CN112481304A - 一种多功能病毒载体的构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体提供了一种多功能病毒载体的构建方法及其应用，所述病毒载体可同时具备多种功能：shRNA干扰、外源基因诱导型表达和外源基因组成型表达。本发明采用基因工程方法将U6（或H1）启动子、NFAT诱导表达启动子和EF1a/5’‑LTR杂合启动子调控的功能区整合到一个重组载体中，显著提高了病毒载体使用范围，有助于提高肿瘤细胞对CART细胞敏感性，为新型溶瘤病毒药物和免疫治疗提供了全新方向，有利于推动细胞治疗药物的研究。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域和肿瘤免疫治疗领域，涉及一种多功能病毒载体的制备方法及其应用。
背景技术
背景技术
目前对于肿瘤的治疗不少的新型治疗手段已经在临床上应用，这对于提升生存期并改善生活质量极为有效，但是由于肿瘤耐药性的原因，使得大部分抗癌药物在后期失去了治疗效果，进而导致肿瘤的复发和反复。基因治疗在未来将是肿瘤患者一个可能的选择，有可能解决化疗药物失活、多药耐药性的产生等现象，目前选择的靶点有细胞死亡/凋亡的基因、药物代谢途径靶点基因、表观遗传相关基因等。所以，针对新的基因靶点设计基因治疗药物进而进行有效的肿瘤治疗具有重要意义。
利用基因工程修饰的T细胞(如CAR-T、TCR-T)进行过继性免疫治疗已取得突破性进展，例如利用CD19 CAR-T进行白血病治疗，90%的急性淋巴细胞白血病患者得到完全缓解。然而，基于免疫细胞的肿瘤靶向治疗在实体肿瘤的治疗中效果非常有限，主要原因在于：（1）免疫检查点，例如PD-1.TIM-3，LAG-3，CTLA-4等限制了CAR-T细胞在肿瘤局部的存活时间；（2）此外，肿瘤局部缺少刺激免疫细胞增殖的细胞因子，例如IL-2，IL-12，IL-15等削弱了CAR-T细胞在肿瘤局部的抑瘤作用；（3）肿瘤组织的异质性导致传统针对单一靶点的CAR-T细胞很难完全清除所有的肿瘤细胞。
慢病毒载体在基因治疗应用中取得了很大的进展，大规模生产临床级病毒载体来转移遗传物质已经可以实现。慢病毒载体可以广泛地转导多种细胞类型，并整合到分裂细胞和非分裂细胞的宿主基因组中，从而使转基因在体内外长期表达。
针对目前的临床需求和问题，研究者已经尝试多种解决方案，例如，用携带IL-12的CAR-T治疗肿瘤；用CAR-T细胞联合双特性抗体克服肿瘤异质性导致的肿瘤免疫逃逸；用shRNA敲降CAR-T细胞的免疫检查点基因PD-1 或TIM-3等以阻断免疫检查点引发的CAR-T细胞耗竭等。但是这些方法都是在某一个层面，部分解决CAR-T细胞治疗实体肿瘤遇到的困境,提示多种手段联用将大有前景。但由于免疫细胞天然具有抵抗外源基因转导的特性，从而在同一细胞上多次转导几种不同功能的病毒载体难以实现，造成难以将多种手段联合起来解决问题。
因此，在本发明中我们提出了一种转染人类细胞的慢病毒载体用于转染CAR-T细胞，构建一种同时具有基因干扰、调控性表达和CAR组成型表达的多功能病毒载体，包括应用基因治疗的技术调节靶点基因表达，能够明显降低恶性肿瘤细胞入侵及扩散，有效提高CART细胞在肿瘤细胞中发挥作用，以实现多手段联合治疗肿瘤。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种多功能病毒载体的制备方法，用于减少细胞转导的次数,实现一次转导,达到三次转导的功能,并大大提高效率。用此载体可以制备多功能的CAR-T细胞，并提高CAR-T细胞制备效率，以提高肿瘤治疗效果。
为实现该目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多功能组合启动子，可以用于构建多种病毒载体，所述多功能组合启动子包括由三个启动子U6或H1启动子、NFAT启动子和EF1a/5’-LTR启动子构成的组合启动子框架，所述组合启动子还包括三组多克隆位点（MCS）。
本发明中，三个启动子可以在框架内随意组合，拓展了载体的功能。
本发明中，U6或H1为驱动干扰的启动子，NFAT为可诱导表达启动子,EF1a /5’-LTR为组成型表达杂合启动子。
优选地，所述三个启动子都伴随有固定的多克隆位点（MCS）。
优选地，组合启动子包含顺序连接的U6-MCS1，NFAT-MCS2和EF1a/5’-LTR-MCS3序列。
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或者逆转录病毒。
优选地，所述U6启动子的核酸序列如SEQID NO.1所示。
优选地，所述多克隆位点LV-MCS1的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述NFAT的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述多克隆位点LV-MCS2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述EF1a/5’-LTR的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述多克隆位点LV-MCS3的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述慢病毒载体的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述多克隆位点RV-MCS1的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述多克隆位点RV-MCS2的核酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述多克隆位点RV-MCS3的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述逆转录载体的核酸序列如SEQ ID NO.11所示。
附图说明
图1为pCDH-TriP重组慢病毒载体示意图。
图2为pCDH-TriP重组慢病毒载体结构图。
图3为pCDH-TriP重组慢病毒载体酶切图，M：DNA标准分子量，1：pCDH-TriP重组载体。
图4为pBABE-TriP逆转录病毒表达载体示意图。
图5为pBABE-TriP逆转录病毒表达载体结构图。
图6为pBABE-TriP重组逆转录病毒载体酶切图，M：DNA标准分子量，1：pBABE-TriP重组载体。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1，pCDH-TriP重组慢病毒载体的构建。
（1）设计并合成如SEQ ID NO.7所示的U6-MCS1-NFAT-MCS2-EF1a-MCS3 DNA片段。
（2）采用Sph I和Sal I对载体pCDH-CMV-MCS-EF1a-copGFP进行双酶切，酶切体系见表1，酶切后对载体片段进行琼脂糖凝胶电泳回收。
表1，载体双酶切体系建立。
（3）采用T4 DNA连接酶，将同样经过SphI和SalI双酶切的SEQ ID NO.7合成片段与凝胶回收获得的慢病毒载体进行 DNA连接反应，连接体系见表2，连接反应在22°C下保持60min。
表2，T4 DNA连接酶连接体系。
（4）将10μL连接产物加入到100μL Stbl3感受态细胞中，冰上孵育30min，42°C水浴45s，再置于冰上2min，加入600 μL的LB液体培养基；感受态细菌在37°C下150rpm摇床复苏培养45 min，随后取100 µL细菌涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上，37°C倒置培养16h，挑取阳性菌落于含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37°C下200rpm培养12～16h，得到pCDH-TriP重组载体的阳性菌。pCDH-TriP重组载体如图1-2所示。
采用质粒小量提取试剂盒 (Kit Ver.4 .0，货号9760)提取pCDH-TriP重组载体，然后采用PacI和XhoI限制性内切酶对pCDH-TriP重组载体进行双酶切。
酶切产物的电泳图如图3所示，可以看到两条长度分别为1739bp和5602bp的片段，其中1739bp的片段为SEQ ID NO.7中的多功能组合启动子片段，5602bp的片段为pCDH，说明pCDH-TriP重组载体构建成功。
实施例2， pCDH-TriP重组慢病毒包装。
pCDH-TriP慢病毒包装：将构建的pCDH-TriP慢病毒载体和包装质粒共转染HEK293细胞，包装病毒，收集和浓缩病毒液，进行滴度检测和MOI值的测定，病毒液的滴度>1 .00E+09TU/mL。
实施例3，pBABE-TriP重组逆转录病毒载体构建。
（1）设计并合成如SEQ ID NO.11中的的多功能组合启动子片段。
（2）采用Sph I和Sal I对载体pBABE载体进行双酶切，酶切体系见表3，酶切后对载体片段进行琼脂糖凝胶电泳回收。
表3，载体双酶切体系建立。
（3）采用T4 DNA连接酶，将同样经过SphI和SalI双酶切的SEQ ID NO.7合成片段与凝胶回收获得的病毒载体进行 DNA连接反应，连接体系见表4，连接反应在22°C下保持60min。
表4，T4 DNA连接酶连接体系。
