CN109988759A - 一种在t细胞中具有高转录活性的嵌合启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在T细胞中具有高转录活性的嵌合启动子，所述启动子序列由增强子sDTS和与该增强子可操作地连接的启动子组成，其中，所述增强子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述；所述增强子位于所述启动子的5’端或3’端，优选位于5’端。本发明还涉及包含该嵌合启动子的核酸构建体、载体和T细胞。本发明的嵌合启动子能在T细胞内高效表达的启动子，特别适用于驱动外源基因(如全长抗体基因)在T细胞内的高效表达。

Description

一种在T细胞中具有高转录活性的嵌合启动子
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种T细胞高活性启动子及其用途。所述启动子为人工合成的嵌合启动子，该启动子在T细胞中具有高活性。本发明还涉及含有该启动子的重组载体、重组病毒、以及所述启动子控制外源基因在转基因T细胞治疗中的用途。
背景技术
人类研究癌症已有百年历史，至今还是无法完全攻克癌症。随着手术治疗、化疗、放疗等治疗方式的出现，癌症患者的生存率已得到极大改善，但这些疗法却不足以挽救全球上千万的癌症患者。随着生物技术的蓬勃发展，生物治疗作为一种新兴的治疗手段应运而生，目前已成为癌症治疗领域的第四大疗法。
生物治疗包括多种模式，如免疫治疗(细胞、细胞因子、抗体和疫苗等)、基因治疗、调节血管生成治疗、小分子靶向药物以及干细胞与组织工程再生医学等。其中，癌症免疫疗法自2013年入选《科学》杂志最值得关注的六大科学领域以来，受到了学术机构、制药公司的广泛关注。
癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫检查点阻断剂等。其中，免疫检查点阻断剂对于很多癌症，尤其是恶性且产生化学药物耐受性癌症的治疗具有明显的效果，已经有4种免疫检查点阻断剂得到了FDA的批准；另外，在过继性细胞治疗领域，特别是新一代CAR-T细胞治疗技术对血液肿瘤包括白血病和淋巴瘤已展现出惊人的治疗效果。目前，CAR-T细胞制备主要基于病毒和非病毒表达体系，而病毒载体很可能导致细胞发生复制和插入诱变继而引起生物安全性问题。2013年MD Anderson癌症中心的Cooper实验室使用一种非病毒转染方法，即睡美人(Sleeping Beauty，SB)转座子系统进行基因修饰获得CD19抗原特异性CAR-T细胞。
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。
根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。
组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。哺乳动物中常用的组成型启动子包括病毒来源：鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子(分别简称mCMV与hCMV)、猴空泡病毒SV40启动子；人基因组天然来源：EF1α启动子、泛素启动子(Ubiquitin，简称Ubi)、β-actin启动子、PGK-1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、eIF4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子、Endothelin-1启动子等。
在肿瘤免疫治疗中，维持外源基因的高效稳定表达非常重要。然而，一些病毒来源的组成型启动子尽管瞬时表达活性较高(如CMV启动子)，但容易因表观遗传修饰而被关闭表达；而一些人源天然组成型启动子或肿瘤特异性启动子虽然表达稳定，但表达活性相对较弱，难以满足免疫治疗需求。因而，研究人员又设计构建了一系列人工嵌合启动子，它们包含了一些顺式调控元件，主要包括能发挥稳定表达作用的启动子核心序列，以及能增强表达效率的上游增强子或下游内含子，代表者是嵌合启动子CAG(包含人CMV增强子-鸡β-actin启动子-兔β-globin内含子)，广泛应用于外源基因的表达。
增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列，增强子通过启动子来增加下游基因的转录。有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。
发明内容
为了解决现有技术中存在的表达载体启动子转录强度不够高的技术问题，本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，设计构建了一系列新型嵌合启动子，并从中筛选获得一组能在T细胞内高效表达的启动子。该启动子特别适用于驱动外源基因(如全长抗体基因)在T细胞内的高效表达。
因此，本发明一方面提供了一种增强的启动子序列(即嵌合启动子)，所述增强的启动子序列由增强子sDTS和与该增强子可操作地连接的启动子组成，其中，所述增强子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述。
在一个或多个实施方案中，所述启动子选自：EF1α启动子、PGK启动子、β-actin启动子、hCMV启动子、EEF2启动子、CAG启动子、U6启动子和SV40启动子。
在一个或多个实施方案中，所述启动子为EF1α启动子、hCMV启动子和β-actin启动子，更优选为EF1α启动子。
在一个或多个实施方案中，所述增强子位于所述启动子的5’端或3’端，较佳地位于所述启动子的5’端。
在一个或多个实施方案中，所述增强的启动子序列的核酸序列由SEQ ID NO:1所示核酸序列与SEQ ID NO:3所示核酸序列组成。
本发明还提供一种核酸构建物，所述核苷酸构建物含有本文所述的增强的启动子序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体是一表达框，从5’端到3’端依次含有可操作性连接的所述增强的启动子序列、感兴趣蛋白的编码序列以及转录终止子。
本发明还提供一种载体，所述载体含有本文所述的增强的启动子序列。
在一个或多个实施方案中，所述载体是真核表达载体，选自：瞬时表达载体、病毒表达载体和转座载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体是用于将感兴趣的基因的表达框整合到宿主细胞的基因组中的载体，优选是转座载体。
在一个或多个实施方案中，所述转座载体含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件。
在一个或多个实施方案中，在所述转座载体的5’LTR和3’LTR之间依次含有可操作性连接的所述增强的启动子序列、一个或多个限制性内切酶的酶切位点或任选的感兴趣的编码序列以及转录终止序列。
在一个或多个实施方案中，在3’LTR的3’端还可操作性地连接有转座酶的编码序列及其启动子序列。
在一个或多个实施方案中，所述载体还含有一个或多个可选择的标记。
在一个或多个实施方案中，所述感兴趣的编码序列为抗体的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述抗体选自：PD-1抗体，PD-L1抗体，CTLA4抗体，CD40抗体，CD40L抗体，CD47抗体，CD137抗体，CD28抗体，CD27抗体，OX40抗体，DNAM-1抗体，GITR抗体，ICSOS抗体，2B4抗体，CD160抗体，TIM3抗体，LAG3抗体，BTLA抗体和TIGIT抗体；优选为PD-1单链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述酶切位点选自：AscI酶切位点、XbaI酶切位点、PvuI酶切位点、EcoRI酶切位点和SalI酶切位点。
