CN114045310A - 一种用于提高基因修复效率的方法 - Google Patents

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CN114045310A CN202111289228.3A CN202111289228A CN114045310A CN 114045310 A CN114045310 A CN 114045310A CN 202111289228 A CN202111289228 A CN 202111289228A CN 114045310 A CN114045310 A CN 114045310A
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Abstract

一种用于提高基因修复效率的方法，涉及基因编辑技术领域。本发明的目的是要解决目前基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的同源重组修复效率低的问题。一种用于提高基因修复效率的方法，将多个高效率基因编辑的sgRNA/Cas9蛋白复合物同时转入细胞中，在突变位点同时进行基因编辑作用，比单一的sgRNA/Cas9蛋白复合物的基因编辑作用更强，从而提高基因编辑的效率，进而直接使基因修复效率提高。本发明可获得一种用于提高基因修复效率的方法。

Description

一种用于提高基因修复效率的方法
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种用于提高基因修复效率的方法。
背景技术
相对于传统的ZFN(zinc-finger nucleases)和TALEN(transcriptionactivator-like effector nucleases)编辑技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术，由于它的高效便捷的优势，目前已在众多基因治疗和生命科学研究中扮演者重要的角色。而现有的CRISPR/Cas9除了存在脱靶效应和sgRNA靶向位置依赖基因组中的PAM位点外，还有基因修复效率比较低等问题。当细胞DNA损伤发生后，将激活细胞内DNA损伤应答，启动双链断裂修复通路同源重组(HR)和非同源重组末端连接(NHEJ)。提高基因的修复效率关键在于提高同源重组的效率。当细胞处于G2期和S期，细胞更倾向于HR修复方式。同源重组效率也与同源臂大小相关，随着同源片段大小的增加，位点的同源重组效率也是逐渐增加的。通过一些小分子Scr7，L755507和白藜芦醇等抑制细胞NHEJ途径或增强HDR途径也可以使纤维细胞的HDR效率提高2-3倍。通过融合的HUH核酸内切酶将单链寡脱氧核苷酸(ssODN)共价连接到Cas9-指导RNA核糖核蛋白(RNP)复合物也可以提高HDR效率。但目前基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的同源重组修复效率依然很低，急需一种提高同源重组效率的方法来满足基因编辑的生命科学研究和治疗应用。
发明内容
本发明的目的是要解决目前基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的同源重组修复效率低的问题，而提供一种用于提高基因修复效率的方法。
一种用于提高基因修复效率的方法，按以下步骤完成：
一、针对目的基因前50bp和后50bp的位置设计5-15个候选的sgRNA，通过体外转录制备sgRNA或采用人工合成sgRNA，将各组候选sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中；细胞转染后24h-48h提取各组细胞基因组进行测序分析；经过细胞转染试验，分别验证了每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、根据步骤一的测序结果，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA，体外转录制备或人工合成的sgRNA浓度应大于1ug/uL、编辑效率30％以上的sgRNA；
三、将步骤二得到的sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、设计150-300bp长度的单链DNA同源模板，保证同源模板中间100bp的序列位于基因组序列的外显子中；同源模板中的高效sgRNA识别部位做同义突变，即利用密码子的简并性，突变后基因序列改变，但是外显子表达的蛋白不发生改变；
五、将不同效率的Cas9/sgRNA蛋白复合物等比例混匀后与单链同源模板转染至目的细胞中；
六、目的细胞培养24-48小时后，检测细胞基因修复效率。
本发明的有益效果：
本发明一种用于提高基因修复效率的方法，将多个高效率基因编辑的sgRNA/Cas9蛋白复合物同时转入细胞中，在突变位点同时进行基因编辑作用，比单一的sgRNA/Cas9蛋白复合物的基因编辑作用更强，从而提高基因编辑的效率，进而直接使基因修复效率提高。
本发明可获得一种用于提高基因修复效率的方法。
附图说明
图1为地贫患者sanger测序峰图，图中阴影部分表示突变开始的位置；