（4）将10μL连接产物加入到100μL Stbl3感受态细胞中，冰上孵育30min，42°C水浴45s，再置于冰上2min，加入600 μL的LB液体培养基；感受态细菌在37°C下150rpm摇床复苏培养45 min，随后取100 µL细菌涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上，37°C倒置培养16h，挑取阳性菌落于含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37°C下200rpm培养12～16h，得到pBABE-TriP重组载体的阳性菌。pBABE-TriP重组载体如图1-2所示。
采用质粒小量提取试剂盒 (TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，货号9760)提取pBABE-TriP重组载体，然后采用PacI和XhoI限制性内切酶对pBABE-TriP重组载体进行双酶切。
酶切产物的电泳图如图3所示，可以看到两条长度分别为1485bp和5865bp的片段，其中1485bp的片段为多功能组合启动子片段，5865bp的片段为pBABE，说明pBABE-TriP重组载体构建成功。
实施例4， pBABE-TriP重组逆转录病毒包装。
pBABE-TriP逆转录病毒包装：将构建的pBABE-TriP逆转录病毒载体和包装质粒共转染GP2-293细胞，包装病毒，收集病毒液，进行滴度检测，病毒液的滴度 > 1 .00E+08TU/mL。
综上所述，本发明构建了包含U6-MCS1-NFAT-MCS2-EF1a-MCS3多功能组合启动子，利用分子克隆技术，将组合启动子连接到慢病毒载体中，构建得到的pCDH-TriP多功能慢病毒载体；将组合启动子连接到逆转录病毒载体中，构建得到pBABE-TriP多功能逆转录病毒载体；将构建的病毒载体包装后得到的相应的慢病毒或逆转录病毒，具有快速构建多功能CART细胞功能，显著提高了制备CART细胞的效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 镇江维根生物科技有限公司
<120> 一种多功能病毒载体的构建和应用
<130> 343072392
<141> 2020-09-12
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
c 241
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accggtacaa cagccacaac gtctatctcg agatagacgt tgtggctgtt gtatttttga 60
attc 64
<210> 3
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc 60
acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120
acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc acgccttctg tatgaaacag tttttcctcc 180
tcgaggacat tttgacaccc ccataatatt tttccagaat taacagtata aattgcatct 240
cttgttcaag agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg 300
c 301
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctagagata tcttcgaagc tagc 24
<210> 5
<211> 493
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60
cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc 240
cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc 300
cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca 360
ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct 420
ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc 480
gccgttacag atc 493
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatcccatt taaatgtcga c 21
<210> 7
<211> 7146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240
ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300
gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360
tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420
ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 480
cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 540
ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 600
agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 660
ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 720
ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 780
ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 840
aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa 900
agtaagacca ccgcacagca agcggccgct gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 960
ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 1020
agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 1080
agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 1140
gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 1200
gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 1260
ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 1320
gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 1380
taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 1440
caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 1500
tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 1560
aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 1620
aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 1680
gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 1740
aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg 1800
atcacgagac tagcctcgag cggccgcccc cttcaccgag ggcctatttc ccatgattcc 1860
ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata attggaatta atttgactgt 1920
aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt 1980
tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta 2040
tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccggta caacagccac 2100
aacgtctatc tcgagataga cgttgtggct gttgtatttt tgaattctcg acctcgagac 2160
aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag 2220
gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa 2280
