CN117042601A - 纯重链抗体 - Google Patents
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Abstract
一种产生小鼠的方法，其中B细胞表达多种纯重链抗体(HCAb)库，所述方法通过在内源免疫球蛋白重链恒定区基因座中内源Cμ基因片段的上游并入转基因Cγ基因片段，其中所述Cγ基因片段包含编码CH1结构域的至少一部分的核苷酸序列的缺失。
Description
技术领域
本发明涉及纯重链抗体(HCAb)构建体、表达HCAb的转基因小鼠以及在体外和体内产生它们的方法。
背景技术
由于(i)抗体表现出能够靶向不同分子形式抗原的细致结合特性，(ii)抗体作为具有期望的药代动力学的生理分子，使得它们在接受治疗的人和动物中具有良好的耐受性，以及(iii)抗体与自然抵御感染因子的强大免疫学特性相关，因此抗体已经成为了重要的生物药物。此外，存在用于从实验动物中快速分离抗体的既定技术，这些技术可以容易地针对几乎任何非体内自然存在的外来物质产生特异性抗体反应。
在抗体最基本的形式中，抗体由两条相同的重链(H)组成，每条重链与一条相同的轻链(L)配对。H链和L链的N端都包含一个可变结构域(分别为VH和VL)，它们共同为成对的H-L链提供了独特的抗原结合特异性。编码抗体VH和VL结构域的外显子在种系DNA中不存在。相反，每个VH外显子是由随机选择的存在于H链基因座(Igh)中的V、D和J基因片段重组产生的；同样，单个VL外显子是通过轻链基因座(Igl)中随机选择的V和J基因片段的染色体重排产生的(见小鼠Igh基因座、Iglκ基因座(Igk或Igκ)和Igλ基因座(Igl或Igλ，图1)(Tonegawa,Nature,302:575,1983；Bassing,et al.,Cell,109Suppl:S45,2002)。小鼠基因组包含两个可以表达H链的等位基因(每个亲本一个等位基因)、两个可以表达κ(κ)L链的等位基因，和两个可以表达λ(λ)L链的等位基因。在H链基因座有多个V、D和J基因片段，在两个L链基因座也有多个V和J基因。每个免疫球蛋白(Ig)基因座的J基因下游存在一个或多个编码抗体恒定区(C)的外显子。在重链基因座中，也存在表达不同抗体类别(同种型)的外显子。在小鼠中，编码的同种型是IgM、IgD、IgG1、IgG2a/c、IgG2b、IgG3、IgE和IgA；在人类中是IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2。
在胎儿肝脏和成人骨髓的B细胞发育过程中，基因重排首先发生在包含H链V、D和J基因片段的两条同源染色体之一上。在前B细胞(pre-B细胞)中，产生的VH外显子在RNA水平上被剪接到编码μH链恒定区的外显子上。pre-B细胞合成的μH链大部分保留在内质网(ER)中，并最终由于μH链部分未折叠的CH1结构域和驻留的ER伴侣BiP之间的非共价相互作用而降解(Haas and Wabl,Nature,306:387-9,1983；Bole,et al.,J Cell Biol.102:1558,1986)。然而，一小部分μ链与由不变的λ5和VpreB蛋白构成的替代轻链复合物结合，取代BiP并允许μH链/λ5/VpreB复合物与Igα/β信号分子一起作为前B细胞受体(preBCR)离开ER并通过分泌途径运输到质膜(übelhart,et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.393:3,2016)。
随后，在一个L链等位基因上发生一次VJ重排，直到产生功能性L链，之后L链多肽可以完全取代BiP并与μH链结合形成抗原的全功能B细胞受体(BCR)，由此形成未成熟B细胞。
防止细胞表面表达或分泌不完全组装的Ig分子的ER质量控制机制是非常严格的，因此，例如HL、HHL或HH的分子通常保留在ER中，如果不通过组装成完整的H2L2结构而被挽救，则被降解。(该系统主要集中于Ig H链的保留；因此，可以经常分泌游离的L链。)然而，几十年来，人们已经知道，在一种称为重链病(HCD)的罕见B细胞增殖性疾病中，可以分泌游离的单克隆H链(Franklin,et al.,Am.J.Med.,37:332,1964)。HCD中的H链被截短，随后的结构研究显示CH1结构域几乎总是缺失(Corcos,et al.,Blood,117:6991,2011)。从机理上讲，CH1缺失使H链从与BiP的抑制性相互作用中释放出来，从而允许其分泌，同时也阻止了二硫键介导的与L链的共价结合，因此HCD蛋白是HH二聚体。纯重链Ab(HCAb)也可以在非疾病环境中发现。i)正常骆驼中约75％的血清IgG由HCAb组成，其缺乏CH1结构域，并且还具有结构上改变的VH结构域，这阻止了与VL结构域的有效结合(de los Rios,et al.,Cur.Opin.Struct.Biol.,33:27,2015)。ii)其中κL链和λL链基因座都失活的小鼠仍然产生血清IgG，但是这种抗体的产生需要类别转换重组(CSR)中的错误，这导致B细胞DNA中CH1结构域编码外显子的缺失(Zou,et al.,J.Exp.Med.,204:3271,2007)。
HCAb作为治疗剂是有吸引力的，因为它们高度稳定并且比常规免疫球蛋白小。分子的VH抗原结合部分不受VL抗原结合部分的阻碍，可以识别蛋白质结构口袋内的表位，包括酶活性位点和病毒上的表位以及常规Ab不能到达的G偶联蛋白受体。衍生自例如小鼠的骆驼基HCAb是这种抗体的潜在来源，其中内源性VH基因已被骆驼VH基因取代，且编码CH1的外显子已缺失。然而，它们的缺点是骆驼VH结构域在人类和其它动物中是免疫原性的，在这些动物中它们可以用作治疗剂。存在这样的小鼠，其中内源性VH基因已经被其人类对应物取代，结合κ和λL链基因座的失活，这可能是HcAb的来源。然而，这种抗体的产生依赖于免疫反应期间CSR中相对罕见的错误，因此效率不高。
具有成对的重链(H)和轻链(L)的常规抗体的结合位点的尺寸可能太大，以致于不能适合靶表位的凹槽或缝隙。HCAb结合位点宽度的减小可能有助于接近“困难的”表位，例如酶的活性位点。在另一个用途中，HCAb促进双特异性抗体的产生。L链的缺失阻止了导致特异性丧失的“L链混乱”。产生由H链组成而没有L链的(人)免疫球蛋白的转基因小鼠可用于发现具有所需抗原特异性的抗体。
然而，如上所述，在没有轻链的情况下，天然重链不被浆细胞分泌。这是因为H链的CH1结构域被伴侣蛋白BiP结合，因此保留在内质网的腔中。CH1的缺失，例如在重链疾病中，或通过工程改造，使得H链分泌为二硫键连接的二聚体。
免疫球蛋白类别转换，也称为同种型转换(isotype switching)、同种型交换(isotypic commutation)或类别转换重组(CSR)，是一种将B细胞产生的免疫球蛋白从一种同种型改变为另一种同种型的生物学机制，例如从同种型IgM改变为同种型IgG。在此过程中，抗体重链的恒定区部分发生变化，但重链的可变区保持不变。由于可变区不变，类别转换不影响抗原特异性。相反，抗体保留了对相同抗原的亲和力，但可以通过其Fc区与不同的效应分子相互作用。
类别转换发生在成熟B细胞通过其膜结合抗体分子(B细胞受体，BCR)活化后，产生不同类别的抗体，作为V(D)J重组过程的结果，所有抗体具有与未成熟B细胞表达的原始抗体相同的可变结构域，但在其重链中具有不同的恒定结构域。
初始野生型成熟B细胞产生IgM(Cμ)和IgD(Cδ)，它们是野生型免疫球蛋白基因座中的前两个重链片段。经抗原激活后，这些B细胞发生增殖。如果这些活化的B细胞通过其CD40和细胞因子受体(均由辅助性T细胞调节)遇到特定的信号分子，它们就会发生抗体类别转换，产生IgG、IgA或IgE抗体。在类别转换过程中，免疫球蛋白重链的恒定区发生变化，但可变区保持不变，因此抗原特异性保持不变。这允许来自同一活化B细胞的不同子细胞产生不同同种型或亚型的抗体(例如，IgG1、IgG2等。)。
虽然人们可以设想和设计各种免疫球蛋白修饰以在细胞培养中产生HCAb，但是对于纯重链(HCO)转基因小鼠，必须记住B淋巴细胞的发育。B细胞每天通过造血干细胞分化为祖B细胞(pro-B细胞)、前B细胞(pre-B细胞)和未成熟B细胞而产生。如果修饰的免疫球蛋白不支持这种分化序列，将不会产生B细胞。
关于骆驼、转基因小鼠和大鼠中HCO抗体的报道表明，可以发育B细胞，其中H链不与L链配对。然而，CH1需要被删除，并且在骆驼中，没有L链的H链具有与标准VH区不同的VH结构。后者实表明，并不是所有的人VH结构域都支持HCO B细胞的发育。
WO2019018770 A1公开了包含由VH结构域和免疫球蛋白恒定结构域CL和CH1组成的抗原结合部分的单链VH抗体。
WO2014/141192A2公开了纯重链抗体的产生以及产生该抗体的转基因非人类动物。这种抗体缺乏CH1结构域。
US8754287B2公开了产生缺乏CH1结构域的重链抗体的小鼠，以及包含删除编码CH1结构域的核酸的种系修饰的转基因小鼠。
Schusser et al.描述了在VJCL敲除鸡中表达纯重链而没有相关轻链的抗体。(Eur.J.Immunol.,46:2137,2016)。
Klein et al.(Biochemistry,18:1473,1979)描述了分离的轻链可变区和恒定区与免疫球蛋白G的Fd’片段的相互作用。
WO2011/072204A1公开了含有功能性Cμ片段的转基因小鼠。因此，以标准IgM为抗原受体的成熟B细胞正常发育。然而，基因组的下游Cγ片段缺少CH1结构域。当在免疫反应过程中，抗体类别转换到(期望的)γ链时，这些链不能与L链配对。在H链类别转换中，保持VH，而交换CH。这将产生两种效果：(i)具有特异性由H+L链的组合定义的抗体的细胞将不再被刺激并将死亡；和(ii)特异性主要由H链定义的细胞可能死亡，因为不成对的VH在结构上不能存活。因此，在这种小鼠中，VH选择是“后端加载的”，即，在免疫反应期间。
WO2007096779A2描述了转基因小鼠用于生产类别特异性纯重链抗体的用途，所述小鼠包含一个以上异源VH重链基因座，其中每个VH重链基因座包含一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段、一个或多个J基因片段和编码重链恒定区的基因片段，所述重链恒定区在表达时不包含CH1结构域。
WO2009013620A2描述了通过将人V片段并入小鼠重链基因座中来产生全人可溶性VH结构域，其中小鼠V、D和J基因片段被人源V、D和J片段取代，并且免疫球蛋白重链效应子恒定区被缺乏CH1的免疫球蛋白重链效应子恒定区取代。
WO2015143414A2描述了一种小鼠，其包含重链恒定区基因序列的免疫球蛋白恒定区CH1基因中的缺失，以及用至少一个未重排的VL基因片段和至少一个未重排的JL基因片段替换一个或所有内源性VH、DH和JH基因片段。
WO2019184014A1描述了包含转基因Cγ基因片段的小鼠，所述转基因Cγ基因片段已被引入免疫球蛋白基因座中代替内源性Cμ基因片段，并且包含CH1结构域的缺失(见图1)。EP2411408B1和US9353179B2描述了包含随机整合的VH和VHH基因座的转基因小鼠。自上世纪80年代以来，记录了随机整合的免疫球蛋白(及其它)基因座的问题：表达的非生理学水平和插入转基因的不稳定性(丢失或功能沉默)。
需要高效且成本有效的方法来稳定生产HCAb。更具体地，需要能够产生抗原特异性HCAb的转基因非人动物。
发明内容
提供本概述以简化的形式介绍将在以下详细说明书中进一步描述的一些概念。本概述不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其它特征、细节、效用和优点将从以下详细书面说明中变得明显，包括附图中示出的和所附权利要求中定义的那些方面。
本发明的目的是提供用于在转基因动物或体外细胞培养物中有效且容易地产生纯重链抗体(HCAb)和表达多种此类HCAb的B细胞库的手段、构建体和方法。
该目的由本权利要求书的主题解决，并在此进一步描述。
根据本发明，提供了一种产生小鼠的方法，所述小鼠中B细胞表达多种的纯重链抗体(HCAb)库，所述方法通过在内源免疫球蛋白重链恒定区基因座内在内源Cμ基因片段上游并入转基因Cγ基因片段，其中所述Cγ基因片段包含缺失编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列。
具体地，在用抗原免疫所述小鼠后，小鼠表达分泌多种抗原特异性HCAb的B细胞库。具体地，在用抗原免疫小鼠后，抗原特异性B细胞分化成分泌抗原特异性HCAb的浆细胞。
具体地，在用抗原免疫后，小鼠激活抗原特异性B细胞，并诱导它们分化成分泌多种抗原特异性HCAb的浆细胞。
具体地，提供了一种产生小鼠的方法，所述小鼠在用抗原免疫后表达分泌多种抗原特异性HCAb的B细胞库，所述方法通过在内源免疫球蛋白重链恒定区基因座内在内源Cμ基因片段上游并入转基因Cγ基因片段，其中所述Cγ基因片段包含缺失编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列。
在野生型B细胞中，IgM和IgD共表达，但这发生在外周的(脾等)成熟B细胞中，而不是骨髓中正在发育的B细胞。位于失活Cμ基因片段下游的Cγ基因片段在B细胞发育过程中可能不表达。由于Ig重链是B细胞发育所必需的，在失活的Cμ基因片段下游含有Cγ基因片段的小鼠可能根本不能产生任何B细胞。如果Cγ基因片段被引入Ig重链基因座取代Cμ基因片段，轻链依赖的IgD的共表达可能对B细胞有害，因为内质网(ER)中会有错误折叠的δ重链。这可能导致ER应激，导致旨在恢复蛋白质稳态的未折叠蛋白反应(UPR)的激活，如果没有恢复，B细胞将经历凋亡性细胞死亡。具体地，通过将Cγ基因片段定位在Cμ基因片段内源位置的上游，pre-B细胞将表达含Cγ的preBCR。这具有显著的优点，即对于没有轻链也能稳定表达的VH-Cγ重链有正向选择。表达VH-Cγ重链版本的pre-B细胞不稳定，不与轻链二聚化，不能形成preBCR，因此被筛选，提供表达多种IgG型HCAb的改进的B细胞库。
具体地，小鼠包含含有能够产生所述B细胞库的重组免疫球蛋白重链基因座的细胞。
具体地，至少缺失的CH1结构域的所述部分包含CH1结构域的全部或部分，特别是编码CH1结构域的整个核苷酸序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或100％中的至少任何一者。具体地，Cγ基因片段包含缺失编码CH1的核苷酸序列的至少一部分，该部分是伴侣结合结构域，具体地，所述部分是由BiP结合的一个或多个氨基酸。
在一个具体的实施方案中，本文所述的HCAb缺乏CH1结构域，特别是缺乏IgG CH1结构域。尽管小鼠可能能够表达CH1结构域的一部分，但根据一个具体的实施方案，该部分不包含能够与CL结构域配对的功能性CH1结构域。
根据另一个具体的实施方案，本文所述的HCAb包含缺乏伴侣结合结构域的CH1结构域，特别是BiP伴侣结合结构域。具体地，小鼠被改造成表达HCAb，其中至少缺失CH1结构域的这类伴侣结合结构域。
本文所述小鼠细胞分泌的HCAb可以是可溶的或膜结合的。通过缺失全部或至少部分CH1结构域，表达的HCAb不会通过内质网(ER)质量控制机制保留在ER中，该机制通常阻止细胞表面表达或分泌纯重链抗体构建体。具体地，ER伴侣BiP不会将本发明的HCAb保留在ER中。
具体地，Cγ基因片段位于内源免疫球蛋白重链基因座中Eμ主要内含子增强子的下游，优选位于小鼠内源Eμ主要内含子增强子的下游，特别地，其包含SEQ ID NO:7，其位于小鼠内源免疫球蛋白重链基因座中J编码序列的下游。
如本文所述，Cγ基因片段位于Cμ基因片段的上游，该片段可以是突变的或未突变的。具体地，Cγ基因片段位于野生型重链基因座中Cμ基因片段所处位置的上游。具体地，Cγ基因片段位于本文所述小鼠的免疫球蛋白重链基因座中Cμ基因片段的上游和JH基因片段的下游。
初始野生型成熟B细胞产生IgM(Cμ)和IgD(Cδ)，它们是野生型免疫球蛋白基因座中的前两个重链片段。如本文所述，通过将Cγ基因片段定位于内源免疫球蛋白重链基因座中Cμ基因片段的上游，本文所述小鼠的初始成熟B细胞产生IgG型HCAb，并且经抗原激活后，这些B细胞发生增殖。令人惊讶的是，包含本文所述免疫球蛋白基因座的B细胞正常发育，并能够产生IgG型膜结合或可溶性HCAb。因此，本发明提供了表达多种IgG型HCAb的改进的B细胞库。
具体地，IgG型HCAb的特征在于包含IgG构架的VH结构域，特别是人或鼠IgG构架的VH结构域，和/或IgG抗体的抗体恒定结构域。具体地，IgG型HCAb是任何IgG亚型，例如，任何小鼠IgG1、IgG2a/c、IgG2b或IgG3亚型或任何人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。
具体地，转基因Cγ基因片段整合在小鼠内源免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段的上游，因此位于不同于其在野生型细胞中的相应位置处，野生型细胞中Cγ基因片段位于免疫球蛋白重链基因座中Cμ基因片段的下游。
在一个具体的实施方案中，转基因Cγ基因片段衍生自内源核酸序列，特别是小鼠Cγ基因片段，其通过缺失编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列而修饰，并且转基因Cγ基因片段并入在小鼠内源免疫球蛋白重链基因座中非自然存在的位置，即内源Cμ基因片段的上游。
根据不同的具体方面，转基因Cγ基因片段是外源核酸，例如合成核酸，并且整合在小鼠内源免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段的上游。
具体地，转基因Cγ基因片段是哺乳动物源的，优选啮齿动物源的，最优选小鼠源的。
具体地，转基因Cγ基因片段是人源的。
具体地，转基因Cγ基因片段包含或由转基因Cγ1、Cγ2a/c、Cγ2b或Cγ3基因片段组成。
具体地，转基因Cγ基因片段包含或由转基因Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4基因片段组成。
具体地，转基因Cγ基因片段是转基因小鼠或人Cγ1基因片段。
具体地，本文所述小鼠的内源免疫球蛋白重链基因座是小鼠内源免疫球蛋白重链基因座，具体地，位于小鼠基因组内的内源位置。
根据本文提供的方法的一个具体方面，本文所述小鼠或本文所述B细胞的免疫球蛋白重链基因座中的Cμ基因片段是无活性的。具体地，Cμ基因片段因功能缺失突变而失活，例如，引入终止密码子，或缺失编码Cμ基因片段的部分核苷酸序列。优选地，Cμ基因片段不完全缺失，仅缺失其一部分。具体地，Cμ基因片段由于缺失CH1、CH2、CH3和/或CH4结构域而失活。
在某些情况下，当基因座转录时，VDJ外显子被剪接到Cμ基因片段上。这可能导致轻链依赖性μ重链的产生。具体地，通过使Cμ基因片段失活，本文所述B细胞库的质量得到进一步改善。
具体地，通过缺失编码内源Cμ基因片段的整个核苷酸序列或其部分，使Cμ基因片段失活，所述部分是所述序列的约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的至少任何一者。
具体地，Cμ基因片段包含功能缺失突变、缺失或失活突变，优选引入终止密码子，优选在其CH1、CH2、CH3和CH4结构域的任一个或全部中引入终止密码子。优选地，Cμ基因片段在CH1、CH2和CH3结构域中包含终止密码子。
根据本文提供的方法的一个具体方面，本文所述小鼠或本文所述B细胞的免疫球蛋白重链基因座中的μ转换(S)区是无活性的。具体地，本文所述小鼠的免疫球蛋白重链基因座包含编码μ转换(S)区的核苷酸序列的功能缺失突变、缺失或失活突变，其通常存在于内源Igh基因座中。具体地，无功能性S区的Igh基因座不能进行同种型转换。
具体地，如果本文所述的B细胞经历同种型转换，则可能产生轻链依赖性重链同种型IgG、IgA或IgE。如本文所述，这可能导致B细胞死亡。因此，通过防止同种型转换，B细胞库可得到进一步改善。
在一个具体的实施方案中，其它重链同种型的CH结构域被失活，优选通过引入功能缺失突变、缺失或失活突变。具体地，本文所述免疫球蛋白重链基因座的恒定区基因片段包含功能缺失突变、缺失或失活突变，优选引入终止密码子，优选在其CH1、CH2、CH3和CH4结构域的任一个或全部中引入终止密码子。
根据一个具体的方面，根据本文所述方法产生的小鼠包含失活或缺失的内源性免疫球蛋白轻链基因座。具体地，本文所述的转基因小鼠包含任何内源κ或λ轻链基因座或两者内的功能缺失突变或缺失。这种小鼠的特征在于表达没有轻链的HCAb。
在一个具体的实施方案中，根据本文所述方法产生的小鼠免疫球蛋白重链基因座包含人VH、D和JH编码序列和表达控制序列，它们以可操作的连接方式控制VH、D和JH编码序列的表达。具体地，表达控制序列是鼠的。
在本文提供的方法的一个具体方面，在B细胞发育期间，本文所述免疫球蛋白重链基因座的VH、D和JH编码序列重组形成表达VH结合位点的VDJ编码序列。每个发育中的B细胞将随机选择一个VH、一个D和一个JH基因片段用于重组和表达为HCAb。成熟后，小鼠体内数以百万计B细胞中的每一个都会识别特定的抗原，并且如果遇到该抗原，就会被激活。
具体地，VH、D和JH编码序列经重组以形成表达特异性识别抗原的VH结合位点的VDJ编码序列，从而在给定B细胞中获得重组VH编码序列，其能够分泌包含由重组VH编码序列编码的抗原特异性VH结合结构域的IgG型HCAb。
具体地，VH、D和Jн编码序列经重组以形成表达特异性识别抗原的VH结合位点的VDJ编码序列，从而在B细胞中获得重组VH编码序列，其后代能够分泌包含由重组VH编码序列编码的抗原特异性VH结合结构域的IgG型HCAb。
具体地，VH、D和JH编码序列经重组以形成表达特异性识别抗原的VH结合位点的VDJ编码序列，从而在B细胞中获得重组VH编码序列，该B细胞在分化成浆细胞后(特别是浆细胞(plasmacyte))，能够分泌包含由重组VH编码序列编码的抗原特异性VH结合结构域的IgG型HCAb。
在本文提供的方法的一个具体方面，在用抗原免疫本文所述小鼠后，表达特异性识别该抗原的VH结合位点的B细胞将经历活化并分化成浆细胞，所述浆细胞能够分泌包含抗原特异性VH结合结构域的IgG型HCAb。
具体地，本文所述小鼠B细胞分泌的HCAb包含或由抗原特异性VH结合结构域和缺乏CH1结构域的IgG恒定区组成，或者包含或仅由CH1结构域的一部分组成。具体地，CH1结构域的所述部分缺乏伴侣结合结构域，优选CH1结构域缺乏BiP伴侣结合结构域。
本文还提供了表达多种IgG型HCAb的B细胞库。具体地，B细胞库表达多种IgG型HCAb，其源自通过本文所述方法获得的小鼠。本文所述的小鼠可包含所述B细胞库，或者B细胞库可从小鼠中分离。B细胞库可以以B细胞文库或源自所述B细胞库的核酸分子库的形式提供。可以使用展示系统提供相应的文库，从而能够筛选表达抗原结合特性的分子。具体地，这种核酸分子的文库编码多种HCAb，或包含这类HCAb的VH结合位点的相应抗原结合分子。根据一个具体方面，这类核酸分子的文库可用于产生抗原结合分子文库的方法中，所述抗原结合分子包含或由VH结构域组成，所述VH结构域在VH抗原结合位点或结合特性上不同。
具体地，本文所述的B细胞库能够表达不同(VH)抗原结合位点的多种HCAb，例如，从而允许产生多种抗原结合分子，诸如抗体，识别相同抗原或表位，例如产生亲和力成熟或优化的抗体变体；或者产生特异性识别靶抗原但识别该靶抗原不同表位的抗体。
根据一个具体的方面，本文所述的文库，例如B细胞文库或核酸分子或抗原结合分子的相应文库，可以被适当地筛选，并且可以根据期望的结构或功能特性选择文库成员，以鉴定和产生包含所选文库成员的VH结合位点的抗原结合分子。可以适当筛选本文所述的这类文库，并且可以根据期望的结构或功能特性选择单个文库成员，以产生抗原结合分子，特别是抗体产物。
具体地，本文所述的B细胞库能够表达多种抗原特异性HCAb，这些HCAb的VH结构域不同。
在一个具体的方面，本文所述的B细胞库表达多种抗体或抗体片段，特别是本文所述的HCAb，包括多种抗体或抗体片段，每种抗体或抗体片段特异性识别相同的靶抗原或表位。具体地，在用抗原免疫本文所述小鼠后，B细胞库表达抗原特异性抗体或抗体片段。根据一个具体的方面，本文提供了抗体文库，其包含或覆盖多种抗体，识别相同的靶抗原或表位。