图2为正常人β基因序列；
图3为将图1中的sanger测序峰图序列拆解分析、再与图2正常人的β基因序列进行对比图，可以发现地贫患者在A碱基插入突变；
图4为sgRNA设计示意图，mutation site标记处为突变位置，sgrna1-11为候选sgRNA序列，excon2为β基因的第2号外显子；
图5为密码子简并性表格；
图6为单链DNA同源模板的密码子同义突变位置展示，TCA、CCA、GGA、AAA、GCA、CTA、CTA、AAA、GCA和CTA为密码子同义突变后的序列，sgrna1-11为设计的候选sgRNA序列，excon2为β地贫基因的第2号外显子序列；
图7为单链DNA设计与PCR引物设计图，3、端单链DNA同源臂和5、端单链DNA同源臂为单链DNA的同源臂，上游同源臂为146bp，下游同源臂为119bp；单链DNA替换模板为单链DNA替换模板区，单链DNA设计总长度为400bp；excon1和HBB-excon2为β基因的第2号外显子，HBB-F1-曹、HBB-R1-曹、NT1-7172M-单链DNA-F和NT1-7172M-单链DNA-R均为PCR引物。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种用于提高基因修复效率的方法，按以下步骤完成：
一、针对目的基因前50bp和后50bp的位置设计5-15个候选的sgRNA，通过体外转录制备sgRNA或采用人工合成sgRNA，将各组候选sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中；细胞转染后24h-48h提取各组细胞基因组进行测序分析；经过细胞转染试验，分别验证了每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、根据步骤一的测序结果，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA，体外转录制备或人工合成的sgRNA浓度应大于1ug/uL、编辑效率30％以上的sgRNA；
三、将步骤二得到的sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、设计150-300bp长度的单链DNA同源模板，保证同源模板中间100bp的序列位于基因组序列的外显子中；同源模板中的高效sgRNA识别部位做同义突变，即利用密码子的简并性，突变后基因序列改变，但是外显子表达的蛋白不发生改变；
五、将不同效率的Cas9/sgRNA蛋白复合物等比例混匀后与单链同源模板转染至目的细胞中；
六、目的细胞培养24-48小时后，检测细胞基因修复效率。
本实施方式的有益效果：
本实施方式一种用于提高基因修复效率的方法，将多个高效率基因编辑的sgRNA/Cas9蛋白复合物同时转入细胞中，在突变位点同时进行基因编辑作用，比单一的sgRNA/Cas9蛋白复合物的基因编辑作用更强，从而提高基因编辑的效率，进而直接使基因修复效率提高。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤一中所述的目的基因的序列为突变的智人血红蛋白亚基β的第2号外显子，该基因发生A碱基插入突变，突变后的序列为：GTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGT。
其他步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：步骤一中验证每个sgRNA的编辑效率的步骤为：将所设计的sgRNA使用Cas9质粒载体的方式导入细胞中，待48-72小时后，提取细胞基因组，通过细胞基因组测序，检测目的基因编辑效率。
其他步骤与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤一中验证每个sgRNA的编辑效率的步骤为：将所设计的sgRNA与Cas9蛋白体外组装后，导入到细胞中，24-48小时后，提取细胞基因组，通过细胞基因组测序，检测目的基因编辑效率。
其他步骤与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤一中验证每个sgRNA的编辑效率的步骤为：将所设计的sgRNA使用Cas9腺病毒载体的方式导入细胞中，待48-72小时后，提取细胞基因组，通过细胞基因组测序，检测目的基因编辑效率。
其他步骤与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤二中浓度大于1ug/uL、编辑效率30％以上的sgRNA的制备方法为：使用sgRNA体外转录试剂盒制备和纯化，得到sgRNA，所述试剂盒为赛默飞的Precision gRNA Synthesis Kit。
其他步骤与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤六中检测细胞基因修复效率的步骤为：对于基因编辑后的细胞进行基因组提取，将基因组进行一代测序，观测是否出现基因编辑套峰；若出现基因编辑套峰，则将基因组PCR产物连接T载体，转化大肠杆菌，挑取单克隆，进行单克隆测序，所述单克隆为30-100个克隆；测序后，分析测序结果并计算基因修复效率。