ttacaaaaat tcaaaatttt actagtggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtacgc 2340
cttctgtatg aaacagtttt tcctccacgc cttctgtatg aaacagtttt tcctccggag 2400
gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtacgc cttctgtatg aaacagtttt tcctccacgc 2460
cttctgtatg aaacagtttt tcctcctcga ggacattttg acacccccat aatatttttc 2520
cagaattaac agtataaatt gcatctcttg ttcaagagtt ccctatcact ctctttaatc 2580
actactcaca gtaacctcaa ctcctgccac aatccacgct gttttgacct ccatagaaga 2640
ttctagagat atcttcgaag ctagcgaagg atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg 2700
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacg 2760
ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 2820
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 2880
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg catctctcct 2940
tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg cgttctgccg 3000
cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt aaagctcagg 3060
tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag ccggctctcc 3120
acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc tgttctgcgc 3180
cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct acgctagacg gatcccattt aaatgtcgac 3240
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 3300
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 3360
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 3420
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 3480
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 3540
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 3600
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 3660
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 3720
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 3780
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggtaccttt 3840
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 3900
actggaaggg ctaattcact cccaacgaaa ataagatctg ctttttgctt gtactgggtc 3960
tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 4020
taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 4080
ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag 4140
tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag 4200
tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 4260
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 4320
tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 4380
tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 4440
tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt ttgcagagac 4500
ggcccaaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 4560
attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 4620
agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 4680
tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 4740
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 4800
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 4860
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 4920
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 4980
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 5040
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 5100
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 5160
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 5220
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 5280
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 5340
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 5400
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 5460
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 5520
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 5580
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 5640
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 5700
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 5760
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 5820
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 5880
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 5940
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 6000
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 6060
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 6120
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 6180