在一个具体的方面，本文所述的B细胞库表达多种抗体或抗体片段，特别是本文所述的HCAb，包括识别不同靶抗原的多种抗体。这种库可以通过用复杂的多组分抗原例如病毒或细菌免疫来获得，所述抗原具有许多不同的靶抗原，每种靶抗原具有多个表位。根据一个具体的方面，本文提供了抗体文库，其包含或覆盖识别不同靶抗原的多种抗体。
根据一个具体的方面，本发明提供了表达多种抗体或抗体片段的B细胞库，这些抗体或抗体片段缺乏任何轻链。具体地，本发明提供了表达本文所述多种HCAb的B细胞库，每种HCAb特异性识别相同的靶抗原或不同的靶抗原。具体地，本文提供了可获得的或通过本文提供的方法获得的B细胞库。具体地，B细胞库由本文所述的转基因小鼠表达。
具体地，本文所指的各种抗原结合分子(例如本文所述的B细胞库或相应的文库的抗原结合分子)，包含或覆盖102、103、104、105或106种抗原特异性分子中的至少任何一种，例如抗体或HCAb。
B细胞库的多样性可以例如通过深度测序来确定，例如确定不同VDJ排列的数量，表明由B细胞库表达的HCAb的多样性。
本文所述的B细胞库可作为核酸序列库提供，所述核酸序列库可通过对本文所述小鼠产生的B细胞中的重组VH序列进行测序而获得。这种测序可以使用深度测序方法来完成，例如下一代测序(NGS)。深度测序是指对一个基因组区域进行多次测序，有时是数百次甚至数千次。这种NGS方法允许提供多种VH结构域核酸或氨基酸序列。
根据一个具体的方面，提供了HCAb的抗体文库，其中
a)编码所述抗体的基因衍生自本文所述的B细胞库，或
b)抗体由哺乳动物浆细胞分泌，优选为啮齿动物源，特别是小鼠源。
具体地，该文库可通过从本文所述B细胞库的B细胞中克隆编码所述抗体库的基因或通过多种哺乳动物浆细胞分泌抗体来获得。具体地，哺乳动物浆细胞分泌的抗体的特征在于糖基化模式，该模式是哺乳动物浆细胞源性种类的特征。
因此，本发明进一步提供了产生本文所述抗体的方法，特别是通过工程改造表达和分泌这类抗体的哺乳动物浆细胞来产生本文所述抗体的库。
具体地，哺乳动物浆细胞源自啮齿动物，优选小鼠。
很好理解的是，本文所述的抗体可以利用除小鼠以外的其它物种的一个或多个相应序列来制备，包括例如非小鼠动物的、或人源的、或其任意组合，例如编码相应人抗体结构域的人核酸序列。
人抗体恒定结构域的序列是本领域众所周知的，可以从各种数据库获得，包括美国国家生物技术信息中心(The National Center for Biotechnology Information)(NCBI)和免疫遗传学(ImmunoGeneTics)(IMGT)。人IgG1恒定结构域外显子CH1、CH2和CH3-S(S，编码γ1HC分泌形式的CH3外显子的3’部分)的示例性序列如SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:18所鉴定。
很好理解的是，人抗体结构域的任何序列仅是示例性的。或者，可以使用相应不同等位基因的人抗体结构域序列。
作为编码抗体结构域的动物或人源的核苷酸序列或者动物或人氨基酸序列的替代物，可以使用修饰的(人工)核苷酸序列和相应的氨基酸序列，例如，相应的序列包含至少80％、85％、90％或至少95％序列同一性中的任一者，只要相应的抗体结构域在本文所述的相应抗体结构内具有配对和连接的功能。
根据一个具体的实施方案，抗体在宿主细胞(体外)或非人类动物宿主，特别是小鼠(体内)中产生。
本文描述的示例性HCAb的结构在图3B中示出。
VH抗原结合部分具体包含或由VH结构域的三个CDR环组成，即VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3。抗原结合部分可以通过一个或多个CDR环的变异而亲和力成熟，从而优化或增加结合靶抗原的亲和力。这种变异可通过一个或多个点突变来获得，例如，通过体内过程或通过体外诱变技术，在任一或每一CDR序列中的1、2、3或更多点突变来获得亲和力成熟的抗原结合位点。
具体地，HCAb是由两条相同的重链组成的分子，每条重链包含与抗体恒定结构域CH2和CH3融合的VH结构域。具体地，抗体恒定结构域是IgG恒定结构域。在两条重链的CH2结构域和CH3结构域配对后，HCAb包含两个VH结构域和一个Fc区。
本文描述的HCAb的Fc区具体包含抗体的恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域。“Fc区”通常指IgG、IgA或IgD的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域和这些结构域N端的柔性铰链区，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域。具体地，铰链是IgG、IgA或IgD抗体。
对于IgG型的HCAb，Fc特异性地包含或由Cγ免疫球蛋白结构域CH2和CH3，以及任选地Fc结构域和VH臂的抗体结构域之间或VH和CH2之间的铰链区组成。IgG型HCAb的Fc区具体不包含CH1结构域或包含缺乏伴侣结合序列的CH1结构域的一部分。Fc区还可以包含CH2或CH3结构域，其形式为相应自然存在的抗体结构域的人工变体，例如，与所述自然存在的抗体结构域具有至少90％的序列同一性。
特别地，本文描述的Fc区包含或由CH2和CH3结构域的二聚体组成，所述结构域是抗体重链(HC)的一部分，其中第一HC的CH2结构域与第二HC的CH2成对，并且第一HC的CH3结构域与第二HC的CH3成对。这种二聚体可以是同源二聚体，即由相同氨基酸序列的两条CH2-CH3结构域链构成，或者是异源二聚体，即由两条CH2-CH3结构域链构成，其中每条链具有不同的氨基酸序列，例如具有不同的CH3氨基酸序列以稳定Fc。
在一个具体的方面，HCAb包含将Fc区的CH2-CH3结构域链连接到VH结构域的铰链区。具体地，HCAb包含连接VH结构域和抗体恒定结构域的铰链区。具体地，铰链区源自将CH1结构域的C端连接到CH2结构域的N端的常规抗体重链铰链区。或者，可以使用大约相同长度的任何其它自然或人工接头。合适的铰链区是天然的(自然存在的，例如人或小鼠的)IgG或IgA重链铰链区，或其相同长度+/-1或+/-2个氨基酸的功能变体，其任选包含一个或多个，最多5个或更少的点突变。铰链区通常包含一个或多个半胱氨酸残基，以在HCAb中产生二硫键，例如连接两个HC。
具体地，包含在HCAb中的两个HC(本文也称为第一HC和第二HC)的氨基酸序列是相同的。或者，两个HC的氨基酸序列不同，例如，使得VH结构域的抗原结合位点不同。
例如，第一HC包括第一VH，第二HC包括第二VH。第一VH和第二VH可以包含相同或不同的抗原结合位点，例如，特异性识别两种不同的靶抗原。因此，HCAb可以是单特异性的、二价的或双特异性的。
由转基因非人类动物(例如本文所述的小鼠)产生的抗体通常被理解为自然或天然的抗体。这种自然抗体可以衍生自特异性识别抗原的抗体库，例如由本文所述的转基因小鼠产生的抗体库。
根据一个具体的方面，抗体或抗体库可以在体内经历亲和力成熟，产生结合特定靶抗原的高亲和力抗体，例如，具有小于10-7M，例如在10-7和10-10M之间的KD。
通过体外诱变方法，例如采用随机诱变和/或文库技术产生的亲和力成熟的抗体可以产生甚至更高的亲和力，例如，具有小于10-8M，例如小于10-11M的KD。
自然抗体有利地以VH-CDR序列的天然的构象为特征。这种天然的构象的特征在于抗原结合位点的自然的一级结构，和/或全长VH结构域的自然的一级结构。
当产生HCAb时，选择的抗体结构域和/或铰链区可以是人、人工或非人动物源的。例如，HCAb在转基因小鼠中产生，包含人和小鼠序列。
根据一个具体的方面，本文所述的HCAb以可溶形式提供，例如浓度适合用于药物制剂的水溶性形式。本文具体提供了一种可溶性制剂，其包含本文所述的分离形式的HCAb，例如从产生HCAb的动物的血清或血液组分中分离，或从细胞培养组分中分离。
本文还提供了可获得或通过本文所述方法获得的小鼠。具体地，本文提供了包含本文所述免疫球蛋白重链基因座的小鼠。具体地，本文所述小鼠在其内源免疫球蛋白重链基因座中包含位于内源Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段，其中Cγ基因片段包含编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列的缺失。
具体地，本文描述的小鼠在其基因组中包含经修饰的免疫球蛋白等位基因或其它转基因。具体地，本文所述小鼠在其内源免疫球蛋白重链基因座中包含至少一个转基因Cγ基因片段，因此是转基因动物。
在一个具体的实施方案中，本文所述的小鼠进一步包含人免疫球蛋白区域。例如，已经开发了许多方法来用人免疫球蛋白序列替换小鼠内源性免疫球蛋白区域，以产生用于药物发现目的的部分或完全人抗体。这种小鼠的实例包括在例如美国专利号7,145,056；7,064,244；7,041,871；6,673,986；6,596,541；6,570,061；6,162,963；6,130,364；6,091,001；6,023,010；5,593,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318；5,789,650；5,661,016；5,612,205和5,591,669中描述的那些。
根据一个具体的方面，本文所述的免疫球蛋白重链基因座包含嵌合基因片段。具体地，本文所述的小鼠包含嵌合免疫球蛋白片段，例如US2013/0219535中所述的嵌合免疫球蛋白片段，具体地，人IGH(VH，D，JH)编码序列嵌入相应的小鼠非编码和调控序列中。包含人免疫球蛋白编码序列和鼠表达控制序列的免疫球蛋白基因片段在本文中也称为“嵌合免疫球蛋白基因片段”。
具体地，这种转基因小鼠的基因组包含引入的外源免疫球蛋白区域，该区域部分是人的，其中引入的区域包含人可变区编码序列和控制人序列表达的鼠非编码调控序列，该调控序列源自小鼠或小鼠的内源基因组，并通过引入嵌合免疫球蛋白基因片段或嵌合免疫球蛋白基因座而敲入小鼠基因组。特别地，鼠序列，特别是鼠非编码和调控序列，是基于相应的鼠内源序列，即与野生型内源免疫球蛋白基因座相同的序列。
本文所述的用于表达人免疫球蛋白基因序列的鼠表达控制序列特别选自启动子、转录起始和终止序列、增强子和激活子序列、核糖体结合位点。这种表达控制序列的具体实例是编码序列侧翼的序列，其可以包括启动子、5’非翻译序列、插入前导肽编码序列的内含子、重组信号序列(RSS)和剪接位点。
具体地，本文所述小鼠在本文所述免疫球蛋白重链基因座内包含VH重链基因座，该基因座包含人VH、D和JH编码序列和表达控制序列，它们以可操作的连接方式控制VH、D和JH编码序列的表达。具体地，VH重链基因座是嵌合的，其中VH重链基因座的表达控制序列是鼠的，优选内源表达控制序列。
具体地，VH重链基因座包含人VH、D和JH编码序列的库。具体地，它是至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120个VH编码序列，2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40个D编码序列和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个JH编码序列，特别是人VH、D和JH编码序列。具体地，它是最多120个VH编码序列，最多40个D编码序列，最多20个JH编码序列。具体地，VH重链基因座包含人VH、D和JH编码序列的完全库。
具体地，VH重链基因座的VH、D和JH编码序列重组以形成特异性识别抗原的VDJ编码序列，并且其中含有重组VH重链基因座的B细胞表达包含抗原特异性VH结合结构域和缺乏CH1结构域或缺乏CH1结构域至少一部分的IgG恒定区的HCAb。
具体地，转基因Cγ基因片段包含在核酸构建体中。
在一个具体的实施方案中，转基因Cγ基因片段包含在核酸构建体中，该核酸构建体包含至少一个免疫球蛋白基因片段编码序列，特别是至少免疫球蛋白重链基因座的JH基因片段编码序列，优选至少JH2-6基因片段的编码序列。
具体地，可将包含转基因Cγ基因片段和嵌合免疫球蛋白基因片段的核酸构建体引入小鼠基因组，作为内源Cμ基因片段上游的外源核酸构建体或元件，并取代小鼠内源免疫球蛋白重链基因座的至少一部分，所述嵌合免疫球蛋白基因片段包含嵌入相应小鼠非编码和调控序列中的人IGH编码序列，优选至少人IGH J编码序列。具体地，核酸构建体包含人IGH VH、D和JH编码序列。
具体地，可将包含转基因Cγ基因片段、嵌合免疫球蛋白基因片段和本文所述的失活Cμ基因片段的核酸构建体引入小鼠基因组，作为内源Cδ基因片段上游的外源核酸构建体或元件，并取代小鼠内源免疫球蛋白重链基因座的至少一部分，所述嵌合免疫球蛋白基因片段包含嵌入相应小鼠非编码和调控序列中的人IGH编码序列，优选至少人IGH J编码序列。具体地，核酸构建体包含人IGH VH、D和JH编码序列。
或者，将转基因Cγ基因片段和任选的失活Cμ基因片段敲入小鼠基因组内的免疫球蛋白基因座。
在另一个有利的方面，本文所述小鼠的基因组内容物经修饰，使得它们的B细胞能够每细胞表达一个以上功能性VH结构域，即细胞产生双特异性抗体，如WO2017035252A1中所述。
具体地，本文所述转基因小鼠的免疫球蛋白重链基因座中的Cμ基因片段是无活性的。具体地，Cμ基因片段因功能缺失突变、Cμ基因片段缺失或者一个或多个引入一个或多个终止密码子的突变而失活。
具体地，本文描述了本文所述小鼠的免疫球蛋白重链基因座，其包含Cμ基因片段的转基因Cγ基因片段5’，其中Cγ基因片段包含编码CH1结构域至少一部分的核苷酸序列的缺失。
在一个具体的实施方案中，Cμ基因片段是本文所述小鼠免疫球蛋白重链基因座的内源基因片段。
在一个具体的实施方案中，本文所述免疫球蛋白重链基因座的Cμ基因片段是一种转基因基因片段，其取代了内源免疫球蛋白重链基因座中的内源Cμ基因片段，并包含一个或多个失活突变。
具体地，转基因Cμ基因片段因功能缺失突变而失活，或因Cμ基因片段的部分缺失而失活，例如缺失至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的任一者，或因在Cμ基因片段中，优选在CH1、CH2、CH3和CH4结构域的任一或多个中引入外源终止密码子而失活。
具体地，本文所述的Cμ基因片段位于野生型小鼠免疫球蛋白重链基因座中Cμ基因片段的自然位置。
具体地，本文所述小鼠包含本文所述其内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰。
具体地，本文描述的基因座是重组(例如“嵌合”)基因座，其源自小鼠，但包含至少一个外源性元件，例如一个或多个外源性重链区，其与该基因座的调控元件非自然相关，例如在编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列中包含缺失的Cγ基因片段。
具体地，通过合适的基因靶向技术，例如定向同源重组、使用位点特异性重组酶技术，或CRISPR/Cas9技术，处理小鼠以将基因序列并入免疫球蛋白重链基因座。
具体地，小鼠不表达内源κ和/或λ基因座，因为所述内源κ和/或λ基因座缺失或沉默，或者经功能丧失突变。
根据一个具体的实施方案，如本文所述的产生抗体的方法还包括以下步骤：用抗原免疫本文所述的小鼠，从而通过小鼠B细胞库所含的抗原特异性B细胞引发针对该抗原的免疫应答。应答的B细胞将最终分化成浆细胞，浆细胞分泌对免疫抗原特异的HCAb。
抗原可以以任何方便的方式施用于小鼠，有或没有佐剂，并且可以按照预定的方案施用。
本文具体提供了产生抗原特异性抗体的方法，包括：
a)用抗原免疫转基因小鼠，所述小鼠包含位于免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段，其中Cγ基因片段包含编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列的缺失，
b)表达包含抗原特异性VH和IgG恒定区的HCAb；
c)分离编码所述抗原特异性VH的一种或多种核酸序列，
d)产生包含所述抗原特异性VH的单克隆抗体。
具体地，本文提供了产生包含抗原特异性VH结构域的抗体的方法，该方法包括：
a)用抗原免疫小鼠，所述小鼠包含位于免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段，其中Cγ基因片段包含编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列的缺失，从而提供表达抗原特异性HCAb的细胞库；
b)从所述库选择表达包含抗原特异性VH的IgG型HCAb的细胞；
c)从所述HCAb中确定编码所述抗原特异性VH的核酸序列，
d)产生包含所述抗原特异性VH的单克隆抗体。
具体地，根据本文所述方法产生的单克隆抗体可以是任何全长免疫球蛋白、其抗原结合抗体片段或包含至少一个可变重链(VH)抗体结构域或单个VH结构域的任何其它抗体构建体，例如包括一种或多种单结构域抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv，或例如IgG型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)的全长抗体、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的抗体。一个具体的实施方案是纯重链抗体，例如本文所述的HCAb。
具体地，编码所述抗原特异性VH的核酸序列通过对本文所述小鼠产生的B细胞中的重组VH序列进行测序来确定。这种测序可以使用深度测序方法例如下一代测序(NGS)来完成。
为了制备单克隆抗体，可以从免疫的转基因小鼠中分离抗体产生细胞，例如脾和/或淋巴结细胞，并用于与转化的细胞系融合以产生杂交瘤，或者通过标准分子生物学技术克隆编码cDNA的抗体并在转染的细胞中表达。制备单克隆抗体的程序在本领域中已经充分确立。
具体地，该方法还包括以下步骤：制备杂交瘤和产生并筛选抗体产生细胞，特别是那些特异性识别靶抗原的细胞。
具体地，本文提供了产生包含抗原特异性VH结构域的抗体的方法，该方法包括：
a)用抗原免疫小鼠，所述小鼠包含位于免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段，其中Cγ基因片段包含编码至少部分CH1结构域的核苷酸序列的缺失，
b)从所述转基因小鼠中分离脾和/或淋巴结细胞；
c)从所述脾和/或淋巴结细胞产生杂交瘤；
d)筛选抗原特异性杂交瘤；
e)从所述杂交瘤中分泌包含抗原特异性VH的IgG型HCAb；和
f)从培养上清液中分离所述单克隆HCAb。
在一个具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：从所述杂交瘤中确定编码所述抗原特异性VH的核酸序列，并产生包含所述抗原特异性VH的重组单克隆抗体。
具体地，该方法包括以下步骤：从免疫小鼠中分离核酸序列，用于在细胞培养物中产生特异性抗体或其片段，特别是抗原结合片段。这种抗体或其抗原结合片段在本文中被理解为超免疫抗体。
本文还提供了本文所述转基因小鼠在制备抗原结合分子文库的方法中的用途，所述抗原结合分子文库包含源自本文所述小鼠或本文所述相应B细胞库的多种VH结合位点。具体地，本文提供了VH结构域的库(例如VH文库)或包含VH的分子的库(或相应的文库)，特别是HCAb的库(或HCAb文库)。
本文还提供了生产本文所述小鼠的方法，包括：
a)提供鼠胚胎干细胞；
b)提供在一个或多个表达盒中包含核酸序列的一个或多个载体(也称为靶向载体)，所述核酸序列包含本文所述的转基因Cγ基因片段和任选的本文所述的无活性Cμ基因片段；
c)将所述一个或多个载体引入细胞；
d)筛选转基因细胞，其中b)的序列已经通过在内源免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段(可以是突变的或未突变的)上游的靶向整合而并入所述细胞的细胞基因组中，或者，如果载体包含替代内源Cμ的无活性Cμ，则并入到内源Cδ基因片段上游的Cμ中；和
e)利用所述转基因细胞产生衍生自所述转基因细胞的转基因小鼠。
具体地，内源Cμ基因片段失活，优选通过功能缺失突变、Cμ基因片段缺失或通过引入终止密码子的突变。
具体地，小鼠表达本文所述的HCAb。具体地，该小鼠表达纯重链抗体，和/或不表达任何包含VL结构域的抗体构建体。
具体地，使用一种或多种标记来指示所述一个或多个载体成功整合到细胞基因组中。具体地，使用了能够在宿主中表达的选择性标记，其允许容易地筛选那些含有引入的核酸或载体的宿主。
选择性标记的实例包括，例如，赋予抗微生物剂(例如，嘌呤霉素、潮霉素、博来霉素或氯霉素)或抗病毒剂(例如，更昔洛韦)抗性的蛋白质，赋予宿主细胞代谢优势(例如，营养优势)的蛋白质，以及赋予细胞功能或表型优势(例如，细胞分裂)的蛋白质。
在一个具体的实施方案中，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因用于负筛选，更昔洛韦和/或嘌呤霉素抗性基因用于筛选已经将靶向载体整合到其基因组中的细胞。
具体地，通过能够将核酸序列并入真核细胞的方式，引入载体，使得编码核酸序列插入细胞，其中核酸序列可以瞬时存在于细胞中，但优选并入或稳定整合到细胞的基因组(特别是染色体)中。
具体地，通过任何靶向重组方法，例如通过同源重组或位点特异性重组技术，将所述一个或多个载体整合到所述小鼠细胞的细胞基因组的靶位点。具体地，CRISPR/Cas9基因组编辑系统可用于靶向重组(He,et al.,Nuc.Acids Res.,44:e85,2016)。
根据一个具体的实施方案，提供了产生本文所述转基因小鼠的方法，包括：
a)提供小鼠细胞，其包含位于内源免疫球蛋白重链基因座的内源Cδ基因片段的5’位置的靶位点；
b)提供在一个或多个表达盒中包含核酸序列的一个或多个载体，所述核酸序列包含含有编码CH1结构域的核苷酸序列缺失的Cγ基因片段，和任选地包含至少一个失活突变的Cμ基因片段，所述核酸序列的侧翼是与所述靶位点同源的DNA序列，和一个或多个标记，以选择载体靶向同源重组到细胞基因组中；
c)将所述一个或多个载体引入所述小鼠细胞；
d)将所述核酸序列并入所述小鼠细胞的基因组中，并筛选转基因细胞，其中所述核酸序列已经在所述靶位点整合到所述细胞的细胞基因组中；和
e)利用所述转基因细胞产生包含所述转基因细胞的转基因小鼠。
具体地，可以使用同源靶向载体或“靶向载体”，其是包含编码靶向序列的核酸、位点特异性重组位点和任选的选择性标记基因的载体，其用于在宿主细胞中使用同源介导的重组(特别是同源重组)来修饰内源免疫球蛋白区域。在一个具体的实施例中，同源靶向载体可以进一步包含位点特异性重组位点，并且可以用于将位点特异性重组位点引入宿主细胞基因组的特定区域。
具体地，使用靶向载体，其在转染宿主细胞后与宿主细胞基因组重组，在生产性VDJ重排后，编码的抗体被表达并插入质膜和/或由宿主细胞分泌。具体地，载体包含一个或多个外源或异源调控元件，例如增强子或启动子，其与抗体编码序列可操作地连接，该调控元件与所述抗体编码序列非自然相关。
根据另一具体的实施方案，提供了用于产生本文描述的小鼠的方法，包括：
a)提供小鼠细胞并整合两个重组酶介导的盒交换(RMCE)靶位点，靶位点侧翼是位点特异性重组酶的识别序列，位于内源免疫球蛋白重链基因座的内源Cμ基因片段的5’和3’位置；
b)提供在一个或多个表达盒中包含核酸序列的一个或多个载体，所述核酸序列包含Cγ基因片段和任选的Cμ基因片段，所述Cγ基因片段包含编码至少部分或全部CH1结构域的核苷酸序列的缺失，所述Cμ基因片段包含至少一种失活突变，所述核酸序列的侧翼是位点特异性重组酶的其它识别位点，以及包含一种或多种标记，以选择载体靶向整合到小鼠基因组中，其中所述其它识别位点能够与所述RMCE靶位点重组；
c)将所述一个或多个载体和识别所述RCME靶位点和其它识别位点的位点特异性重组酶引入所述小鼠细胞；
d)将所述核酸序列并入所述小鼠细胞的基因组中，并筛选转基因细胞，其中所述核酸序列已经在所述RMCE靶位点整合到所述细胞的细胞基因组中；和
e)利用所述转基因细胞产生包含所述转基因细胞的转基因小鼠。
具体地，位点特异性重组酶的任何所述识别位点是重组酶识别位点(例如，Cre/lox、Flp-FRT等)，其中重组酶能够切除其两个识别位点之间的DNA序列。
根据一个具体的方面，本文提供了生产纯重链抗体的方法，所述方法包括：
