒。
如图5所示，挑选的序列为：
sgRNA1(SEQ ID No:1)：
Figure BDA0001839601910000092
sgRNA2(SEQ ID No:2):
Figure BDA0001839601910000093
其中，带下划线的斜体字母为sgRNA序列，即与靶DNA结合的序列，其余字母部分为支架(scaffold)，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。
CRISPR/Cas9表达质粒构建方法参考引文(Cong et al.Science.2013Jan 3.)中的构建方法完成构建，将Cas9序列和sgRNA序列克隆到表达载体PX330上，构建CRISPR/Cas9的真核表达载体质粒。
构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。
实施例3
依据图2的设计原理，设计合成定点无痕突变的供体(donor)序列并合成。
截取实施例1中得到的HBB-28突变点附近的100bp碱基序列，在其中引入HBB-28致病突变(带下划线斜粗体字体)和无义突变(下划线字体)，并在两端进行硫代修饰(*所示)，donor序列(SEQ ID No:3)如下：
Figure BDA0001839601910000094
序列提交苏州金唯智生物科技有限公司合成。由此得到供体。
实施例4、CRISPR单碱基供体修复体系的建立以及效果验证
将实施例2构建的CRISPR/Cas9表达质粒和实施例3合成的供体作为CRISPR单碱基供体修复体系。
鉴定CRISPR/Cas9表达质粒刀子的切割作用以及供体是否整合。
将CRISPR/Cas9质粒和供体(donor-ssDNA)共转染293TT细胞后，抽提总细胞基因组DNA进行Sanger测序验证CRISPR/Cas9质粒刀子的切割作用以及donor是否整合。在图6中，WT代表没有转染CRISPR/Cas9质粒；sgRNA1和sgRNA2分别代表在HBB-28突变位点附近设计的两条sgRNA；左边阴影框代表在293TT细胞的基因组上引入-28突变，A→G；右边阴影框代表引入的无义突变碱基，A→C。质粒和ssDNA转染到细胞后，质粒表达出来的靶向HBB-28突变位点的CRISPR/Cas9系统，可以迅速地识别HBB-28突变位点序列，发挥切割作用。切割后细胞在有外源ssDNA作为修复模板的时候，增加同源修复HDR的效率，从而达到无痕修复，同时引物需要的突变碱基序列，表现在图6所示的测序峰图上，显示为HBB-28突变位点和无义突变位点的套峰，如箭头所示。在WT组则没有现象出现。同时将抽提的细胞基因组DNA进行PCR扩增包含突变的目的片段后开展酶切实验，其中T7E1酶切实验鉴定刀子的切割效率，AatII酶切实验鉴定donor-ssDNA整合的效率，两组酶切实验控制为同一批实验，并且模板量一致。可观测到实验组(-28-g1和-28-g2)均出现T7E1酶和AatII酶的酶切条带。-28-g1和-28-g2的整合效率结果如图8所示，-28-g1的整合效率％为68.73％，-28-g2的整合效率％为85.49％。
具体操作方法是：
(1)细胞培养
293TT细胞系用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。
(2)质粒转染
24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染2ugCRISPR/Cas9质粒以及100pmol的donor-ssDNA，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)基因组DNA抽提
转染48小时后，常规使用0.25％的胰酶消化细胞，收集细胞到离心管中，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，常温条件下300g离心5分钟。使用全式金DNA抽提试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：EE101-01)的试剂组分，按照以下步骤抽提细胞基因组DNA：
①加入100ul细胞裂解液LB2，充分混匀，悬浮细胞，加入20ul RnaseA以及20ulProteinase K于样品中，涡旋混匀，室温孵育2min。
②加入500ul结合DNA的BB2试剂，立即涡旋5秒钟，室温孵育10min。
③将全部的溶液加入离心柱中，12000xg离心30秒，弃去流出液。
④加入500ul溶液clean buffer2(CB2)，12000xg离心30秒，弃去流出液。然后重复一次。
⑤加入500ul溶液wash buffer2(WB2)，12000xg离心30秒，弃去流出液。然后重复一次。
⑥12000xg离心2分钟，彻底去除残留的WB2。
⑦将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50ul预热(60-70℃)的去离子水(PH>7)室温静置1分钟，12000xg离心1分钟，洗脱DNA。测量DNA浓度。
(4)引物的设计
采用之前扩增目标突变点的上下游片段的引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选～500bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别50bp以上以便在琼脂糖凝胶电泳时能有效的区分酶切开的两个小片段)。PCR产物送上海生工生物技术公司进行Sanger测序，扩增引物和测序引物一致，序列为:
primer-F:GCAATTTGTACTGATGGTATGG
primer-R:ATAACAGCATCAGGAGTGGAC
(5)PCR反应
以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的
Figure BDA0001839601910000112
PCR SuperMix(货号：AS111-02)。
PCR反应体系：
Figure BDA0001839601910000111
Figure BDA0001839601910000121
PCR反应条件：
Figure BDA0001839601910000122
PCR反应完成后，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。
(6)T7内切酶I酶切实验及聚丙烯凝胶电泳
本实验使用的T7内切酶I以及配套的10×NEB Buffer 2购自New EnglandBiolabs公司(货号：M0302S)。操作步骤如下：