在一个或多个实施方案中，所述载体的核酸序列如SEQ ID NO:12所示。
本发明还提供本文所述的增强的启动子序列在驱动外源基因(如全长抗体基因)在T细胞内的表达中的应用。
附图说明
图1：携带各启动子核苷酸序列的表达载体的结构模式图。
图2A-2B：pNB328-E-EGFP、pNB338A-E-EGFP、pNB338B-E-EGFP质粒在T细胞株中表达的荧光强度(2A)和阳性率(2B)。
图3：pNB328-E-Nluc、pNB338B-E-Nluc、pNB328-hC-Nluc、pNB338B-hC-Nluc、pNB328-β-Nluc、pNB338B-β-Nluc质粒在T细胞株中表达的Nluc荧光值。
图4：pNB328-E-m279V、pNB338B-E-m279V、pNB328-hC-m279V、pNB338B-hC-m279V、pNB328-β-m279V、pNB338B-β-m279V质粒表达PD-1抗体表达的比较。
图5：EF1a和sDTS+EF1a启动子介导EGFP蛋白在CHO细胞中的表达。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。应理解，除非在本文中另有定义，否则本文所用各术语具有本领域所公认的含义。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括可操作性连接的启动子和基因编码序列。
术语“编码序列”指核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型。
术语“可操作性连接的”或“可操作性连接”指DNA调节序列(如增强子、启动子等)以允许感兴趣蛋白的编码序列表达的方式与该编码序列连接。
本发明通过改造启动子活性来提高其驱动基因表达强度，从而实现外源基因尤其是全长抗体基因在T细胞内的高效表达。
本发明的增强的启动子序列由增强子sDTS和与该增强子可操作地连接的启动子组成，其中，所述增强子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述。
本发明增强的启动子序列中的启动子可以是本领域常规用于在T细胞中表达外源基因的各类启动子序列，包括但不限于EF1α启动子、PGK启动子、β-actin启动子、hCMV启动子、EEF2启动子、CAG启动子、U6启动子和SV40启动子；优选的启动子为EF1α启动子、hCMV启动子和β-actin启动子，更优选为EF1α启动子。示例性的EF1α启动子的核苷酸序列可如SEQID NO:3所示；示例性的hCMV启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示；示例性的β-actin启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:5所示。
在某些实施方案中，本发明的增强的启动子序列由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3、4或5组成，优选由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3组成。
本发明包括核酸构建体，该核酸构建体含有本文所述的增强的启动子序列。
在某些实施方案中，该核酸构建体是一表达框，含有本文所述的增强的启动子序列和感兴趣蛋白的编码序列。表达框中通常含有转录终止序列(即转录终止子)，转录终止序列是由宿主细胞识别以终止转录的序列。转录终止序列与本文所述的编码序列3’末端可操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明，包括但不限于SV40polyA转录终止序列。
在某些实施方案中，所述核酸构建体是一载体。载体通常包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体，包括瞬时表达载体、病毒表达载体和转座载体。载体优选为真核表达载体。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种在宿主细胞中起作用的复制起点、方便的限制性内切酶酶切位点和一个或多个可选择的标记。
可选择的酶切位点包括但不限于AscI酶切位点、XbaI酶切位点、PvuI酶切位点、EcoRI酶切位点和SalI酶切位点。通常，载体中有部分酶切位点位于本发明所述的增强的启动子序列和转录终止序列之间，用于在此处切开载体，插入感兴趣蛋白的编码序列，使得所述编码序列与本发明的增强的启动子序列和转录终止序列可操作性地连接。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，载体是用于将感兴趣的基因的表达框整合到宿主细胞的基因组中的载体，优选是转座载体。在某些实施方案中，该转座载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，本发明的载体以CN 201510638974.7所公开的pNB328载体为骨架，但使用本文所述的增强的启动子序列替换该载体原本含有的EF1α启动子。
在某些实施方案中，本发明的载体是空载体，即不含有感兴趣蛋白的编码序列。通常，这类空载体依次含有本文所述的增强的启动子序列、一个或多个限制性内切酶酶切位点和转录终止序列，用于通过酶切将感兴趣蛋白的编码序列连接到所述增强的启动子序列与转录终止序列之间。在某些实施方案中，本发明的载体是在本文所述的增强的启动子序列和转录终止序列之间插入了感兴趣蛋白的编码序列的载体，优选是转座载体。在这类载体中，在5’LTR和3’LTR之间依次含有本文所述的增强的启动子序列、感兴趣蛋白的编码序列和转录终止序列，优选地，在3’LTR的3’端还含有转座酶的编码序列及其启动子序列。
本发明也包括本文所述各核苷酸序列的互补序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。
本文所述的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。在某些实施方案中，在合适的情况下，可采用人工合成的方法合成本发明的某些核苷酸序列。
本发明中，感兴趣的蛋白可以是本领域周知的各种蛋白，包括但不限于酶、抗体以及其它具有所需功能的蛋白。优选的是，感兴趣蛋白是本领域周知的需在T细胞中表达的蛋白，例如具有抗肿瘤作用的各种抗体，包括单链抗体，或嵌合抗原受体(CAR)等。
本发明的增强的启动子序列尤其适合用于在T细胞中驱动各类抗体，优选是全长抗体的基因表达。示例性的抗体包括但不限于PD-1抗体，PD-L1抗体，CTLA4抗体，CD40抗体，CD40L抗体，CD47抗体，CD137抗体，CD28抗体，CD27抗体，OX40抗体，DNAM-1抗体，GITR抗体，ICSOS抗体，2B4抗体，CD160抗体，TIM3抗体，LAG3抗体，BTLA抗体和TIGIT抗体等。
在某些实施方案中，本发明的表达载体含有本文所述的增强的启动子序列和PD-1抗体的编码序列，用于在T细胞中表达PD-1抗体，或用于将PD-1抗体的表达框整合到T细胞的基因组中。