a)在小鼠中表达重组免疫球蛋白重链基因座，该基因座包含
i)可变重链区，该可变重链区包含一个或多个VH、D和JH基因片段，优选包含嵌入小鼠调控序列中的人VH、D和JH编码序列，
ii)恒定重链区，该恒定重链区包含免疫球蛋白重链基因座中Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段，
其中Cγ基因片段包含编码至少部分或全部CH1结构域的核苷酸序列的缺失，并且其中，任选地，Cμ基因片段是无活性的，和
iii)连接区，
所述区域被改造并定位成表达本文所述的HCAb，
其中所述小鼠不表达内源性κ和/或λ基因座；和
b)产生抗体，即所述HCAb。
根据一个具体的实施方案，本文所述的抗体是使用合适的生产宿主细胞系在细胞培养物中产生的。具体地，该生产采用细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞培养物。具体地，宿主细胞在引入编码本文所述抗体的相应核酸分子后使用。特别地，有利地使用任何哺乳动物宿主细胞：BHK、CHO、HeLa、HEK293、MDCK、NIH3T3、NS0、PER.C6、SP2/0或VERO细胞。
根据一个具体方面，本发明提供了本文所述小鼠用于产生抗原结合分子文库的用途，所述抗原结合分子例如抗体，至少包含VH结合位点或相应的VH结构域，例如HCAb抗体，或其至少包含VH结合位点的片段，或编码或表达所述文库的核酸序列文库。
本文所述的转基因细胞可用于产生用于鉴定感兴趣的抗体的表达文库，例如，通过从B细胞中克隆编码抗体的基因，或通过在浆细胞膜上表达抗体的工程化小鼠中选择具有确定特异性的浆细胞，例如，如US20170226162A1中所述。因此，本发明还包括使用细胞技术产生的抗体库，用于鉴定浆细胞表达的抗原特异性抗体。
具体实施方案包括从来自本文所述遗传修饰小鼠的工程化部分的免疫球蛋白重链基因转录的部分或全部免疫球蛋白蛋白；和源自遗传修饰小鼠细胞的部分或全部工程化免疫球蛋白。
下面将更详细地描述本发明的这些和其他方面、目的和特征。
附图说明
图1：描绘了小鼠种系Igh基因座(上部)[包括V(IghV)、D(IghD)、J(IghJ)和C(IghC)基因片段；有多个IghC外显子编码不同的Ig H链同种型]，Igκ基因座(Igκ，中间)[包括V(IgkV)、J(IgkJ)和C(IgkC)基因片段]和Igλ基因座(底部)[包括V(IgIV)、J(IglJ)和C(IgIC)基因片段]。还显示了(1)PAIR元件，其是Igh成环的关键顺式调控序列，以确保在VDJ重排中利用远端VH基因片段，(2)Adam6a雄性生育能力基因，(3)基因间控制区1(IGCR1)，其包含调节Igh基因座有序、谱系特异性重排的位点，(4)Eμ、IEκ和Eλ2-4，重链、κ和λ轻链内含子增强子，(5)3’Eκ、Eλ和Eλ3-1，κ和λ轻链3’增强子，(6)Sμ，μ转换区，和(7)3’调控区(3’RR)，一个控制同种型转换的顺式作用元件。
图2：用于通过同源重组将小鼠Ighg1ΔCH1基因盒引入小鼠内源Igh基因座Ighm上游以产生HCO Ab的靶向载体。在该图和图3中，“小鼠内源Igh基因座”位于含有部分人IGH基因座的ES细胞中，如Wabl和Killeen在US20130219535A1中所述。
图3：(A)描绘了用图2所示载体靶向的小鼠内源Igh基因座，该基因座编码纯重链(HCO)抗体(ΔCH1 HCO IgG1)。将CH1外显子缺失的小鼠Cγ1基因插入小鼠Igh基因座的Eμ和Ighm之间，并将终止密码子(TGA，用星号表示)插入编码μ重链(HC)的CH1、CH2和CH3结构域的每个外显子中。在野生型小鼠中，在发育中的B细胞中进行生产性VDJH重组后，产生轻链(LC)依赖性μHC。在本文描述的突变Igh基因座中，却产生了LC非依赖性ΔCH1γ1HC。IgG1HCO抗体的两种跨膜(M)分泌(S)形式都由该修饰的Igh基因座编码。γ1m转录物通过交替剪接产生，包括M1和M2外显子，γ1s包括位于CH3外显子3’端的S外显子。CH1缺失允许HC运输到质膜(γ1m)或分泌(γ1s)，而不必与替代或常规(κ或λ)LC关联。当VDJH外显子直接剪接到Cμ而不是Cγ1ΔCн1时，Cμ中的三个终止密码子阻止LC依赖性μHC的表达。(B)是IgG1 HCO抗体蛋白的跨膜形式的示意图，其包含可变(VH)、CH2、CH3和M结构域，但缺少CH1结构域。HC作为二聚体存在，通过非共价相互作用和链间二硫键结合在一起(由位于VH和CH2结构域之间的水平线表示)，并通过其M结构域插入质膜。分泌形式的IgG1 HCO抗体(未显示)缺乏M结构域，而是在蛋白质的COOH端具有一个短的分泌(S)结构域。在B细胞活化并分化为成浆母细胞/浆细胞后表达。
图4：描绘了TRN11/2/5和TRN34/29/30小鼠骨髓中的B细胞发育。在TRN11/2/5小鼠中，内源性VH、Vκ和Vλ基因座分别被侧翼为小鼠调控序列的人VH、Vκ和Vλ基因座编码序列所取代。在TRN34/29/30小鼠中，VH、D和JH基因片段与TRN11相同，但Igh基因座的其余部分已被修饰，如图3所示，以编码IgG1 HCO抗体。Vκ和Vλ基因座分别在TRN29和TRN3O等位基因中失活。骨髓细胞用对所示CD抗原特异的荧光缀合单克隆抗体(mAb)染色，并通过流式细胞术分析。流程图中的数字表示给定门中细胞的百分比。还显示了B细胞的发育阶段。成熟的再循环B(recirc.B)，B细胞在骨髓中产生并在外周(例如脾)完成成熟，并通过血流再循环回骨髓(BM)。
图5：描绘了TRN11/2/5和TRN34/29/30小鼠脾脏中的B细胞分化。脾细胞用对所示CD抗原特异的荧光缀合mAb染色，并通过流式细胞术分析。流程图中的数字表示给定门中细胞的百分比。还显示了B细胞的发育阶段。Fo.B，滤泡B细胞；MZ B，边缘带B细胞；T，过渡性；Mat，成熟。
图6：TRN11/2/5和TRN34/29/30小鼠的脾边缘带B细胞和滤泡B细胞上的表面IgG1表达。分析门控于MZ(上部)和Fo.(底部)B细胞的脾细胞的λ1HC的细胞表面表达。
图7：描绘了TRN11/2/5和TRN34/29/30小鼠淋巴结中的B细胞分化和表面IgG1表达。淋巴结细胞用对所示CD抗原和λ1HC特异的荧光缀合mAb染色，并通过流式细胞术分析。流程图中的数字表示给定门中细胞的百分比。
图8：描绘了TRN11/2/5和TRN34/29/30小鼠腹膜腔中的B细胞分化和表面IgG1表达。腹膜腔细胞用对所示CD抗原和λ1HC特异的荧光缀合mAb染色，并通过流式细胞术分析。流程图中的数字表示给定门中细胞的百分比。
图9：描绘了在未免疫的TRN11/2/5(空心圈)和TRN34/29/30HCO(实心圈)小鼠中检测血清IgG1和IgM的ELISA试验。光密度显示在Y轴上，血清稀释度显示在X轴上。为了标准化(空心框)，100μg/ml的单克隆IgG1(左)和IgM(右)也被连续稀释。
图10：描绘了在未免疫的TRN11/2/5(空心圈)和TRN34/29/30HCO(实心圈)小鼠中检测血清IgG2b、IgG2c和IgG3的ELISA试验。光密度显示在Y轴上，血清稀释度显示在X轴上。为了标准化(空心框)，100μg/ml的单克隆IgG2b(左)、IgG2c(中)和IgG3(右)也被连续稀释。
图11：本文提及的核苷酸序列。
具体实施方式
除非另有说明或定义，否则本文使用的所有术语都具有其在本领域中的通常含义，这对本领域技术人员来说是清楚的。参考例如标准手册，诸如Sambrook et al,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"(2nd Ed.),Vols.1 -3,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)；Lewin,"Genes IV",Oxford University Press,New York,(1990)和Janeway et al.,"Immunobiology"(5th Ed.,或更新版),Garland Science,NewYork,2001。
本文使用的术语“包括(comprise)”、“包含(contain)”、“具有(have)”和“含有(include)”可以作为同义词使用，并且应当理解为开放的定义，允许更多的成员或部件或元件。“组成(consisting)”被认为是最封闭的定义，没有组成定义特征的其它元件。因此，“包括(comprising)”更宽泛，包含“组成(consisting)”的定义。
本文使用的术语“约”是指相同的值或与给定值相差+/-5％的值。
本发明人已经克服了现有技术的局限性，并表明可以通过将内源Cμ基因片段的转基因Cγ基因片段5’靶向整合到免疫球蛋白重链基因座中来产生转基因小鼠，以有效产生纯重链抗体(HCAb)，其由B细胞表达并由浆细胞分泌。然后，例如，使用已建立的杂交瘤技术，这些可用于产生可靠的HCAb或其抗原结合片段的供应。
本文称为HCAb的抗体构建体和本文所述的库和本文提供的文库是人工构建体。可以理解，本发明的材料、方法和用途，例如具体指分离的核酸序列、氨基酸序列、表达构建体、转化的宿主细胞、转基因动物和重组抗体，是“人造的”或合成的，因此不被认为是“自然产物”或“自然法则”的结果。
本文所用术语“抗体”指由各种组合或结构的抗体结构域组成或包含各种组合或结构的抗体结构域的多肽或蛋白质，这些结构域被理解为免疫球蛋白重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域。如果多肽包含由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两条β链组成的β桶结构，则多肽被理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然的结构或通过诱变或衍生化修饰的，例如，修饰抗原结合特性或任何其它特性，例如稳定性或功能特性，例如与Fc受体、Fcμ、Fcα/μ、Fcα、Fcε和/或Fcγ受体(例如，小鼠中的FcRn、FcγRI、FcγRIIB、FcγRIII或FcγRIV)的结合或与聚合Ig受体(plgR)的结合。
在本文中，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。
本文使用的术语“抗体”应特别指包含抗原结合位点，特别是VH结构域的抗原结合位点的抗体构建体。具体实施方案涉及包含VH或由VH组成的抗体作为单一可变抗体结构域，例如，与一个或多个其它可变结构域和/或恒定抗体结构域组合(或融合)，任选具有一个或多个连接序列或铰链区，例如重链抗体，由一条或两条单链组成，其中每条单链包含与恒定结构域连接的可变重链区(或VH)或由其组成。
本文所指的特异性抗体可以是全长抗体或其抗原结合抗体片段，或包含或由至少一个可变重链(VH)抗体结构域或单个VH结构域组成的任何其它抗体构建体，例如包含或由一种或多种单结构域抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv组成的抗体。示例性抗体包含或由本文进一步描述的任何HCAb组成。本文描述的抗体可以是某种免疫球蛋白类型。特异性抗体包含抗体恒定结构域，特别是重链恒定结构域，其属于IgG型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM型，或它们的鼠对应物，IgG1、IgG2a/c、IgG2b、IgG3、IgA、IgD、IgE或IgM。优选地，本文所述的抗体包含IgG类型的恒定抗体结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)。
据此，抗体通常被理解为包括一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白质(或蛋白质复合物)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及免疫球蛋白可变区基因。轻链(LC)分为κ链或λ链。重链(HC)分为γ链、μ链、α链、δ链或ε链，它们依次分别定义了免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
在典型的IgG抗体结构中，HC或LC各自包含至少两个相互连接的结构域，以产生一对结合位点结构域。在特定的情况下，重链可以并入LC恒定结构域，但仍被认为是HC，例如缺乏轻链可变结构域或轻链可变区。
抗体的HC可以包含将抗体的一个或两个抗原结合臂连接到Fc部分的铰链区。铰链区可以是免疫球蛋白(例如IgG1或IgG3)的自然重链铰链区，或者是包含或由许多连续氨基酸组成的人工铰链区，其长度与自然铰链区大约相同(+/-20％，或+/-10％)。优选的铰链区包含一个或多个，例如2、3或4个半胱氨酸残基，它们可以与另一个铰链区形成二硫键，从而获得二聚体构建体。
本文所述的抗体可包含一个或多个抗体结构域，所述抗体结构域被缩短或延伸，例如使用连接序列或接头。这种连接特别是通过重组融合或化学连接。特异性连接可以通过将一个结构域的C端连接到另一个结构域的N端，例如，其中末端区域中的一个或多个氨基酸残基被删除以缩短结构域尺寸或被延伸以增加结构域的灵活性。
具体地，缩短的结构域序列包含C端和/或N端区域的缺失，例如缺失至少1、2、3、4或5个，最多6、7、8、9或10个氨基酸。
通过接头进行的结构域延伸可以通过源自免疫球蛋白结构域的N-或C-端区域的氨基酸序列，其天然地位于结构域附近，例如包括结构域之间的天然的连接。或者，接头可以含有源自铰链区的氨基酸序列。然而，接头也可以是人工序列，例如，富含多个Gly和Ser氨基酸或由其组成。
本文所述的术语“抗原结合分子”指任何蛋白质或蛋白质复合物(例如，由一个以上结合到复合物形式的多肽链组成)，其包含抗体或由抗体组成，所述抗体包含抗体的至少一个抗原结合位点。此外，抗原结合分子还可以包含一个或多个与抗体部分融合或复合的元件，从而提供抗体衍生物，例如融合蛋白。
术语“抗原结合位点”或“结合位点”是指参与抗原结合的抗体部分。自然抗体中的抗原结合位点由重链(“H”)和/或轻链(“L”)N端可变(“V”)区或其可变结构域的氨基酸残基形成。重链(和任选的轻链)的V区内的三个高度可变的序列，称为“高变区”，介于称为框架区的更保守的侧翼序列之间。抗原结合位点提供了与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。并入CDR的结合位点在本文中也称为“CDR结合位点”。
具体地，本文所述HCAb的抗原结合位点由重链(“H”)N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。
术语“CDR区”或相应序列指可变抗体结构域(例如VH结构域)的可变抗原结合区，其包括能够与抗原结合相互作用的可变结构。具有CDR区的抗体结构域可以原样使用或整合到更大的蛋白质构建体中，从而形成具有结合功能的这种构建体的特定区域。不同的结构可以衍生自结合蛋白的自然库，例如免疫球蛋白，特别是抗体或免疫球蛋白样分子。不同的结构也可以通过随机化技术产生，特别是本文描述的那些。这些包括抗体可变结构域的诱变CDR环区，特别是免疫球蛋白的CDR环。
通常，具有特定CDR结构的抗原结合位点的抗体能够特异性结合靶抗原，即通过一对VH结构域的CDR环特异性识别这种靶抗原。
在HC抗体中，抗原结合位点的特征在于仅由VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3环组成的特异性CDR结构。如果由动物(例如本文所述的转基因小鼠)产生，这种抗原结合位点被理解为是天然的，或者具有天然的结构和/或构象。尽管抗原结合位点可以人工产生，例如，因为它是通过合成新结构的重组技术经工程改造的，但是将编码相应抗体的相应基因并入转基因非人动物中导致产生具有天然构象的新合成抗体。
这种天然构象可通过任何体内或体外亲和力成熟技术进一步亲和力成熟，从而产生包含人工抗原结合位点的多克隆和/或单克隆抗体，所述人工抗原结合位点的特征在于天然构象，并且进一步特征在于特异性结合其靶抗原的高亲和力。
术语“抗体”应适用于动物源的抗体，例如哺乳动物，包括人、鼠、兔和大鼠，或鸟类，例如鸡，该术语应特别包括基于动物源的序列，例如小鼠序列的重组抗体。
术语“抗体”进一步适用于完全人抗体。
关于免疫球蛋白使用的术语“完全人”应理解为包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。人抗体包括从人免疫球蛋白或抗体文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因动物中分离的抗体。
人免疫球蛋白优选选自或衍生自由IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM组成的组。
鼠免疫球蛋白优选选自或衍生自由IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM组成的组。
术语“抗体”进一步适用于嵌合抗体，其具有源自不同物种的混合序列，例如鼠源和人源的序列。
具体地，术语“抗体”适用于由转基因非人动物(例如小鼠)产生的抗体，其包含人抗原结合区和非人(例如小鼠)恒定区或框架序列。
关于免疫球蛋白或抗体使用的术语“嵌合”是指这样的分子，其中抗体链的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的免疫球蛋白中的相应序列同源，而该链的剩余片段与另一物种或类别中的相应序列同源。典型地，可变区模拟衍生自一种哺乳动物的免疫球蛋白的可变区，而恒定区与衍生自另一种哺乳动物的免疫球蛋白序列同源。在一个实施例中，可变区可以衍生自目前已知的来源，使用容易获得的来自人宿主生物的B细胞，结合衍生自例如非人细胞制品的恒定区。具体地，嵌合抗体或抗体片段可由转基因小鼠产生，例如本文所述的转基因小鼠，其包含人可变区编码序列(或相应的可变抗体结构域)和小鼠恒定区编码序列(或相应的恒定区抗体结构域)。
术语“抗体”还适用于单克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有类型的抗体和抗体结构，例如源自动物(例如包括人在内的哺乳动物)的抗体，其包含不同来源的基因或序列，例如嵌合抗体、人源化抗体或杂交瘤衍生抗体。其它实例涉及从经转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，或从抗体或抗体结构域的重组组合文库中分离的抗体，或通过涉及抗体基因序列与其它DNA序列剪接的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。
术语“抗体”被理解为包括新的或现有的(本文称为“亲本”)分子的功能活性变体，例如自然存在的免疫球蛋白。还应理解，该术语包括抗体变体，也应包括这些分子的衍生物。衍生物是一种或多种抗体和/或融合蛋白的任何组合，其中抗体的任何结构域，例如包含VH结构域的抗原结合位点的抗体结构域，或VH结构域，可以在任何位置与一种或多种其它蛋白质融合，例如与其它抗体融合，诸如与包含CDR环的结合结构、受体多肽融合，也可以与其它配体、酶、毒素等融合。本文所述的抗体可具体用作分离的多肽或组合分子，例如通过重组、融合或缀合技术与其它肽或多肽结合。
抗体的衍生物也可以通过各种化学技术例如共价连接、静电相互作用、二硫键等与其它物质缔合或结合而获得。与抗体结合的其它物质可以是脂类、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或其任意组合(例如PEG、前药或药物)。衍生物也可以包含具有相同氨基酸序列但完全或部分由非自然或化学修饰的氨基酸制成的抗体。在一个具体的实施方案中，抗体是包含允许与生物学上可接受的化合物特异性相互作用的附加标签的衍生物。对于可用于本发明的标签没有特别的限制，只要它对免疫球蛋白与其靶标的结合没有负面影响或负面影响可接受。合适的标签的实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、钙调蛋白(Calmodulin)标签、GST-标签、MBP-标签和S-标签。在另一个具体的实施方案中，抗体是包含标记的衍生物。本文使用的术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接与抗体缀合，从而产生“标记的”抗体。标记本身可以是可检测的，例如放射性同位素标记或荧光标记，或者在酶标记的情况下，其可以催化可检测的底物化合物的化学变化。
抗体的衍生物例如衍生自亲本抗体或抗体序列，例如亲本抗原结合(例如CDR)序列或框架(FR)序列，诸如通过例如计算机或重组工程或化学衍生或合成获得的突变体或变体。
术语“变体”应具体包括功能活性变体。本文所述抗体的功能变体特别在抗原结合特异性方面有功能。
术语“变体”应特别指抗体，例如突变抗体或抗体片段，诸如通过诱变方法获得，特别是在特定抗体氨基酸序列或区域中删除、交换、引入插入或缺失，或者化学衍生氨基酸序列，诸如在恒定结构域中工程化以提高抗体稳定性、增强效应子功能或半衰期，或在可变结构域中调节抗原结合特性，诸如通过本领域可用的亲和成熟技术。可以使用任何已知的诱变方法，包括在所需位置的点突变，例如通过随机化技术获得，或用于HCAb工程改造的结构域缺失。在一些情况下，随机选择位置，例如，用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。术语“诱变”指任何本领域公认的改变多核苷酸或多肽序列的技术。优选的诱变类型包括易错PCR诱变、饱和诱变或其它定点诱变。
当抗原在细胞表面或细胞内或微珠(例如Luminex)上表达时，抗体在抗原结合方面的功能活性通常用ELISA测定法、BIAcore测定法、Octet BLI测定法或基于流式细胞术的测定法来测定。
可以获得功能活性变体，例如，通过改变亲本抗体的序列，例如具有免疫球蛋白的特定天然的结构诸如IgG1结构的单克隆抗体，以获得在识别靶抗原方面具有相同特异性但具有不同于亲本结构的结构的变体，例如，修饰任何抗体结构域以引入特定突变或产生亲本分子的片段。
特定的功能活性变体包含一种或多种功能活性CDR变体或亲本抗体，每种变体在亲本CDR序列中包含至少一个点突变，并且包含或由与亲本CDR序列具有至少60％序列同一性，优选至少70％，至少80％，至少90％序列同一性的氨基酸序列组成。
特定变体例如是亲本抗体的功能活性变体，其中亲本CDR序列并入人框架序列中，其中每个亲本CDR序列的任选1、2、3或4个氨基酸残基可通过引入点突变而进一步突变，以提高亲本或人源化抗体的稳定性、特异性和亲和力。
具体地，抗体可以包含亲本抗体的任何CDR序列的功能活性CDR变体，其中功能活性CDR变体包含以下的至少一种：
a)亲本CDR序列中的1、2或3个点突变，优选其中每个CDR序列中点突变的数目是0、1、2或3；和/或
b)在亲本CDR序列的四个C端或四个N端或四个中心氨基酸位置的任何一个中的1或2个点突变；和/或
c)与亲本CDR序列至少60％的序列同一性；
优选地，其中功能活性变体抗体包含至少一种如本文所述的功能活性CDR变体。具体地，包含一个或多个功能活性CDR变体的功能活性变体抗体具有与亲本抗体结合相同表位的特异性。
根据一个具体方面，点突变是一个或多个氨基酸的任何氨基酸取代、缺失和/或插入。
关于抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在根据本领域众所周知的方法例如CLUSTALW(Chenna et al.,Nucleic Acids Res.,31:3497,2003)比对序列并引入缺口后，如果需要，达到最大百分比的序列同一性，并且不考虑作为序列同一性一部分的任何保守取代。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的全长序列上实现最大程度对准所需的任何算法。
抗体变体应具体理解为包括具有特定糖基化模式的同源物、类似物、片段、修饰物或变体，例如由糖基因工程产生的，它们是功能性的并且可以充当功能等同物，例如与特定靶标结合并且具有不同的功能特性。抗体可以是糖基化的或非糖基化的。例如，如本文所述的重组抗体可在合适的哺乳动物细胞中表达，以允许由表达抗体的宿主细胞确定的分子的特异性糖基化，或者在缺乏糖基化机制的原核细胞中表达，产生未糖基化的蛋白质。