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 6240
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 6300
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 6360
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 6420
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 6480
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 6540
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 6600
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 6660
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 6720
cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 6780
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 6840
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 6900
gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 6960
agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 7020
tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 7080
ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc 7140
aagctg 7146
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccatgggcat gcggatcc 18
<210> 9
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accggtacaa cagccacaac gtctatctcg agatagacgt tgtggctgtt gtatttttga 60
attc 64
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcgacacgc gt 12
<210> 11
<211> 7400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagctttgct cttaggagtt tcctaataca tcccaaactc aaatatataa agcatttgac 60
ttgttctatg ccctaggggg cggggggaag ctaagccagc tttttttaac atttaaaatg 120
ttaattccat tttaaatgca cagatgtttt tatttcataa gggtttcaat gtgcatgaat 180
gctgcaatat tcctgttacc aaagctagta taaataaaaa tagataaacg tggaaattac 240
ttagagtttc tgtcattaac gtttccttcc tcagttgaca acataaatgc gctgctgagc 300
aagccagttt gcatctgtca ggatcaattt cccattatgc cagtcatatt aattactagt 360
caattagttg atttttattt ttgacatata catgtgaatg aaagacccca cctgtaggtt 420
tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat 480
agaaaagttc agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat 540
atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa cagctgaata 600
tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga 660
tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg 720
gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc 780
tcgcttctgt tcgcgcgctt atgctccccg agctcaataa aagagcccac aacccctcac 840
tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc caataaaccc 900
tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc ctctgagtga 960
ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt tgggggctcg tccgggatcg ggagacccct 1020
gcccagggac caccgaccca ccaccgggag gtaagctggc cagcaactta tctgtgtctg 1080
tccgattgtc tagtgtctat gactgatttt atgcgcctgc gtcggtacta gttagctaac 1140
tagctctgta tctggcggac ccgtggtgga actgacgagt tcggaacacc cggccgcaac 1200
cctgggagac gtcccaggga cttcgggggc cgtttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa 1260
tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc ccccttagag gagggatatg tggttctggt 1320
aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggga 1380
ccgaagccgc gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc tctgtctgac 1440
tgtgtttctg tatttgtctg aaaatatggg cccgggctag cctgttacca ctcccttaag 1500
tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt 1560
caagaagaga cgttgggtta ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta acgtcggatg 1620
gccgcgagac ggcaccttta accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc 1680
acctggcccg catggacacc cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc 1740
ttttgacccc cctccctggg tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc 1800
tccatccgcc ccgtctctcc cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc gatcctccct 1860
ttatccagcc ctcactcctt ctctaggcgc ccccatatgg ccatatgaga tcttatatgg 1920
ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacatg acaagagtta ctaacagccc 1980
ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct ggagacctct 2040
ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg acccgtggta cctcaccctt accgagtcgg 2100
cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta gaacctcgct ggaaaggacc 2160
ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta gacggcatcg cagcttggat 2220
acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga ccatcctcta gactgccatg 2280