可采用常规的转染方法将本发明的载体转入感兴趣的细胞中，这些转入方法包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将本文所述的载体转染感兴趣的细胞中。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
因此，在某些实施方案中，本发明提供本文所述的增强的启动子序列在驱动外源基因(如全长抗体基因)在T细胞内的表达中的应用。
在某些实施方案中，本发明还提供一种T细胞，其含有本文所述的增强的启动子序列或核酸构建物或载体。优选地，所述T细胞的基因组中整合了以本文所述的增强的启动子序列作为启动子以驱动感兴趣外源基因表达的表达框。更优选地，本发明的T细胞的基因组中整合了含有本文所述的增强的启动子序列及与该启动子序列可操作性连接的PD-1抗体的编码序列的表达框。在某些实施方案中，与不含本文所述的增强子序列、但含有相同的启动子序列的对照T细胞相比，在相同条件下测得的本发明T细胞感兴趣蛋白的表达量为对照T细胞感兴趣蛋白表达量的至少1.1倍、至少1.2位、至少1.5倍。
在某些实施方案中，本文所述的PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:10所示。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：携带各启动子核苷酸序列表达载体的构建
1、增强型绿色荧光蛋白EGFP表达载体构建
委托上海捷瑞生物公司合成序列sDTS-LTR(SEQ ID NO:2)，并在序列上游引入AscI酶切位点，在其下游插入XbaI酶切位点，装入经AscI+XbaI双酶切的pNB328载体中(pNB328载体的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文，其含EF1α启动子)构成重组质粒，命名为pNB338A-E。
委托上海捷瑞生物公司合成序列sDTS(SEQ ID NO:1)，并在序列上游引入XbaI酶切位点，在其下游插入PvuI酶切位点，装入经XbaI+PvuI双酶切的pNB328载体中EF1α构成重组质粒，命名为pNB338B-E(其核酸序列如SEQ ID NO:12所示)。
委托上海捷瑞生物公司合成绿色荧光蛋白EGFP基因序列(其核酸序列如SEQ IDNO:8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)，并在序列上游引入EcoRI酶切位点，在其下游插入SalI酶切位点，分别装入经EcoRI+SalI双酶切的pNB328载体、pNB338A-E载体和pNB338B-E载体中构成重组质粒，分别命名为pNB328-E-EGFP、pNB338A-E-EGFP和pNB338B-E-EGFP。
2、携带各启动子的萤光素酶报告基因表达载体构建
委托上海捷瑞生物公司合成pNL1.3.CMV[secNluc-CMV]质粒中纳米荧光素酶(Nano luciferase，简称NLuc)基因的编码序列(其核酸序列如SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)，并在序列上游引入EcoRI酶切位点，在其下游插入SalI酶切位点，分别装入经EcoRI+SalI双酶切的pNB328-E载体和pNB338B-E载体中构成重组质粒，分别命名为pNB328-E-NLuc和pNB338B-E-NLuc。
委托上海捷瑞生物公司合成SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的hCMV启动子和β-Actin启动子核苷酸序列，并在其上游引入XbaI，在其下游引入酶切位点EcoRI，装入经XbaI+EcoRI双酶切的pNB328-E-NLuc载体(替换原pNB328-E-NLuc载体中的EF1α启动子)中构建重组质粒，分别命名为pNB328-hC-NLuc和pNB328-β-NLuc；同时装入经XbaI+EcoRI双酶切的pNB338B-E-NLuc载体中构建重组质粒，分别命名为pNB338B-hC-NLuc和pNB338B-β-NLuc。
3、携带各启动子的PD-1抗体表达载体构建
委托上海捷瑞生物公司合成PD-1抗体核苷酸序列(核酸序列如SEQ ID NO:10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)，并在序列上游引入EcoRI酶切位点，在其下游插入SalI酶切位点，分别装入经EcoRI+SalI双酶切的pNB328-E-NLuc、pNB328-hC-NLuc、pNB328-β-NLuc、pNB338B-E-NLuc、pNB338B-hC-NLuc和pNB338B-β-NLuc载体中构成重组质粒，分别命名为pNB328-E-m279V、pNB328-hC-m279V、pNB328-β-m279V、pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279V和pNB338B-m279V。
各表达载体的结构模式图如图1所示。
实施例2：T细胞的构建
利用Filcoll分离法从捐献者血液中分离获得外周血单核细胞(PBMCs)。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤。
取15个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号1-15，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，每管按比例加入电转试剂共100ul，1-15管分别加入上述质粒6ug，分别重悬混匀细胞；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培养液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培养液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，6小时后加入刺激因子IL-2和CD3抗体、CD28抗体，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得表达EGFP、Nluc及PD-1抗体的T细胞。
实施例3：pNB328-E-EGFP、pNB338A-E-EGFP、pNB338B-E-EGFP质粒表达EGFP的比较 鉴定
将实施例2获得的pNB328-E-EGFP、pNB338A-E-EGFP、pNB338B-E-EGFP质粒修饰的活化T细胞，分别在电转后培养第8天和第18天在荧光显微镜下观察，并分别收集5×105个细胞沉淀，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。
结果如图2A和2B以及下表1所示，pNB338B-E-EGFP质粒的表达无论在阳性率及荧光强度都优于pNB338A-E-EGFP质粒的表达，而pNB338A-E-EGFP质粒的表达在阳性率及荧光强度上优于pNB328-E-EGFP质粒的表达。这说明含sDTS序列的质粒表达强于不含sDTS序列的质粒，且sDTS序列在EF1α启动子前而在5’LTR之后组合模式的质粒(pNB338B-E-EGFP)表达更强。
表1
细胞种类 培养天数 荧光强度
pNB328-E-EGFP T细胞 8 188
pNB338A-E-EGFP T细胞 8 360
pNB338B-E-EGFP T细胞 8 510
pNB328-E-EGFP T细胞 18 76
pNB338A-E-EGFP T细胞 18 179
pNB338B-E-EGFP T细胞 18 318
