EA015897B1

EA015897B1 - Применение человеческого моноклонального антитела к ил-15 в составе композиции и лекарственного препарата (варианты), композиция и лекарственный препарат, его включающие

Info

Publication number: EA015897B1
Application number: EA200501362A
Authority: EA
Inventors: Ян Г. Я. Ван Де Винкел; Маркус Антониус Ван Дейк; Янине Схурман; Арнаут Ф. Герритсен; Оле Д. M. Ск. Бодсгор; Йерген Петерсен
Original assignee: Генмаб А/С
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2004-02-25
Publication date: 2011-12-30
Also published as: JP2007528348A; RS20050724A; ZA200506724B; CN1780856A; EA200501362A1; AR043405A1; JP4892335B2

Abstract

Описаны выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с ИЛ-15 (например, человеческим ИЛ-15), а также соответствующие композиции на основе подобных антител и молекулы. Человеческие антитела могут быть получены в трансфектоме или отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способной к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Представлены также фармацевтические композиции, содержащие человеческие антитела, трансгенные животные, отличные от человека, и гибридомы, которые продуцируют человеческие антитела, а также способы терапии и диагностики с использованием человеческих антител.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, конкретно к выделенным моноклональным человеческим антителам к интерлейкину-15 (ИЛ-15), которые могут быть использованы для диагностики, лечения или предупреждения нарушений, которые ассоциированы со сверхэкспрессией человеческого ИЛ-15 и/или при которых даунрегуляция или ингибирование эффектов, индуцированных человеческим ИЛ-15, являются благоприятными.

Сведения о предшествующем уровне техники

Интерлейкин-15 представляет собой провоспалительный цитокин, гликопротеин молекулярной массы 14-15 кД. Отмечена его конститутивная экспрессия в различных клетках и тканях, включая моноциты и макрофаги, фибробласты, кератиноциты и дендритные клетки (см. статьи \Уа1бшапп и Тадауа, 1999; Еейшдег и Сайдшп, 2001). Положительная регуляция экспрессии происходит в условиях воспаления, как описано для моноцитов, стимулируемых ΙΕΝ-γ (интерфероном-γ) и ЬР8 (липополисахаридами), или при инфекции вирусов, бактерий или простейших (см. статьи Китап и соавт., 1998; \Уа1бшапп и соавт., 1998; \Уа1бшапп и Тадауа, 1999; Еейшдег и СаНдшп, 2001). Кроме того, при хронических воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, местное образование ИЛ-15, вероятно, усиливает воспаление путем рекрутирования и активации синовиальных Т-клеток. Данный эффект, индуцируемый ИЛ-15, как предполагалось, играет центральную роль в патогенезе заболевания (см. статьи Кптап и соавт., 1998; Мс1пие§ и соавт., 1996; Мс1пие§ и соавт., 1997; Мс1пие§ и Ыете, 1998; Еейшдег и СаНдшп, 2001).

Исследования ш νίΐτο показали, что ИЛ-15 имеет ряд общих биологических активностей с ИЛ-2 в связи с наличием общих рецепторных компонентов. Рецептор ИЛ-15, присутствующий на Т-клетках, состоит из уникальной ο-цепи, ИЛ-15Ко, но имеет такие же β-цепь и γ-цепь, как ИЛ-2К. Вследствие этого, оба рецептора используют одинаковые элементы передачи сигнала 1ак/8ТАТ. Однако, основываясь на системной регуляции и дифференцированной экспрессии ИЛ-2 и ИЛ-15 и их рецепторов, были описаны важные различия данных функций ш νίνο (см. статьи К1гтап и соавт., 1998; \Уа1бшапп и Тадауа, 1999; \Уа1бшапп и соавт., 2001).

Важно также отметить основную роль ИЛ-15 в развитии, жизнеспособности, экспансии и функции натуральной киллерной (ΝΚ) клетки, ΝΚ-Т-клетки и интраэпителиального лимфоцита (см. статьи Кеппебу и соавт., 2000; Ыи и соавт., 2000).

Мс1ппе5 с коллегами (см. статью Мс1пие§ и соавт., 1997; Мс1пие§ и Ыете, 1998) описали индукцию продукции ΪΝΕ-α в Т-клетках, выделенных у больных ревматоидным артритом, после стимуляции с помощью ИЛ-15. Кроме того, было показано, что Т-клетки периферической крови, активированные ИЛ-15, индуцируют продукцию Т№-а макрофагами на значительном уровне посредством механизма, зависимого от контакта клеток. Вследствие деструктивной роли ΈΝΕ-ο в развитии ревматоидного артрита ингибирование данного цитокина снижает активность заболевания (см. статьи Ва11юп и соавт., 2000; Кйрре1, 2000; Боуе11 и соавт., 2000; Маш1 и Тау1ог, 2000).

Сущность изобретения

Изобретательской задачей является получение новых, полностью человеческих антител к интерлейкину-15, позволяющих расширить круг средств данного назначения.

Данное изобретение основано на создании и выделении впервые полностью человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с человеческим ИЛ-15, а также на характеризации данных новых антител и демонстрации их терапевтической ценности при лечении ряда ИЛ-15опосредованных заболеваний. Например, как описано в данном контексте, было показано, что человеческие антитела ингибируют оба процесса, как продукцию ΈΝΕ-ο, так и пролиферацию Т-клеток, которые полностью входят в воспалительные нарушения. Согласно этому человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, представляют собой усовершенствованное средство для лечения и профилактики данных нарушений (и любого другого ИЛ-15-опосредованного нарушения). Это отчасти обусловлено их уникальной специфичностью (например, специфичностью в отношении эпитопа или вида), аффинностью, структурой, функциональной активностью и тем фактом, что они являются полностью человеческими, что делает их значительно менее иммуногенными и более терапевтически эффективными при введении пациенту-человеку, чем другие антитела против ИЛ-15, полученные ранее (например, мышиные и гуманизированные антитела). В основе данного изобретения лежит также разработка новых способов терапевтического применения антител, ингибирующих ИЛ-15, таких как человеческие антитела, описанные в данном контексте, в том числе для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз, отторжение трансплантатов и рак. Выделенные человеческие антитела, соответствующие изобретению, включают множество изотипов антител, таких как 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4, 1дМ, 1дА1, 1дА2, 1дА§ес, 1дЭ и 1дЕ. Как правило, они включают изотипы 1дО1 (например, 1дО1к), 1дС3 и 1дМ. Антитела могут иметь полную длину (например, антитело 1дС1 или 1дО3) или включать только антигенсвязывающую часть (например, ЕаЬ, Р(аЬ')2, Εν, фрагмент одноцепочечного Εν, выделенный гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность)(СЭК) или комбинацию из двух или более выделенных СЭК.

- 1 015897

В одном из вариантов осуществления человеческие антитела представляют собой рекомбинантные антитела. В конкретном варианте осуществления человеческое антитело кодируется нуклеиновыми кислотами человеческой тяжелой цепи 1дС и человеческой κ-легкой цепи, которые содержат в вариабельных областях нуклеотидные последовательности, приведенные в 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 3 соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей.

В другом варианте осуществления человеческое антитело включает вариабельные области тяжелой цепи 1дС и κ-легкой цепи, которые содержат последовательности аминокислот, представленные в 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 4 соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей.

Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть получены рекомбинантным путем в клетке-хозяине, такой как трансфектома (например, трансфектома, состоящая из иммортализованных клеток СН0 (яичников китайского хомячка) или лимфоцитарных клеток), содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, или могут быть получены непосредственно из гибридомы, которая экспрессирует антитело (например, гибридомы, которая включает Вклетку, выделенную из организма трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие антитело, слитую с иммортализованной клеткой).

В конкретном варианте осуществления продукция антител осуществляется гибридомой, обозначаемой в данном контексте 146В7, или трансфектомой на основе клетки-хозяина (например, клетки СН0), содержащей нуклеиновые кислоты человеческой тяжелой цепи и человеческой легкой цепи, которые содержат в вариабельных областях нуклеотидные последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 3 соответственно, и их консервативные модификации.

В конкретных вариантах осуществления продукция антител осуществляется гибридомами, обозначаемыми в данном контексте 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8.

В предпочтительном варианте осуществления антитело специфически связывает эпитоп, находящийся на домене ИЛ-15, который взаимодействует с β- и/или γ-цепью.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, специфически связываются с человеческим ИЛ-15 и подавляют способность ИЛ-15 индуцировать провоспалительные эффекты, например ингибируют продукцию ТИЕ-а и/или подавляют пролиферацию Т-клеток, таких как Т-клетки, представленные РВМС (мононуклеарными клетками периферической крови) или СТЬЬ-2, при связывании ИЛ-15 с рецептором ИЛ-15.

Как правило, человеческие антитела связываются с ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (ΚΌ) меньше чем приблизительно 10^-7 М, например, меньше чем приблизительно 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже меньше, определенной методом поверхностного плазменного резонанса (8РК.) на приборе ВIАС0КЕ 3000, используя рекомбинантный человеческий ИЛ-15 в качестве аналита и антитело в качестве лиганда.

В конкретном варианте осуществления антитело связывается с человеческим ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (ΚΌ) приблизительно 6,5х10^-8 М.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему по меньшей мере одну последовательность СОК, выбранную из группы, состоящей из:

(1) 8 ЕС) ΙΌ N0: 5, 6, 7, 8, 9 и 10;

(ίί) последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (1); и (ίίί) фрагментов последовательностей, определенных в (ί) или (ίί), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему:

(ί) 8 ЕС) ΙΌ N0: 7;

(ίί) последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична 8Е0 ΙΟ N0: 7; или (ίίί) фрагмент последовательности, определенной в (ί) или (ίί), который сохраняет способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему:

(ί) 8 ЕС) ΙΌ N0: 5 и 8;

(ίί) 8ЕС) ΙΌ N0: 6 и 9;

(ίίί) 8ЕС) ΙΌ N0: 7 и 10;

(ίν) последовательности, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по

- 2 015897 меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (ί), (ίί) или (ίίί); либо (ν) фрагменты последовательностей, определенных в (ί)-(ίίί) или (ίν), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему по меньшей мере четыре СЭК, выбранные из:

(ί) 8 ЕС) Ш N0: 5, 6, 7, 8, 9 или 10;

(ίί) последовательности, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (1); и (ίίί) фрагменты последовательностей, определенных в (ί) или (ίί), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕС Ш N0: 2 или последовательностью, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична 8ЕС ΙΌ N0: 2.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 4 или последовательностью, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична 8ЕС ΙΌ N0: 4.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, которое ингибирует цис-передачу сигнала через γ-цепь ИЛ-15К посредством специфического связывания эпитопа, находящегося на домене человеческого ИЛ-15, взаимодействующим с γ-цепью, и которое ингибирует транс-передачу сигнала на соседние клетки, экспрессирующие γ-цепъ или β- и γ-цепи как часть ИЛ-15К или другого цитокинового рецептора.

В еще одном варианте осуществления выделенное человеческое моноклональное антитело специфически связывается с человеческим ИЛ-15 и нарушает сборку α-, β- и γ-цепей рецептора ИЛ-15 и/или ингибирует сборку на соседних клетках, экспрессирующих β- и γ-цепи как часть рецептора ИЛ-15 или другого цитокинового рецептора.

В другом аспекте в изобретении представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или антигенсвязывающие части, соответствующие изобретению. Согласно этому изобретение охватывает также рекомбинантные экспрессионные векторы, которые включают кодирующие антитело нуклеиновые кислоты, соответствующие изобретению, клетки-хозяева, трансфицированные данными векторами, а также способы получения антител, соответствующих изобретению, путем культивирования данных клеток-хозяев.

Изобретение касается также экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, которые содержат аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕС ΙΌ N0: 2 и 8ЕС ΙΌ N0: 4 соответственно, и их консервативные модификации. Данные экспрессионные векторы хорошо известны в области техники. Примеры векторов включают векторы для транскрипции/трансляции ίη νίΐτο с использованием, например, лизатов ретикулоцитов.

В еще одном аспекте изобретение представляет выделенные В-клетки трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, которые способны экспрессировать различные изотипы (например, ΙβΟ. Ι§Ά и/или Ι§Μ) человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с ИЛ-15. Предпочтительно, когда выделенные В-клетки получают у трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, которая была иммунизирована очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Предпоч

- 3 015897 тительно, когда геном трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи. Затем выделенные В-клетки иммортализуют с целью получения источника (например, гибридомы) человеческих антител против ИЛ-15.

Соответственно данное изобретение представляет также гибридому, способную продуцировать человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления гибридома включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие целое антитело, соответствующее изобретению, или его фрагмент, слитую с иммортализованной клеткой. Трансгенное животное, отличное от человека, может быть иммунизировано очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15, с целью создания гибридом, продуцирующих антитело. Конкретные гибридомы, представленные в изобретении, включают 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8.

В еще одном аспекте изобретение представляет трансгенное животное, отличное от человека, например трансгенную мышь, которая экспрессирует человеческие моноклональные антитела, специфически связывающиеся с ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления трансгенное животное, отличное от человека, представлено трансгенной мышью, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи. Трансгенное животное, отличное от человека, может быть иммунизировано очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Предпочтительно, когда трансгенное животное, отличное от человека, например трансгенная мышь, способно к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, 1дС. 1дА и/или 1дМ) путем рекомбинации У-И-1 и переключения изотипов. Переключение изотипов может осуществляться, например, путем классического и неклассического переключения изотипов.

В другом аспекте данное изобретение представляет способы получения человеческих моноклональных антител, которые специфически реагируют с ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления способ включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие целое антитело, очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Затем получают В-клетки (например, В-клетки селезенки) животного и сливают их с клетками миеломы с образованием иммортализованных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15.

В еще одном аспекте данного изобретения охарактеризованы человеческие антитела против ИЛ15, конъюгированные с терапевтической молекулой, например цитотоксическим лекарственным веществом, токсином с ферментативной активностью или его фрагментом, радиоизотопом или маленькой молекулой противоопухолевого лекарственного вещества.

В другом аспекте данное изобретение представляет композиции, например фармацевтические и диагностические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере одно человеческое моноклональное антитело, соответствующее изобретению, которое специфически связывается с ИЛ-15. Кроме того, композиция может содержать другие терапевтические агенты, такие как другие иммунодепрессанты или химиотерапевтические агенты.

В еще одном аспекте в изобретении представлены способы ингибирования провоспалительных эффектов ИЛ-15, такие как ингибирование образования ΤΝΡ-α и/или пролиферации Т-клеток, индуцируемых ИЛ-15, предпочтительно без ингибирования активности (например, образования ΤΝΡ-α и/или пролиферации Т-клеток) структурно близких белков/цитокинов (например, ИЛ-2) с использованием одного или более человеческих антител, соответствующих изобретению.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, можно использовать для лечения и/или профилактики ряда ИЛ-15-опосредованных заболеваний посредством введения антител пациентам, страдающим данными заболеваниями.

Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, облегчить) или предупредить, используя способы и композиции, соответствующие изобретению, включают без ограничения перечисленным воспалительные заболевания, такие как артрит (например, псориатический артрит и ревматоидный артрит, в том числе активный ревматоидный артрит и ювенильный ревматоидный артрит (болезнь Стилла)) и воспалительное заболевание кишки. Например, было показано, что антитела снижают паракератоз, уменьшают толщину эпидермиса и снижают пролиферацию кератиноцитов при псориазе. Показано также, что антитела уменьшают воспаление и/или препятствуют хемотаксису активированных лейкоцитов, участвующих в развитии ревматоидного артрита. Антитела можно также использовать для лечения инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-инфекция. Более того, антитела могут быть использованы для лечения отторжения трансплантата. Согласно этому человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, могут быть использованы у пациентов, подвергающихся или тех, которые были подвергнуты трансплантации органа или ткани, например сердца, легкого, комбинации серд

- 4 015897 ца-легкого, трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишки, кожи, конечности, трансплантации пуповины, трансплантации стволовых клеток, трансплантации клеток островков и т.п.

Антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть, таким образом, использованы для профилактики отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата или использованы для реверсии, лечения или иного облегчения эпизодов острого отторжения аллотрансплантатов или ксенотрансплантатов.

Дальнейшие заболевания, которые можно лечить, включают болезнь трансплантат против хозяина, например болезнь трансплантат против хозяина, связанную с переливанием крови, и болезнь трансплантат против хозяина при трансплантации костного мозга. Кроме того, антитела могут быть использованы для лечения ряда заболеваний, включающих неоваскуляризацию, опосредованную ИЛ-15, таких как рост опухоли и формы рака, например Т-клеточный лейкоз. Другие примеры заболевания с повышенным уровнем ангиогенеза включают воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения или предупреждения нарушения, которое ассоциировано со сверхэкспрессией человеческого ИЛ-15 и/или при котором даунрегуляция или ингибирование эффектов, индуцированных человеческим ИЛ-15, является благоприятной, предусматривающему введение антитела, соответствующего изобретению, субъекту в количестве, эффективном для лечения или предупреждения нарушения.

В следующем варианте изобретения нарушение выбрано из группы, состоящей из подагрических заболеваний, таких как анкилозирующий спондилит, реактивный артрит, саркоилеит и болезнь Стилла взрослых;

нарушений соединительной ткани, таких как системная красная волчанка, дискоидная волчанка, волчанка ЦНС, волчаночный нефрит, саркоидоз, саркоидоз ЦНС и полимиозит/дерматомиозит;

глазных нарушений, таких как увеит и хореоритинит;

неврологических нарушений, таких как миелопатия/тропический спастический парапарез, злокачественная миастения, рак шейки матки, рабдомиосаркома, саркома Эвинга и рассеянный склероз; желудочно-кишечных нарушений и нарушений печени, таких как острый скоротечный гепатит, колики, послеоперационный энтероколит, язвенный колит и болезнь Крона;

аллергических нарушений, таких как бронхиальная астма;

гематологических нарушений, таких как острый Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз, Тклеточный лейкоз взрослых, синдром Сезари, хронический лимфоцитарный лейкоз, грибовидный микоз, острый лимфобластный лейкоз/лимфома предшественников В-клеток, хронический миелогенный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, большой гранулярный лимфоцитоз, большой гранулярный лимфоцитарный лейкоз, миелома, плазмацитома, миелома плазматических клеток, заболевания, связанные с тяжелой цепью (включая γ-, μ- и α-заболевание), лимфома экстранодальных натуральных киллеров/Тклеток и агрессивный лейкоз клеток натуральных киллеров;

кожных нарушений, таких как аллергическая контактная экзема, буллезный пемфигоид, послеожоговые гипертрофированные рубцы и красный лишай;

легочных нарушений, таких как хроническое обструктивное легочное заболевание, фиброзирующий альвеолит и острый респираторный дистресс-синдром;

злокачественных новообразований, таких как колоректальный рак и злокачественная меланома;

нарушений, связанных с трансплантацией, таких как отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата и болезнь трансплантат против хозяина;

эндокринологических нарушений, таких как аутоиммунный тиреоидит и болезнь Грейва;

сосудистых нарушений, таких как грануломатоз Вегенера, микроскопический полиангиит, узелковый полиартериит, артериит гигантских клеток и атеросклероз;

гинекологических нарушений - нарушений при родах, таких как привычный самопроизвольный выкидыш и эндометриоз; и инфекционных заболеваний, таких как сепсис и СПИД.

В еще одном варианте осуществления нарушение выбрано из группы, состоящей из анкилозирующего спондилита, системной красной волчанки, язвенного колита, отторжения трансплантата и болезни трансплантат против хозяина.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также скомбинированы с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, такими как противовоспалительные агенты, ΌΜΆΚΟ (модифицирующие заболевание антиревматические лекарственные вещества), иммунодепрессанты, химиотерапевтические препараты и агенты для лечения псориаза.

В одном из вариантов осуществления субъекта могут дополнительно лечить одним или более агентами, которые усиливают подавление провоспалительного эффекта антител, например противовоспалительным агентом, таким как стероидное лекарственное вещество или Ν8ΑΙΌ (нестероидное противовоспалительное лекарственное вещество). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, ингибиторы Сох-2, такие как рофекоксиб (Уюхх (Виокс)) и целекоксиб (Се1еЬгех (Целебрекс)), Ν8ΑΙΌ, такие как ибупрофен (Μοΐτίη, (Мотрин) Αάνίΐ (Адвил)), фенопрофен (Ναΐίοη (Налфон)), напроксен Щартокуп (Напросин)), сулиндак (Οίηοπΐ (Клинорил)), диклофенак (УоИагеп (Воль

- 5 015897 тарен)), пироксикам (Ее14епе (Фелден)), кетопрофен (Огибщ (Орудие)), дифлунисал (ΌοΙοΜά (Долобид)), набуметон (Ке1аЕеп (Релафен)), этодолак (Ьобше (Лодин)), оксапроцин (Эаурго (Дайпро)) и индометацин (Ιηάοοίη (Индоцин)).

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более ΌΜΆΚΌ, такими как метотрексат (Кйеита1гех (Реуматркес)), гидроксихлороквин (Р1ас.|иеш1 (Плаквенил)), сульфасалазин (АкиИШше (Асульфидин)), ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид (Агауа (Арава)), блокаторы рецептора ИЛ-1, например анакинра (Кшеге! (Кинерет)) и блокатор ΤΝΕ-α, например этанерцепт (ЕпЬте1 (Энбрел)), инфликсимаб (Репйеабе (Ремикад)) и адалимумаб.

Дальнейшие примеры представляют собой ИЛ-10, растворимый ИЛ-15Р. антитела против ИЛ-6В, СТЬА41д и антитела против ΟΌ20.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более иммунодепрессантами, такими как циклоспорин (8апФттипе (Сандиммун), №ога1 (Неорал)) и азатиоприн (1тига1 (Имурал)).

Дальнейшими примерами являются микофеноловая кислота, мофетил микофенолят, кортикостероиды, такие как преднизон, метотрексат, соли золота, сульфасалазин, антималярийные препараты, бреквинар, лефлуномид, мизорибин, 15-дезоксиспергуалин, 6-меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус (ЕК-506) и антитимоцитарный глобулин.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с двумя или более иммунодепрессантами, такими как преднизон и циклоспорин; преднизон, циклоспорин и азатиоприн или преднизон, циклоспорин и мофетил микофенолят.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более химиотерапевтическими препаратами, такими как доксорубицин (Абпатусш (Адриамицин)), цисплатин (Р1айпо1 (Платинол)), блеомицин (В1епохапе (Бленоксан)), кармустин (О11абе1 (Глиадел)), циклофосфамид (Су1охан (Цитоксан), Ргосу1ох (Процитокс), №о8ат (Неосар)) и хлорамбуцил (Ьеикеган (Лейкеран)). Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть также введены в сочетании с радиотерапией.

В следующем варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более агентами для лечения псориаза, такими как наружные лекарственные препараты, содержащие каменноугольный деготь, витамин А, кортизон или другие кортикостероиды, пероральные или инъекционные лекарственные препараты, такие как кортикостероиды, метотрексат, ретиноиды, например ацикретин (№одйа§оп (Неогистасон)) или циклоспорин (8ап4пптипе (Сандиммун), №ога1 (Неорал)). Другие способы лечения могут включать воздействие солнечного света или фототерапию.

Дальнейшими примерами являются антралин, кальципотриен, таразотен, энанерцепт, алефацепт, эфалицумаб, 6-тиогуанин, мофетил микофенолят, такролимус (ЕК-506) и гидроксимочевина. Другие примеры представляют собой СТЬА41д и инфликсимаб. Другие лекарственные препараты могут включать ИВУ (широкополосный и узкополосный ультрафиолет В), ИУА (ультрафиолет А) и РИУА (псорален метоксален и ультрафиолет А).

В следующем варианте осуществления композиции, соответствующие изобретению, вводят в сочетании с двумя или более вышеуказанными терапевтическими препаратами, такими как метотрексат+фототерапия (РИУА или ИУА); метотрексат+аситретин; ацитретин+фототерапия (РИУА или ИУА); метотрексат+аситретин+фототерапия (РИУА или ИУА); гидроксимочевина+ацитретин; циклоспорин+метотрексат или кальципотреин+фототерапия (ИУВ).

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с другими антителами, такими как СО4-специфические антитела и ИЛ-2специфические антитела. Комбинацию данных человеческих антител с СО4-специфическими антителами или ИЛ-2-специфическими антителами считают особенно эффективной для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

В еще одном варианте осуществления данные антитела могут быть введены в комбинации с другими антителами, например другими иммуносупрессивными человеческими моноклональными антителами, такими как антитела, связывающиеся, например, с МНС, СО2, СО3, СЭ7, 0028, В7, СЭ40, 0045, ИФН-γ, ΤΝΕ-α, ИЛ-2В, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6В, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, СО11а, СО20 или СО58, или другие лиганды либо другие иммуномодулирующие соединения, например растворимый ИЛ-15В или ИЛ-10.

В еще одном аспекте данное изобретение представляет способ детекции ш ν Нго или ш у1уо присутствия антигена ИЛ-15 в образце, например, с целью диагностики ИЛ-15-опосредованных заболеваний. В одном из вариантов осуществления этого достигают посредством контактирования тестируемого образца параллельно с контрольным образцом с человеческим моноклональным антителом, соответствующим изобретению, или его антигенсвязывающей частью в условиях, которые дают возможность формирования комплекса антитела и ИЛ-15. Затем формирование комплекса определяют (например, с помощью ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ)) в обоих образцах, и любая значимая раз

- 6 015897 ница в образовании комплексов между образцами указывает на присутствие антигена ИЛ-15 в тестобразце.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из следующего детального описания и пунктов формулы изобретения.

Перечень чертежей

Фиг. 1 включает графики, отражающие связывание специфических в отношении человеческого ИЛ-15 антител 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 с человеческим ИЛ-15 (КИЛ-15) и мутантными белками ИЛ-15 01088 и Ό88Ο1088. Различные разведения антитела исследуют на связывание с КИЛ-15 или мутантными белками ИЛ-15 Ό88Ρ1088 и Р1088 с помощью ЕЫ8А.

На фиг. 2 и 3 представлены аминокислотные и (8Е0 ГО N0: 2 и 4) и нуклеотидные (8Е0 ГО N0: 1 и 3) последовательности У_Н- и У|-областей соответственно из антитела 146В7. Указаны каркасный сегмент (ΡΒ) и гипервариабельные участки (СИВ).

Фиг. 4Α-4Ό включают графики, отражающие ингибирование ИЛ-15-опосредованного выхода ΤΝΡ-α антителом 146В7. Человеческие РВМС инкубировали с КИЛ-15 (в концентрациях 0, 50, 100 нг/мл) в комбинации с антителом 146В7 или изотипическим контрольным антителом (в концентрации 0,1, 1, 10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество образованного ΤΝΡ-α измеряли с помощью ЕЬ18А. Приведены данные по двум здоровым добровольным участникам эксперимента.

На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий эффект антитела 146В7 на ГО-2- или 1Ь-15опосредованную продукцию ΤΝΡ-α. Человеческие РВМС инкубировали с КИЛ-15 (в концентрациях 0, 50, 100 нг/мл) или КИЛ-2 (в концентрации 100 нг/мл) в комбинации с антителом 146В7 (в концентрации 0,1, 1, 10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество образованного ΤΝΡ-α измеряли с помощью ЕЫ8А.

На фиг. 6 представлен график, демонстрирующий ингибирующую активность антител 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8 на индуцированную КИЛ-15 пролиферацию ΟΤΕΕ-2. Клетки СТЕЕ-2, испытывающие необходимость в КИЛ-2, инкубировали с КИЛ-15 (в концентрации 60 пг/мл) в сочетании с серийными разведениями 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8 в течение 48 ч. С целью отображения пролиферации измеряли включение [³Н]-тимидина (число импульсов/мин). Результаты представлены как средние значения.

Фиг. 7-9 включают графики, демонстрирующие ингибирующую активность антител 146В7 (см. фиг. 7), 404Е4 (см. фиг. 8) и 404А8 (см. фиг. 9) на индуцированную КИЛ-15 пролиферацию РВМС. Человеческие РВМС инкубировали с КИЛ-15 (в концентрации 0,25, 100 нг/мл; см. фиг. 7А, 8А и 9А соответственно) или КИЛ-2 (в концентрации 0, 10, 100 нг/мл; см. фиг. 7В, 8В и 9В соответственно) в сочетании с 146В7 (см. фиг. 7), 404Е4 (см. фиг. 8) или 404А8 (см. фиг. 9) в концентрации 0,1, 1, 10 пг/мл в течение 72 ч. С целью отображения пролиферации измеряли включение [³Н]-тимидина (число импульсов/мин).

На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий связывание антитела 146В7 с моноцитами, стимулированными ΙΡΝ-γ. Человеческие РВМС культивировали в присутствии ΙΡΝ-γ (500 ед./мл) сроком до 2 дней (при 37°С). Интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец определяли после анализа с помощью проточной цитометрии при установке дискриминационного окна на моноциты. Данные показывают коэффициент стимуляции (8.Ι.) = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания)).