抗体结构域，特别是恒定抗体结构域的术语“β折叠”或“β链”在本文中理解如下。抗体结构域通常由通过至少两个或三个主链氢键横向连接的至少两条β链组成，形成通常扭曲的折叠片。β链是典型地具有3至10个氨基酸长度的单一连续的氨基酸序列，采用这种延伸的构象并在主链中与至少一条其它链形成氢键，从而它们形成β折叠。在β折叠中，大多数β链与其它链相邻排列，并与相邻链形成广泛的氢键网络，其中一条链主链中的N-H基团与相邻链主链中的C＝O基团建立氢键。
抗体恒定结构域(例如CL(Cк，Cλ)、CH1、CH2或CH3结构域)的结构，类似于可变结构域的结构，由通过环连接的β-链组成，其中一些包含短的α-螺旋伸展。从各种Fc晶体结构的x射线晶体学B因子中可以看出，框架大部分是刚性的，而环相对更具柔性。抗体恒定结构域通常具有形成β折叠的七条β链(A-B-C-D-E-F-G)，其中β链通过环连接，三个环位于该结构域的N末端(A-B，C-D，E-F)，另外三个环位于该结构域的N末端(B-C，D-E，F-G)。结构域的“环区”是指位于β链区域之间的蛋白质部分(例如，每个CH3结构域包含7个β折叠，A至G，从N端至C端取向)。
在某些实施方案中，抗体结构域可包含野生型氨基酸序列，例如源自动物(包括人)的序列，或包含突变的人工序列，例如，可将一条或多条β链的至少一部分替换为异源序列，例如包括促进与另一个结构域配对的突变，诸如结构域间二硫键，诸如连接两个抗体结构域的β-折叠区、“杵”和/或“臼”突变或链交换。
特异性结构域突变可以包括并入新的(额外的)氨基酸残基，例如Cys残基，其能够形成额外的结构域间或链间二硫键，从而
a)通过额外的结构域内二硫键稳定抗体结构域，和/或
c)通过额外的链间二硫键稳定抗体结构域的两条链。
二硫键通常由两个半胱氨酸或其它形成巯基的氨基酸的巯基基团氧化形成，或者由氨基酸类似物的巯基基团氧化形成，通过连接氨基酸侧链的S原子形成人工二硫键。具体地，半胱氨酸可以插入(作为额外的氨基酸或氨基酸取代)一对结构域之间，这保证了额外的半胱氨酸修饰，从而通过二硫键形成产生稳定的结构域对。
可以通过首先筛选抗原结合位点来产生抗体，所述抗原结合位点通过在抗体文库的每个结合位点中折叠CDR序列来形成，以选择特异性结合物。下一步，选择的文库成员可作为CDR序列(或亲本CDR序列，其可进一步修饰以调节抗原结合甚至表型特性)的来源，其可用于工程化任何类型的抗体构建体，例如全长免疫球蛋白或其抗原结合片段。
抗体文库(例如包含识别相同靶抗原的特异性抗体构建体的库，或由某种动物或品种，例如本文所述的转基因小鼠产生的抗体的初始文库，该文库包含识别不同靶抗原的抗体的库)指一组(a set)或一组(a collection of)抗体(例如本文所述的HCAb)，每种抗体适当地展示在所选展示系统或容器中。
特定展示系统将给定蛋白质(例如抗体，诸如本文所述的HCAb)与其编码核酸(例如其编码mRNA、cDNA或基因)连接。因此，文库的每个成员包含编码展示于其上的抗体的核酸。展示系统包括但不限于细胞、病毒(例如噬菌体)、核糖体、真核细胞(例如酵母)、DNA(包括质粒)和mRNA。
任何抗体基因多样性文库都可以用于这种目的，例如，包括大量的单个文库成员，以产生抗体序列的多样性，或者使用预选的文库，其例如富含稳定的或功能活性的文库成员。例如，展示系统可以富含结合某个靶标的库成员。
文库可以通过众所周知的技术构建，包括例如链替换方法(chain-shufflingmethod)。对于重链替换，将抗体克隆到含有例如人VH基因库的载体中，以产生噬菌体抗体库转化体。进一步的方法包括抗体CDR的定点诱变，或CDR随机化，其中部分或全部CDR被随机化，使用含有NNK密码子的诱变寡核苷酸对靶向残基进行完全随机化，或使用限定性突变(parsimonious mutagenesis)对靶向残基进行部分随机化，其中编码靶向氨基酸残基的位置的寡核苷酸含有偏向原始核苷酸碱基的混合物。或者，可以使用易错PCR构建文库，在PCR反应中应用dNTP类似物、易错聚合酶或添加Mn2+离子。
各种技术可用于制造编码人抗体文库构建设计的基因。有可能通过完全合成的方法产生DNA，其中序列被分成重叠的片段，这些片段随后制备成合成的寡核苷酸。这些寡核苷酸被混合在一起，并通过首先加热到约100℃而彼此退火，然后慢慢冷却到环境温度。在退火步骤后，合成组装的基因可以直接克隆或者在克隆前通过PCR扩增。当需要大的单锅(single-pot)人类文库并且大量资源可用于构建过程时，这是特别需要的。
特定的方法使用噬菌体、噬菌粒和/或酵母文库进行直接结合物选择和内化噬菌体抗体选择。用于定点诱变的其它方法可用于产生文库插入，例如Kunkel方法(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,82:488,1985)或Dpnl方法[Weiner,et al.,Gene 151:119,1994]。
“抗原特异性文库”指的是多核苷酸(或由这种多核苷酸编码的多肽)的文库，该文库已经用于查询是否存在对特定抗原具有特异性的抗体。这种文库可以限于或偏向或富集对任何抗原组或特定抗原具有特异性的抗体序列。示例性的抗原特异性文库是抗体“优化文库”(例如，“成熟文库”或“亲和力成熟文库”)。
本文描述的具体的实施方案基于在用抗原免疫之前包含或表达免疫前文库的小鼠。免疫前文库可以是初始文库，其在自然序列经历抗原选择之前具有与自然抗体序列相似的序列多样性。可以设计和制备免疫前文库以反映或模拟免疫前库，和/或可以基于V、D和J基因的集合以及其它重链序列(例如，公知的种系序列)的大型数据库所提供的合理设计来设计和制备。在本发明的某些实施方案中，代表在人类或非人类库内发现的可能的V、D和J多样性以及连接多样性(即N1和N2)的表达盒被重新合成为单链或双链DNA寡核苷酸。
“优化文库”或“成熟文库”是指设计用于增强或改善抗体序列的至少一种特征的文库，所述抗体序列是在对文库(例如初始文库或免疫前文库)进行查询以确定是否存在对抗原具有特异性的抗体序列时鉴定的。这种成熟文库可以通过并入对应于以下的核酸序列来产生：一个或多个CDR；一个或多个抗原结合区；一个或多个VH区域；和/或一条或多条重链；从初始文库中获得或在对初始文库查询中鉴定，所述初始文库被设计成在体外或体内进一步诱变以产生具有在初始(亲本)抗体的背景下引入多样性的文库。
作为阵列技术的一个不同实例，可以使用B细胞克隆，在B细胞阵列中人工或计算机可寻址的位置产生编码本文所述抗体构建体的基因。可以使用机器人或手动方法来操作该阵列，以重新排列仅表达特定类型抗体和/或特异性识别特定靶标的细胞。
在某些实施方案中，使用B细胞克隆，例如来自经适当免疫的非人转基因动物(诸如本文所述的小鼠)的B细胞克隆，其经遗传工程改造以产生抗体，或者使用哺乳动物细胞表达文库，或者通过抗体和蛋白质工程的标准方法和机器人工具产生大量稳定转化的哺乳动物细胞。在合适的培养箱中和/或在长期储存条件下，在排列在平板上的可寻址的孔中，保持单个克隆存活，例如，这可以包括在液氮中冷冻细胞悬浮液，在-135℃下储存，或在允许回收储存的细胞系的其它可接受的条件下储存。
本文所用的关于抗体的术语“库”是指变体的集合，例如以靶表位或抗原特异性的多样性为特征的变体。通常，抗体的结构(也称为“支架”)在这样的库内是相同的，但具有各种不同的CDR序列。
如本领域众所周知的，有多种展示和选择技术可用于鉴定和分离具有某些结合特征和亲和力的蛋白质，包括例如展示技术，诸如细胞和非细胞方法，特别是移动展示系统。在细胞系统中，可以使用噬菌体展示、病毒展示、酵母或其它真核细胞展示，例如哺乳动物或昆虫细胞展示。移动系统涉及可溶形式的展示系统，例如体外展示系统，其中包括核糖体展示、mRNA展示或核酸展示。
可以通过任何合适的方法从文库中筛选展示能够结合靶标的抗原结合结构的文库成员。筛选步骤可以包括一轮或几轮筛选。
可以使用任何适于鉴定能够结合靶抗原的抗体的筛选方法。特别地，筛选的轮次可以包括在所述靶标存在下孵育文库，以便选择结合所述抗原或其表位的抗体。
一旦鉴定出具有所需结构的抗体，就可以通过本领域公知的方法产生这种抗体，包括例如杂交瘤技术或重组DNA技术。
在杂交瘤方法中，免疫合适的非人宿主动物，例如本文所述的小鼠，以激活淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的抗原的抗体。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。然后用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与浆细胞瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
测定杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过流式细胞术、免疫沉淀或通过体外结合测定(例如酶联免疫吸附试验，ELISA)来确定。
根据另一个具体的实施例，重组单克隆抗体可以通过分离编码所需抗体链的DNA，并用编码序列转染重组宿主细胞以进行表达，使用众所周知的重组表达载体，例如包含编码本文所述抗体序列的核苷酸序列的质粒或表达盒。重组宿主细胞可以是原核和真核细胞。
根据一个具体的方面，编码核苷酸序列可用于遗传操作，以使抗体人源化或提高抗体的亲和力或其它特征。例如，恒定区可以被改造成类似于人的恒定区。可能需要对抗体序列进行遗传操作，以获得对靶抗原的更大亲和力。对本领域技术人员显而易见的是，可以对抗体进行一个或多个氨基酸改变，并且仍然保持其与靶标(表位或抗原)的结合能力。
通过各种方式产生抗体分子是众所周知的。与抗体生产相关的各种技术记载于，例如Harlow,et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2014)。
单克隆抗体可以例如使用通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何方法来产生。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括杂交瘤方法(Kohler,et al.,Nature 256:495,1975)和人B细胞杂交瘤方法[Kozbor,J.Immunol.133:3001,1984；和Brodeur,et al.,1987,in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,LB Schook,ed.,(Marcel Dekker,Inc.,New York),pp.51-63]。
术语“B细胞”是指一类在体液免疫反应中起重要作用的淋巴细胞(与由T细胞控制的细胞介导的免疫反应相对)。B细胞的主要功能是产生针对抗原的抗体，特别是表达对特定抗原特异的细胞表面抗体(形成BCR复合物)，发挥抗原呈递细胞(APC)的作用，并最终在通过抗原相互作用活化后发育成分泌抗体的浆细胞和记忆B细胞。B细胞是适应性免疫系统的重要组成部分。具体地，当暴露于抗原时，B细胞被激活并分化成表达免疫球蛋白的B细胞变体，例如浆细胞，也称为浆细胞(plasmacyte)，以及记忆细胞。
本文所用的关于B细胞的术语“库”，在本文中也称为“B细胞库”，是指变体的集合，例如通过表达包含多种靶表位或抗原特异性的免疫球蛋白为特征的B细胞变体。
本文使用的术语“靶标”是指表位或抗原。
本文所用的术语“抗原”应特别包括由于抗原暴露于动物免疫系统或抗体库而被抗体结合位点(至少一个抗原决定簇)识别的所有抗原和靶分子。具体地，本文所述抗体靶向的优选抗原是那些已经被证明是或能够是免疫学或治疗学相关的分子，尤其是那些已经测试了临床疗效的分子。
术语“抗原”用于描述完整的靶分子或该分子的片段，尤其是亚结构，例如靶标的多肽或碳水化合物结构。这种亚结构通常被称为“表位”(例如B细胞表位、T细胞表位)，其可以是免疫学相关的，即也可以被自然或单克隆抗体识别。
本文所用的术语“表位”特别是指存在于抗原和特异性抗体之间界面上的分子结构，其中与该表位相互作用的抗体表面被称为“副表位”。在化学上，表位可以由碳水化合物序列或结构、肽序列或不连续表位中的一组序列、脂肪酸或寡核苷酸或多核苷酸构成。当抗原性分子是有机、生物化学或无机物质时，它被称为“半抗原”。表位或半抗原可以由上述物质的衍生物或任何组合组成。如果表位是多肽，它通常在肽中包含至少3个氨基酸，优选8-50个氨基酸，更优选约10-20个氨基酸。表位可以是线性或不连续的表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个片段构成。线性表位可以是连续的或重叠的。不连续表位由氨基酸或碳水化合物构成，它们通过折叠多肽而聚集在一起形成三级结构，并且氨基酸在线性序列中不一定彼此相邻。具体地，表位至少是诊断相关分子的一部分，即样品中表位的存在与否与疾病或患者的健康状况或制造过程状态或环境和食品状态的定性或定量相关。表位也可以是治疗相关分子的至少一部分，即可以被改变疾病进程的特异性结合结构域靶向的分子。
如本文所用，术语“特异性”或“特异性结合”指的是在异质分子群中决定感兴趣的同源配体的结合反应。因此，在指定的条件(例如，免疫测定条件)下，抗体与其特定的靶标结合，并且不会与样品中存在的其他分子大量结合。特异性结合意味着结合在靶同一性、高、中或低结合亲和力或亲合力方面是选择性的，如所选择的相符。如果结合常数或结合动力学与样品中的竞争靶标至少相差10倍，优选相差至少100倍，更优选至少1000倍，则通常能够实现选择性结合。
特异性结合不排除与相似抗原或不同物种的相同抗原(类似物)的交叉反应。例如，结合实体也可以优选地与类似于人靶标的啮齿类动物或灵长类动物靶标交叉反应，以促进临床前动物研究。
本文所用术语“基因座”指编码表达产物的DNA编码序列或DNA片段，即基因组序列，例如宿主生物基因组的一部分，或载体的一部分，诸如整合在靶位点，例如限定的限制性位点或同源区域。
可以设计限制性位点以确保表达盒插入到正确的阅读框中。通常，外源(froeign)(本文也称为外源(exogenous))DNA被插入载体DNA的一个或多个限制性位点，然后被载体携带与可转移载体DNA一起进入宿主细胞。
通常，基因座包含至少一个基因或一个或多个如本文所述的基因片段。术语“基因座”并不意味着基因被活跃地转录或保持完整。可以包括已经失活的基因。
本文所用术语“免疫球蛋白重链基因座”涉及编码VH结构域的基因座，所述VH结构域包含一个或多个V基因片段、一个或多个D基因片段和一个或多个J基因片段，与一个或多个重链恒定区可操作地连接。优选地，本文所指的免疫球蛋白重链基因座是小鼠内源性免疫球蛋白重链基因座，包含至少一个转基因核酸序列，特别是本文所述的Cγ基因片段。免疫球蛋白重链基因座的V、D和J基因片段分别包含VH、D和JH编码序列和表达控制序列，它们以可操作的连接方式控制相应的VH、D和JH编码序列的表达。根据一个具体的实施方案，VH、D和JH编码序列是人的，VH重链基因座的表达控制序列是鼠的，优选内源表达控制序列，因此提供了嵌合的V、D和J基因片段。
可以通过增加基因座中存在的V基因片段的数量或通过使用不同的基因座来增加V基因片段的复杂性，每个基因座包含不同的V基因片段。
优选地，免疫球蛋白重链基因座的可变区包含5至120个(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120个)或更多不同的V基因片段，其衍生自任何脊椎动物物种或如本文所述的嵌合体。
优选地，免疫球蛋白重链基因座的可变区包含2至40个(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30或40个)或更多个D基因片段。D基因片段可以衍生自任何脊椎动物物种，或者可以是本文所述的嵌合体。
优选地，免疫球蛋白重链基因座的可变区包含2至20个(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20个)或更多个J基因片段。J基因片段可以衍生自任何脊椎动物物种，或者可以是本文所述的嵌合体。
V基因片段必须能够在DNA水平上与D基因片段、J基因片段重组，以形成功能性VDJ外显子。在转录和RNA剪接后，VDJ外显子和重链恒定(效应)区(可能包含数个外显子)在mRNA转录物中变得邻近，并具有翻译功能；根据本发明，当核酸表达时，产生纯重链抗体。
可操作地，重链恒定区由自然存在的或工程改造的基因片段编码，该基因片段能够在B细胞中以VDJ外显子表达。
抗体可以有不同的种类，称为同种型或同类别。在胎盘哺乳动物中，有五种抗体同种型，称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们都以代表免疫球蛋白(有时与抗体互换使用)的“Ig”前缀命名，它们在生物学特性、功能位置和处理不同抗原的能力上有所不同。抗体同种型的不同后缀表示抗体包含的不同类型的重链，每个重链类别按字母顺序命名：α(alpha)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(epsilon)和μ(mu)。由此分别产生了IgA、IgG、IgD、IgE和IgM。
本文所述的免疫球蛋白重链基因座的重链恒定区至少包含本文所述的转基因Cγ基因片段，其在没有功能性CH1结构域的情况下表达，从而可以产生IgG型的纯重链抗体。每个重链恒定区还可以包含一个或多个额外的重链恒定区基因片段，其选自由Cδ、Cμ、Cε和Cα基因片段组成的组。重链恒定区基因片段的选择取决于所需抗体类别的优选类别或混合类别。
例如，根据工程化Igh基因座中存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型，包含CH1结构域全部或部分缺失的转基因Cγ基因片段的异源免疫球蛋白重链基因座的全部或部分表达将任选产生一些或所有IgG同种型。
或者，可以获得选择的抗体混合物。例如，当重链恒定区包含Cα和Cμ基因片段时，可以额外获得IgA和IgM。
具体地，本文所述的Cγ基因片段包含编码CH1结构域的全部或部分的核苷酸序列的缺失，例如CH1外显子的缺失。这种缺失可以是编码CH1结构域的核苷酸序列的部分缺失，只要它剥夺了CH1结构域的功能。优选地，部分缺失使得去除或灭活伴侣结合结构域，特别是BiP伴侣结合结构域。
任选地，异源重链基因座是Cμ缺陷型的或包含无活性的Cμ基因片段。具体地，Cμ基因片段因功能缺失突变而失活，例如引入终止密码子，或编码Cμ基因片段的核苷酸序列的至少一部分缺失。具体地，Cμ基因片段由于CH1、CH2、CH3和/或CH4结构域的缺失而失活。
具体地，通过缺失编码Cμ基因片段的整个核苷酸序列或所述序列的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的至少任何一者，使Cμ基因片段失活。
具体地，Cμ基因片段在其CH1、CH2、CH3和CH4结构域中的任何一个或全部中包含功能缺失突变、缺失或失活突变，优选引入终止密码子。优选地，Cμ基因片段在CH1、CH2和CH3结构域中包含终止密码子。
在一个具体的实施例中，为了衍生用于人类治疗应用的HCAb，存在于基因座中的VDJ编码序列将衍生自人类种系序列，任选地被修饰，并且如果宿主动物是啮齿动物例如小鼠，恒定区可以是啮齿动物源的。然后可以克隆包含可溶性人VH结合结构域和啮齿动物恒定效应区的选择的纯重链抗体，并且啮齿动物效应区被选择的人恒定效应区替代，或者可溶性VH结构域用于衍生替代性VH融合蛋白、VH结构域抗体复合物等。
根据另一个具体的实施例，当纯重链抗体用于兽医或替代目的时，V、D和J编码序列优选来自最适合预期目的的脊椎动物或哺乳动物。例如，V基因片段和D和J基因片段可以衍生自其它哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、牛、山羊、绵羊、骆驼、马等)，取决于预期用途，例如兽医、工业、农业、诊断或试剂应用。
“重链恒定区外显子”(“CH外显子”)包括自然存在的脊椎动物，尤其是哺乳动物的CH外显子序列。这随类别的不同而不同。例如，IgG和IgA天然缺乏CH4结构域。术语“CH外显子”在其范围内还包括其衍生物、同源物和片段，只要CH外显子当其是重链恒定区的组分时能够形成本文定义的功能性HCAb。
在本文所述的具体实施方案中，转基因小鼠的内源κ和λ轻链基因座由于一个或多个修饰而失去功能，例如功能缺失突变，或内源к和/或λ轻链基因座或其部分的缺失。
示例性的适当修饰理解如下。为了使κ链基因座失活，通过重组酶介导的盒交换(RMCE)策略使Vк2-137(Cк最远端的Vк基因片段)和Jк5(Cк最近端的Vк)之间的整个3.2Mb基因组区域缺失。这是通过在Vк2-137上游和Jк5下游插入合适的靶向序列，然后在体外由Cre介导缺失中间的基因组区域来实现的。类似的策略被用于使λ链基因座失活。通过RMCE使包含小鼠λV基因片段(IgIV)的整个194Kb区域缺失。在这种情况下，将合适的靶向序列插入IgIV2上游和IgIV1下游，随后在体外由Cre介导缺失中间的基因组区域。
基因座可以被工程化以表达或包含编码抗体的外显子，例如本文进一步描述的。
重组基因座可以使用各种位点特异性编辑和/或重组的常规技术来创建。优选地，通过将含有基因片段的一段DNA(此处称为“供体DNA”)插入到非人动物免疫球蛋白基因座(例如宿主生物的重链基因座，此处称为“受体等位基因”)的修饰形式中来产生修饰的基因座。受体等位基因可以包含位点特异性DNA重组酶的识别位点，例如Cre重组酶(loxP位点和loxP位点的突变形式)。供体DNA的两侧可以是相同的Cre重组酶识别位点(在5’末端和3’末端，例如，一侧是loxP位点，另一侧是loxP位点的突变形式)。Cre重组酶可用于催化供体DNA插入受体等位基因。
在另一个实施方案中，基因片段主要(如果不是唯一方式的话)通过同源重组引入免疫球蛋白基因座。在这种实施方案中，使用包含基因组靶向同源臂的靶向序列或载体，所述同源臂位于包含抗体编码基因片段的核酸序列的侧翼(即，在5’端和3’端的核苷酸序列，其与靶序列同源并能够与之杂交)。这些基因组同源臂促使DNA插入免疫球蛋白基因座，例如编码免疫球蛋白重链的DNA。靶向序列指与细胞基因组中位于待修饰免疫球蛋白基因座区域的侧翼或附近的DNA序列同源的序列。侧翼或相邻序列可以在基因座本身内，或者在宿主细胞基因组中编码序列的上游或下游。将靶向序列插入到用于细胞转染的重组DNA载体中，使得待插入到细胞基因组中的序列，例如重组位点的序列，位于载体的靶向序列的侧翼。
在使用同源重组来实现基因组中遗传改变(例如插入或缺失)的许多情况下，进一步的修饰将涉及使用工程化的位点特异性核酸内切酶来增加实现所需结果的可能性。这种核酸内切酶是有价值的，因为它们可以被设计成对靶基因组中的独特序列具有高度特异性，并且因为它们在所识别的位点造成双链DNA断裂。双链断裂促进与靶向载体的同源重组，所述靶向载体具有与紧邻断裂的DNA的靶向同源性。因此，靶向载体和位点特异性核酸内切酶的组合通常比单独使用靶向载体产生高得多的同源重组效率，所述位点特异性核酸内切酶切割载体靶向区域内或其附近的DNA。此外，有可能通过使用一种或多种位点特异性核酸内切酶和包含两条靶向同源臂的靶向载体来促进产生基因组缺失，其中一条臂靶向待缺失区域的一侧，另一条臂靶向另一侧。
位点特异性重组不同于一般的同源重组，因为重组酶识别所需的短的特异性DNA序列是重组发生的唯一位点。位点特异性重组需要专门的重组酶来识别位点并催化这些位点的重组。许多噬菌体和酵母来源的位点特异性重组系统(每一个都包含重组酶和特异性同源靶位点)，已经显示出在真核细胞DNA整合的目的中起作用，因此适用于本文所述的用途。这些包括噬菌体P1 Cre/lox、酵母FLP-FRT系统和位点特异性重组酶酪氨酸家族的Dre系统。这种系统和使用方法在现有技术中已得到充分描述。重组酶介导的盒交换(RMCE)程序通过使用野生型和突变型loxP(或FRT等)位点与合适的重组酶(例如Cre或Flp)的组合，以及负筛选和/或正筛选来促进。当所用的位点彼此相同和/或没有选择时，将发生RMCE，但是该过程的效率降低，因为切除比插入更有利反应，并且(没有并入正筛选)不会富集适当突变的细胞。
已知酪氨酸家族的其它系统例如噬菌体λInt整合酶、HK2022整合酶，以及属于重组酶的独立丝氨酸家族的其它系统例如噬菌体phiC31、R4Tp901整合酶利用其各自的重组位点在哺乳动物细胞中起作用，并且也适用于本文所述的用途。