实施例4：pNB328-E-Nluc、pNB338B-E-Nluc、pNB328-hC-Nluc、pNB338B-hC-Nluc、 pNB328-β-Nluc、pNB338B-β-Nluc质粒表达Nluc的比较
实施例2构建得到的pNB328-E-Nluc、pNB338B-E-Nluc、pNB328-hC-Nluc、pNB338B-hC-Nluc、pNB328-β-Nluc、pNB338B-β-Nluc质粒修饰的活化T细胞，在第7天和第17天，按2×106细胞数目收集细胞并按2×106细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。利用多功能酶标仪检测分泌到细胞上清中的新型荧光素Nluc的荧光值。
结果如图3和下表2-4所示，不同启动子(EF1α/hCMV/β-Actin)且含有sDTS序列的质粒(pNB338B-E-Nluc、pNB338B-hC-Nluc、pNB338B-β-Nluc)，其表达的Nluc荧光值均高于相同启动子而不含sDTS序列的质粒(pNB328-E-Nluc、pNB328-hC-Nluc、pNB328-β-Nluc)。
表2
表3
细胞种类 培养天数 Nluc荧光值
Mock T细胞 8 300
Mock T细胞 18 332
pNB328-hC-Nluc T细胞 8 5056150
pNB328-hC-Nluc T细胞 18 1984001
pNB338B-hC-Nluc T细胞 8 7935584
pNB338B-hC-Nluc T细胞 18 3382779
表4
细胞种类 培养天数 Nluc荧光值
Mock T细胞 8 293
Mock T细胞 18 315
pNB328-β-Nluc T细胞 8 4841137
pNB328-β-Nluc T细胞 18 2028848
pNB338B-β-Nluc T细胞 8 8235377
pNB338B-β-Nluc T细胞 18 3680633
结果也说明，在不同启动子介导下，含sDTS序列的表达质粒中均优于不含sDTS序列的质粒，且和表达的基因无关。
实施例5：pNB328-E-m279V、pNB338B-E-m279V、pNB328-hC-m279V、pNB338B-hC- m279V、pNB328-β-m279V、pNB338B-β-m279V质粒表达PD-1抗体表达的比较
实施例2构建得到的pNB328-E-m279V、pNB338B-E-m279V、pNB328-hC-m279V、pNB338B-hC-m279V、pNB328-β-m279V、pNB338B-β-m279V质粒修饰的活化T细胞，在第8天和第18天，按2×106细胞数目收集细胞并按2×106细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。用双抗体夹心ELISA方法(使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的鼠抗人IgG4mAb检测，以商品化的抗PD-1抗体作为标准品，待测样品50倍稀释后定量检测。
结果如图4和下表5-7所示，不同启动子(EF1α/hCMV/β-Actin)但含有sDTS序列的质粒(pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279V、pNB338B-β-m279V)，其表达的PD-1抗体的量均高于相同启动子而不含sDTS序列的质粒(pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279V、pNB338B-β-m279V)。
表5
细胞种类 培养天数 PD1抗体(ng/ml)
Mock T细胞 8 0.23
Mock T细胞 18 0.13
pNB328-E-m279v T细胞 8 1230
pNB328-E-m279v T细胞 18 470
pNB338B-E-m279v T细胞 8 1860
pNB338B-E-m279v T细胞 18 890
表6
表7
细胞种类 培养天数 PD1抗体(ng/ml)
Mock T细胞 8 0.44
Mock T细胞 18 0.49
pNB328-β-m279v T细胞 8 1145
pNB328-β-m279v T细胞 18 513
pNB338B-β-m279v T细胞 8 1437
pNB338B-β-m279v T细胞 18 660
这些结果也说明，在不同启动子介导下，含sDTS序列的表达质粒中均优于不含sDTS序列的质粒；同时也说明含sDTS序列的质粒不仅在表达报告基因的能力上更优，其表达功能蛋白的能力也更强。
对比例1：EF1a和sDTS+EF1a启动子介导EGFP蛋白在CHO细胞中的表达
使用实施例1构建得到的pNB328-E-EGFP和pNB338B-E-EGFP分别转染CHO细胞。具体而言，取2个离心管，每管加入5×106个CHO细胞，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，每管按比例加入电转试剂共100ul，每管分别加入6ug的pNB328-E-EGFP和6ug的pNB338B-E-EGFP，分别重悬混匀细胞；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击。电转后CHO细胞在10％FBS的1640/DMEM(1：1混合)培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。在电转后第8天，收集5×105个细胞沉淀，PBS清洗细胞沉淀2遍，加入400ul PBS将细胞转移至流式管中，上机检测。结果如图5所示。
第8天时，转入了pNB338B-E-EGFP的CHO细胞的阳性率是转入了pNB328-E-EGFP的CHO细胞的阳性率的约1.9倍。实施例3中，第8天时，转入了pNB338B-E-EGFP的T细胞的阳性率是转入了pNB328-E-EGFP的T细胞的阳性率的约4.3倍。这一结果表明，本发明增强的启动子能够特异性地在T细胞中增强启动子转录的强度。
对比例2：pNB338h-E-m279V、pNB338h-hC-m279V、pNB338h-β-m279V、pNB338e-E- m279V、pNB338e-hC-m279V、pNB338e-β-m279V质粒修饰表达PD-1抗体表达的比较
根据实施例1的方法构建pNB338h-β-m279V、pNB338h-hC-m279V、pNB338h-β-m279V、pNB338e-β-m279V、pNB338e-hC-m279V和pNB338e-β-m279V重组质粒；与pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279V和pNB338B-β-m279V不同的是，pNB338h-β-m279V、pNB338h-hC-m279V和pNB338h-β-m279V中用hCMV增强子序列代替sDTS序列，pNB338e-β-m279V、pNB338e-hC-m279V和pNB338e-β-m279V中用CD3e增强子替换sDTS序列。
将pNB338h-β-m279V、pNB338h-hC-m279V、pNB338h-β-m279V、pNB338e-β-m279V、pNB338e-hC-m279V、pNB338e-β-m279V质粒修饰的活化T细胞，在第8天和第18天，按2×106细胞数目收集细胞并按2×106细胞/孔，铺在加有3ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24h后收集细胞上清，-20℃保存备用。用双抗体夹心ELISA方法(使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的鼠抗人IgG4mAb检测，以商品化的抗PD-1抗体作为标准品，待测样品50倍稀释后定量检测。