На фиг. 11 представлено связывание человеческих моноцитов с антителом 146В7 (панель В) или с изотипическим контрольным антителом (панель А). Выделяли человеческие РВМС и получали осадки в цитоцентрифуге после культивирования клеток с ΙΡΝ-γ (500 ед./мл). Клетки подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином.

На фиг. 12 представлено связывание человеческой пораженной псориазом кожи с 146В7 (панель В) или с изотипическим контрольным антителом (К1дОЬ) (панель А). Человеческие псориазные бляшки получали от пациентов после согласия на основе полученной информации и хранили при -80°С до проведения анализа. Ткани окрашивали биотинилированными антителами и визуализировали после активации пероксидазой хрена.

На фиг. 13А представлен график, демонстрирующий процент ядерных клеток в ткани, пораженной ревматоидным артритом, после лечения мышей 8СГО с помощью 146В7 или носителем. Ткани окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и анализировали с использованием программы РКо1о 8Кор, версия 6.0. Данные представлены как средние значения и 8.е.ш. (стандартная ошибка) для ядер (как процент от общей площади) у мышей после лечения 146В7 (п=4) или введения носителем (п=2). На фиг. 13В и 13С показано репрезентативное окрашивание ГЭ (гематоксилинэозином) ксенотрансплантированной ткани ВА у мышей 8С1Э после лечения 146В7 (см. фиг. 13С) или РВ8 (см. фиг. 13В).

Фиг. 14 включает графики, демонстрирующие эффекты лечения антителом 146В7 у мышей 8СГО/псориаз. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали Н&Е и на ядерный антиген Κί-67. На фиг. 14А представлена степень тяжести псориаза, определенная по толщине кожи, которую измеряли от рогового слоя от начала ограничивающей сети. На фиг. 14В представлена толщина эпидермиса, которая измерена от рогового слоя до самой глубокой части ограничивающей

- 7 015897 сети. На фиг. 14С представлена степень паракератоза. На фиг. 14Ό представлено число воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое дермиса. На фиг. 14Е представлено число циклирующих (митотически активных) кератиноцитов Κι- 67+.

На фиг. 15 представлено окрашивание Н&Е человеческой пораженной псориазом кожи, трансплантированной мышам 8СГО, после лечения антителом 146В7 (панель С), С§А (панель В) или введения носителя (панель А). Через три недели после трансплантации мыши получали РВ8 (плацебо), С§А (циклоспорин А) (δαηάοζ) в дозе 10 мг/кг каждый второй день в течение 15 дней или 146В7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и из каждого ксенотрансплантата брали пункционную биопсию размером 4 мм. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали Н&Е.

На фиг. 16 представлено окрашивание Κί-67 человеческой пораженной псориазом кожи, трансплантированной мышам 8СГО, после лечения антителом 146В7 (панель С), С§А (панель В) или носителем (панель А). Через 3 недели после трансплантации мыши получали РВ8 (плацебо), С§А (циклоспорин А) (δαηάοζ) в дозе 10 мг/кг каждый второй день в течение 15 дней или 146В7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и из каждого ксенотрансплантата брали пункционную биопсию размером 4 мм. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали ядерным антигеном Κί-67.

На фиг. 17 представлен график, показывающий связывание антитела 146В7 с ИЛ-15, связанным с рецептором. Платы покрывают ИЛ-15Ка и инкубируют с ИЛ-15. Через 10 мин в лунки добавляют биотинилированное 146В7. Связывание 146В7 с ИЛ-15, связанным с рецептором, определяют при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЬ18А.

На фиг. 18 представлен график, показывающий связывание антитела 146В7 с ИЛ-15 после связывания ИЛ-15 с его рецептором, экспрессированным на клетках Кар. После инкубирования в течение 10 мин клеток Кар, экспрессирующих ИЛ-15К, с ИЛ-15 к клеткам добавляли биотинилированное 146В7. Связывание 146В7 с ИЛ-15, связанным с рецептором, определяют посредством анализа с использованием ЕАС8 (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном изобретении представлены новые лекарственные препараты на основе антител для лечения и диагностики ряда нарушений, опосредованных ИЛ-15 (т.е. нарушений, вызываемых провоспалительными эффектами ИЛ-15). Как используют в данном контексте, термин провоспалительные эффекты ИЛ-15 включает любой гуморальный или опосредованный клетками иммунный ответ, индуцируемый ИЛ-15, такой как продукция ΤΝΕ-α и других воспалительных медиаторов и рекрутирование/пролиферация Τ-клеток. В лекарственных препаратах, соответствующих изобретению, используют выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом, присутствующим на ИЛ-15.

В одном из вариантов осуществления человеческие антитела образуются в организме трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, способной продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, 1дС, 1дА и/или 1дЕ) путем рекомбинации У-Э-1 и переключения изотипа. Соответственно различные аспекты изобретения включают антитела и их фармацевтические композиции, а также трансгенных животных, отличных от человека, В-клетки, трансфектомы клетки-хозяина и гибридомы для получения данных моноклональных антител. Изобретение охватывает также способы применения антител, соответствующих изобретению, для детекции клеток, с которыми связан ИЛ-15, и/или для подавления функций, опосредованных ИЛ-15 либо ίη νίίτο, либо ίη νίνο. Включены также способы создания направленности агентов на клетки, с которыми связан ИЛ-15.

Для того чтобы было легче понять данное изобретение, сначала дают определение некоторым терминам. Дополнительные определения представлены во всем тексте детального описания.

Термины ИЛ-15, антиген ИЛ-15 и интерлейкин 15 взаимозаменяемо используют в данном контексте, и они включают любые варианты и изоформы, которые в естественных условиях экспрессируются клетками.

Термин антитело, рассматриваемый в данном контексте, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающую часть) или одну цепь антитела. Термин антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном контексте как УН) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном контексте как УЪ) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена СЬ. Области УН и УЪ могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (СЭК), которые перемежаются с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными (скелет

- 8 015897 ными) сегментами (ЕЯ). Каждая из УН и УЪ состоит из трех СЭЯ и четырех ЕЯ, организованных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: ЕЯ1, СЭРЕ ЕЯ2, СЭЕ2. ЕЯ3, СЭЯЗ. ЕЯ4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен. который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина. включающими различные клетки иммунной системы (например. эффекторные клетки) и первым компонентом (С1с|) классической системы комплемента.

Термин антигенсвязывающая часть антитела (или просто часть антитела). как используют в данном контексте. относится к одному или более фрагментам антитела. которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например. ЕСЕЯ). Показано. что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов. охватываемые термином антигенсвязывающая часть антитела. включают:

(ί) фрагмент ЕаЬ - моновалентный фрагмент. состоящий из доменов УЪ. УН. СЬ и СН1;

(ίί) фрагмент Е(аЬ')₂ - бивалентный фрагмент. содержащий два фрагмента ЕаЬ. связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области;

(ίίί) фрагмент Е6. состоящий из доменов УН и СН1;

(ίν) фрагмент Еу. состоящий из доменов УЪ и УН одного плеча антитела;

(ν) фрагмент 6ЛЬ (см. статью \Уаг6 с1 а1.. №1Шге. 341: 544-546 (1989)). который состоит из домена УН; и (νί) выделенный гипервариабельный участок (СОЯ) или (νίί) комбинацию двух или более выделенных СОЯ. которые необязательно могут быть связаны с синтетическим линкером.

Более того. хотя два домена фрагмента Еу. УЬ и УН. кодируются разными генами. они могут быть связаны с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером. который делает возможным получить их в виде одной белковой цепи. в которой области УЪ и УН связывают попарно с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Еу (ксЕу); см.. например. статьи Βιγ6 и соавт.. 8с1епсе. 242:423-426 (1988) и Нийоп и соавт.. Ргос. ИаН. Асаб. 8с1. И8А. 85:5879-5883 (1988)). Предусматривается. что данные одноцепочечные антитела также охватываются термином антиген-связывающая часть антитела. Данные фрагменты антитела получают с использованием принятых технологий. известных компетентным специалистам в области техники. и проводят скрининг фрагментов на возможность применения таким же образом. что интактные антитела.

Термин моноклональное антитело. как используют в данном контексте. относится к антителу. которое проявляет одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Соответственно термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам. проявляющим одну связывающую специфичность. которые имеют вариабельную и константную области. выделенные из последовательностей иммуноглобулина человеческих зародышевых линий. В одном из воплощений изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой. которая включает Вклетку. полученную от трансгенного животного. отличного от человека. например трансгенной мыши. геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи. слитую с иммортализованной клеткой.

Термин рекомбинантное человеческое антитело. как используют в данном контексте. предусматривает включение всех человеческих антител. которые получены. экспрессированы. созданы или выделены рекомбинантными способами. такими как: (а) антитела. выделенные у животного (например. мыши). которая является трансгенной или трансхромосомной по генам человеческого иммуноглобулина. или из гибридомы. полученной из него (описано далее в разделе I. ниже). (Ь) антитела. выделенные из клетки-хозяина. трансформированной таким образом. чтобы она экспрессировала антитело. например. из трансфектомы. (с) антитела. выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител. и (6) антитела. полученные. экспрессированные. созданные или выделенные любыми другими способами. которые включают сплайсинг последовательностей гена человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Данные рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области. выделенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако в ряде вариантов осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться мутагенезу ίη νίίτο (или при использовании животного. трансгенного по последовательностям человеческого 1д. соматическому мутагенезу ίη νίνο). и таким образом последовательности аминокислот областей УН и УЪ рекомбинантного антитела представляют собой последовательности. которые. хотя и выделены из последовательностей УН и УЪ человеческой зародышевой линии и близки им. могут не существовать в природных условиях в репертуаре человеческих антител зародышевой линии ίη νίνο.

Как используют в данном контексте. термин гетерологичное антитело определяют относительно трансгенного организма. отличного от человека. продуцирующего данное антитело. Термин относится к антителу. имеющему последовательность аминокислот или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. соответствующую последовательностям. обнаруженным в организме. который не является трансгенным животным. отличным от человека. и. как правило. выделенному у животного

- 9 015897 другого вида, чем трансгенное животное, отличное от человека.

Термин выделенное антитело, как используют в данном контексте, предназначен для определения антитела, которое практически не содержит другие антитела, имеющие отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с ИЛ-15, практически не содержит антитела, которые специфически связываются с антигенами, отличными от ИЛ-15). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом ИЛ-15, может, однако, обладать перекрестной реактивностью с другими подобными цитокинами или другими белками ИЛ-15, выделенными у других видов. Однако антитело всегда предпочтительно связывается с человеческим ИЛ-15. Кроме того, выделенное антитело, как правило, практически не содержит другой клеточный материал и/или химические вещества.

В одном из вариантов осуществления изобретения комбинацию выделенных моноклональных антител с различными специфичностями в отношении ИЛ-15 смешивают в хорошо определенной композиции.

Как используют в данном контексте, термин специфическое связывание относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью (К_с) меньше чем приблизительно 10^-7 М, такой как меньше чем приблизительно 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже при определении с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РК.) с помощью прибора В1АСОКЕ 3000, при использовании рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда. При этом антитело связывается с заданным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, В8А, бычьим сывороточным альбумином, казеином), отличным от заданного антигена, или близкородственного антигена. Выражения антитело, распознающее антиген и антитело, специфическое в отношении антигена используют в данном контексте взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.

Термин К_с, как используют в данном контексте, предназначен для определения константы диссоциации взаимодействия конкретного антитела и антигена.

Как используется в данном контексте, термин изотип относится к классу антител (например, 1дМ или 1дС1). кодируемых генами константной области тяжелой цепи.

Как используется в данном контексте, термин переключение изотипа относится к феномену, вследствие которого класс, или изотип, антитела переходит из одного класса 1д в другие классы 1д.

Как используется в данном контексте, термин непереключенный изотип относится к изотипическому классу тяжелой цепи, который образуется, когда не происходит никакого переключения изотипа; ген СН, кодирующий непереключенный изотип, как правило, представляет собой первый ген СН, расположенный по ходу транскрипции сразу после функционального реаранжированного гена УЭБ

Переключение изотипа классифицируют как классическое и неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит посредством рекомбинационных событий, которые затрагивают по меньшей мере один участок переключающей последовательности в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, путем гомологичной рекомбинации между σ_μ человека и Σ_μ человека (δ-ассоциированная делеция). Возможно существование и осуществление переключения изотипа посредством альтернативных неклассических механизмов, таких как (среди прочих) интертрансгенная и/или интерхромосомная рекомбинация.

Как используется в данном контексте, термин переключающая последовательность относится к таким последовательностям ДНК, которые отвечают за переключающую рекомбинацию. Последовательность донора переключения, как правило, μ-участок переключения, будет расположена 5' (т.е. выше по ходу транскрипции) участка конструкции, который должен подвергнуться делеции при переключающей рекомбинации. Участок акцептора переключения будет находиться между константной областью, которая должна быть подвергнута делеции, и замещающей константной областью (например, γ, ε и т.п.). В связи с отсутствием специфического сайта, в котором всегда происходит рекомбинация, конечную последовательность гена, как правило, нельзя будет предсказать, исходя из конструкции.

Как используется в данном контексте, термин тип гликозилирования определяют как тип углеводных молекул, которые ковалентно связываются с белком, в частности с белком иммуноглобулина. Тип гликозилирования гетерологичного антитела может быть охарактеризован как в значительной степени близкий типам гликозилирования, которые существуют в естественных условиях на антителах, продуцируемых видами трансгенных животных, отличных от человека. При этом обычный компетентный специалист в данной области определил бы тип гликозилирования гетерологичного антитела, как более близкий к указанному типу гликозилирования у видов трансгенного животного, отличного от человека, чем у видов организмов, из которых были выделены гены СН трансгена.

Термин природный, как используется в данном контексте применительно к объекту, относится к тому факту, что объект можно обнаружить в естественных условиях. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая

- 10 015897 может быть выделена из природного источника и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной.

Термин реаранжированный, как используется в данном контексте, относится к конфигурации локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, где положение сегмента V находится в непосредственной близости к сегменту Ό-1 или 1 в конформации, кодирующей в основном полный домен νΗ или АЬ соответственно. Реаранжированный локус гена иммуноглобулина может быть идентифицирован путем сравнения с ДНК зародышевой линии, реаранжированный локус будет содержать по меньшей мере один подвергнувшийся рекомбинации гептамерный/нонамерный гомологичный элемент.

Термин нереаранжированный или конфигурация зародышевой линии, как используется в данном контексте в отношении сегмента V, относится к конфигурации, в которой сегмент V не подвергся рекомбинации, при которой он находился бы в непосредственной близости к сегменту Ό или 1.

Термин молекула нуклеиновой кислоты, как используется в данном контексте, предусматривает включение молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двунитевой, но предпочтительно представлена двунитевой ДНК.

Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты, как используют в данном контексте применительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например, ν_Η, СЭКЗ), которые связываются с ИЛ-15, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или части антител, которые связываются с антигенами, отличными от ИЛ-15. При этом данные другие последовательности могут в естественных условиях фланкировать указанную нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. 8ЕО ГО N0: 1-4 соответствуют нуклеотидным и аминокислотным последовательностям, содержащим вариабельные области тяжелой цепи (ν_Η) и легкой цепи (Ур человеческого антитела 146В7 против ИЛ-15, соответствующего изобретению. В частности, 8Е0 ГО N0: 1 и 2 соответствуют ν_Η антитела 146В7, 8Е0 ГО N0: 3 и 4 соответствуют V,. антитела 146В7.

Данное изобретение охватывает также консервативные модификации последовательности, касающиеся последовательностей, представленных в 8Е0 ГО N0: 1-4, т.е. модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не оказывают существенного воздействия или не изменяют характеристик связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Данные консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации могут быть интродуцированы в 8Е0 ГО N0: 1-4 посредством стандартных технологий, известных в области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР (полимеразная цепная реакция)опосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот включают замены, при которых остаток аминокислоты заменяют остатком аминокислоты, имеющим аналогичную боковую цепь. В области техники определены семейства остатков аминокислот, имеющих аналогичные боковые цепи. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный остаток неосновной аминокислоты в человеческом антителе против ИЛ-15 предпочтительно заменяют другим остатком аминокислоты из того же семейства боковых цепей.

Альтернативно, в другом варианте осуществления возможна интродукция мутаций случайным образом на протяжении всей последовательности, кодирующей антитело против ИЛ-15, или ее части, в частности, путем насыщающего мутагенеза, и может быть проведен скрининг полученных в результате модифицированных антител против ИЛ-15 на активность связывания.

Соответственно антитела, кодируемые нуклеотидными последовательностями (вариабельной области тяжелой и легкой цепей), описанными в данном контексте, и/или содержащие аминокислотные последовательности (вариабельной области тяжелой и легкой цепи), описанные в данном контексте (т.е. 8Е0 ГО N0: 1-4), включают практически аналогичные антитела, кодируемые близкими последовательностями или содержащие близкие последовательности, которые были консервативно модифицированы. Ниже приведено дальнейшее обсуждение, касающееся того, как можно получить практические аналогичные антитела на основе частичных последовательностей (т.е. вариабельных областей тяжелой и легкой цепей), представленных в данном контексте как 8Е0 ГО N0: 1-4.

Для нуклеиновых кислот термин существенная гомология показывает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными (при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов) по меньшей мере приблизительно на 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98-99,5% нуклеотидов. Альтернативно, имеется

- 11 015897 существенная гомология, когда сегменты гибридизуются в условиях селективной гибридизации с комплементом нити.

Для последовательностей аминокислот термин гомология показывает степень идентичности между двумя последовательностями аминокислот, когда их оптимальным образом выравнивают и сравнивают с соответствующими инсерциями и делециями.

Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = числу идентичных положений/общее число положений х 100), с учетом числа гэпов (двунитевых разрывов) и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального элайнмента (способа сравнения с использованием выравнивания последовательностей) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществить с использованием математического алгоритма, как описано ниже в неограничивающих примерах.

Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью программы САР в пакете программного обеспечения ССС (см. ййр://те^ет.дсд.сот) при использовании матрицы Ы^Здарйпа.СМР и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с использованием алгоритма, предложенного Е. Меуегк и МШет (см. САВЮ8, 4:11-17 (1988)), введенные в программу АЫСЫ (версия 2.0), с использованием таблицы весов остатков РАМ 120, поправочного коэффициента длины гэпа 12 и поправочного коэффициента гэпа 4. Кроме того, можно определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей, используя алгоритм Ыеей1етап и ^ипксй (см. 1. Мо1. ΒίοΙ., 48:444-453 (1970)), введенный в программу САР в пакете программного обеспечения ССС (см. ййр://^тете.дсд.сот) при использовании либо матрицы В1о88ит 62, либо матрицы РАМ250 и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Кроме того, последовательности нуклеиновых кислот и белков, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы в качестве запрашивающей последовательности для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, с целью идентификации близких последовательностей. Такой поиск может быть предпринят с использованием программ ЫВБА8Т и ХВБА8Т (версия 2.0), представленных в работе АЙ8сйи1 и соавт., 1. Мо1. Вю1., 215:403-10 (1990). Поиск нуклеотидов ВБА8Т может быть осуществлен с помощью программы ЫВБА8Т (сумма баллов = 100, длина слова = 12) с целью получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, соответствующих изобретению. Поиск белка ВБА8Т можно выполнить с помощью программы ХВБА8Т (сумма баллов = 50, длина слова = 3) с целью получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам, соответствующим изобретению. Для получения выровненных последовательностей с гэпами с целью проведения сравнения можно использовать Саррей ВБА8Т, как описано в статье А1йсйи1 и соавт., Ыис1е1с АаЙ5 Кек., 25 (17):3389-3402 (1997). При использовании программ ВБА8Т и Саррей ВБА8Т могут быть использованы параметры умолчания соответствующих программ (например, ХВБА8Т и ЫВЬАЗТ), см. 1Шр://\\л\лу.псЫ.п1т.ш11.доу.

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в лизатах клеток или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновая кислота считается выделенной или практически чистой, когда она очищена от других клеточных компонентов или иных примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков стандартными методиками, включая обработку щелочью/8Б8 (додецилсульфатом натрия), разделение при центрифугировании в градиенте СкС1, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методики, хорошо известные в области техники. См. монографию под ред. Е. Аи8иЬе1 и соавт. Современные методы молекулярной биологии (Ситтеп! Рто1осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду), Сгеепе РиЫщЫпд апй \Уйеу 1п1ет8с1епсе, №\ν Уогк (1987).

Для получения последовательностей генов композиции нуклеиновых кислот, соответствующие данному изобретению, зачастую в нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), из кДНК, геномной ДНК или их смесей, могут быть подвергнуты мутированию согласно стандартным методикам. В кодирующих последовательностях данные мутации могут, если это желательно, затрагивать аминокислотную последовательность. В частности, имеются в виду последовательности ДНК с существенной гомологией или выделенные из нативных последовательностей V, Ό, 1, константных, переключающих или других последовательностей, описанных в данном контексте (в данном случае выделенный означает, что последовательность является идентичной другой последовательности или ее модифицированной формой).

Нуклеиновая кислота считается функционально связанной, когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер являются функционально связанными с кодирующей последовательностью, если они воздействуют на транскрипцию данной последовательности. Касательно последовательностей регуляции транскрипции, термин функционально связанные означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, прилегают друг к другу и, при необходимости соединения двух участков, кодирующих белки, прилегают друг к другу и находятся в рамке считывания. Для переключающих последовательностей быть функционально связанными означает, что последовательности способны к осуществлению переключающей

- 12 015897 рекомбинации.

Термин вектор, как используют в данном контексте, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Одним из типов вектора является плазмида, что означает кольцевую петлю двунитевой ДНК, с которой можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представлен вирусным вектором, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина посредством интродукции в клетку-хозяин и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Данные векторы определяют в данном контексте как рекомбинантные экспрессионные векторы (или просто экспрессионные векторы). Как правило, экспрессионные векторы, используемые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто представлены плазмидными формами. В данном описании термины плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Однако изобретение предусматривает включение других форм экспрессионных векторов, таких как вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые осуществляют эквивалентные функции.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин), как используют в данном контексте, предназначен для определения клетки, в которую интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что данные термины предназначены не только для определения данной конкретной клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут произойти определенные модификации либо вследствие мутаций, либо под воздействием окружающей среды, данное потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, но может еще быть включено в объем термина клетка-хозяин, как используют в данном контексте.

Как используют в данном контексте, термин субъект включает любого человека или отличное от человека животное. Например, способы и композиции, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для лечения субъекта с воспалительным заболеванием, таким как артрит, например ревматоидный артрит. Термин животное, отличное от человека включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова, курицы, амфибии, рептилии и т. п.

В последующих подразделах различные аспекты изобретения описаны более детально.

I. Получение человеческих антител к ИЛ-15.

Человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, можно получить с использованием множества известных технологий, таких как стандартная технология гибридизации соматических клеток КоЫег и МПк1еш (см. МШис. 256:495 (1975)). Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе могут быть использованы другие технологии получения моноклональных антител, например трансформация В-лимфоцитов вирусами или онкогенами, технология представления на фагах с использованием библиотек генов человеческих антител.

Предпочтительной системой получения гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, на основе является система на основе мышей или крыс. Получение гибридомы с использованием мышей хорошо известно в области техники, включая протоколы иммунизации и технологии выделения и слияния иммунизированных спленоцитов.

В одном из вариантов осуществления человеческие моноклональные антитела, направленные против ИЛ-15, получают с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, а не мышиной системы. В одном из вариантов осуществления в изобретении используют трансгенных мышей, обозначаемых в данном контексте как мыши НиМАЬ, которые содержат минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, кодирующие нереаранжированные последовательности тяжелой (μ и γ) и κ-легкой цепей иммуноглобулина, а также направленные мутации, которые инактивируют эндогенные локусы μ- и κ-цепей (см. статью ЬопЬегд и соавт., №1иге, 368 (6474):856-859 (1994)). Соответственно у мышей проявляется пониженная экспрессия мышиного 1дМ или κ, и в ответ на иммунизацию интродуцированные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепей подвергаются переключению класса и соматической мутации с образованием высокоаффинных человеческих моноклональных антител 1дСк (см. статью ЬопЬегд N. и соавт., кирга (1994); обзор в монографии ЬопЬегд, N. Справочник по экспериментальной фармакологии (НапбЬоок о! Ехрепшеп1а1 Рйагшасо1оду) 113:49-101 (1994); статьи ЬопЬегд N. и Никхаг Ό., 1п1егп. Веу. 1тшипо1., т. 13:65-93 (1995) и Нагбшд Б. и ЬопЬегд N. Αηη. N. Υ. Асаб. 8ск, 764:536-546 (1995)). Получение мышей НиМАЬ детально описано в разделе II ниже и в работах Тау1ог Ь. и соавт., М.1с1е1с Ас1бк Векеагсй, 20:6287-6295 (1992); Сйеп 1. и соавт., 1п1етайопа1 1тшипо1оду, 5:647-656 (1993); ТиаШоп и соавт., Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 90:3720-3724 (1993); СЬог и соавт., ХаИие Сепейск, 4:117-123 (1993); Сйеп 1. и соавт., ЕМВО 1., 12:821

- 13 015897

830 (1993); ТиаШоп и соавт., 1. 1ттипо1., 152:2912-2920 (1994); ЬопЬегд и соавт., Ыа1иге, 368 (6474):856859 (1994); ЬопЬегд Ν., Справочник по экспериментальной фармакологии (НапбЬоок о£ Ехрептеп!а1 Рйагтасо1оду) 113:49-101 (1994); Тау1ог Ь. и соавт., 1п1егпайопа1 1ттцпо1оду, 6:579-591 (1994); ЬопЬегд N. и Никхаг И., 1п1егп. Кет. 1ттипо1., т. 13:65-93 (1995); Нагбшд Р. и ЬопЬегд Ν., Апп. N. Υ. Асаб. 8ск, 764:536-546 (1995); Ρίκ1ι\νί1ά И. и соавт., №1Шге В1о1есйпо1оду, 14:845-851 (1996). Кроме того, см. патенты США №№ 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5789650, 5877397, 5661016, 5814318, 5874299 и 5770429, все из которых выданы ЬопЬегд и Кау и СепРйагт 1п1ета1юпа1, патент США № 5545807, выданный 8игаш и соавт.; международная публикация №№ νθ 98/24884, опубликованная 11 июня 1998 г., νθ 94/25585, опубликованная 10 ноября 1994 г., νθ 93/1227, опубликованная 24 июня 1993 г., νθ 92/22645, опубликованная 23 декабря 1992 г., νθ 92/03918, опубликованная 19 марта 1992 г. В частности, получение трансгенных мышей НиМаЬ НСО12 описано в примере 2.

Иммунизации.

Для генерации полностью человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина (например, мышей НСо12, НСо7 или КМ) можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15, как описано, например, в статьях ЬопЬегд и соавт., №1Шге. 368 (6474):856-859 (1994); Ρίκ1ι\νί1ά и соавт., №1Шге Вю1есйпо1оду, 14:845-851 (1996) и в публикации νθ 98/24884. Альтернативно, мыши могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческий ИЛ-15. Предпочтительно, когда для первого вливания используют мышей в возрасте 6-16 недель. Например, очищенный или обогащенный препарат (5-50 мкг) антигена ИЛ-15 может быть использован для внутрибрюшинной иммунизации мышей НиМАЬ. В случае, когда иммунизации с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена ИЛ-15 не приводят к образованию антител, мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими ИЛ-15, например клеточной линией, с целью стимуляции иммунных ответов. Обобщенный опыт работы с различными антигенами показывает, что трансгенные мыши НиМАЬ дают наилучший ответ при изначальной внутрибрюшинной (1Р) или подкожной (8С) иммунизации антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующими еженедельными 1Р/8С иммунизациями (в целом до 10 раз) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунный ответ можно мониторировать в ходе протокола иммунизации с использованием образцов плазмы, получаемых при отборе крови из ретроорбитальной вены. Проводят скрининг образцов плазмы с помощью ЕЬ18А (как описано ниже) и мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина против ИЛ-15 используют для слияний. Мышам проводят бустерную иммунизацию путем внутривенного введения антигена за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки.

Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15.

Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15, спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированной мыши могут быть выделены и слиты с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Затем проводят скрининг полученных гибридом на продукцию антигенспецифических антител. Например, суспензии отдельных клеток лимфоцитов селезенки, полученных от иммунизированных мышей, сливают с несекретирующими клетками мышиной миеломы 8Р2/0-АО8.653 (АТСС (Американская коллекция типовых культур), СКЕ 1580) с использованием 50% РЕО (мас./об.). Клетки в концентрации приблизительно 1х 10⁵ помещают в плоскодонные платы для микротитрования с последующим инкубированием в течение двух недель в селективной среде, содержащей кроме обычных реагентов 10% эмбриональной С1опе 8егит (сыворотки для клонирования), 5-10% фактора клонирования гибридом огщеп (ΙΟΕΝ) и 1хНАТ (среда ГАТ, содержащая гипоксантин-аминоптерин-тимидин) (81дта). Приблизительно через две недели клетки можно культивировать в среде, где НАТ заменена НТ (среда ГТ, содержащая гипоксантин-тимидин). Затем проводят скрининг отдельных лунок с помощью ЕЫ8А на человеческие моноклональные антитела 1дМ и 1дО против ИЛ-15. Как правило, после начала сильного роста гибридом среду исследуют через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, переносят на другие платы, снова проводят скрининг и, если они остаются положительными в отношении человеческих моноклональных антител 1дС против ИЛ-15, их субклонируют, по меньшей мере, дважды путем ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны культивируют ш ν 11го в среде для культур тканей с целью получения антитела для характеризации.

Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15.

Человеческие антитела, соответствующие изобретению, также можно получить в трансфектоме клетки-хозяина при использовании, например, комбинации технологии рекомбинантной ДНК и способов трансфекции гена, как это хорошо известно в области техники (см. статью Моткоп 8., 8аепсе, 229:1202 (1985)).

Например, в одном из вариантов осуществления ген(ы), представляющий интерес, в частности гены человеческого антитела, могут быть лигированы в экспрессионный вектор, такой как эукариотическая экспрессионная плазмида, такая как используют в системе экспрессии гена 08, описанной в публикациях νθ 87/04462, νθ 89/01036 и ЕР 338841, или других экспрессионных системах, хорошо из

- 14 015897 вестных в области техники. Очищенную плазмиду с клонированными генами антитела интродуцируют в эукариотические клетки-хозяева, например клетки СНО или клетки N80, или, альтернативно, в другие эукариотические клетки, например клетки, выделенные из растений, грибов или дрожжей. Способ, используемый для интродукции данных генов, может быть представлен способами, описанными в области техники, такими как электропорация, использование липофектина, липофектамина или иными способами. После интродукции данных генов антител в клетки-хозяева можно идентифицировать и селектировать клетки, экспрессирующие антитело. Данные клетки представляют собой трансфектомы, которые затем могут быть размножены на основе уровня экспрессии и масштабированы для получения антител. Из супернатантов и/или клеток данных культур можно выделить и очистить рекомбинантные антитела.

Альтернативно, данные клонированные гены антител можно экспрессировать в других экспрессионных системах, таких как Е. сой или целые организмы, или они могут быть экспрессированы синтетическим путем.

Использование частичной последовательности антитела для экспрессии интактных антител.

Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, которые находятся в шести гипервариабельных участках (СИР.) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности внутри СЭК являются более разнообразными среди отдельных антител, чем последовательности вне СЭК. Поскольку последовательности СЭК отвечают за большинство взаимодействий антитела и антигена, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител путем конструирования экспрессионных векторов, которые включают последовательности СЭК из специфического природного антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, статьи Ктесйтаии Ь. и соавт., №1иге, 332:323-327 (1998); 1оие8 Р. и соавт., №1иге, 321:522-525 (1986) и Оиееп С. и соавт., Ргос. Ναΐί. Асаб. 8с1. И.8.А., 86:10029-10033 (1989)). Данные каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Данные последовательности зародышевой линии будут отличаться от последовательностей генов зрелого антитела, поскольку они не будут включать полностью собранные вариабельные гены, которые формируются путем связывания У(И)1 в процессе созревания В-клеток. Последовательности генов зародышевой линии также будут отличаться от последовательностей высокоаффинного антитела из вторичного репертуара характерным равномерным расположением в вариабельной области. Например, соматические мутации относительно редко встречаются в аминоконцевой части каркасного сегмента. В частности, соматические мутации относительно редко встречаются в аминоконцевой части каркасного сегмента 1 и в карбоксиконцевой части каркасного сегмента 4. Более того, многие соматические мутации не изменяют существенным образом связывающие свойства антитела. В связи с этим нет необходимости в получении полной последовательности ДНК конкретного антитела с целью воссоздания интактного рекомбинантного антитела, имеющего свойства связывания, аналогичные данным свойствам исходного антитела (см. публикацию РСТ/И8 99/05535, зарегистрированную 12 марта 1999 г.). Как правило, для этой цели является достаточным охват участков СЭК частичных последовательностей тяжелой и легкой цепей. Частичную последовательность используют для определения, какие вариабельные и связывающие сегменты генов зародышевой линии участвуют в образовании вариабельных генов рекомбинированного антитела. Кроме того, последовательность зародышевой линии используют для заполнения утраченных частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи расщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в формирование свойств конечного антитела. Для восполнения утраченных последовательностей клонированные последовательности кДНК можно комбинировать с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или ПЦР-амплификации. Альтернативно, целая вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и скомбинирована посредством ПЦР-амплификации с целью создания полностью синтетического клона вариабельной области. Данный процесс обладает рядом преимуществ, таких как элиминация или включение определенных сайтов рестрикции или оптимизация определенных кодонов. Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей из гибридом используют для конструирования перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов с целью создания синтетических Vпоследовательностей со способностями кодирования аминокислот, идентичными способностям природных последовательностей. Синтетические последовательности тяжелой и κ-цепи могут отличаться от природных последовательностей по трем направлениям: цепи повторяющихся нуклеотидных оснований прерывают для облегчения синтеза олигонуклеотидов и ПЦР-амплификации, инкорпорируют оптимальные сайты инициации трансляции согласно правилам Кохак (см. статью Кохак, 1. ΒίοΙ. Сйет., 266Ы9867019870 (1991)) и конструируют сайты Ηίη6ΙΙΙ, расположенные выше по ходу транскрипции относительно сайтов инициации трансляции.

Для оптимизированного кодирования и соответствующего некодирования вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепи последовательности цепей разбивают на фрагменты из 30-50 нуклеотидов примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для ка

- 15 015897 ждой цепи можно собрать олигонуклеотиды в перекрывающиеся двунитевые наборы, которые заполняют сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем пулы используют как матрицы для получения продуктов ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые раздельно амплифицируют с получением двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Затем данные перекрывающиеся продукты комбинируют путем ПЦРамплификации с образованием полной вариабельной области. Для создания фрагментов, легко клонируемых в конструкции экспрессионных векторов, может быть также желательным включение в ПЦРамплификацию перекрывающегося фрагмента константной области тяжелой или легкой цепи (в том числе сайта ВЬЛ κ-легкой цепи или сайта Лде1 γ-тяжелой цепи).

Затем реконструированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей смешивают с клонированными промотором, лидерной последовательностью, последовательностью инициации трансляции, лидерной последовательностью, последовательностями константной области, З'-нетранслируемого участка, участка полиаденилирования и терминации транскрипции с целью формирования конструкций экспрессионного вектора. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепей могут быть скомбинированы в одном векторе, котрансфицированы, серийно трансфицированы или раздельно трансфицированы в клетки-хозяева, которые затем сливают с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи.

Плазмиды, используемые в конструкциях экспрессионных векторов для человеческого 1дС-к. описаны ниже (см. пример 1). Плазмиды сконструированы таким образом, чтобы ПЦРамплифицированные последовательности кДНК У-тяжелой и У-к-легкой цепей можно было бы использовать для реконструкции минигенов полной тяжелой и легкой цепей. Данные плазмиды могут быть использованы для экспрессии полностью человеческих антител 1дС1-к или 1дС4-к. Полные человеческие и химерные антитела, соответствующие данному изобретению, включают также антитела 1дС2, 1дС,3 1дЕ, 1дЛ, 1дМ и Ι§Ό. Могут быть сконструированы подобные плазмиды для экспрессии других изотипов тяжелых цепей или для экспрессии антител, содержащих λ-легкие цепи.

Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные свойства человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих изобретению (146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4), используют для создания структурно близких человеческих антител против ИЛ-15, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител, соответствующих изобретению, такое как связывание с ИЛ-15. В частности, один или более участков СЭК 146В7,147Н5, 404А8 и 404Е4 могут быть скомбинированы рекомбинантным образом с известными человеческими каркасными сегментами и СИР. для создания дополнительных, рекомбинантно-инжнерных человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих изобретению.

Соответственно в другом варианте осуществления изобретение представляет способ получения антитела против ИЛ-15, предусматривающий получение антитела, содержащего: (1) каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи и СЭК человеческой тяжелой цепи, где по меньшей мере один из СИК человеческой тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СИК, представленных на фиг. 2 (или соответствующих аминокислотных остатков в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2), и (2) каркасные сегменты человеческой легкой цепи и СИК человеческой легкой цепи, где по меньшей мере один из СИК человеческой легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СИК, представленных на фиг. 3 (или соответствующих аминокислотных остатков в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4), где антитело сохраняет способность связываться с ИЛ-15.

Способность антитела связывать ИЛ-15 можно установить с использованием стандартных анализов связывания, таких как приведенные в примерах (например, ЕШЗА).

Поскольку в области техники хорошо известно, что домены СИКЗ тяжелой и легкой цепей антитела играют исключительно важную роль в специфичности связывания/аффиности антитела к антигену, рекомбинантные антитела, соответствующие изобретению, полученные как представлено выше, предпочтительно содержат СИКЗ тяжелой и легкой цепей 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Кроме того, антитела могут содержать СИК2 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Далее антитела могут содержать СИК1 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Кроме того, антитела могут содержать любые комбинации СОК.

Соответственно в другом варианте осуществления изобретение далее представляет антитела против ИЛ-15, содержащие: (1) каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи, участок СЭК1 человеческой тяжелой цепи, участок СЭК2 человеческой тяжелой цепи и участок СЭКЗ человеческой тяжелой цепи, где участок СЭКЗ человеческой тяжелой цепи выбран из СЭКЗ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4, например представлен участком СОК человеческой тяжелой цепи 146В7, как показано на фиг. 2 (или соответствующими аминокислотными остатками в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2), и (2) каркасные сегменты человеческой легкой цепи, участок ί.ΌΕ1 человеческой легкой цепи, участок СЭК2 человеческой легкой цепи и участок СЭКЗ человеческой легкой цепи, где участок СЭКЗ человеческой легкой цепи выбран из СЭКЗ 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4, например представлен участком СОК человеческой тяжелой цепи 146В7, как показано на фиг. З (или соответствующими аминокислотными остатками в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4).

- 16 015897

При этом антитело связывает ИЛ-15. Кроме того, антитело может содержать СЭК2 тяжелой цепи и/или СЭК2 легкой цепи 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4. Далее антитело может содержать СЭК1 тяжелой цепи и/или СЭК1 легкой цепи 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4.

Участки СЭКЕ 2 и/или 3 вышеописанных инженерных антител содержат точно такую же аминокислотную последовательность(и), как у 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4, представленные в данном контексте. Однако обычный компетентный специалист примет во внимание возможность некоторого отклонения от точных последовательностей СОК 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 при сохранении способности антитела эффективно связывать ИЛ-15 (например, консервативные модификации последовательностей). Соответственно в другом варианте осуществления инженерное антитело может состоять из одного или более СОК, которые, например, на 90, 95, 98 или 99,5% идентичны одному или более СОК 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4.

Кроме того, для простого связывания ИЛ-15 инженерные антитела, такие как описано выше, могут быть отобраны на основании их удерживания или других функциональных свойств антител, соответствующих изобретению, таких как:

(1) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование индуцированных ИЛ-15 провоспалительных эффектов;

(2) ингибирование индуцированной ИЛ-15 продукции ТИЕ-а или пролиферации Т-клеток;

(3) связывание человеческого ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (К_с) меньше чем приблизительно 10^-7 М при определении с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РК) с помощью прибора ВIАС0КЕ 3000 с использованием рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда;

(4) связывание эпитопа, находящегося на домене ИЛ-15, взаимодействующем с β-и/или γ-цепью;

(5) нарушение связывания А§р8 человеческого ИЛ-15 с β-субъединицей рецептора человеческого ИЛ-15 и/или 01η 108 человеческого ИЛ-15 с γ-субъединицей рецептора человеческого ИЛ-15;

(6) связывание человеческого ИЛ-15, связанного с рецептором;

(7) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать паракератоз;

(8) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать утолщение эпидермиса;

(9) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать пролиферацию кератиноцитов и/или (10) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать хемотаксис активированных лейкоцитов.

Характеризация связывания человеческих моноклональных антител с ИЛ-15.

Человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, могут быть охарактеризованы по связыванию с ИЛ-15 с использованием множества известных методик. Как правило, изначально антитела характеризуют с использованием ЕЫ8А. Вкратце, платы для микротитрования покрывают очищенным ИЛ-15 в РВ8 (фосфатно-буферном растворе), а затем блокируют несоответствующими белками, такими как бычий сывороточный альбумин (В8А), разведенными в РВ8. В каждую лунку вносят разведения плазмы мышей, иммунизированных ИЛ-15, и инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С. Платы промывают РВ8/Твином 20, а затем инкубируют с козьим Ес-специфическим поликлональным реагентом против человеческого Ι§Ο, конъюгированным с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После отмывания платы проявляют с использованием субстрата АВТ8 и анализируют при 0Ό (оптическая плотность) 405. Предпочтительно использование для слияний мышей, имеющих максимальные титры.

Способ ЕЫ8А, как описано выше, также может быть использован для скрининга антител, и, следовательно, гибридом, которые продуцируют антитела, проявляющие положительную реактивность с иммуногеном ИЛ-15. Гибридомы, которые (предпочтительно с высокой аффинностью) связываются с ИЛ-15, затем субклонируют и характеризуют дополнительно. Один клон каждой гибридомы, который сохраняет реактивность родительских клеток (по данным ЕЫЗА), затем может быть выбран для создания банка клеток и очистки антитела.

Для очистки человеческих антител против ИЛ-15 отобранные гибридомы выращивают в роллерных флаконах, двухлитровых роллерных колбах или в других системах для культивирования. Перед проведением аффинной хроматографии с использованием белка А-сефарозы (Рйагтааа, Р18са1а^ау, N1) супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы. После замены буферного раствора на РВ8 концентрацию можно определить при 0Ό₂₈₀ с использованием коэффициента экстинкции 1,43 или, что предпочтительно, с помощью нефелометрического анализа. ΙβΟ может быть проверен с помощью гель-электрофореза и способом с использованием специфичности антител.