本文描述的方法具体利用位点特异性重组位点，这些位点利用相同的重组酶，但不促进位点之间的重组。例如，loxP位点和突变的loxP位点可以整合到宿主的基因组中，但是将Cre导入宿主不会导致这两个位点发生重组；相反，loxP位点会与另一个loxP位点重组，而突变的位点只会与另一个同样突变的loxP位点重组。
两类变异重组酶位点可用于促进重组酶介导的盒交换。一个在该位点的8bp间隔区含有突变，而另一个在13bp反向重复序列中含有突变。
间隔区突变体例如lox511(Hoess,et al.,Nucleic Acids Res.,14:2287,1986)、lox5171和lox2272(Lee and Saito,Gene,216:55,1998)、m2、m3、m7和mil(Langer,et al.,Nucleic Acids Res.,30:3067,2002)容易与自身重组，但与野生型位点的重组率显著降低。通过重组酶介导的盒交换将这类突变位点用于DNA插入的实例可见于Baer and Bode,Curr.Opin.Biotechnol.,12:473,2001。
反向重复突变体代表第二类变异重组酶位点。例如，loxP位点可以在左侧反向重复序列(LE突变体)或右侧反向重复序列(RE突变体)中包含改变的碱基。LE突变体lox71在左侧反向重复序列的5’端有5bp从野生型序列的改变为TACCG(Araki,Nucleic AcidsRes.,25:868,1997)。类似地，RE突变体lox66的5个最3’端碱基变成了CGGTA。反向重复突变体可用于将质粒插入物整合到染色体DNA中。例如，LE突变体可用作“供体”RE突变体重组的“靶”染色体loxP位点。重组后，将发现含有RE位点的DNA供体片段插入基因组中，其一侧是双突变位点(含有le和RE反向重复突变)，另一侧是野生型位点(Lee and Sadowski,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.,80:1,2005)。双突变体与野生型位点充分不同，它不能被Cre重组酶识别，因此插入的片段不能被两个位点之间的Cre介导的重组切除。
在某些方面，位点特异性重组位点可被引入内含子或基因间区域，而不是编码核酸区域或调控序列。这可以避免在将位点特异性重组位点插入动物细胞的基因组中时，无意中破坏基因正确表达所必需的任何调控序列或编码区。
位点特异性重组位点的引入可以通过常规的同源重组技术来实现。这些技术在参考文献中有所描述，例如Sambrook and Russell(2001)Molecular cloning:a laboratorymanual,3d ed.(Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Nagy,(2003)Manipulating the mouse embryo:a laboratory manual,3d ed.(ColdSpring Harbor,N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
使用本领域已知的为正筛选或负筛选而设计的载体，可以促进特异性重组到基因组中。为了促进已经经历置换反应的细胞的鉴定，可以使用合适的遗传标记系统，并且通过例如使用选择培养基来选择细胞。然而，为了确保基因组序列在置换间隔的两个终点或其附近基本上没有外来核酸序列，理想的是，在选择含有置换核酸的细胞后，可以除去标记系统/基因。
重组酶可以作为纯化的蛋白质提供，或者可以从在细胞内瞬时表达的构建体中表达，以便提供重组酶活性。或者，该细胞可用于产生转基因动物，其可与表达所述重组酶的动物杂交，以产生缺乏标记基因和相关重组位点的后代。
在本文中，关于基因的术语“内源”表示该基因是细胞天然的，即该基因存在于未修饰细胞基因组中的特定基因座。内源基因可以是存在于野生型细胞(如在自然界中发现)中该基因座的野生型基因。如果内源基因与野生型基因存在于基因组中相同的基因座，那么内源基因可以是修饰的内源基因。这种修饰的内源基因的实例是在其序列中包含缺失或外源核酸插入其中的基因。内源基因可能存在于核基因组、线粒体基因组等中。具体地，本文所述的免疫球蛋白重链基因座是包含本文所述修饰的小鼠内源性免疫球蛋白基因座。
本文描述的免疫球蛋白重链基因座包含内源Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段。在一个具体的实施方案中，内源Cμ基因片段被修饰为无活性的，但是Cμ基因片段存在于基因座中与野生型小鼠相同的位置。
在另一个实施方案中，通过CRISPR/Cas9技术使用非同源末端连接方法将基因片段引入免疫球蛋白基因座，例如，参见He,et al.,Nuc.Acids Res.,44:e85,2016，而不是通常用该系统进行的同源定向修复。
在本发明的上下文中，术语“异源”是指本文所述的核苷酸序列或基因座，其对于其所在的哺乳动物而言不是内源的，或者是通过替换或去除内源序列而修饰的内源基因座。
在本文中，术语“转基因”指核酸元件(例如核酸构建体诸如免疫球蛋白基因片段，或非编码或编码基因序列诸如基因或基因座)，分别表示该基因、基因片段和基因座不是细胞天然的(即，不是天然存在于相同物种的野生型细胞中细胞基因组内的相同位置)，或者对于产生重组细胞的细胞是外源的，即，该核酸元件存在于修饰(重组)的细胞的基因组中，修饰的细胞不是野生型细胞。转基因基因片段可以是野生型基因片段，其存在的基因座或位置不同于野生型细胞中的相应基因座或位置(因此在自然界中不存在相同的基因座)。转基因基因片段可以包含(修饰的或未修饰的)内源编码序列或基因，如果它存在于基因组中不同于野生型基因或生物中的基因座。这种转基因核酸元件的实例是修饰的内源元件，例如本文所述的Cγ基因片段，其在CH1结构域中包含缺失或修饰，并且该基因片段整合在小鼠内源免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段的上游，因此位于不同于其在野生型细胞中相应位置的位置，野生型细胞中Cγ基因片段位于免疫球蛋白重链基因座中Cμ基因片段的下游。
术语“转基因”在本文中用于描述已经或将要被人工插入细胞(特别是宿主动物细胞)的基因组中的遗传物质。本文所用术语“转基因”是指核酸分子或元件，例如包含在表达构建体和/或靶向载体中的核酸，其可被引入和并入宿主基因组中，例如本文所述在其CH1结构域中包含缺失的Cγ基因片段。因此，宿主生物(例如小鼠)被改造成“转基因”宿主。
术语“重组体”指宿主细胞中非自然存在的多核苷酸或多肽。重组或转基因分子可以包含两个或多个以非自然方式连接在一起的自然序列。重组或转基因细胞包含重组多核苷酸或多肽。如果细胞接受转基因或重组核酸，该核酸对该细胞是“外源的”。
术语“重组”特别是指“由基因工程制备或产生”。或者，使用“工程”一词。例如，可以通过工程化改造相应的亲本序列来产生工程化的抗体或结构域，从而修饰抗体或抗体结构域以产生变体。重组宿主具体包含表达载体或靶向载体，或者其已经被遗传工程化以包含重组核酸序列，特别是使用宿主外源的核苷酸序列。通过在宿主中表达相应的重组核酸来生产重组蛋白。如本文所用，术语“重组抗体”包括免疫球蛋白，特别是通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如：
a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体(transchromosomal)的动物(例如，非人类动物，诸如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，
b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体，
c)从重组组合抗体文库中分离的抗体，和
d)通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，包括例如人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列的剪接。这种重组抗体包括被改造成包括例如在抗体成熟过程中发生重排和突变的抗体。
在实施方案的某些方面，本发明的转基因动物进一步包含人免疫球蛋白区域。例如，已经开发了许多方法来用人免疫球蛋白序列替换小鼠内源性免疫球蛋白区域，以产生用于药物发现目的的部分或完全人抗体。这种小鼠的实例包括描述于例如美国专利号7,145,056；7,064,244；7,041,871；6,673,986；6,596,541；6,570,061；6,162,963；6,130,364；6,091,001；6,023,010；5,593,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318；5,789,650；5,661,016；5,612,205和5,591,669中的那些。
如本文所用，术语“嵌合免疫球蛋白基因片段”用于指包含人免疫球蛋白基因片段编码序列，特别是人IGH(VH、D和JH)编码序列和鼠表达控制序列的免疫球蛋白基因片段。包含这种嵌合基因片段的小鼠具有基因组，该基因组包含引入的外源免疫球蛋白区域，该区域部分是人的，其中引入的区域包含人可变区编码序列和控制人序列表达的鼠非编码调控序列，该序列来自小鼠或小鼠的内源基因组，并通过引入嵌合免疫球蛋白基因片段或嵌合免疫球蛋白基因座而敲入小鼠基因组。特别地，鼠序列，特别是鼠非编码和调控序列，是基于相应的鼠内源序列，即与内源野生型免疫球蛋白基因座相同的序列。
本文所述的用于表达人免疫球蛋白基因序列的鼠表达控制序列特别选自由启动子、转录起始和终止序列、增强子和激活子序列或核糖体结合位点组成的组。这种表达控制序列的具体实例是编码序列侧翼的序列，其可以包括启动子、5’非翻译序列、插入前导肽编码序列的内含子、重组信号序列(RSS)和剪接位点。
在特别有利的方面，本文所述的转基因小鼠包含嵌合免疫球蛋白片段，如Wabl和Killeen的美国专利2013/0219535所描述。这种转基因小鼠的基因组包含引入的部分人免疫球蛋白区域，其中引入的区域包含人可变区编码序列和基于小鼠内源基因组的非编码可变区序列。具体地，本发明的转基因细胞和小鼠具有部分或全部内源免疫球蛋白区域被去除的基因组。
在另一个有利的方面，如WO2017035252A1中所述，本文所述小鼠的基因组内容物被修饰，使得其B细胞能够每细胞表达一个以上功能性VH结构域，即细胞产生双特异性抗体。
本文所用的“载体”定义为在合适的宿主生物中转录克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)和翻译其mRNA所需的DNA序列。载体包括质粒和病毒以及任何DNA或RNA分子，无论是否自我复制，其可用于转化、转导或转染细胞。载体可以包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列。表达载体可另外包含在宿主细胞中自主复制的起点或基因组整合位点、一个或多个选择性标记(例如，氨基酸合成基因或赋予抗生素抗性的基因，诸如嘌呤霉素、ZeocinTM、卡那霉素、G418或潮霉素)、大量限制性酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组件可操作地连接在一起。
一种常见类型的载体是“质粒”，它通常是双链DNA的独立分子，可以容易地接受额外的(外源)DNA，并且可以容易地引入合适的宿主细胞。质粒通常含有编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适于插入外源DNA的限制性位点。具体地，术语“质粒”指一种载体，通过该载体可将DNA或RNA序列(例如，外源基因)导入宿主细胞，从而转化宿主并促进导入序列的表达(例如，转录和翻译)。
本文所用的术语“宿主细胞”是指被转化以产生特定重组蛋白(例如本文所述的抗体)的初始受试细胞及其任何后代。应该理解的是，并非所有的后代都与亲代细胞完全相同(由于环境产生有意或无意的突变或差异)，然而，这些术语包括这种改变的后代，只要后代保留与原始转化细胞相同的功能。术语“宿主细胞系”指用于表达重组基因以产生重组多肽例如重组抗体的宿主细胞的细胞系。本文所用的术语“细胞系”指特定细胞类型的已建立的克隆，其获得了长期增殖的能力。这种宿主细胞或宿主细胞系可以保持在细胞培养物中和/或培养以产生重组多肽。
本文所用的关于核酸、抗体或其它化合物的术语“分离”或“分离物”是指这样的化合物，其已经从与其自然相关的环境中充分分离，从而以“基本上纯的”形式存在。“分离”不一定意味着排除人工或合成的与其它化合物或材料的混合物，或者不干扰基本活性的杂质的存在，并且可以含有例如由于不完全纯化而可能存在的杂质。特别地，本文所述的分离的核酸分子也包括化学合成的核酸分子。
关于本文所述的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。当应用于DNA时，该术语指的是DNA分子，该DNA分子与其来源的生物体的自然基因组中紧邻的序列分离。例如，“分离的核酸”可以包含插入载体例如质粒或病毒载体的DNA分子，或者整合到原核或真核细胞或宿主生物的基因组DNA中的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可指已与其它在自然状态下(即，在细胞或组织中)与其相关联的核酸充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步表示通过生物或合成手段直接产生的分子，并且在其产生过程中与存在的其它成分分离。
关于多肽或蛋白质，例如分离的抗体，术语“分离”应具体指不含或基本上不含与其自然相关的物质的化合物，例如在其自然环境中或其制备环境(当这种制备是通过体外或体内实施的重组DNA技术进行时，诸如细胞培养)中发现的其它化合物。分离的化合物可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且为了实用的目的仍然是分离的，例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
本文所述的抗体特别以分离的形式提供，其基本上不含针对不同靶抗原的其它抗体和/或包含不同结构排列的抗体结构域。然而，分离的抗体可以包含在组合制剂中，包含分离的抗体与例如至少一种其它抗体(例如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段)的组合。
具体地，本文所述的抗体以基本上纯的形式提供。本文使用的术语“基本上纯”或“纯化的”是指包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％中任一者的化合物(例如核酸分子或抗体)的制剂。纯度通过适合于该化合物的方法(例如，色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)来测量。
“位点特异性重组”是指两个相容的重组位点之间的重组过程，包括以下三种情况中的任一种：
a)重组位点侧翼的预选核酸的缺失；
b)侧翼为重组位点的预选核酸的核苷酸序列的反向，和
c)位于不同核酸分子上的重组位点附近的核酸区域的相互交换。应当理解，如果一个或两个核酸分子是环状的，核酸片段的这种相互交换导致整合事件。
参考下面的实施例，将更全面地理解前面的描述。然而，这些实施例仅仅是实践本发明的一个或多个实施方案的代表方法，并且不应该被理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：使用同源重组将小鼠Ighg1 ΔCH1基因盒引入小鼠内源Igh基因座Ighm 的上游，以产生纯重链(HCO)Ab。
图2和图3说明了引入Ighg1ΔCH1基因盒以产生HCO Ab(或HCAb)的示例性方法。
同源重组靶向载体(图2)的两个基本组成部分是短同源臂(SHA)和长同源臂(LHA)，它们与位于被修饰的内源基因座区域侧翼的同源DNA片段具有序列同一性。在这种情况下，SHA由人JH2-JH6基因片段组成，其侧翼是相应的小鼠Jh非编码序列(SEQ ID NO:2)。LHA由完整的Ighm基因组成，起始于5’内含子，终止于3’内含子(SEQ ID NO:12)。始于5’端的靶向载体的其它显著特征包括：1)Pgk_TK_pA(SEQ ID NO:1)，一种由磷酸甘油酸激酶启动子(Pgk)驱动的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因，包括多聚腺苷酸位点(pA)。该元件与更昔洛韦一起用于负筛选整合了(但不是通过同源重组)靶向载体的细胞。在同源重组过程中，SHA的非同源DNA 5’(或LHA的3’)将被消除(图2)。在这种情况下，如果载体通过同源重组整合，HSV-TK基因被缺失。任何没有通过同源重组整合载体的细胞将保留HSV-TK基因并被杀死。2)T3噬菌体RNA聚合酶的T3启动子(SEQ ID NO:3)。这种依赖DNA的RNA聚合酶对T3噬菌体启动子具有高度特异性。99KD的酶催化体外RNA合成，这允许从少量B细胞或杂交瘤中快速克隆VDJ重排。3)CAG_PuroR_pA，一种由强CAG启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因，包括polyA位点(SEQ ID NO:5)。该元件用于正筛选整合了基于嘌呤霉素抗性的靶向载体的细胞。4)注意，通过同源重组将靶向载体稳定整合到其基因组中的细胞将同时对更昔洛韦和嘌呤霉素具有抗性。5)注意，可以使用侧翼具有FRT位点(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6)的CAG_PuroR_pA元件，在鉴定了正确靶向的ES细胞克隆后，通过提供Flp重组酶在体外或体内除去该元件。Eμ增强子(SEQ ID NO:7)包含在Ighg1ΔCH1基因盒的上游，以促进该基因座的转录。在靶向载体中，接下来是Ighg1 5’内含子的部分序列(SEQ ID NO:8)、Iggh1铰链5’内含子的部分序列(SEQ ID NO:9)、Ighg1ΔCH1基因(SEQ ID NO:10)和人生长激素1多聚腺苷酸化信号序列(hGH1 pA，SEQ ID NO:11)。紧接着的下游是LHA(SEQ ID NO:12)。它由Ighm 5’内含子的部分序列(SEQ ID NO:13)和Ighm基因(SEQ ID NO:14)组成，Ighm基因包括3’UTR，其后是Ighm 3’内含子的部分序列(SEQ ID NO:15)。在CH1、CH2和CH3 Ighm外显子中引入终止密码子(TGA)，以防止如果VDJH外显子直接剪接到Cμ而不是Ighg1ΔCH1基因上时LC依赖性μHC的表达。靶向载体缺乏内源性Igh基因座中存在的μ转换(S)区，因此靶向基因座也将缺乏S区，因此不能进行同种型转换。通过电穿孔将靶向载体导入ES细胞。细胞在补充有更昔洛韦和嘌呤霉素的培养基中生长。然后通过基因组PCR监测存活的分离的ES细胞克隆的成功基因靶向，所述基因组PCR使用广泛实践的基因靶向策略，其中引物位于新引入的Ighg1ΔCH1基因盒的5’和3’内。通过基因组Southern印迹进一步证实了靶向盒的正确整合，Southern印迹使用了映射定位于SHA 5’侧DNA序列侧翼的探针；映射定位于LHA 3’侧DNA序列侧翼的第二探针；和映射定位于载体基因组同一性的两个臂之间的新DNA内的第三探针。(正确靶向基因座的结构如图3所示，下文称为HCO基因座。)
使用原位荧光杂交方法分析经PCR和Southern印迹验证的ES细胞克隆的核型，该方法设计用于区分小鼠ES细胞中最常见的染色体畸变。具有这种畸变的克隆排除进一步使用。基于PCR和Southern印迹数据判断具有预期的正确基因组结构，并且基于核型分析也没有可检测的染色体畸变的ES细胞克隆被选择进一步使用。
根据标准程序，将在小鼠重链基因座中携带正确靶向的Ighg1ΔCH1基因盒的ES细胞克隆显微注射到来自DBA/2品系的小鼠胚泡中，以产生部分ES细胞衍生的嵌合小鼠。选择对其皮毛具有最高水平ES细胞来源贡献的雄性嵌合小鼠与雌性小鼠交配。这里选择的雌性小鼠是C57B1/6NTac品系，在其种系中携带编码Flp重组酶的转基因。分析这些交配产生的后代中Ighg1ΔCH1基因盒的存在和FRT侧翼嘌呤霉素抗性基因的缺失。(图3)正确靶向的小鼠，称为TRN0034或TRN34，用于建立小鼠群体。
实施例2：HCO小鼠骨髓(BM)中的B细胞发育。
在现有技术中(参见例如WO 2011/072204 A1)，IgG型HCAb在缺乏功能性轻链且在缺乏CH1结构域的重组Cγ基因片段上游具有功能性Cμ基因片段的小鼠中产生。在这些小鼠中产生HCAb具有明显的缺点。具有功能性Cμ基因片段，以标准IgM作为抗原BCR的成熟B细胞将正常发育。然而，在免疫应答过程中，抗体类别转换到(所需的)γ链，这些链不能与L链配对，因为它缺失。这将产生两个影响：
(i)具有抗体的细胞，其中特异性由H+L链的组合定义，将不再被刺激和死亡，和
(ii)特异性主要由H链定义的细胞可能死亡，因为不成对的VH在结构上不能存活。
因此，在现有技术的这种小鼠中，VH选择是“后端加载的(backloaded)”，即发生在免疫应答期间。
通过将转基因Cγ1基因片段整合到内源免疫球蛋白基因座中Cμ基因片段的上游，VH选择是“前端加载的(frontloaded)”，即发生在个体发育期间。
为了显示B细胞在这些小鼠中正常发育，骨髓细胞CD抗原特异性单克隆抗体进行表面染色，并通过流式细胞术进行分析，如图4所示。在对照TRN11/2/5小鼠中，内源性VH、Vκ和Vλ基因座分别被侧翼为小鼠调控序列的人VH、Vκ和Vλ基因座编码序列取代，如Wabl和Killeen的共同未决申请美国专利20130219535A1中所述。在TRN34/29/30小鼠中，VH、D和JH基因片段与TRN11相同，但Igh基因座的其余部分已被修饰，以编码IgG1 HCO抗体，如图3所示。Vκ和Vλ基因座分别在TRN29和TRN30等位基因中失活。流程图中的数字表示给定门中细胞的百分比。
TRN11/2/5小鼠的遗传组成：
内源性VH、Vκ和Vλ基因座分别替换为人VH、Vκ和Vλ基因座编码序列，其侧翼为小鼠调控序列；
TRN34/29/30小鼠的遗传组成：
HCO基因座：Ighg1ΔCH1和终止密码子(TGA)被引入CH1、CH2和CH3 Ighm外显子，
嵌合VH基因座：人VH、Vκ和Vλ基因座编码序列，其侧翼为替换内源性VH基因座的小鼠调控序列，以及
无活性的Vκ和Vλ基因座。
还显示了B细胞的发育阶段。成熟的再循环B表示在骨髓中产生并在外周(例如在脾中)完成成熟的B细胞，并通过血流再循环回到骨髓(BM)。
在两种小鼠品系中，早期B谱系细胞(B220+CD23-)的频率是相同的，然而，与对照组相比，在HCO小鼠中，pro-B细胞的频率增加，而其后代pre-B细胞的频率减少(下图)。这种减少导致外周的过渡和成熟B细胞的相应减少(图5、7、8)和BM中成熟再循环B细胞的相应减少(上图)。对于pro-B细胞和pre-B细胞频率的改变有几种可能的解释。正常情况下，pre-B细胞合成与替代轻链和CD79A/B相关的μHC，并在细胞表面低水平表达。这标志着细胞在V→J重排和轻链基因表达之前增殖，标志着未成熟的B细胞阶段。HCO小鼠的γ1HC不与SLC结合，在细胞表面以CD79A/B表达。这种pre-B细胞可能不会增殖到与WT相同的程度，并且可能分化成未成熟的B细胞，并且更快地离开BM，因为不需要LC基因重排。pro-B细胞的增加表明在pro-B到pre-B的发育阶段可能存在瓶颈。
在任何情况下，所有预期发育阶段的B谱系细胞都存在于HCO小鼠中。
实施例3：HCO小鼠外周B细胞分化和细胞表面IgG1表达。
来自与实施例3中相同小鼠的脾细胞用对所示CD抗原特异的荧光缀合单克隆抗体染色，并通过流式细胞术分析(图5)。流程图中的数字表示给定门中细胞的百分比。根据BM中pre-B细胞和成熟再循环B细胞频率降低的预测(图4)，HCO小鼠脾脏中所有B细胞亚群总体下降。分析的亚群包括总B，B1，B2，过渡1和2(T1和T2)，滤泡(Fo.)B和边缘区(MZ)B细胞。尽管它们的数量减少，但所有预期分化阶段的细胞都存在于HCO小鼠中。
大量的脾MZ(80％)和Fo.B(91％)细胞在细胞表面表达γ1HC(图6)，表明HCO基因座在体内体内功能正常。