其他步骤与具体实施方式一至六相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：利用CRISPR基因编辑技术修复来自β地中海贫血患者的自体核移植胚胎干细胞的β基因；
背景概述：β地中海贫血(β-thalassemia，简称β地贫)是常见的遗传性溶血性贫血。主要由β链异常结构或缺失引起，并影响全世界数百万人。在我国，广东和广西两省的地贫基因缺陷发病率分别高达10％和20％。目前并没有根治的手段，而CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展为基因突变疾病患者的治疗带来了希望。采用基因编辑技术可以修复患者突变的β基因，使β链蛋白表达恢复正常，使患者血红蛋白发挥正常的携氧能力，从而实现患者的治愈。体细胞核移植(SCNT)技术是将体细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，培养得到遗传特性与供体高度一致的胚胎干细胞系。自体核移植干细胞建系指利用SCNT技术建立全能胚胎干细胞系(ES)，并已在猪、牛、猴的动物模型上取得了成功。YoungGie Chung(郑永基)等人在2014年实现世界上首次利用35岁和75岁成年人的体细胞建立自体核移植细胞系。人自体核移植建系的成功为多种目前无药可治的疾病带来了希望。我们的方案是对β地贫患者的自体核移植干细胞系进行基因修复，可用于将来的造血干细胞分化实验，为地贫患者提供一个细胞移植替代治疗的途径。
实验目的：利用基因编辑技术对来自β地中海贫血患者的自体核移植胚胎干细胞的β基因进行同源重组修复，修复突变的β基因可用于将来的造血干细胞分化实验，为患者提供一个细胞移植替代治疗的途径。
实验步骤：
1、靶向β地贫突变位置的sgRNA设计与合成：
(1)对患者自体核移植干细胞进行测序并确认突变位点：
(2)根据突变位点的前50bp和后50bp的位置设计10～15个候选sgRNA；
如图4所示，图4为sgRNA设计示意图，我们利用在线sgRNA预测网站http://chopchop.cbu.uib.no/#和http://crispor.tefor.net/进行候选sgRNA的预测，并且筛选出预测分数排名较高的候选sgRNA。mutation site标记处为突变位置，sgrna1-11为候选sgRNA序列，excon2为β基因的第2号外显子；
(3)将设计的候选sgRNA序列交由生物公司进行合成；
(4)使用GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit进行sgRNA片段的体外制备，并将纯化后的sgRNA产物冻存于-80℃冰箱备用。
2、Cas9蛋白制备：
(1)直接采购商业化的Cas9蛋白(ThermoFisher Scientific)。
3、单链同源模板(单链DNA)设计与合成：
(1)单链DNA同源模板同义突变区：
根据图5的密码子表格，在单链DNA的替换模板区域进行同义突变，同义突变位置对应设计的候选sgRNA的位置，突变后的单链DNA序列将不会被设计的候选sgRNA所靶向识别，从而满足多个sgNRA靶向目的细胞基因组和避免设计的sgRNA影响同源重组修复的过程。
(2)单链DNA同源模板长度及位置示意图：
4、细胞准备与细胞培养：
(1)293T细胞的培养；
(2)患者的自体核移植胚胎干细胞的培养；
5、高效sgRNA的筛选：
(1)将步骤1和步骤2制备好的候选sgRNA和Cas9蛋白分别体外孵育组装；
(2)利用电穿孔转染仪转染到步骤4(1)中培养的293T细胞中；
(3)转染后细胞培养24小时；
(4)利用提基因组试剂盒提取各组细胞样品的基因组；
(5)利用设计好的基因组PCR引物对各组基因组进行PCR扩增；
(6)基因组PCR产物纯化和送至生物公司进行测序；
(7)通过测序结果筛选出编辑效率30％以上的sgRNA。
6、多个高效sgRNA，Cas9蛋白，单链DNA体外孵育组装与自体核移植胚胎干细胞的转染：
(1)将步骤5筛选出的sgRNA分别与Cas9蛋白体外组装；
(2)Cas9/sgRNA组装后等比例混匀，并加入步骤3合成的同义突变单链DNA同源模板；
(3)将多重Cas9/sgRNA蛋白复合物，利用电穿孔转染法转染到步骤4(2)中培养的患者的自体核移植胚胎干细胞中。
7、转染后细胞培养24小时。
8、利用提基因组试剂盒提取各组细胞样品的基因组。
9、利用设计好的基因组PCR引物对各组基因组进行PCR扩增。
10、基因组PCR产物纯化，生物公司进行测序。
11、通过测序结果分析基因修复的效率。
表1为相关合成引物的序列；
表1
Figure BDA0003334011150000061
Figure BDA0003334011150000071
序列表
<110>
<120>一种用于提高基因修复效率的方法
<160>24
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-7172M-ssOND-F的核苷酸序列。
<400> 1
TAGAAACTGG GCATGTGGAG AC 22
<210>2
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-7172M-ssOND-R的核苷酸序列。