Чтобы определить, могут ли отобранные человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15 связываться с уникальными эпитопами, каждое антитело биотинилируют с использованием имеющихся в продаже реагентов (Р1егсе, КоскТог!, ГЬ). Связывание биотинилированных МаЬ (моноклональные

- 17 015897 антитела) может быть определено с использованием зонда, меченного стрептавидином. Для определения изотипа очищенных антител можно провести ЕЫ8А изотипов с использованием известных в области техники методик. Например, лунки платы для микротитрования покрывают 10 мкг/мл 1д против человека в течение ночи при 4°С. После блокирования с помощью 5% В8А в платах проводят реакцию с 10 мг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в лунках проводят реакцию либо с человеческим 1дС1, либо с зондами, конъюгированными с агентом, специфическим в отношении другого человеческого изотипа. Платы проявляют и анализируют, как описано выше. Для демонстрации связывания моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими ИЛ-15, можно использовать проточную цитометрию. Вкратце, клеточные линии и/или человеческие РВМС, экспрессирующие связанный с мембраной ИЛ-15 (выращенные в стандартных условиях роста), смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в РВ8, содержащим 0,1% В8А и 0,01% ΝαΝ₃ при 4°С в течение 1 ч. После промывания проводят реакцию клеток с меченным флуоресцеином антителом против человеческого 1дС в тех же условиях, что окрашивание первичного антитела. Образцы анализируют с помощью устройства РАС8сап (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции) с использованием характеристик света и бокового рассеяния дискриминационного окна для отдельных клеток, при этом определяют связывание меченых антител. В дополнение или вместо проточного цитометрического анализа может быть использован альтернативный способ анализа с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивают точно так, как описано выше, и исследуют с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный способ позволяет визуализировать отдельные клетки, но он может иметь пониженную чувствительность в зависимости от плотности антигена.

Кроме того, человеческие 1дС против ИЛ-15 могут быть протестированы на реактивность с антигеном ИЛ-15 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, получают экстракты из клеток, экспрессирующих ИЛ-15, и подвергают их электрофорезу в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (8Ό8). После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% мышиной сывороткой и зондируют с помощью тестируемых моноклональных антител. Связывание человеческого 1дС можно определить с использованием 1дС против человека-щелочной фосфатазы и проявить таблетированным субстратом ВС'ЧР^ВТ (81§та Сйет. Οο., 8ΐ. Εοιιίδ. МО).

II. Получение трансгенных и трансхромосомных животных, отличных от человека, которые образуют человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15.

В еще одном аспекте изобретение представляет трансгенных или трансхромсомных животных, отличных от человека, таких как трансгенные или трансхромосомные мыши, которые способны к экспрессии человеческих моноклональных антител, специфически связывающихся с ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления изобретение представляет трансгенную или трансхромосомную мышь с геномом, содержащим трансген тяжелой цепи человека, так что данная мышь продуцирует человеческие антитела против ИЛ-15 при иммунизации антигеном ИЛ-15 и/или клетками, экспрессирующимим ИЛ15. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенной мыши, например мыши НиМАЬ, что детально описано в данном контексте и подкреплено примерами. Альтернативно, трансген тяжелой цепи человека может поддерживаться экстрахромосомно, как в случае трансхромосомной мыши (например, КМ), как описано в патентной заявке \¥О 02/43478. Данные трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, 1дО, 1дА и/или 1дЕ) путем рекомбинации У-Ό-Ι и переключения изотипов. Переключение изотипов может происходить, например, посредством классического или неклассического переключения изотипов.

Для конструирования трансгенного или трансхромосомного животного, отличного от человека, которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном репертуаром гетерологичных антител, необходимо, чтобы трансгены гетерологичного иммуноглобулина, которые содержит трансгенное животное, функционировали нормально на всем пути развития В-клеток. Это включает, например, переключение изотипа трансгена гетерологичной тяжелой цепи. Соответственно трансгены конструируют так, чтобы они осуществляли переключение изотипа и одну или более из следующих характеристик антител: (1) высокий уровень и экспрессия, специфическая для клеточного типа, (2) функциональная реаранжировка гена, (3) активация ответа на аллельное исключение, (4) экспрессия достаточного первичного репертуара, (5) сигнальная трансдукция, (6) соматическая гипермутация и (7) доминирование локуса трансгенного антитела в процессе иммунного ответа.

Не все из вышеперечисленных критериев должны быть представлены. Например, в тех вариантах осуществления, где локусы эндогенного иммуноглобулина трансгенного животного функционально разрушены, трансген может не активировать аллельное исключение. Кроме того, в тех вариантах осуществления, когда трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, второй критерий функциональной реаранжировки гена не является необходимым, по меньшей мере, для трансгена, который уже реаранжирован. Основы молекулярной иммунологии см. в монографии Фундаментальная иммунология (Рипбатеп1а1 Ιιηιηιιηοίοβν) под ред. Раи1 ^1Шат

- 18 015897

Е., 2 изд., Катеп Ргекк, КУ. (1989).

В некоторых вариантах осуществления трансгенных или трансхромосомных животных, отличных от человека, используют для генерации человеческих моноклональных антител, соответствующих изобретению, которые содержат реаранжированные, неаранжированные или комбинацию реаранжированных и неаранжированных трансгенов гетерологичных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в зародышевой линии трансгенного животного. Каждый из трансгенов тяжелой цепи содержит по меньшей мере один ген С_Н. Кроме того, трансген тяжелой цепи может содержать функциональные последовательности переключения изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа гетерологичного трансгена, кодирующего множество генов С_Н в В-клетках трансгенного животного. Данные переключающие последовательности могут быть последовательностями, присутствующими в естественных условиях в локусе иммуноглобулина зародышевой линии вида, который служит источником трансгенных генов С_Н, или данные переключающие последовательности могут быть выделены из имеющихся у видов, которые предназначены для получения трансгенной конструкции (трансгенного животного). Например, человеческая трансгенная конструкция, которую используют для получения трансгенной мыши, может давать повышенную частоту событий переключения изотипа, если она содержит переключающие последовательности, близкие существующим в естественных условиях в локусе тяжелой цепи мыши, поскольку переключающие последовательности мыши, в отличие от переключающих последовательностей человека, по-видимому, оптимизированы для функционирования с переключающей ферментной системой рекомбиназы мыши. Переключающие последовательности выделяют и клонируют принятыми способами клонирования, или они могут быть синтезированы бе ηονο из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, касающейся последовательностей области переключения иммуноглобулина (см. статьи МШк и соавт., N^1. Аабк Кек., 15:7305-7316 (1991); 81бегак и соавт., Ιηΐΐ. ТштипоГ, 1:631642 (1989). У каждого из вышеописанных трансгенных животных функционально реаранжированные трансгены гетерологичных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина обнаруживают в значительной фракции В-клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%).

Трансгены, используемые для создания трансгенных животных, соответствующих изобретению, включают трансген тяжелой цепи, содержащий ДНК, которая кодирует по меньшей мере один сегмент вариабельного гена, один сегмент разнообразия, один сегмент связывающего гена и по меньшей мере один сегмент гена константной области. Трансген легкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую по меньшей мере один сегмент вариабельного гена, один сегмент связывающего гена и по меньшей мере один сегмент гена константной области. Сегменты генов, кодирующих сегменты генов легкой и тяжелой цепей, являются гетерологичными для трансгенного животного, отличного от человека, поскольку они выделены из ДНК или соответствуют ДНК, кодирующей сегменты генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, видов, не включающих трансгенное животное, отличное от человека. В одном из аспектов изобретения трансген конструируют таким образом, чтобы отдельные сегменты гена были переаранжированными, т.е. не были реаранжированы так, чтобы кодировать функциональные легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина. Такие нереаранжированные трансгены поддерживают рекомбинацию сегментов генов V, Ό и ί (функциональную реаранжировку) и предпочтительно поддерживают инкорпорацию полного сегмента гена участка Ό или его части в полученную в результате реаранжированную тяжелую цепь иммуноглобулина у трансгенного животного, отличного от человека, при воздействии антигена ИЛ-15.

В альтернативном варианте осуществления трансгены содержат нереаранжированный минилокус. Данные трансгены, как правило, содержат значительную часть сегментов С, Ό и ί. а также подгруппу сегментов гена V. В данных трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности, например промоторы, энхансеры, участки переключения класса, сплайс-донорные и сплайсакцепторные последовательности процессинга РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности, выделенные из гетерологичной ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть инкорпорированы в трансген от того же самого или близкого вида животного, отличного от человека, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина могут быть скомбинированы в трансгене с последовательностью энхансера иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Альтернативно, в трансген могут быть инкорпорированы синтетические регуляторные последовательности, где данные синтетические регуляторные последовательности негомологичны функциональной последовательности ДНК, которая, как известно, присутствует в естественных условиях в геномах млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности конструируют согласно правилам консенсуса, таким как, например, правила, определяющие допустимые последовательности сплайс-акцепторного сайта или мотива промотора/энхансера. Например, минилокус содержит часть геномного локуса иммуноглобулина по меньшей мере с одной внутренней (т.е. неконцевой части) делецией неосновной части ДНК (например, промежуточной последовательности, интрона или его фрагмента) по сравнению с природным локусом Ι§ зародышевой линии.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансгенное или трансхромосомное

- 19 015897 животное, используемое для генерации человеческих антител к ИЛ-15, которое содержит по меньшей мере один, как правило, 2-10 и иногда 25-50 или более копий трансгена, описанного в примере 12 патентной заявки АО 98/24884 (например, рНС1 или рНС2), скрещивают с животным, содержащим одну копию трансгена легкой цепи, описанным в примерах 5, 6, 8 или 14 патентной заявки АО 98/24884, и их потомство скрещивают с животным, несущим делецию 1_Н, описанным в примере 10 патентной заявки АО 98/24884. Животных скрещивают до получения гомозиготности по каждому из данных трех признаков. Такие животные имеют следующий генотип: одна копия (на гаплоидный набор хромосом) нереаранжированного минилокуса человеческой тяжелой цепи (описано в примере 12 патентной заявки АО 98/24884), одна копия (на гаплоидный набор хромосом) реаранжированной конструкции человеческой К-легкой цепи (описано в примере 14 патентной заявки АО 98/24884) и делеция в каждом эндогенном локусе мышиной тяжелой цепи, которая элиминирует все функциональные сегменты (описано в примере 10 патентной заявки АО 98/24884). Данных животных скрещивают с мышами, гомозиготными по делеции сегментов 1_Н (примеры 10 патентной заявки АО 98/24884) для получения потомства, гомозиготного по делеции 1_Н и гемизиготного по конструкциям человеческих тяжелой и легкой цепей. Полученным в результате животным инъекционно вводят антигены и используют для продукции человеческих моноклональных антител против данных антигенов.

В-клетки, изолированные у данного животного, являются моноспецифическими относительно человеческих тяжелой и легкой цепей, поскольку они содержат только одну копию каждого гена. Более того, они будут моноспецифическими относительно человеческой и мышиной тяжелых цепей, потому что обе копии эндогенного гена мышиной тяжелой цепи нефункциональны вследствие делеции объема участка 1_Н, интродуцированной, как описано в примерах 9 и 12 патентной заявки АО 98/24884. Более того, существенная фракция В-клеток будет моноспецифической относительно человеческой или мышиной легких цепей, поскольку экспрессия единственной копии реаранжированного гена человеческой κ-легкой цепи будет аллельно и изотипически исключать реаранжировку эндогенных генов мышиных к- и λ-цепей в существенной фракции В-клеток.

Трансгенные и трансхромосомные мыши, используемые в данном изобретении, демонстрируют значительный репертуар продукции иммуноглобулина, в идеале практически аналогичном репертуару нативной мыши. Так, например, в вариантах осуществления с инактивацией эндогенных генов 1д уровни общего иммуноглобулина будут лежать в интервале от приблизительно 0,1 до 10 мг/мл сыворотки, предпочтительно от 0,5 до 5 мг/мл, в идеальном случае по меньшей мере приблизительно 1,0 мг/мл. Когда трансген, способный воздействовать на переключение с 1дМ на 1дС, интродуцирован трансгенной мыши, у взрослой мыши соотношение сывороточного 1дС к 1дМ составляет предпочтительно приблизительно 10:1. У неполовозрелой мыши соотношение 1дС к 1дМ будет значительно ниже. Как правило, больше приблизительно 10%, предпочтительно от 40 до 80% В-клеток селезенки и лимфатических узлов экспрессируют исключительно человеческий белок 1дС.

Репертуар будет идеально приближаться к показанному для нативной мыши, обыкновенно иметь величину по меньшей мере приблизительно 10%, предпочтительно 25-50% или больше. Как правило, будет продуцироваться по меньшей мере приблизительно тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале 1дС), предпочтительно 10⁴-10⁶ или больше в зависимости прежде всего от числа различных участков V, I и Ό, интродуцированных в геном мыши. Данные иммуноглобулины, как правило, будут распознавать приблизительно половину или больше высокоантигенных белков, например белок А. δίαρίιν1ососси8. В типичном случае аффинность (К_с), которую проявляют иммуноглобулины в отношении заранее заданных антигенов, будет ниже 10^-7 М, например, ниже 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже.

В ряде вариантов осуществления может быть предпочтительным получение мышей с заранее заданными репертуарами с целью ограничения отбора У-генов, представленных в ответе антитела на заданный тип антигена. Трансген тяжелой цепи, имеющий заранее заданный репертуар, может содержать, например, гены У_Н человека, которые преимущественно используются в ответах антител на заданный тип антигена у людей. Альтернативно, некоторые гены У_Н могут быть исключены из определенного репертуара по разным соображениям (например, при низкой вероятности кодирования высокоаффинных У-областей для заданного антигена, при высокой частоте соматических мутаций и сужения аффинности или при иммуногенности для некоторых людей). Таким образом, перед реаранжировкой трансгена, содержащего различные сегменты генов тяжелой и легкой цепей, данные сегменты генов можно легко идентифицировать, например, путем гибридизации или секвенирования ДНК, как происходящие из видов организма, отличного от трансгенного животного.

Как описано выше, трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть иммунизированы, например, очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клетками, экспрессирующими ИЛ-15. Альтернативно, трансгенные мыши могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческий ИЛ-15. Тогда мыши будут продуцировать В-клетки, в которых переключение класса происходит путем внутритрансгенной переключающей рекомбинации (цис-переключения), и экспрессировать иммуноглобулины, реактивные с ИЛ-15. Иммуноглобулины могут быть представлены человеческими

- 20 015897 антителами (называемыми также антителами с человеческими последовательностями), где полипептиды тяжелой и легкой цепей кодируются человеческими трансгенными последовательностями, которые могут включать последовательности, полученные путем соматической мутации и рекомбинаторных связей ν-области, а также последовательностями, кодируемыми зародышевой линией. Данные человеческие антитела можно рассматривать, как имеющие существенную идентичность с полипептидной последовательностью, кодируемой сегментом гена человеческих У_ь или Ун и сегментом человеческих Т. или Ό| | и Ч_Н, хотя другие последовательности незародышевой линии могут присутствовать в качестве результата соматической мутации и дифференциальных рекомбинационных связей У-Ч и У-Ό-

1. Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% кодируется сегментами генов человеческой зародышевой линии V, 1 и, в случае тяжелых цепей Ό, зачастую по меньшей мере 85% вариабельных областей кодируется последовательностями человеческой зародышевой линии, присутствующими в трансгене; часто 90 или 95% или больше последовательностей вариабельной области кодируется последовательностями человеческой зародышевой линии, присутствующими в трансгене. Однако, хотя последовательности незародышевой линии интродуцируют путем соматической мутации и связывания VI и УЭЧ, антитела с человеческими последовательностями зачастую будут иметь некоторые последовательности вариабельной области (и реже последовательности константной области), которые не кодируются сегментами генов человеческих У, Ό или Ч. как обнаружено в человеческом трансгене(ах) в зародышевой линии мышей. Обычно такие последовательности незародышевой линии (или отдельные положения нуклеотидов) будут образовывать кластеры в СОВ или около них или в областях, где, как известно, соматические мутации образуют кластер. Человеческие антитела, которые связываются с заданным антигеном, можно получить в результате переключения изотипа, при этом происходит продукция человеческих антител, содержащих человеческую последовательность γ-цепи (такой как γ1, γ2α, γ2В или γ3) и человеческую последовательность легкой цепи (такой как к). Такие человеческие антитела с переключенным изотипом часто содержат одну или более соматических мутаций, как правило, в вариабельной области, и часто в приблизительно 10 остатках СОВ или около них, что является результатом созревания аффинности и отбора В-клеток с помощью антигена, в особенности после вторичного (или последующего) введения антигена. Данные высокоаффинные человеческие антитела могут иметь аффинности связывания (К_с) ниже 10^-7 М, такие как ниже 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10М или даже ниже.