在淋巴结(LN，图7)中，总B细胞(上图)和成熟Fo.B细胞(中图)减少。与脾B细胞相似，HCO小鼠中89％的LN B细胞在细胞表面表达γ1HC(下图)。
在腹膜腔中(图8)，总B细胞(上图)、Fo.B细胞和B1 B细胞(中图)减少。与脾和LN B细胞相似，HCO小鼠的大多数腹膜B细胞在细胞表面表达γ1HC(下图)。
总之，即使所有B细胞发育阶段和亚群的频率在HCO小鼠的BM和外周中降低(除了BM中的pro-B细胞)，所有B细胞发育阶段和亚群都存在，并且γ1HCO基因座在体内功能正常。
实施例4：HCO小鼠的血清免疫球蛋白(lg)水平
图9显示了在未免疫的TRN11/2/5(空心圈)和TRN34/29/30HCO(实心圈)小鼠中检测血清IgG1和IgM的ELISA测定结果。光密度显示在Y轴上，血清稀释度显示在X轴上。为了标准化(空心框)，100μg/ml的单克隆IgG1(左)和IgM(右)也被连续稀释。在TRN34/29/30HCO小鼠的血清中检测到显著水平的纯重链IgG1，略低于对照TRN11/2/5血清中的IgG1(包含重链和轻链)。相比之下，HCO小鼠的IgM处于背景水平。使用类似的ELISA测定检测血清IgG2b、IgG2c和IgG3(图10)。所有三种Ig同种型均未在TRN34/29/30HCO小鼠中检测到。
这些结果表明，由于μHC开放阅读框中存在三个终止密码子，TRN34/29/30HCO小鼠中的B细胞不能分化为分泌IgM的浆细胞。结果还表明，由于在这些小鼠中Igh基因座的μ转换区的缺失，在HCO小鼠中没有IgG2b、IgG2c或IgG3的同种型转换。
SEQUENCE LISTING
<110> 特里安尼公司
<120> 纯重链抗体
<130> P23JM1WN00389AT
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2182
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 1
agtcagcttc tgatggaatt agaacttggc aaaacaatac tgagaatgaa gtgtatgtgg 60
aacagaggct gctgatctcg ttcttcaggc tatgaaactg acacatttgg aaaccacagt 120
acttagaacc acaaagtggg aatcaagaga aaaacaatga tcccacgaga gatctataga 180
tctatagatc atgagtggga ggaatgagct ggcccttaat ttggttttgc ttgtttaaat 240
tatgatatcc aactatgaaa cattatcata aagcaatagt aaagagcctt cagtaaagag 300
caggcattta tctaatccca ccccaccccc acccccgtag ctccaatcct tccattcaaa 360
atgtaggtac tctgttctca cccttcttaa caaagtatga caggaaaaac ttccatttta 420
gtggacatct ttattgttta atagatcatc aatttctgca gacttacagg acggatcgat 480
cccctcagtt agcctccccc atctcccggg caaacgtgcg cgccaggtcg catatcgtcg 540
gtatggagcc gggggtggtg acgtgggtct ggaccatccc ggaggtaagt tgcagcaggg 600
cgtcccggca gccggcgggc gattggtcgt aatccaggat aaagacgtgc atggaacgga 660
ggcgtttggc caagacgtcc aaggcccagg caaacacgtt atacaggtcg ccgttggggg 720
ccagcaactc gggggcccga aacagggtaa ataacgtgtc cccgatatgg ggtcgtgggc 780
ccgcgttgct ctggggctcg gcaccctggg gcggcacggc cgtccccgaa agctgtcccc 840
agtcctcccg ccacgacccg ccgcactgca gataccgcac cgtattggca agtagcccgt 900
aaacgcggcg aatcgcagcc agcatagcca ggtccagccg ctcgccgggg cgctggcgtt 960
tggccaggcg gtcgatgtgt ctgtcctccg gaagggcccc aagcacgatg ttggtgccgg 1020
gcaaggtcgg cgggatgagg gccacgaacg ccagcacggc ctggggggtc atgctgccca 1080
taaggtaccg cgcggccggg tagcacagga gggcggcgat gggatggcgg tcgaagatga 1140
gggtgagggc cgggggcggg gcatgtgagc tcccagcctc ccccccgata tgaggagcca 1200
gaacggcgtc ggtcacggca taaggcatgc ccattgttat ctgggcgctt gtcattacca 1260
ccgccgcgtc cccggccgat atctcaccct ggtcgaggcg gtgttgtgtg gtgtagatgt 1320
tcgcgattgt ctcggaagcc cccagcaccc gccagtaagt catcggctcg ggtacgtaga 1380
cgatatcgtc gcgcgaaccc agggccacca gcagttgcgt ggtggtggtt ttccccatcc 1440
cgtggggacc gtctatataa acccgcagta gcgtgggcat tttctgctcc gggcggactt 1500
ccgtggcttc ttgctgccgg cgagggcgca acgccgtacg tcggttgcta tggccgcgag 1560
aacgcgcagc ctggtcgaac gcagacgcgt gttgatggcc ggggtacgag gccatgatgg 1620
caaggacggt gcattggctg caggtcgaaa ggcccggaga tgaggaagag gagaacagcg 1680
cggcagacgt gcgcttttga agcgtgcaga atgccgggcc tccggaggac cttcgggcgc 1740
ccgccccgcc cctgagcccg cccctgagcc cgcccccgga cccacccctt cccagcctct 1800
gagcccagaa agcgaaggag caaagctgct attggccgct gccccaaagg cctacccgct 1860
tccattgctc agcggtgctg tccatctgca cgagactagt gagacgtgct acttccattt 1920
gtcacgtcct gcacgacgcg agctgcgggg cgggggggaa cttcctgact aggggaggag 1980
tagaaggtgg cgcgaagggg ccaccaaaga acggagccgg ttggcgccta ccggtggatg 2040
tggaatgtgt gcgaggccag aggccacttg tgtagcgcca agtgcccagc ggggctgcta 2100
aagcgcatgc tccagactgc cttgggaaaa gcgcctcccc tacccggtag aattgacctg 2160
ccggggccct cgaatcctgc ag 2182
<210> 2
<211> 2369
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 2
aggtgctcag caaaggaggt cggcaggagg gcggagggtg tgtttttgta tgggagaagc 60
aggagggcag aggctgtggg tttttgttat aggaacagag gcagaacaga cactgtgcta 120
ctggtacttc gatctctggg gccgtggcac cctggtcact gtctcctcag gtaagctggc 180
ttttttcttt ctgcacattc cattctgaaa cgggaaaaga tattctcaga tctccccatg 240
tcaggccatc tgccacactg tgagtcctgc atctggggac tgtggggttc aggtggccta 300
aggcaggatg tggagaggtt tttgttcggg gaacagaggg gtatccaaca ctgtgtgatg 360
cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttcaggtaag atggctttcc 420
ttctgcctcc tttctctggg cccagcgtcc tctgtcctgg agctgggaga taatgtccgg 480
gggctccttg gtctgcgctg ggccatgtgg ggccctccgg ggctccttct ccggctgtct 540
gcatgctgca gaagcttttc tgtaaggata gggtcttcac tcccaggaaa agaggcagtc 600
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ctacatgggt agatgggttt ttgtacaccc actaaagggg tctatgacac tgtgactact 720
ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc aggtgagtcc ttacaacctc 780
tctcttctat tcagcttaaa tagattttac tgcatttgtt gggggggaaa tgtgtgtatc 840
tgaatttcag gtcatgaagg actagggaca ccttgggagt cagaaagggt cattgggagc 900
cctggctgac gcagacagac atcctcagct cccatacttc atggccagag atttataggg 960
atcctggcca gcattgccgc taggtccctc tcttctatgc tttctttgtc cctcactggc 1020
ctccatctga gatcatcctg gagccctagc caaggatcgg tttttgtcag gggtctaatc 1080
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ctcctcaggt gagtcctaac ttctcccatt ctaaatgcat gttgggggga ttctgggcct 1200
tcaggaccaa gattctctgc aaacgggaat caagattcaa cccctttgtc ccaaagttga 1260
gacatgggtc tgggtcaggg actctctgcc tgctggtctg tggtgacatt agaactgaag 1320
tatgatgaag gatctgccag aactgaagct tgaagtctga ggcagaatct tgtccagggt 1380
ctatcggact cttgtgagaa ttaggggctg acagttgatg gtgacaattt cagggtcagt 1440
gactgtctgg tttctctgag gtgaggctgg aatataggtc accttgaaga ctaaagaggg 1500
gtccaggggc ttctgcacag gcagggaaca gaatgtggaa caatgacttg aatggttgat 1560
tcttgtgtga caccaggaat tggcataatg tctgagttgc ccaggggtga ttctagtcag 1620
actctgggtt tttgttcggg tatagaggaa aaatccacca ctgtgattac tactactact 1680
actacatgga cgtctggggc aaagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt aagaatggcc 1740
tctccaggtc tttattttta acctttgtta tggagttttc tgagcattgc agactaatct 1800
tggatatttg tccctgaggg agccggctga gagaagttgg gaaataaact gtctagggat 1860
ctcagagcct ttaggacaaa cggtggctgc cgtcctgaca ggggcttagg gaggctccag 1920
gacctcagtg ccttgaagct ggtttccaag agaaaaggat tgtttatctt aggaggcatg 1980
cttactgtta aaagacagga tatgtttgaa gtggcttctg agaaaaatgg ttaagaaaat 2040
tatgacttaa aaatgtgaga gattttcaag tatattaatt tttttaactg tccaagtatt 2100
tgaaattctt atcatttgat taacacccat gagtgatatg tgtctggaat tgaggccaaa 2160
gcaagctcag ctaagaaata ctagcacagt gctgtcggcc ccgatgcggg actgcgtttt 2220
gaccatcata aatcaagttt atttttttaa ttaattgagc gaagctggaa gcagatgatg 2280
aattagagtc aagatggctg catgggggtc tccggcaccc acagcaggtg gcaggaagca 2340
ggtcaccgcg agagtctatt ttaggaagc 2369
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 3
cctttagtga gggttaatt 19
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 4
gaagttccta ttccgaagtt cctattcttc aaaaggtata ggaacttc 48
<210> 5
<211> 2711
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 5
tcattctggc ctccccctcc cccaaggtca ttctggcctc cccctccccc aaggtcattc 60
tggcctcccc ctcccccttg gccgcgcctc attctggcct ccccctcccc caaggcacac 120
aaaaaaccaa cacacagatc tattgaaaat aatgatcttt tattgatccg cgcctggatc 180
tcgaaccggt tcaggcaccg ggcttgcggg tcatgcacca ggtgcgcggt ccttcgggca 240
cctcgacgtc ggcggtgacg gtgaagccga gccgctcgta gaaggggagg ttgcggggcg 300
cggaggtctc caggaaggcg ggcaccccgg cgcgctcggc cgcctccact ccggggagca 360
cgacggcgct gcccagaccc ttgccctggt ggtcgggcga gacgccgacg gtggccagga 420
accacgcggg ctccttgggc cggtgcggcg ccaggaggcc ttccatctgt tgctgcgcgg 480
ccagccggga accgctcaac tcggccatgc gcgggccgat ctcggcgaac accgcccccg 540
cttcgacgct ctccggcgtg gtccagaccg ccaccgcggc gccgtcgtcc gcgacccaca 600
ccttgccgat gtcgagcccg acgcgcgtga ggaagagttc ttgcagctcg gtgacccgct 660
cgatgtggcg gtccgggtcg acggtgtggc gcgtggcggg gtagtcggcg aacgcggcgg 720
cgagggtgcg tacggcccgg gggacgtcgt cgcgggtggc gaggcgcacc gtgggcttgt 780
actcggtcat ggaaggctag gcggatcggc gatcgctccg gaggccgccc tgggagtgga 840
cacctgtgga gagaaaggca aagtggatgt caatgtcact caagtgtatg gccagatctc 900
aagcctgcca cacctcaagc ttgacaacaa aaagattgtc ttttctgacc agatggacgc 960
ggccaccctc aaaggcatca ccgcgggcca ggtgaatatc aaatcctcct cgtttttgga 1020
aactgacaat cttagcgcag aagtcatgcc cgcttttgag agggagtact caccccaacg 1080
cttctagagc cgccggtcac acgccagaag ccgaaccccg ccctgccccg tcccccccga 1140
aggcagccgt ccccccgcgg acagccccga ggctggagag ggagaagggg acggcggcgc 1200
ggcgacgcac gaaggccctc cccgcccatt tccttcctgc cggcgccgca ccgcttcgcc 1260
ccgcgcccgc tagagggggt gcggcggcgc ctcccagatt tcggctccgc acagatttgg 1320
gacaaaggaa gtccctgcgc cctctcgcac gattaccata aaaggcaatg gctgcggctc 1380
gccgcgcctc gacagccgcc ggcgctccgg gggccgccgc gcccctcccc cgagccctcc 1440
ccggcccgag gcggccccgc cccgcccggc acccccacct gccgccaccc cccgcccggc 1500
acggcgagcc ccgcgccacg ccccgtacgg agccccgcac ccgaagccgg gccgtgctca 1560
gcaactcggg gaggggggtg cagggggggt tgcagcccga ccgacgcgcc cacaccccct 1620
gctcaccccc ccacgcacac accccgcacg cagcctttgt tcccctcgca gccccccccg 1680
caccgcgggg caccgccccc ggccgcgctc ccctcgcgca cactgcggag cgcacaaagc 1740
cccgcgccgc gcccgcagcg ctcacagccg ccgggcagcg cggagccgca cgcggcgctc 1800
cccacgcaca cacacacgca cgcacccccc gagccgctcc ccccgcacaa agggccctcc 1860
cggagcccct caaggctttc acgcagccac agaaaagaaa caagccgtca ttaaaccaag 1920
cgctaattac agcccggagg agaagggccg tcccgcccgc tcacctgtgg gagtaacgcg 1980
gtcagtcaga gccggggcgg gcggcgcgag gcggcggcgg agcggggcac ggggcgaagg 2040
cagcgcgcag cgactcccgc ccgccgcgcg cttcgctttt tatagggccg ccgccgccgc 2100
cgcctcgcca taaaaggaaa ctttcggagc gcgccgctct gattggctgc cgccgcacct 2160
ctccgcctcg ccccgccccg cccctcgccc cgccccgccc cgcctggcgc gcgccccccc 2220
cccccccgcc cccatcgctg cacaaaataa ttaaaaaata aataaataca aaattggggg 2280
tggggagggg ggggagatgg ggagagtgaa gcagaacgtg gggctcacct cgaccatggt 2340
aatagcgatg actaatacgt agatgtactg ccaagtagga aagtcccata aggtcatgta 2400
ctgggcataa tgccaggcgg gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg 2460
catatgatac acttgatgta ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatact ccacccattg 2520
acgtcaatgg aaagtcccta ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa 2580
tgggcggggg tcgttgggcg gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg 2640
gaactccata tatgggctat gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aataactagt 2700
caataatcaa t 2711
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 6
gaagttccta ttccgaagtt cctattcttc aaaaggtata ggaacttc 48
<210> 7
<211> 313
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 7
ctgcagcagc tggcaggaag caggtcatgt ggcaaggcta tttggggaag ggaaaataaa 60
accactaggt aaacttgtag ctgtggtttg aagaagtggt tttgaaacac tctgtccagc 120
cccaccaaac cgaaagtcca ggctgagcaa aacaccacct gggtaatttg catttctaaa 180
ataagttgag gattcagccg aaactggaga ggtcctcttt taacttattg agttcaacct 240
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gtatttagaa ttc 313
<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 8
ttaaaaaaaa aaaaaaagga aagggacttc tctgtgtttg gcaacacaag tgcgatgcac 60
aggcaggaag atcaaatctg tcccaacaat acaggggaca gagggtcaac ctacaaaagg 120