<400> 2
ACCCTGTTAC TTATCCCCTT CCTAT 25
<210>3
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7newsgRNA1-F的核苷酸序列。
<400> 3
TAATACGACT CACTATAGTG CTCGGTGCCT TTAAGT 36
<210>4
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7newsgRNA1-R的核苷酸序列。
<400>4
TTCTAGCTCT AAAACTCACT TAAAGGCACC GAGCA 35
<210>5
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA2-F的核苷酸序列。
<400>5
TAATACGACT CACTATAGCA GCTCACTCAG TGTGGC 36
<210>6
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA2-R的核苷酸序列。
<400> 6
TTCTAGCTCT AAAACTTGCC ACACTGAGTG AGCTG 35
<210>7
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7newsgRNA3-F的核苷酸序列。
<400> 7
TAATACGACT CACTATAGTG AGCCAGGCCA TCACTT 36
<210>8
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7newsgRNA3-R的核苷酸序列。
<400> 8
TTCTAGCTCT AAAACTTAAG TGATGGCCTG GCTCA 35
<210>9
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA4-F的核苷酸序列。
<400> 9
TAATACGACT CACTATAGAC AGTGCAGCTC ACTCAG 36
<210>10
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA4-R的核苷酸序列。
<400> 10
TTCTAGCTCT AAAACCACTG AGTGAGCTGC ACTGT 35
<210>11
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA5-F的核苷酸序列。
<400> 11
TAATACGACT CACTATAGGG TTGCCCATAA CAGCAT 36
<210>12
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA5-R的核苷酸序列。
<400> 12
TTCTAGCTCT AAAACGATGC TGTTATGGGC AACC 34
<210>13
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA6-F的核苷酸序列。
<400> 13
TAATACGACT CACTATAGTG CTGTTATGGG CAACCC 36
<210>14
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA6-R的核苷酸序列。
<400> 14
TTCTAGCTCT AAAACTAGGG TTGCCCATAA CAGCA 35
<210>15
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA7-F的核苷酸序列。
<400> 15
TAATACGACT CACTATAGTA TGGGCAACCC TAAGGT 36
<210>16
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA7-R的核苷酸序列。
<400> 16
TTCTAGCTCT AAAACTCACC TTAGGGTTGC CCATA 35
<210>17
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA8-F的核苷酸序列。
<400> 17
TAATACGACT CACTATAGAG GTGCCCTTGA GGTTGT 36
<210>18
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA8-R的核苷酸序列。
<400> 18
TTCTAGCTCT AAAACGGACA ACCTCAAGGG CACCT 35
<210>19
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA10-F的核苷酸序列。
<400> 19
TAATACGACT CACTATAGCC CATAACAGCA TCAGGA 36
<210>20
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA10-R的核苷酸序列。
<400> 20