Другой аспект изобретения касается В-клеток, выделенных у трансгенных или трансхромосомных мышей, как описано в данном контексте. В-клетки могут быть использованы для генерации гибридом, экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим ИЛ15 с высокой аффинностью (например, ниже чем 10^-7 М). Так, в другом варианте осуществления изобретение представляет гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, которое имеет аффинность (К_с) ниже 10^-7 М, такие как ниже 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже по определению с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (8РВ) с помощью прибора В1АС0ВЕ 3000, используя рекомбинантный человеческий ИЛ-15 в качестве аналита и антитело в качестве лиганда для связывания человеческого ИЛ-15, где антитело содержит:

последовательность человеческой легкой цепи, состоящую из: (1) вариабельной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена У_ъ и сегментом человеческого Ч_ъ, и (2) константной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена Сь и последовательность человеческой тяжелой цепи, состоящую из (1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена У_Н, необязательно Ό-участком и сегментом человеческого Ч_Н, и (2) константной области, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена СН.

Созданию высокоаффинных человеческих моноклональных антител против ИЛ-15 способствует способ расширения репертуара сегментов человеческого гена вариабельной области у трансгенной мыши, которая имеет геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина. Данный способ предусматривает интродукцию в геном трансгена У-гена, содержащего сегменты гена У-области, которые не присутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген У-области представляет собой искусственную хромосому дрожжей, содержащую часть последовательности сегмента человеческого гена У_Н или У_ъ (У_К), так как она может находиться в естественных условиях в геноме человека или поскольку она может быть раздельно сплайсирована вместе рекомбинантными способами, которые могут включать нарушенные или пропущенные сегменты гена У. Часто УАС (искусственная хромосома дрожжей) содержит по меньшей мере пять или более функциональных сегментов гена У. В данном варианте возможно создание трансгенной мыши, полученной способом расширения У-репертуара, где мышь экспрессирует цепь иммуноглобулина, содержащую последовательность вариабельной области, кодируемую сегментом гена У-области, при

- 21 015897 сутствующим в трансгене У-области, и С-область, кодируемую трансгеном 1д человека. С помощью способа расширения У-репертуара могут быть получены трансгенные мыши по меньшей мере с 5 различными У-генами, а также мыши, несущие по меньшей мере приблизительно 24 У-гена или более. Некоторые сегменты У-гена могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т. п.); если желательно, данные сегменты можно сохранять или избирательно элиминировать рекомбинантными способами, которые доступны компетентным исследователям.

После конструирования мышиной зародышевой линии, содержащей функциональную УАС, имеющую расширенный репертуар У-сегментов, практически не присутствующий в трансгене человеческого 1д, содержащем сегменты генов ί и С, признак может быть размножен и введен путем скрещивания в другие генетические системы, включая системы, в которых функциональную УАС с расширенным репертуаром У-сегментов вводят путем скрещивания в зародышевую линию мышей, несущую другой трансген человеческого 1д. Для функционирования с трансгеном человеческого 1д (или множеством трансгенов человеческого 1д) множество функциональных УАС с расширенным репертуаром Усегментов может быть путем скрещивания введено в зародышевую линию. Хотя и обозначаемые в данном контексте как трансгены УАС, данные трансгены при интеграции в геном могут практически утрачивать дрожжевые последовательности, такие как последовательности, необходимые для автономной репликации в дрожжах, данные последовательности необязательно могут быть удалены способами геннной инженерии (например, рестрикционным расщеплением и гель-электрофорезом в пульсовом поле или другим подходящим способом) после репликации в дрожжах при отсутствии дальнейшей необходимости (т.е. перед интродукцией в мышиные клетки Е8 или прозиготу мыши). Способы размножения признака экспрессии последовательности человеческого иммуноглобулина включают скрещивание трансгенной мыши, имеющей трансген(ы) человеческого 1д и необязательно имеющей также функциональную УАС с расширенным репертуаром У-сегмента. На УАС могут присутствовать сегменты обоих генов У_н и У_ъ. Трансгенная мышь может быть скрещена с любой системой, желательной для исследователя, включая системы, несущие другие трансгены человека, в том числе трансгены 1д человека и/или трансгены, кодирующие другие белки лимфоцитов человека. Изобретение представляет также последовательность высокоаффинного человеческого иммуноглобулина, продуцируемую трансгенной мышью, несущей трансген УАС расширенного репертуара У-области. Хотя вышеприведенное описывает предпочтительный вариант осуществления трансгенного животного, соответствующего изобретению, представлены другие варианты осуществления, которые разделены на четыре категории:

I. Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью.

II. Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью.

III. Трансгенное животное, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью.

ГУ Трансгенные животные, содержащие трансгены иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью.

Из данных категорий трансгенных животных предпочтительным порядком выбора является следующий: II > I > III > ТУ, где эндогенные гены легкой цепи (или по меньшей мере гена К) выбиты путем гомологичной рекомбинации (или другим способом), и I > II > III > ТУ, где эндогенные гены легкой цепи не выбиты и должны доминировать посредством аллельного исключения.

III. Конъюгаты антител/иммунотоксины.

В другом аспекте данное изобретение характеризует человеческое моноклональное антитело против ИЛ-15, конъюгированное с такой терапевтической молекулой, как цитотоксин, лекарственное вещество (например, иммунодепрессант) или радиоизотоп. При конъюгировании с цитотоксином данные конъюгаты антител обозначают термином иммунотоксины. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который причиняет вред клетке (например, уничтожает ее). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают без ограничения перечисленным антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркптопурин, 6тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиоэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ί.’ί.’Νυ). циклофосфамид, бисульфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатину (II) ((ОРР)-цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), а также антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Антитело, соответствующее данному изобретению, может быть конъюгировано с радиоизотопом, например радиоактивным йодом, с целью получения цитотоксических радиофармацевтических препаратов для лечения нарушения, связанного с ИЛ-15, такого как рак.

- 22 015897

Конъюгаты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для модификации заданного биологического ответа. Термин терапевтическая молекула не следует ограничивать рамками классических химических терапевтических агентов. Например, молекула лекарственного вещества может быть представлена белком или полипептидом, обладающими желательной биологической активностью. Данные белки могут включать, например, токсин с активностью фермента или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, эндотоксин Ркеиботопак или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолей или интерферон-γ, или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-6 (ИЛ-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (6М-С8Р), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (6-С8Р) и другие факторы роста.

Технологии конъюгирования такой терапевтической молекулы с антителами хорошо известны, см., например раздел, написанный Агпоп и соавт., Моноклональные антитела для создания иммунонаправленности лекарственных веществ в терапии рака (Мопос1опа1 апбЬоб1ек Рог 1ттипо!агде!тд 01 Огидк 1п Сапсег ТНегару), в монографии Моноклональные антитела и терапия рака (Мопос1опа1 аибЬоб1ек Апб Сапсег ТНегару) под ред. Ке1к£е1б и соавт., с. 243-56 (А1ап К. Ыкк, 1пс. 1985); раздел, написанный Ие11к1гот и соавт., Антитела для доставки лекарственных веществ (АпНЬоб1ек Рог Эгид ЭеНуегу) в монографии Контролируемая доставка лекарственных веществ (Соп!го11еб Эгид ОеНуегу), 2 изд., под ред. КоЫпкоп и соавт., с. 623-53 (Магсе1 Эеккег, 1пс. 1987); обзор ТНогре Антитела-носители цитотоксических агентов в терапии рака (АпНЬобу Сагпегк 01 Су!о!охю Адеп1к 1п Сапсег ТНегару: А Кеу1ете, в сборнике Моноклональные антитела'84: биологическое и клиническое применение (Мопос1опа1 апНЬоб1ек'84: Вю1одюа1 Апб С1шюа1 АррНсабопк) под ред. РтсНега и соавт., с. 475-506 (1985); раздел Анализ, результаты и будущие перспективы терапевтического применения антител с радиоактивной меткой в терапии рака Апа1ук1к, КекиНк, Апб Ри!иге РгокресНуе 01 ТНе ТНегареиНс Ике 01 Кабю1аЬе1еб АпНЬобу 1п Сапсег ТНегару, в монографии Моноклональные антитела для определения и терапии рака Мопос1опа1 АпНЬоб1ек Рог Сапсег Ое1есбоп Апб ТНегару, под ред. Ва1б\\зп и соавт., с. 303-16 (Асабетю Ргекк 1985) и статью ТНогре и соавт. Получение и цитотоксические свойства конъюгатов антител и токсинов, ТНе РгерагаНоп Апб СуЮЮхк РгорегНек 01 АпНЬобу-Тохт Соп)ида!ек, 1ттипо1. Кеу., 62:119-58 (1982).

IV. Фармацевтические композиции.

В другом аспекте данное изобретение представляет композицию, например фармацевтическую композицию, содержащую одно или комбинацию человеческих моноклональных антител или их антигенсвязывающую часть(и), соответствующие данному изобретению, изготовленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В предпочтительном варианте осуществления композиции включают комбинацию множества (двух или более) выделенных человеческих антител или их антигенсвязывающих фрагментов, соответствующих изобретению. Предпочтительно, когда каждое из антител, составляющих композицию, связывается с различными заранее выбранными эпитопами ИЛ-15.

Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, можно также применять в комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию, соответствующую данному изобретению, по меньшей мере с одним или более дополнительных терапевтических агентов, таких как противовоспалительные агенты, ОМАКЭ (противоревматические лекарственные вещества, модифицирующие заболевание), иммунодепрессанты, химиотерапевтические агенты и агенты против псориаза). Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут также вводиться в сочетании с радиотерапией. Изобретение охватывает также совместное введение с другими антителами, такими как СО4-специфические антитела и ИЛ-2специфические антитела. Полагают, что данные комбинации с СП4-специфическими антителами и ИЛ2-специфическими антителами являются особенно эффективными для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

Как используют в данном контексте, термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т. п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно, когда носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула, могут быть покрыты материалом для защиты соединения от действия кислот и других условий естественной среды, которые могут инактивировать соединение.

Термин фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не вносит никакие нежелательные токсикологические эффекты (см., например, Вегде 8.М. и соавт. I. РНагт. 8ск, 66:1-19 (1977)). Примеры данных солей включают соли, полученные при добавлении кислот, и соли, полученные при добавлении оснований. Соли, полученные при добавлении кислот, включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как гидрохлорная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодистоводородная, фосфористая и т. п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатиче

- 23 015897 ские моно- и дикарбоновые кислоты. фенилзамещенные алкановые кислоты. гидроксиалкановые кислоты. ароматические кислоты. алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли. полученные при добавлении оснований. включают соли. полученные из щелочно-земельных металлов. таких как натрий. калий. магний. кальций и т. п.. а также из нетоксичных органических аминов. таких как Ν-Ν'-дибензилэтилендиамин. Ν-метилглюкамин. хлорпрокаин. холин. диэтаноламин. этилендиамин. прокаин и т. п.

Композиция. соответствующая данному изобретению. может быть введена множеством способов. известных в области техники. Компетентный специалист примет во внимание. что путь и/или способ введения будет изменяться в зависимости от желательных результатов. Активные соединения могут быть приготовлены с носителями. которые будут предохранять соединение от быстрого выхода. как в препарате с контролируемым выходом. включая имплантаты. чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Возможно использование биодеградируемых биосовместимых полимеров. таких как этиленвинилацетат. полиангидриды. полигликолевая кислота. коллаген. полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления данных препаратов запатентованы или в целом известны компетентным специалистам в данной области. См.. например. монографию под ред. б. Я. ЯоЫпкоп Системы доставки лекарственных веществ с задержанным или контролируемым выходом (Зикбашеб апб Соп1го11е6 Яе1еаке Эгид ОеШегу Зукбетк). Магсе1 Эеккег. 1пс.. Νονν Уогк (1978).

Для введения соединения. соответствующего изобретению. определенными путями может быть необходимым покрыть соединения оболочкой или вводить соединения вместе с материалом. который предупреждает его инактивацию. Например. соединение может быть введено субъекту в подходящем носителе. например в липосомах или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии ССЕ типа вода-в-масле-в-воде. а также обычные липосомы (см. статью 8бге_)ап и соавт.. б. ИешШттипок. 7:27 (1984)).

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. В области техники известно применение таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций. Таким образом. за исключением любых обычных сред и агентов. несовместимых с данным активным соединением. их применение предусматривается в фармацевтических композициях. соответствующих изобретению. В композиции могут быть также введены дополнительные активные соединения.

Терапевтические композиции. как правило. должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора. микроэмульсии. липосомы или другой упорядоченной структуры. подходящей для высокой концентрации лекарственного вещества. Носитель может быть представлен растворителем или дисперсионной средой. содержащей. например. воду. этанол. полиол (например. глицерин. пропиленгликоль и жидкий пропиленгликоль и т. п.). а также их подходящие смеси. Необходимую текучесть можно поддерживать. например. с помощью такого покрытия. как лецитин. поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включение в композицию изотонических агентов. например сахаров. многоатомных спиртов. таких как маннит и сорбит. или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента. который задерживает всасывание. например солей моностеарата и желатина.

Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов. как требуется. с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Как правило. дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель. который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и высушивание вымораживанием (лиофилизация). которые приводят к получению порошка активного ингредиента. содержащего любой дополнительный желательный ингредиент из его раствора. предварительно простерилизованного фильтрованием.