结果发现不同启动子(EF1α/hCMV/β-Actin)且含有sDTS序列的质粒(pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279V、pNB338B-β-m279V)，其表达的PD-1抗体的量均高于含有相应启动子而含有hCMV增强子序列或CD3e增强子序列的质粒。
这些结果说明，在不同启动子介导下，含sDTS序列的表达质粒中均优于其他增强子序列的质粒；同时也说明含sDTS序列的质粒表达某个特异基因的能力强于其他增强子序列介导表达基因的能力。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 一种在T细胞中具有高转录活性的嵌合启动子
<130> 17A173
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120
tgcatctcaa ttagtcagca acca 144
<210> 2
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120
tgcatctcaa ttagtcagca accattaacc ctagaaagat aatcatattg tgacgtacgt 180
taaagataat catgcgtaaa attgacgcat g 211
<210> 3
<211> 545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggatctgcg atcgctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga acgggtgcct agagaaggtg gcgcggggta 120
aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg 180
tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca 240
cagctgaagc ttcgaggggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc 300
cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact 360
gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc 420
ccttggagcc tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa 480
ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg 540
cctac 545
<210> 4
<211> 584
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584
<210> 5
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120
gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc 180
ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg 240
gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc gctgccttcg 300
ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt 360
actaaaacag gtaagtcc 378
<210> 6
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg cctgctcctg 60
gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagtc ttcacactcg aagatttcgt tggggactgg 120
cgacagacag ccggctacaa cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt gtccagtttg 180
tttcagaatc tcggggtgtc cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag cggtgaaaat 240
gggctgaaga tcgacatcca tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg cgaccaaatg 300
ggccagatcg aaaaaatttt taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca ctttaaggtg 360
atcctgcact atggcacact ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat cgactatttc 420
ggacggccgt atgaaggcat cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt aacagggacc 480
ctgtggaacg gcaacaaaat tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg ctccctgctg 540
ttccgagtaa ccatcaacgg agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat tctggcgtaa 600
<210> 7
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Phe Thr
20 25 30
Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu
35 40 45
Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu
50 55 60
Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn
65 70 75 80
Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser
85 90 95
Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro
100 105 110
Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val
115 120 125
Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr
130 135 140
Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp
165 170 175
Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg
180 185 190
Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala
195
<210> 8
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 9
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 10
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcactggtat 180
caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 240
ggcgtcccag ccaggttcag tggtagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 300
agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc acagcaggga ccttccgctc 360
acgttcggcg gagggaccaa agtggagatc aaaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 420
agcggcggtg gcgggtcgca ggtgcagctg gtgcagtccg gcgtggaggt gaagaagcct 480
ggcgcctccg tcaaggtgtc ctgtaaggcc tccggctaca ccttcaccaa ctactacatg 540
tactgggtgc ggcaggcccc aggccaggga ctggagtgga tgggcggcat caacccttcc 600
aacggcggca ccaacttcaa cgagaagttc aagaaccggg tgaccctgac caccgactcc 660
tccaccacaa ccgcctacat ggaactgaag tccctgcagt tcgacgacac cgccgtgtac 720
tactgcgcca ggcgggacta ccggttcgac atgggcttcg actactgggg ccagggcacc 780
accgtgaccg tgtcctccga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 840
gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 900
atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 960
gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020
gaggagcagt tccagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080
tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1140
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1200
ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1260
taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1380
gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440
cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatga 1488
<210> 11
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
165 170 175
Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu
195 200 205
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
260 265 270
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
305 310 315 320
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
325 330 335
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
340 345 350
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
420 425 430
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
450 455 460
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
485 490 495
<210> 12
<211> 5037
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcgcgcctt aaccctagaa agataatcat attgtgacgt acgttaaaga taatcatgcg 60
taaaattgac gcatgtctag aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 120
tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 180
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaaggat ctgcgatcgc 240
tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 300
ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 360
gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 420
gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga 480
ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg 540
ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag 600
gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct 660
agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt 720
tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gaattcgtcg 780
accagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 840
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 900
caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 960
gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtagcatgc gtcaatttta 1020
cgcagactat ctttctaggg ttaaatcgat ttagaagcag ctctggcaca tgtcgatgtt 1080
gtgctcgcgg cagatcacct tcttgcactt cttgcagctg gcgctggcct tgcggcggat 1140
cttgctgggg cagtaggtgc agtaggtgcg cttcttcatc acgggctcct cggtgctgtc 1200
gtcgctggtg ccgggcacct ccttgggcag gatgttgctg atgttgtcgc gcaggtagcg 1260
cttcagggtg ggggcctcca ggcgcttgcg catgaagctg ctggtcaggc ccatgtacag 1320
gttgcgcatg aacttcttgc ggctctgcac cttctcgccc ttgctgctca cgttgtggct 1380
gtagatgatg aagctgttga tgcaggcgat gttgatcatg ccgtacagca gggccatggg 1440
ccagcggttg gtcttgcggc tgcaggtcat cacgctgcac atctggtcca gggtgtccac 1500
gccgcccttg gtctggttgt agtacatcac catctggggc ttgccggtgc tctcgttgat 1560
gctggcgtcc tcgtcgcagc tgctcagcag gtacaccatc ttggcgggct tgggcttgta 1620
gctcaccagg gtcagggggc cgtcgaagca gaacatgctg gtgcccacgg ggcggctgcg 1680
gctgttcttc agcacctcgg ggatctcgcg cttgttgctg cgcacggtgc ccacgatggt 1740
cagcttgtag ggctcctgca gcaggttctt ggccaggggg atgctggtga accagttgtc 1800
gcaggtgatg ttgcggcagc tgccgtgcac gggcttgctc agctccttca cgtagtactc 1860
gcccaggggc acgccgttgg tctgggtgcc gcggcccagg tagggcatgc cgttgatcat 1920
gtacttggtg ccgctgtcgc acatcatcag gatcttgatg ccgtacttgc tgggcttgtt 1980
ggggatgtac acgcggaagg ggcagcggcc gcggaagccc agcagctgct cgtcgatggt 2040
caggtgggcg ccgggggtgt agttctggat gcactggtgg atgaacaggt cccagatctt 2100
gcgcacgggg gtgaacacgt cgttctcgcg cagggtgggg cggatgctct tgtcgtccat 2160
gcgcaggcag cggatcagga agtcgaagcg gtcgcggctc atcacgctca cgtacaccat 2220
gctcaggctg cggtcgaaca ggtcgtcggt gctcatgtgg ttgtccttgc gcacggcggt 2280
catcaccagg atgccgaaga aggcgtagat ctcgtcctcg ttggtgtcgc ggaaggtggc 2340
gctggtcatg ctctcgcggc gcttcaggct gatctcggcg ttggtccact tcacgatctc 2400
gctgatgatc tcgtcggtga agaacagctt gaagcacagc agggggtcgt agatgttgcg 2460
gcacatgcgg gtggggccgc gctggctgcg cacgatgttc agggcgctca cgcggctgcg 2520
gcgggtgggc ttgctggtgc tccagcagtg cttgttcttg ccgcggatgg tgcgctgggg 2580
cagggtcagg atgcggttgc tggccaggct gctgccgggc tgctcgatca cgttctgctc 2640
gtccaggatc tcgctgccgc tgctggtggg ctgcacctcg tgcacctcgt cgatgaaggc 2700
ctcctcggtg tcgctctgca cgtcgtcctc gctcacgtgg tcgctcacct cgctgtcgct 2760
gtcctcgccc accagctcgt cgtcgctctg cagcagggcg ctcaggatgt gctcgtcgtc 2820
caggctgctg ccgtccaact tgaccctctt ggcagcaggg cccatggtgg caagcttgat 2880
ctgcgttcta cggtggtcag accgaagact gcgacggtac cgacgctggt cgcgcctctt 2940
atacccacgt agaacgcagc tcagccaata gaatgagtgc caatatggaa tttccagggg 3000
aaaaccgggg cggtgttacg ttttggctgc cctttcactt cccattgacg tgtattggct 3060
cgagaacggt actttcccat taatcagcta tgggaaagta ccgtttaaag gtcacgttgc 3120
attagtttca atagcccatt gacgtcaatg gtgggaaagt acatggcgtt ttaatttaat 3180
ggctggaaaa acccaatgac tcacccctat tgaccttatg tacgtgccaa taatgggaaa 3240
aacccattga ctcaccccct attgaccttt tgtactgggc aaaacccaat ggaaagtccc 3300
tattgactca gtgtacttgg ctccaatggg actttcctgt tgattcaccc ctattgacct 3360
tatgtactgg gcaaaaccca ttggaaagtc cctaatgact cagtatattt aattaagagg 3420
gggagaccaa agggcgagac gttaaggcct cacgtgacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3480
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3540
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 3600