ggcatgcgga tccgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa 2340
ggctgttaga gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa 2400
tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa 2460
aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat 2520
cttgtggaaa ggacgaaaca ccggtacaac agccacaacg tctatctcga gatagacgtt 2580
gtggctgttg tatttttgaa ttctcgacct cgagacaaat ggcagtattc atccacaagc 2640
ggccgcggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtacgc cttctgtatg aaacagtttt 2700
tcctccacgc cttctgtatg aaacagtttt tcctccggag gaaaaactgt ttcatacaga 2760
aggcgtacgc cttctgtatg aaacagtttt tcctccacgc cttctgtatg aaacagtttt 2820
tcctcctcga ggacattttg acacccccat aatatttttc cagaattaac agtataaatt 2880
gcatctcttg ttcaagagtt ccctatcact ctctttaatc actactcaca gtaacctcaa 2940
ctcctgcgtc gacacgcgtc atcatcgatc cggattagtc caatttgtta aagacaggat 3000
atcagtggtc caggctctag ttttgactca acaatatcac cagctgaagc ctatagagta 3060
cgagccatag ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga 3120
ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaaa 3180
tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa cagctgaata 3240
tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga 3300
tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc 3360
agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc tagagaacca 3420
tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac 3480
caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag 3540
cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc gggtacccgt 3600
gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt ccttgggagg 3660
gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcacacatgc agcatgtatc 3720
aaaattaatt tggttttttt tcttaagtat ttacattaaa tggccatagt acttaaagtt 3780
acattggctt ccttgaaata aacatggagt attcagaatg tgtcataaat atttctaatt 3840
ttaagatagt atctccattg gctttctact ttttctttta tttttttttg tcctctgtct 3900
tccatttgtt gttgttgttg tttgtttgtt tgtttgttgg ttggttggtt aatttttttt 3960
taaagatcct acactatagt tcaagctaga ctattagcta ctctgtaacc cagggtgacc 4020
ttgaagtcat gggtagcctg ctgttttagc cttcccacat ctaagattac aggtatgagc 4080
tatcattttt ggtatattga ttgattgatt gattgatgtg tgtgtgtgtg attgtgtttg 4140
tgtgtgtgac tgtgaaaatg tgtgtatggg tgtgtgtgaa tgtgtgtatg tatgtgtgtg 4200
tgtgagtgtg tgtgtgtgtg tgtgcatgtg tgtgtgtgtg actgtgtcta tgtgtatgac 4260
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgttgt gaaaaaatat 4320
tctatggtag tgagagccaa cgctccggct caggtgtcag gttggttttt gagacagagt 4380
ctttcactta gcttggaaat cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 4440
tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 4500
cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg 4560
cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac 4620
tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc 4680
cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac 4740
cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgatgac 4800
gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4860
agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4920
aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4980
attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 5040
cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5100
aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5160
ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5220
gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5280
attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5340
tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5400
tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5460
atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5520
agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5580
aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5640
caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5700
ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5760
gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5820
tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5880
atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5940
tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 6000
accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6060
gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6120
caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 6180
tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6240
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tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6360
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attgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6480
gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6540
gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6600
ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6660
ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 6720
ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 6780
tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 6840
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caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg 6960
ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc 7020
atgattacgc caagctttgc tcttaggagt ttcctaatac atcccaaact caaatatata 7080
aagcatttga cttgttctat gccctagggg gcggggggaa gctaagccag ctttttttaa 7140
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tgtgcatgaa tgctgcaata ttcctgttac caaagctagt ataaataaaa atagataaac 7260
gtggaaatta cttagagttt ctgtcattaa cgtttccttc ctcagttgac aacataaatg 7320
cgctgctgag caagccagtt tgcatctgtc aggatcaatt tcccattatg ccagtcatat 7380
taattactag tcaattagtt 7400
Claims (10)
1.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组载体包括由U6或H1启动子、NFAT诱导表达启动子和EF1a/5’-LTR杂合组成性表达启动子构成的多功能组合启动子框架。
2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述多功能组合启动子还包括三组多克隆位点（MCS）：
所述的U6启动子后多克隆位点MCS1，其限制性酶切位点为EcoRI和Age I；NFAT启动子后多克隆位点MCS2，其限制性酶切位点为NheI和BamH I；EF1a/5’-LTR启动子后多克隆位点MCS3，其限制性酶切位点为XbaI和Sal I：
所述的重组载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体；
所述的组合启动子的组成顺序为U6-MCS1-NFAT-MCS2-EF1a/5’-LTR-MCS3；
所述的组合启动子的组成顺序不限于U6-MCS1-NFAT-MCS2-EF1a/5’-LTR-MCS3，可以是其他顺序的组合。
3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述U6启动子的核酸序列如SEQID NO.1所示；
所述的多克隆位点LV-MCS1的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的NFAT的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的多克隆位点LV-MCS2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的EF1a/5’-LTR的核酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的多克隆位点LV-MCS3的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的多功能LV载体的核酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的多克隆位点RV-MCS1的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述的多克隆位点RV-MCS2的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述的多克隆位点LV-MCS3的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的多功能RV载体的核酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.一种多功能慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括权利要求1-3任一项所述的多功能组合启动子，所述生物慢病毒载体所用的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.一种多功能逆转录病毒载体，其特征在于，所述逆转录病毒载体包括权利要求1-3任一项所述的多功能组合启动子，所述的逆转录病毒载体所用的核酸序列如SEQ ID NO.11所示。
6.一种制备如权利要求4所述的多功能慢病毒载体及病毒包装的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建如权利要求1-3任一项所述的组合启动子；
(2)将步骤(1)所述组合启动子克隆入慢病毒载体中，得到多功能慢病毒载体；
(3)将步骤(2)所述的慢病毒表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞并筛选阳性克隆；
(4)将筛选后的慢病毒载体质粒和包装质粒共转染哺乳动物细胞，包装得到所述慢病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为任意基因片段可以插入SEQ ID NO.7所示的组合启动子中的任一多克隆位点，所述的步骤(4)所述的哺乳动物细胞为HEK293细胞。
8.制备如权利要求5所述的多功能逆转录病毒载体的方法,根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建如权利要求1-3任一项所述的组合启动子；
(2)将步骤(1)所述组合启动子克隆入逆转录病毒载体中，得到多功能逆转录病毒载体；
(3)将步骤(2)所述的逆转录病毒载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞并筛选阳性克隆；
(4)将筛选后的逆转录病毒载体质粒和包装质粒共转染哺乳动物细胞，包装得到所述逆转录病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为任意基因片段可以插入SEQ ID NO.11 所示的组合启动子中的任一多克隆位点，所述的步骤(4)所述的哺乳动物细胞为GP2-293细胞。
10.一种如权利要求2和3所述的组合启动子多功能病毒载体的应用，其特征在于：用于制备T细胞、巨噬细胞、NK细胞或NKT细胞的免疫疗法治疗肿瘤，进一步地，用于制备稳定的基因敲低或者过表达哺乳动物细胞株。
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| CN202011032401.7A CN112481304A (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | 一种多功能病毒载体的构建和应用 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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Family Applications (1)
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2020
- 2020-09-27 CN CN202011032401.7A patent/CN112481304A/zh active Pending
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