取200ng纯化PCR产物进行如下反应：
反应体系：
Figure BDA0001839601910000123
退火条件：
Figure BDA0001839601910000124
退火反应完成后，此时再加入T7内切酶I 1μL，震荡混匀后，37℃孵育20分钟完成切割，加入2μL 0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述PCR产物能被T7内切酶I切断，出现一大一小两条条带，说明CRISPR/Cas9在细胞内成功的切割HBB-28基因序列，通过ImageJ软件对条带的灰度值进行测算，就能估算其切割效率。
另外，编辑效率的计算公式为：
％基因修饰＝100x(1–(1-切割效率)1/2)。
其中，T7E1酶切效率——反映刀子靶向切割的效率；
AatII酶切效率——当供体整合至目标位置时，会被此酶识别并切割；
供体的整合效率——计算公式为整合效率＝(AatII酶切效率/T7E1酶切效率)x100％，此效率代表了整合修复引入突变的效率。
其中，编辑效率是指基因编辑工具在目标基因位点发生切割作用的效率，而整合效率就是修复效率，指的是将碱基A转换为G的效率，整合效率为编辑效率的子集。因此编辑效率、整合效率和修复效率关系简单来说为：(整合效率＝修复效率)<编辑效率。
(7)整合鉴定AatII酶切实验及聚丙烯凝胶电泳
本实验使用的AatII酶以及配套的10×Buffer购自Thermo Scientific公司(货号：FD0994)。操作步骤如下：
取200ng纯化PCR产物进行如下反应：
反应体系：
Figure BDA0001839601910000131
混匀后，37℃孵育1小时完成切割，加入2μL 0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。
如图7的琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述PCR产物能被AatII切断，出现一大一小两条条带，说明CRISPR/Cas9细胞内成功切割HBB基因后，修饰的donor-ssDNA整合至了目标位点。通过Image J软件对条带的灰度值进行测算，就能估算AatII切割效率，将其与T7E1酶切效率进行比较，即可计算获得donor的整合效率。
实施例5
通过挑选单克隆细胞进一步鉴定筛选出HBB-28突变及无义突变的293TT细胞系。
如图9所示的单克隆细胞测序数据显示，通过此方法成功在正常293TT细胞中引入了HBB-28突变及无义突变，从而获得HBB-28突变型293TT细胞系。表明了高效定点突变方法的成功使用。
具体操作步骤为：
(1)取转染48h后的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，最终使培养孔中最多包含1个细胞。置37℃5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，扩增传代至细胞数量达到50万个/孔，收取一部分细胞按前述方法抽提细胞DNA，按前述方法PCR扩增后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
序列表
<110> 广州鼓润医疗科技有限公司
<120> 针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系
<141> 2018-10-24
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
agggctgggc ataaaagtca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cagggctggg cataaaagtc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tggccaatct actcccagga gcagggaggg caggagccag ggctgggcat agacgtcagg 60
gcagagccat ctattgctta catttgcttc 90

Claims (10)

1.一种针对HBB-28地中海贫血基因的CRISPR单碱基供体修复体系，其包含：
(1)CRISPR/Cas表达质粒、和
(2)包含正常HBB基因和阻断再次编辑的无义突变碱基的序列的供体。
2.根据权利要求1所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas表达质粒包括针对HBB-28型突变位点的sgRNA序列和Cas9序列。
3.根据权利要求2所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述HBB-28型突变为A到G的单碱基点突变。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas表达质粒是将Cas9序列和sgRNA序列克隆到真核表达载体上而构建的真核表达载体质粒。
5.根据权利要求4所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述真核表达载体包括PX330、pCDNA3.1、pMXs-IRES和pCDH-EF1-MCS。
6.根据权利要求4所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述sgRNA序列由序列表中SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示。
7.根据权利要求1或2所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述供体是5’和3’端2个碱基被硫代修饰的单链寡核苷酸ssDNA。
8.根据权利要求7所述的CRISPR单碱基供体修复体系，其特征在于：所述供体的序列由序列表中SEQ ID No:3所示。
9.权利要求1～8中任一项所述的CRISPR单碱基供体修复体系在制备HBB-28地中海贫血基因治疗的治疗剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的CRISPR单碱基供体修复体系作用于真核细胞；
所述真核细胞包括293TT细胞、SiHa细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、MCF7细胞和U2OS细胞。
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