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 3660
ttacgggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 3720
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 3780
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 3840
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 3900
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 3960
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 4020
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 4080
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 4140
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gccgtctcag aagaactcgt 4200
caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga 4260
ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta 4320
tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc 4380
cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc 4440
cgtcgggcat gctcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct 4500
cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctctctcga 4560
tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc 4620
gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat 4680
cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga 4740
gtacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtctt 4800
gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg 4860
ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc 4920
cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca 4980
taatattatt gaagcattta tcagggttcg tctcgtcccg gtctcctccc atgcatg 5037

Claims (10)

1.一种增强的启动子序列，其特征在于，所述增强的启动子序列由增强子sDTS和与该增强子可操作地连接的启动子组成，其中，所述增强子sDTS的序列如SEQ ID NO:1所述；所述增强子位于所述启动子的5’端或3’端，优选位于5’端。
2.如权利要求1所述的增强的启动子序列，其特征在于，所述启动子选自：EF1α启动子、PGK启动子、β-actin启动子、hCMV启动子、EEF2启动子、CAG启动子、U6启动子和SV40启动子；优选地，所述启动子为EF1α启动子、hCMV启动子或β-actin启动子；更优选地，所述启动子为EF1α启动子；
优选地，所述EF1α启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示；所述hCMV启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示；所述β-actin启动子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:5所示。
3.一种核酸构建物，所述核苷酸构建物含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列；
优选地，所述核酸构建体是一表达框，从5’端到3’端依次含有可操作性连接的所述增强的启动子序列、感兴趣蛋白的编码序列以及转录终止子。
4.一种载体，所述载体含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体是真核表达载体，选自：瞬时表达载体、病毒表达载体和转座载体；
优选地，所述载体是用于将感兴趣的基因的表达框整合到宿主细胞的基因组中的载体，优选是转座载体；优选地，所述转座载体含有选自piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5或Ty的转座元件。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，在所述转座载体的5’LTR和3’LTR之间依次含有可操作性连接的所述增强的启动子、一个或多个限制性内切酶的酶切位点或任选的感兴趣的编码序列、以及转录终止序列；
优选地，在所述3’LTR的3’端还可操作性地连接有转座酶的编码序列及其启动子序列；
优选地，所述载体的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述转录终止序列是SV40polyA转录终止序列。
7.如权利要求5或6所述的载体，其特征在于，
所述感兴趣的基因为PD-1单链抗体的编码序列；和/或
所述酶切位点选自：AscI酶切位点、XbaI酶切位点、PvuI酶切位点、EcoRI酶切位点和SalI酶切位点。
8.权利要求1或2所述的增强的启动子序列在驱动外源基因在T细胞内的表达中的应用。
9.一种T细胞，其含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列或权利要求3所述的核酸构建物或权利要求4-7中任一项所述的载体；
优选地，所述T细胞的基因组中整合了以权利要求1或2所述的增强的启动子序列作为启动子以驱动感兴趣外源基因表达的表达框。
10.一种稳定地表达抗体的T细胞，其特征在于，所述T细胞的基因组中整合了含有权利要求1或2所述的增强的启动子序列及与该启动子序列可操作性连接的抗体的编码序列的表达框；
优选地，所述抗体选自：PD-1抗体，PD-L1抗体，CTLA4抗体，CD40抗体，CD40L抗体，CD47抗体，CD137抗体，CD28抗体，CD27抗体，OX40抗体，DNAM-1抗体，GITR抗体，ICSOS抗体，2B4抗体，CD160抗体，TIM3抗体，LAG3抗体，BTLA抗体和TIGIT抗体；
更优选地，所述抗体为PD-1抗体；优选地，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:11所示。
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