aaagaacctg gggcagtgtg aagacaacac tgtagaagcc aaggctgagt tcactgagct 180
ctcgttagtg agactacaca gcaaggaggt ggcgggcact gagcagtgag gccccgggaa 240
gtgggggtga tggtggtgac ggtggtaact gttaagaact gggggaaaga attgtggaga 300
accaagctaa atagttatgt caaaccacat gtttaggagc ctgggttgac ttcataggga 360
gtaggcatgg aggctaatct agaggtttgt gtataggcaa gaagtgaatc ctgacccaag 420
aatagagagt gctaaacgga cttagttcaa agacaactga aaaagacaat gcctgcaaaa 480
caaagctaag gccagagctc ttggactatg aagagttcag ggaacctaag aacagggacc 540
atctgtgtac aggccaaggc cggtagaagc agcctaggaa gtgtcaagag ccaacgtggc 600
tgggtgggca aagacaggaa gggactgtta ggctgcaggg atgtgccgac ttcaatgtgc 660
ttcagtattg tccagattgt gtgcagccat atggcccagg tataagaggt ttaacagtgg 720
aacacagatg cccacatcag acagctgggg ggcgggggtg aacacagata cccatactgg 780
aaagcaggtg gggcattttc ctaggaacgg gactgggctc aatggcctca ggtctcatct 840
ggtctggtga tcctgacatt gataggccca aatgttggat atcacctact ccatgtagag 900
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 9
aagatcaaaa gttgttcttc tcccttctgg agatttctat gtcctttaca actcaattgg 60
ttaatatcct gggttggagt cccacacatc ttgacaaaca gagacaaatt tgagtatcac 120
cagccaaaag tcatacccaa aaacagcctg gcatgaccac acaccagact caaacttacc 180
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cag 243
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<211> 4252
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 10
tgcccaggga ttgtggttgt aagccttgca tatgtacagg taagtcagtg gccttcacct 60
gacccagatg caacaagtgg caatgttgga gggtggccag gtattgacct atttccacct 120
ttcttcttca tccttagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa 180
ggatgtgctc accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa 240
ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca 300
gacgcaaccc cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat 360
catgcaccag gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt 420
ccctgccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggt gagagctgca gtgtgtgaca 480
tagaagctgc aatagtcagt ccatagacag agcttggcat aacagacccc tgccctgttc 540
gtgacctctg tgctgaccaa tctctttacc cacccacagg cagaccgaag gctccacagg 600
tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt ctgacctgca 660
tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat gggcagccag 720
cggagaacta caagaacact cagcccatca tgaacacgaa tggctcttac ttcgtctaca 780
gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc tgctctgtgt 840
tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct cctggtaaat 900
gatcccagtg tccttggagc cctctggtcc tacaggactc tgacacctac ctccacccct 960
ccctgtataa ataaagcacc cagcactgcc ttgggaccct gcaataacgt cctggtgatt 1020
tctgagatgt agagtctagc taggtcatgg aatgaggggt ctccatggtt tgagccctga 1080
gttgtgacta aggaaaaact cataggccta cactgccaca cccagcactt ttgaatttgc 1140
ctgacatgaa aagaatttac ctctccctgg aaagtggagc cttatcccta ggcagttccc 1200
ttaccagacc ttcctctagc ttgcactatg ttctgggcac agaatgtgtc taacccccca 1260
aagtaaggaa gacacaacct ctacttccct cactctgtcc ttaccccttt tcctggctaa 1320
gcatctcact gagtgcgctg aatagatgca tgtggccaca gcttgcagac agacctttgc 1380
catctctccg ctcagctttc cagaggctaa gtctagcccg tatggtgatg atgcagggag 1440
ctctatgcta tctcagtgtt atcagactcc taagtggagg atcaacatgg tcccattaaa 1500
accaacctgc tcagcaacac cctgccaata aggcccgtat gtgaaaatgt gcacacatct 1560
acacatgcac aggcacacac acacacacat gcatgggcac acacacatac agagagagag 1620
aatcacagaa actcccatga gcatcctata cagtactcaa agataaaaag gtaccaggtc 1680
tacccacatg atcatcctcg gcatttacaa gtgggccaac tgatacagat aaaacttttc 1740
tatgccaagg acgccaacaa ccttcctcat atacacaagt ccgctcatga caaatctgtc 1800
cctgaacctc agactggcgc ccgtgactca cacagtggac actcctccaa agctgtatag 1860
cttcctttac ttccctgtgt gtactttctc tgaagtacac tcatcacaca gaagaggccc 1920
tgtgattact ctggccctct gttcttggtc atcagagaat agacagaaga tcaggcaaac 1980
tacacagaca cttcccacaa tcatcacagg ccctgactct gctctccagt ctcaaaactg 2040
aaggctggag cacacagaaa taagctccta cacagcccag accagtatcg ggtccagtgt 2100
gtctgaatga gcccagggac aaaatggcag cactttgggg aactgagatt tctggtccaa 2160
gaaggagaga tggaggccca gggagggtct gctgacccag cccagcccag cccagctgca 2220
gctttctcct gggcctccat gcagcttcct gccacacagg gaatggccct agccccacct 2280
tattgggaca aacactgacc gccctctctg tccagggctg caactggacg agacctgtgc 2340
tgaggcccag gacggggagc tggacgggct ctggacgacc atcaccatct tcatcagcct 2400
cttcctgctc agcgtgtgct acagcgctgc tgtcacactc ttcaaggtca gccatactgt 2460
ccccacagtg tctacaatgt cctcatactc ttccccatac tgtccctgtg gtgacctata 2520
ccccacactg tcccatgcta atgaccacag tcttacatgc tatgtaatgc tgtctaccct 2580
tctgtatgca cagtctcaca atgtcccatg cagtctccac gatgctccat gctgcccctt 2640
gttccacgct atgctgtccc atgctattgt ctgtattttc atgctctttt cacactgtcc 2700
ctagtgtcac attctgccca tgttgtccac cacattgtcc ccactctgca cacagcctca 2760
cactgtaccc tgctacccga taatgttccc tgttgtcccc aactctctcc ctgcatcatt 2820
tgtcaactgt cccctgaatt cccatgttgt tcccacactg ttagtgtgta atgtgctctg 2880
tcccaggtgt accttgttcc gtgctgtctc acttcatcgc ccattctgtc cttttactaa 2940
ccccactcta tcaccacact gtccctatgc actgcccaca ttgtcctcat actgtcccat 3000
tttgtatctt catcctgtcc ccatagtgtc caatgatcta ccccacacta ttcccacttc 3060
atgcccctac aatttcccta ttccatccct ctctggtcac catgccatcc ttcccactcc 3120
tgcacagctg gagagggact cccgggatga gtccttgccc agatgagcta cctatctaga 3180
ggagtcttca ggtgggaagg gaatgcagtc ttgatcttgg tcttattcac cctgtctcac 3240
aggtaaagtg gatcttctcc tcggtggtgg agctgaagca gacactggtt cctgaataca 3300
agaacatgat tgggcaagcg ccctaggcca cctcttgtaa tggcagggga tttcccaggc 3360
cccaaaggac cctgtccaat atgccaagca gcacaactga gatcacactg tctgctcatc 3420
tcgctttcct ccgaccccga gactcagcta ctctcaaatt ttccctctct gaaggaccat 3480
gtggacatta cattgctcca ggccacagcc accaggacct aaaacaccat cacagcagca 3540
ccaaagacac tggatagacc cacaagagca atagcttcct caacagtata tccaaactgt 3600
tgggacaaac gagcaatcac tgaagaagtg acaagttccc acaatgtcag tgtccagctg 3660
agaaggggca aaaagtggta ccagccctgt ccacaccacc ttctaattca caggaatccg 3720
tgatagaaga ggcaggttgt agatccgaaa gatgagacag attttatcaa ctccagaaag 3780
agctgggccc aactgaatct aactgaatta ttctagcgac cttggcattg ccatgacctg 3840
ccatgacctt cctccttagc acttcgatga accctgggat atggaaaatg cctgtgtttc 3900
tcagggtttg ggaagaacca tccatgttgg gattcttgtg tagatcctcc tcctggtcac 3960
agatgcaata cactggattt tcaggcaaag gagcaaattc acagacaact ctggccctac 4020
agtcctcaga cctagacacc accatctcct tggaattatc aaatctaaca cccggcacac 4080
aacaaagaag gactgggact ttgaggcctt tgtgtagccc tagagggggc agaggccact 4140
gagcagggat tgggtgatca gcaaggacct cctggagagg gacctgagga gcaggttcca 4200
attgggccaa agaaagaaga agaacaatag aggtgaagga tgctggaaag ag 4252
<210> 11
<211> 623
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180
acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240
ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300
ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360
ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420
tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg 480
attttaaaat aactatacca gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat 540
gcccaaccgg tgggacattt gagttgcttg cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc 600
actcagtaga tgcctgttga att 623
<210> 12
<211> 4565
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 12
gtgttcatgc ccctagagtt ggctgaaggg ccagatccac ctactctaga ggcatctctc 60
cctgtctgtg aaggcttcca aagtcacgtt cctgtggcta gaaggcagct ccatagccct 120
gctgcagttt cgtcctgtat accaggttca cctactacca tatctagccc tgcctgcctt 180
aagagtagca acaaggaaat agcagggtgt agagggatct cctgtctgac aggaggcaag 240
aagacagatt cttacccctc catttctctt ttatccctct ctggtcctca gagagtcagt 300
ccttcccaaa tgtcttcccc ctcgtctcct gcgagagccc cctgtctgat aagaatctgg 360
tggccatggg ctgcctggcc cgggacttcc tgcccagcac catttccttc acctgaaact 420
accagaacaa cactgaagtc atccagggta tcagaacctt cccaacactg aggacagggg 480
gcaagtacct agccacctcg caggtgttgc tgtctcccaa gagcatcctt gaaggttcag 540
atgaatacct ggtatgcaaa atccactacg gaggcaaaaa caaagatctg catgtgccca 600
ttccaggtaa gaaccaaacc ctcccagcag gggtgcccag gcccaggcat ggcccagagg 660
gagcagcggg gtggggctta ggccaagctg agctcacacc ttgacctttc attccagctg 720
tcgcagagat gaaccccaat gtaaatgtgt tcgtcccacc acgggatggc ttctctggcc 780
ctgcaccacg caagtctaaa ctcatctgcg aggccacgaa cttcactcca aaaccgatca 840
cagtatcctg actaaaggat gggaagctcg tggaatctgg cttcaccaca gatccggtga 900
ccatcgagaa caaaggatcc acaccccaaa cctacaaggt cataagcaca cttaccatct 960
ctgaaatcga ctggctgaac ctgaatgtgt acacctgccg tgtggatcac aggggtctca 1020
ccttcttgaa gaacgtgtcc tccacatgtg ctgccagtga gtggcctggg ctaagcccaa 1080
tgcctagccc tcccagatta gggaagtcct cctacaatta tggccaatgc cacccagaca 1140
tggtcatttg ctccttgaac tttggctccc cagagtggcc aaggacaaga atgagcaata 1200
ggcagtagag gggtgagaat cagctggaag gaccagcatc ttcccttaag taggtttggg 1260
ggatggagac taagcttttt tccaacttca caactagata tgtcataacc tgacacagtg 1320
ttctcttgac tgcaggtccc tccacagaca tcctaacctt caccatcccc ccctcctttg 1380
ccgacatctt cctcagcaag tccgctaacc tgacctgtct ggtctcaaac ctggcaacct 1440
atgaaaccct gaatatctcc tgagcttctc aaagtggtga accactggaa accaaaatta 1500
aaatcatgga aagccatccc aatggcacct tcagtgctaa gggtgtggct agtgtttgtg 1560
tggaagactg gaataacagg aaggaatttg tgtgtactgt gactcacagg gatctgcctt 1620
caccacagaa gaaattcatc tcaaaaccca atggtaggta tccccccttc ccttcccctc 1680
caattgcagg acccttcctg tacctcatag ggagggcagg tcctcttcca ccctatcctc 1740
actactgtct tcatttacag aggtgcacaa acatccacct gctgtgtacc tgctgccacc 1800
agctcgtgag caactgaacc tgagggagtc agccacagtc acctgcctgg tgaagggctt 1860
ctctcctgca gacatcagtg tgcagtggct tcagagaggg caactcttgc cccaagagaa 1920
gtatgtgacc agtgccccga tgccagagcc tggggcccca ggcttctact ttacccacag 1980
catcctgact gtgacagagg aggaatggaa ctccggagag acctatacct gtgttgtagg 2040
ccacgaggcc ctgccacacc tggtgaccga gaggaccgtg gacaagtcca ctggtaaacc 2100
cacactgtac aatgtctccc tgatcatgtc tgacacaggc ggcacctgct attgaccatg 2160
ctagcgctca accaggcagg ccctgggtgt ccagttgctc tgtgtatgca aactaaccat 2220
gtcagagtga gatgttgcat tttataaaaa ttagaaataa aaaaaatcca ttcaaacgtc 2280
actggttttg attatacaat gctcatgcct gctgagacag ttgtgttttg cttgctctgc 2340
acacaccctg catacttgcc tccaccctgg cccttcctct accttgccag tttcctcctt 2400
gtgtgtgaac tcagtcaggc ttacaacaga cagagtatga acatgcgatt cctccagcta 2460
cttctagata tatggctgaa agcttgccta acctggtgca ggcagcattc aggcacatat 2520
atagacacac atgcatttat acatagatat ataggtacac atgtgtagac acatacatga 2580
atgtgtattc atggacacac agacaaaggt acacatatat acacatgagt tcatgcgcac 2640
acacatgcat ggacacttac aaacgccttc agagacaaat aggcatagac acacaaccac 2700
tcacagaaac agataccaat atgcatggtc ctgtgtacac agaaacagac tataggcaaa 2760
tatacacaaa taaactatat agatacaaag atatgcatat acacacatgt acagaaacat 2820
cttcacatgt gtacactaac atgtgaacag gtatagcaca cagatacacc tggactctga 2880
ccagggctgt aatctccaag gctcacggct cagagagcct acactaggct gggtcactga 2940