TTCTAGCTCT AAAACCTCCT GATGCTGTTA TGGG 34
<210>21
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA11-F的核苷酸序列。
<400>21
TAATACGACT CACTATAGGC TCACCTGGAC AACCTC 36
<210>22
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物NT1-T7-sgRNA11-R的核苷酸序列。
<400> 22
TTCTAGCTCT AAAACTGAGG TTGTCCAGGT GAGC 34
<210>23
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物HBB-F1-曹的核苷酸序列。
<400> 23
GAACGTGGAT GAAGTTGGTG GTGAG 25
<210>24
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物HBB-R1-曹的核苷酸序列。
<400> 24
AACATCAAGC GTCCCATAGA CTCAC 25

Claims (7)

1.一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于该方法按以下步骤完成：
一、针对目的基因前50bp和后50bp的位置设计5-15个候选的sgRNA，通过体外转录制备sgRNA或采用化学合成sgRNA，将各组候选sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中；细胞转染后24h-48h提取各组细胞基因组进行测序分析；经过细胞转染试验，分别验证了每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、根据步骤一的测序结果，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA，体外转录制备或人工合成的sgRNA浓度应大于1ug/uL、编辑效率30％以上的sgRNA；
三、将步骤二得到的sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、设计150-300bp长度的单链DNA同源模板，保证同源模板中间100bp的序列位于基因组序列的外显子中；同源模板中的高效sgRNA识别部位做同义突变，即利用密码子的简并性，突变后基因序列改变，但是外显子表达的蛋白不发生改变；
五、将不同效率的Cas9/sgRNA蛋白复合物等比例混匀后与单链同源模板转染至目的细胞中；
六、目的细胞培养24-48小时后，检测细胞基因修复效率。
2.根据权利要求1所述的一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于步骤一中所述的目的基因的序列为突变的智人血红蛋白亚基β的第2号外显子，该基因发生A碱基插入突变，突变后的序列为：GTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGT。
3.根据权利要求1所述的一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于步骤一中验证每个sgRNA的编辑效率的步骤为：将所设计的sgRNA使用Cas9质粒载体的方式导入细胞中，待48-72小时后，提取细胞基因组，通过细胞基因组测序，检测目的基因编辑效率。
4.根据权利要求1所述的一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于步骤一中验证每个sgRNA的编辑效率的步骤为：将所设计的sgRNA与Cas9蛋白体外组装后，导入到细胞中，24-48小时后，提取细胞基因组，通过细胞基因组测序，检测目的基因编辑效率。
5.根据权利要求1所述的一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于步骤一中验证每个sgRNA的编辑效率的步骤为：将所设计的sgRNA使用Cas9腺病毒载体的方式导入细胞中，待48-72小时后，提取细胞基因组，通过细胞基因组测序，检测目的基因编辑效率。
6.根据权利要求1所述的一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于步骤二中浓度大于1ug/uL、编辑效率30％以上的sgRNA的制备方法为：使用sgRNA体外转录试剂盒制备和纯化，得到sgRNA，所述试剂盒为赛默飞的Precision gRNA Synthesis Kit。
7.根据权利要求1所述的一种用于提高基因修复效率的方法，其特征在于步骤六中检测细胞基因修复效率的步骤为：对于基因编辑后的细胞进行基因组提取，将基因组进行一代测序，观测是否出现基因编辑套峰；若出现基因编辑套峰，则将基因组PCR产物连接T载体，转化大肠杆菌，挑取单克隆，进行单克隆测序，所述单克隆为30-100个克隆；测序后，分析测序结果并计算基因修复效率。
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