tactcctcag gagcccactc tatgattggg agagataacc ccaggtacaa agtatgccta 3000
tctgtctcaa caccatgggg cagaagatac tccactaacc acccatgaca gaaagttagc 3060
cttggctgtg tctccattaa tagaacacct cagaagacca atgtgaaatt gcctaaccca 3120
ctcacaccca ccctgatctc cagttcaaaa tgcagaaaac ataatgcagt tgtccaaaag 3180
atgccccaac cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 3240
cacacacaca ccatcaagga gcctctgtaa ggagtcacca cccaataaca ctgcctcttt 3300
gggctcatat cctggacatt cttcatattc atatccattt ggggcctagg ctttagatat 3360
ccccaagggc tcatctttac agggatcaga gatcccaata aatgccctgg tcccacagcc 3420
tccctcaggt atctgtctgt ttatctcttg gtaccaagac ccaacattgc tggcaggggt 3480
aggacaagca acgcacggga actctgatca aagaaagtca tgagatgcct gagtccttca 3540
ggaagtaagg agggacaacc tctggtatcc ctgttcttat tgctaaagcc caagagacag 3600
ggagacctgc tctaaattct cagtctaaac agcaccgatg gcaccacctg ctcagggaaa 3660
gtccagagca caccaatatc attttgccac agttcctgag tctgccttta cccaggtcca 3720
tacattgcat ctgtcttgct tgctctgctg ccccagggct cctggaacaa aggctccaaa 3780
ttagtgtgtc ctacagcttg gcctgttctg tgcctccgtc tagcttgagc tattagggga 3840
ccagtcaata ctcgctaaga ttctccagaa ccatcagggc accccaaccc ttatgcaaat 3900
gctcagtcac cccaagactt ggcttgaccc tccctctctg tgtcccttca tagaggggga 3960
ggtgaatgct gaggaggaag gctttgagaa cctgtggacc actgcctcca ccttcatcgt 4020
cctcttcctc ctgagcctct tctacagcac caccgtcacc ctgttcaagg tagtgtggtt 4080
gtggggctga ggacacaggg ctgggacagg gagtcaccag tcctcactgc ctctacctct 4140
actccctaca agtggacagc aattcacact gtctctgtca cctgcaggtg aaatgactct 4200
cagcatggaa ggacagcaga gaccaagaga tcctcccaca gggacactac ctctgggcct 4260
gggatacctg actgtatgac tagtaaactt attcttacgt ctttcctgtg ttgccctcca 4320
gcttttatct ctgagatggt cttctttcta gactgaccaa agactttttg tcaacttgta 4380
caatctgaag caatgtctgg cccacagaca gctgagctgt aaacaaatgt cacatggaaa 4440
taaatacttt atcttgtgaa ctcactttat tgtgaaggaa tttgttttgt ttttcaaacc 4500
tttcctgcgg tgttgacagc ccaaggatta tctgaataga gcttaggaac tggaaatgga 4560
acagt 4565
<210> 13
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 13
gtgttcatgc ccctagagtt ggctgaaggg ccagatccac ctactctaga ggcatctctc 60
cctgtctgtg aaggcttcca aagtcacgtt cctgtggcta gaaggcagct ccatagccct 120
gctgcagttt cgtcctgtat accaggttca cctactacca tatctagccc tgcctgcctt 180
aagagtagca acaaggaaat agcagggtgt agagggatct cctgtctgac aggaggcaag 240
aagacagatt cttacccctc catttctctt ttatccctct ctggtcctca g 291
<210> 14
<211> 4227
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 14
agagtcagtc cttcccaaat gtcttccccc tcgtctcctg cgagagcccc ctgtctgata 60
agaatctggt ggccatgggc tgcctggccc gggacttcct gcccagcacc atttccttca 120
cctgaaacta ccagaacaac actgaagtca tccagggtat cagaaccttc ccaacactga 180
ggacaggggg caagtaccta gccacctcgc aggtgttgct gtctcccaag agcatccttg 240
aaggttcaga tgaatacctg gtatgcaaaa tccactacgg aggcaaaaac aaagatctgc 300
atgtgcccat tccaggtaag aaccaaaccc tcccagcagg ggtgcccagg cccaggcatg 360
gcccagaggg agcagcgggg tggggcttag gccaagctga gctcacacct tgacctttca 420
ttccagctgt cgcagagatg aaccccaatg taaatgtgtt cgtcccacca cgggatggct 480
tctctggccc tgcaccacgc aagtctaaac tcatctgcga ggccacgaac ttcactccaa 540
aaccgatcac agtatcctga ctaaaggatg ggaagctcgt ggaatctggc ttcaccacag 600
atccggtgac catcgagaac aaaggatcca caccccaaac ctacaaggtc ataagcacac 660
ttaccatctc tgaaatcgac tggctgaacc tgaatgtgta cacctgccgt gtggatcaca 720
ggggtctcac cttcttgaag aacgtgtcct ccacatgtgc tgccagtgag tggcctgggc 780
taagcccaat gcctagccct cccagattag ggaagtcctc ctacaattat ggccaatgcc 840
acccagacat ggtcatttgc tccttgaact ttggctcccc agagtggcca aggacaagaa 900
tgagcaatag gcagtagagg ggtgagaatc agctggaagg accagcatct tcccttaagt 960
aggtttgggg gatggagact aagctttttt ccaacttcac aactagatat gtcataacct 1020
gacacagtgt tctcttgact gcaggtccct ccacagacat cctaaccttc accatccccc 1080
cctcctttgc cgacatcttc ctcagcaagt ccgctaacct gacctgtctg gtctcaaacc 1140
tggcaaccta tgaaaccctg aatatctcct gagcttctca aagtggtgaa ccactggaaa 1200
ccaaaattaa aatcatggaa agccatccca atggcacctt cagtgctaag ggtgtggcta 1260
gtgtttgtgt ggaagactgg aataacagga aggaatttgt gtgtactgtg actcacaggg 1320
atctgccttc accacagaag aaattcatct caaaacccaa tggtaggtat ccccccttcc 1380
cttcccctcc aattgcagga cccttcctgt acctcatagg gagggcaggt cctcttccac 1440
cctatcctca ctactgtctt catttacaga ggtgcacaaa catccacctg ctgtgtacct 1500
gctgccacca gctcgtgagc aactgaacct gagggagtca gccacagtca cctgcctggt 1560
gaagggcttc tctcctgcag acatcagtgt gcagtggctt cagagagggc aactcttgcc 1620
ccaagagaag tatgtgacca gtgccccgat gccagagcct ggggccccag gcttctactt 1680
tacccacagc atcctgactg tgacagagga ggaatggaac tccggagaga cctatacctg 1740
tgttgtaggc cacgaggccc tgccacacct ggtgaccgag aggaccgtgg acaagtccac 1800
tggtaaaccc acactgtaca atgtctccct gatcatgtct gacacaggcg gcacctgcta 1860
ttgaccatgc tagcgctcaa ccaggcaggc cctgggtgtc cagttgctct gtgtatgcaa 1920
actaaccatg tcagagtgag atgttgcatt ttataaaaat tagaaataaa aaaaatccat 1980
tcaaacgtca ctggttttga ttatacaatg ctcatgcctg ctgagacagt tgtgttttgc 2040
ttgctctgca cacaccctgc atacttgcct ccaccctggc ccttcctcta ccttgccagt 2100
ttcctccttg tgtgtgaact cagtcaggct tacaacagac agagtatgaa catgcgattc 2160
ctccagctac ttctagatat atggctgaaa gcttgcctaa cctggtgcag gcagcattca 2220
ggcacatata tagacacaca tgcatttata catagatata taggtacaca tgtgtagaca 2280
catacatgaa tgtgtattca tggacacaca gacaaaggta cacatatata cacatgagtt 2340
catgcgcaca cacatgcatg gacacttaca aacgccttca gagacaaata ggcatagaca 2400
cacaaccact cacagaaaca gataccaata tgcatggtcc tgtgtacaca gaaacagact 2460
ataggcaaat atacacaaat aaactatata gatacaaaga tatgcatata cacacatgta 2520
cagaaacatc ttcacatgtg tacactaaca tgtgaacagg tatagcacac agatacacct 2580
ggactctgac cagggctgta atctccaagg ctcacggctc agagagccta cactaggctg 2640
ggtcactgat actcctcagg agcccactct atgattggga gagataaccc caggtacaaa 2700
gtatgcctat ctgtctcaac accatggggc agaagatact ccactaacca cccatgacag 2760
aaagttagcc ttggctgtgt ctccattaat agaacacctc agaagaccaa tgtgaaattg 2820
cctaacccac tcacacccac cctgatctcc agttcaaaat gcagaaaaca taatgcagtt 2880
gtccaaaaga tgccccaacc acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 2940
acacacacac acacacacac catcaaggag cctctgtaag gagtcaccac ccaataacac 3000
tgcctctttg ggctcatatc ctggacattc ttcatattca tatccatttg gggcctaggc 3060
tttagatatc cccaagggct catctttaca gggatcagag atcccaataa atgccctggt 3120
cccacagcct ccctcaggta tctgtctgtt tatctcttgg taccaagacc caacattgct 3180
ggcaggggta ggacaagcaa cgcacgggaa ctctgatcaa agaaagtcat gagatgcctg 3240
agtccttcag gaagtaagga gggacaacct ctggtatccc tgttcttatt gctaaagccc 3300
aagagacagg gagacctgct ctaaattctc agtctaaaca gcaccgatgg caccacctgc 3360
tcagggaaag tccagagcac accaatatca ttttgccaca gttcctgagt ctgcctttac 3420
ccaggtccat acattgcatc tgtcttgctt gctctgctgc cccagggctc ctggaacaaa 3480
ggctccaaat tagtgtgtcc tacagcttgg cctgttctgt gcctccgtct agcttgagct 3540
attaggggac cagtcaatac tcgctaagat tctccagaac catcagggca ccccaaccct 3600
tatgcaaatg ctcagtcacc ccaagacttg gcttgaccct ccctctctgt gtcccttcat 3660
agagggggag gtgaatgctg aggaggaagg ctttgagaac ctgtggacca ctgcctccac 3720
cttcatcgtc ctcttcctcc tgagcctctt ctacagcacc accgtcaccc tgttcaaggt 3780
agtgtggttg tggggctgag gacacagggc tgggacaggg agtcaccagt cctcactgcc 3840
tctacctcta ctccctacaa gtggacagca attcacactg tctctgtcac ctgcaggtga 3900
aatgactctc agcatggaag gacagcagag accaagagat cctcccacag ggacactacc 3960
tctgggcctg ggatacctga ctgtatgact agtaaactta ttcttacgtc tttcctgtgt 4020
tgccctccag cttttatctc tgagatggtc ttctttctag actgaccaaa gactttttgt 4080
caacttgtac aatctgaagc aatgtctggc ccacagacag ctgagctgta aacaaatgtc 4140
acatggaaat aaatacttta tcttgtgaac tcactttatt gtgaaggaat ttgttttgtt 4200
tttcaaacct ttcctgcggt gttgaca 4227
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 15
gcccaaggat tatctgaata gagcttagga actggaaatg gaacag 46
<210> 16
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60
gcacagcagc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120
ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180
gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240
acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttg 294
<210> 17
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc 60
tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 120
ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc 180
cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc 240
aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc 300
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 330
<210> 18
<211> 320
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga 60
accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 120
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 180
acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 240
acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc 300
tctccctgtc tccgggtaaa 320
Claims (18)
1.一种产生小鼠的方法，其中B细胞表达多种纯重链抗体(HCAb)库，所述方法通过在内源免疫球蛋白重链恒定区基因座中内源Cμ基因片段的上游并入转基因Cγ基因片段，其中所述Cγ基因片段包含编码CH1结构域的至少一部分的核苷酸序列的缺失。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小鼠在经抗原免疫后激活抗原特异性B细胞并诱导其分化为分泌多种抗原特异性HCAb的浆细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Cγ基因片段位于Eμ主要内含子增强子的下游，优选位于包含SEQ ID NO:7的内源Eμ主要内含子增强子的下游。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述Cγ基因片段包含Cγ1基因片段。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述CH1结构域的至少一部分包含BiP伴侣结合结构域。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述小鼠包含失活或缺失的内源免疫球蛋白轻链基因座，优选地所述小鼠包含内源κ或λ轻链基因座中的任一者或两者内的功能丧失突变或缺失。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述内源Cμ基因片段是无活性的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述内源Cμ基因片段因功能丧失突变、Cμ基因片段的部分缺失或因引入一个或多个终止密码子的一个或多个突变而失活。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链基因座包含人VH、D和JH编码序列以及与所述VH、D和JH编码序列可操作连接的表达控制序列，优选地其中所述表达控制序列是鼠的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述VH、D和JH编码序列经重组以形成表达特异性识别抗原的VH结合位点的VDJ编码序列，从而在给定B细胞中获得重组VH编码序列，所述B细胞在分化成浆细胞后能够分泌IgG型HCAb，所述HCAb包含由所述重组VH编码序列编码的抗原特异性VH结合结构域。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，包括：
a)提供鼠胚胎干细胞；
b)提供在一个或多个表达盒中包含核酸序列的一个或多个载体，所述核酸序列包含所述Cγ基因片段；
c)将所述一个或多个载体引入细胞；
d)筛选转基因细胞，其中b)的序列已经通过在内源免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段上游的靶向整合而并入到所述细胞的细胞基因组中，所述Cμ基因片段任选地是无活性的；和
e)利用所述转基因细胞产生衍生自所述转基因细胞的转基因小鼠。
12.一种小鼠，其可通过权利要求1到11中任一项的方法获得，在其内源免疫球蛋白重链恒定区基因座中内源Cμ基因片段的上游包含转基因Cγ基因片段，其中所述Cγ基因片段包含编码CH1结构域的至少一部分的核苷酸序列的缺失。
13.根据权利要求12所述的小鼠，其包含VH重链基因座，所述VH重链基因座包含人VH、D和JH编码序列的库，所述编码序列至少为2VH、2D和2JH。
14.根据权利要求12或13所述的小鼠，其包含内源κ或λ轻链基因座中的任一者或两者内的功能丧失突变或缺失。
15.表达多种IgG型HCAb的B细胞库，其源自可通过权利要求1至11中任一项所述的方法获得的小鼠。
16.根据权利要求15所述的B细胞库，其表达在其VH结构域上不同的多种抗原特异性HCAb。
17.一种产生包含抗原特异性VH结构域的抗体的方法，所述方法包括：
a)用抗原免疫小鼠，所述小鼠包含位于免疫球蛋白重链基因座中内源Cμ基因片段上游的转基因Cγ基因片段，其中所述Cγ基因片段包含编码CH1结构域的至少一部分的核苷酸序列的缺失，从而提供表达抗原特异性HCAb的细胞库；
b)从所述库筛选表达包含抗原特异性VH的IgG型HCAb的细胞；
c)从所述HCAb中确定编码所述抗原特异性VH的核酸序列；和
d)产生包含所述抗原特异性VH的单克隆抗体。
18.权利要求12至14中任一项所述的小鼠在用于产生B细胞库或包含VH的分子库的方法中的用途。
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