Схемы дозирования подбирают так. чтобы получить оптимальный желательный ответ (например. терапевтический ответ). Например. может быть введен один болюс. за определенный период может быть введено несколько разделенных доз или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена. как продиктовано терапевтической ситуацией. Например. человеческие антитела. соответствующие изобретению. можно вводить путем подкожной инъекции один или два раза в неделю или путем подкожной инъекции один или два раза в месяц. Особенно эффективным является приготовление парентеральных композиций в унифицированной лекарственной форме для простоты применения и унификации дозы. Термин унифицированная лекарственная форма. как используют в данном контексте. относится к физически дискретным единицам. соответствующим однократным дозам. предназна

- 24 015897 ченным для субъектов, проходящих лечение. Каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Подробное определение унифицированных лекарственных форм, соответствующих изобретению, продиктовано и непосредственно зависит от: (а) уникальных характеристик активного соединения и определенного терапевтического эффекта, который предусматривается достигнуть, и (Ь) ограничений, присущих области техники, связанной с составлением рецептур данного активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) антиоксиданты, растворимые в масле, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гиброкситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, α-токоферол и т.п.; и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕИТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Касательно терапевтических композиций, препараты, соответствующие данному изобретению, включают пригодные для перорального, назального, наружного (в том числе защечного и подъязычного), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Препараты могут быть удобно представлены в унифицированной лекарственной форме и могут быть приготовлены способами, известными в фармации. Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалом носителя при получении лекарственной формы для однократного приема, будет варьировать в зависимости от субъекта, проходящего лечение и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалом носителя для получения лекарственной формы для однократного приема, будет, как правило, составлять то количество композиции, которое обеспечивает терапевтический эффект. В общем, из 100% данное количество будет находиться в интервале от приблизительно 0,001 до приблизительно 90% активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,005 до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,01 до приблизительно 30%.

Препараты, соответствующие данному изобретению, которые пригодны для вагинального введения, включают также препараты в виде пессариев (маточных колец), тампонов, кремов, гелей, паст, пенок или спреев, содержащих такие носители, которые в области техники известны как приемлемые. Лекарственные формы для наружного или чрескожного применения композиций, соответствующих данному изобретению, включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляционные препараты. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут оказаться необходимыми.

Выражения парентеральное введение и вводимый парентерально, как используют в данном контексте, означают способы введения, отличные от энтерального и наружного введения, обычно путем инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную (подоболочечную), внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуралыную и внутригрудинную инъекции или вливания.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекционного введения органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью таких покрывающих материалов, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ.

Данные композиции могут также содержать вспомогательные компоненты, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение появления микроорганизмов обеспечивают процедурами стерилизации, кирга, и введением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Желательным может также оказаться введение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно осуществить включением агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

При введении человеку и животным соединений, соответствующих данному изобретению, в виде фармацевтических препаратов их можно применять в виде монокомпонентов или как фармацевтическую композицию, содержащую, например, 0,001-90% (более предпочтительно 0,005-70%, например 0,01-30%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Независимо от выбранного способа введения, соединения, соответствующие данному изобретению, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтиче

- 25 015897 ские композиции, соответствующие данному изобретению, готовят в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм обычными способами, известными компетентным специалистам в данной области техники.

Фактические уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтических композициях, соответствующих данному изобретению, могут варьировать, чтобы обеспечить количество активного ингредиента, эффективное для достижения желательного терапевтического ответа у конкретного пациента, состав и способ введения без токсического воздействия на пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включая активность используемых определенных композиций, соответствующих данному изобретению, или их сложных эфиров, солей или амидов, способа введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с определенными композициями, которые используют, возраста, пола, массы тела, условий, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, проходящего лечение, а также подобных факторов, хорошо известных в области медицины. Врач или ветеринар со средним уровнем компетентности в данной области легко может определить и прописать эффективное количество требующейся фармацевтической композиции. Например, врачу или ветеринару следовало бы начать с доз соединений, соответствующих изобретению, которые используют в фармацевтической композиции, на более низких уровнях, чем требуются для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу, пока терапевтический эффект не будет достигнут. Как правило, подходящей суточной дозой композиций, соответствующих изобретению, будет такое количество соединения, которое в самой низкой дозе эффективно обеспечивает терапевтический эффект. В основном данная эффективная доза будет зависеть от вышеописанных факторов. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение, предпочтительно проведенное вблизи области мишени. Если желательно, эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, которые вводят раздельно с определенными интервалами в течение дня, (необязательно) в унифицированных лекарственных формах. Хотя для соединения, соответствующего данному изобретению, допустимо введение в виде монокомпонента, предпочтительным является вводить соединение как фармацевтический препарат (композицию).

Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области. Например, в предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция, соответствующая изобретению, может быть введена с помощью безыгольного гиподермического инъекционного устройства, такого как устройства, описанные в патентах США №№ 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, используемых в данном изобретении, включают патент США № 4487603, который раскрывает имплантируемый микроинфузионный насос для введения лекарственного препарата с контролируемой скоростью; патент США № 4486194, который раскрывает терапевтическое устройство для введения лекарственных препаратов через кожу; патент США № 4447233, в котором описан насос для инфузии лекарственного препарата, доставляющий лекарственный препарат с точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, раскрывающий имплантируемое устройство для инфузии с изменением потока, служащее для непрерывной доставки лекарственного вещества; патент США № 4439196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества, имеющая многокамерные отделения, и патент США № 4475196, раскрывающий осмотическую систему доставки лекарственного вещества. Компетентным специалистам в данной области известно много других подобных имплантатов, систем доставки и модулей.

В ряде вариантов осуществления может быть получен препарат человеческих моноклональных антител, соответствующих изобретению, обеспечивающий надлежащее распределение ίη у1уо. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) не пропускает многие соединения с высокой гидрофильностью. Чтобы обеспечить прохождение терапевтических соединений, соответствующих изобретению, через ВВВ (если это желательно), их можно приготовить, например, в липосомах. Относительно способов изготовления липосом см., например, патенты США 4522811, 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более молекул, которые селективно транспортируются в специфические клетки или органы, повышая таким образом направленную доставку лекарственного вещества (см., например, статью У.У. Вапабе, Е С1ш. РНагтасоЕ 29:685 (1989)). Примеры направленных молекул включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016, выданный Ьоте и соавт.); маннозиды (см. статью итеха\уа и соавт., Вюсйет. Вюрйук. Век. Сошшип., 153:1038 (1988)); антитела (см. статьи Р.С. В1оешап и соавт., БЕВ8 Ьей., 357:140 (1995); М. О\\шк и соавт., АпйшюгоЬ. Адеп1к СйешоШег., 39:180 (1995)); рецептор поверхностно-активного белка А (см. статью Вйксое и соавт., Аш. Е РНукюЕ 1233:134 (1995)), различные виды которого могут представлять препараты, соответствующие изобретениям, а также являться компонентами изобретенных молекул; р120 (см. 8сНге1ег и соавт., Е Вю1. Сйеш., 269:9090 (1994)); см. также статьи К. Кешапеп, М.Ь. Ьаиккапеп, БЕВ8 Ьей., 346:123 (1994); 1.1. Кййоп, 1.1. Б1б1ег, 1тшипоше1йобк, 4:273 (1994). В одном из вариантов осуществления изобретения терапевтические соединения, соответствующие изобретению, приготовлены в липосомах; в более предпочти

- 26 015897 тельном варианте осуществления липосомы содержат направленную структуру. В наиболее предпочтительном варианте осуществления терапевтические соединения в липосомах доставляют путем болюсной инъекции в область, расположенную вблизи опухоли или места инфекции. Композиция должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко набрать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения, и необходимо принять меры для ее предохранения от загрязняющего действия таких микроорганизмов, как бактерии и грибы.

В следующем варианте осуществления человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, могут быть получены для предупреждения или уменьшения транспорта через плаценту. Это можно осуществить способами, известными в области техники, например путем ПЭГилирования антитела или использования фрагментов Е(аЬ)2'. Дальнейшие ссылки можно сделать на статьи Сипшпдйат-ВипШек С., ΖΙιιμ Ζ., СпГПШ В., Кеепап 1. (1992) Биологические активности конъюгатов полиэтиленгликоль-иммуноглобулин. Устойчивость к ферментативному разложению (В1о1од1са1 асРуЩех оГ ро1уе1йу1епе-д1усо1 1ттцпод1оЬийп соп)ида1е5. Ве5151апсе 1о епхутаРс йедгайайоп), 1. 1ттипо1. МеЙюШ, 152:177-190 и Ьапбог М. (1995) Перенос иммуноглобулинов от матери к плоду (Ма1егпа1-Ге1а1 1гап§Гег оГ 1ттипод1оЬийп8), Апп. А11егду Аййта 1ттипо1., 74:279-283. Это особенно важно, когда антитела используют для лечения или предупреждения привычного самопроизвольного выкидыша.

Терапевтически эффективная доза для ревматоидного артрита предпочтительно выражается в Предварительном определении улучшения АСВ20 у пациентов, более предпочтительно в Предварительном определении улучшения АСВ50 и даже более предпочтительно в Предварительном определении улучшения АСК.70.

Предварительное определение улучшения АСВ20 определяют как >20% улучшение Показателя болезненности сустава (ТО) и Показателя опухания сустава (8^1) и 20% улучшение по 3 из 5 следующих критериев: оценка болезненных ощущений у пациента (УА8), оценка общего состояния пациента (УА8), самооценка нетрудоспособности пациента (НЛО), реагент острой фазы (СВР или Е8В).

АСВ50 и АСВ70 определяют аналогичным образом при улучшениях >50 и >70% соответственно. Более подробное описание см. в работе Еекоп и соавт. Американская корпорация по Ревматологическому предварительному определению улучшения при ревматоидном артрите (Атепсап Со11еде оГ Вйеита1о1оду Ргейттагу ЭейпШоп оГ 1тргоуетеп1 ш ВйентаОй АгШгйщ); Аййгйщ ВйеитаШт, 38: 727-735 (1995).

Способность соединения подавлять развитие рака можно оценить в системе модели на животных, предсказывающей эффективность в отношении опухолей человека. Альтернативно, данное свойство композиции можно оценить путем исследования подавляющей способности соединения, данное подавление т νίΙΐΌ определяют с помощью анализов, известных компетентным практическим исследователям. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли или иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Обычный специалист в данной области смог бы определить данные количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов заболевания у субъекта, а также выбор конкретной композиции и способа введения.

Согласно способам, хорошо известным в области техники, может быть также определена способность антител лечить или предупреждать развитие псориаза.

Композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы композицию можно было доставлять с помощью шприца. Кроме воды, носитель может быть представлен изотоническим забуференным солевым раствором, этанолом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем и т.п.), а также их подходящими смесями. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью таких покрывающих материалов, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применением поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно введение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Длительное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента, который задерживает всасывание, например моностеарата алюминия или желатина.

При соответствующей защите активного соединения, как описано выше, соединение можно принимать перорально, например, с инертным разбавителем или ассимилируемым пищевым носителем.

У. Применения и способы, соответствующие изобретению.

Человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие данному изобретению, (включая производные и конъюгаты антител) и композиции, содержащие антитела, могут быть использованы в ряде диагностических и терапевтических способов применения ш νίΙΐΌ и ш у1уо.

В одном из вариантов осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, используют для ингибирования индуцируемой ИЛ-15 продукции ΤΝΕ-α Т-клетками и/или моноцитами/макрофагами предпочтительно без ингибирования продукции ΤΝΕ-α, индуцируемой другими цитокинами, такими как ИЛ-2. При контактировании антитела с ИЛ-15 (например, при введении антитела субъекту) происходит подавление способности ИЛ-15 к образованию сигнала посредством рецептора ИЛ-15 и таким образом осуществляется ингибирование продукции ΤΝΕ-α Τ-клетками и/или моноцита

- 27 015897 ми/макрофагами. Предпочтительные антитела связываются с эпитопами (например, определенными субъединицами, такими как γ-субъединица), которые обладают специфичностью в отношении ИЛ-15, и, таким образом эффективно ингибируют продукцию ТХЕ-α, индуцируемую ИЛ-15, но не нарушают продукцию ТХЕ-α, связанную с близкими цитокинами, такими как ИЛ-2.

Альтернативно, человеческие антитела используют для нарушения сборки α-, β- и γ-цепи рецептора ИЛ-15 и/или ингибирования сборки на соседних клетках, экспрессирующих β- и γ-цепи как часть рецептора ИЛ-15 или другого цитокинового рецептора.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, используют для подавления индуцируемых ИЛ-15 рекрутирования и/или пролиферации Т-клеток предпочтительно без ингибирования пролиферации Т-клеток, индуцируемой другими структурно близкими цитокинами, такими как ИЛ-2. Что касается продукции ТХЕ-α, то при контактировании антитела с ИЛ15 (например, при введении антитела субъекту) происходит подавление способности ИЛ-15 к образованию сигнала посредством рецептора ИЛ-15 и таким образом осуществляется ингибирование стимуляции Т-клеток под воздействием ИЛ-15.

Соответственно в еще одном варианте осуществления данное изобретение представляет способ лечения или профилактики нарушения, опосредованного ИЛ-15 (например, аутоиммунного заболевания, такого как псориаз, ревматоидный артрит или воспалительное заболевание кишечника, или инфекционного заболевания, такого как ВИЧ), путем введения субъекту человеческого антитела, соответствующего изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Антитело может быть введено в виде монотерапии или вместе с другим терапевтическим агентом, таким как противовоспалительный агент, например стероидный или нестероидный противовоспалительный агент, или цитотоксин, который дает сочетанный или синергический эффект с антителом при лечении или профилактике заболевания, опосредованного ИЛ-15.

В конкретном варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, используют для лечения или профилактики ревматоидного артрита (КА). Антитела ограничивают роль, которую ИЛ-15 играет в развитии воспаления, ассоциированного с заболеваниями, такими как КА (ревматоидный артрит). Т-клетки, в особенности Т-хелперные клетки СЭ4+, участвуют в инициации и поддержании воспалительных процессов при КА. ТХЕ-α, другой цитокин, также участвует в воспалительных путях, которые в конечном счета ведут к разрушению сустава и инвалидности пациента с КА. Местный синтез ИЛ-15 играет ключевую роль как в активации, так и в рекрутировании Тклеток и индукции ТХЕ-α и других воспалительных цитокинов. Роль ИЛ-15 в развитии КА включает процесс, при котором ИЛ-15, синтезирующийся в макрофагах, индуцирует рекрутирование Т-клеток. Затем активированные Т-клетки: (1) поддерживают активацию макрофагов и (2) индуцируют продукцию ТХЕ-α. Стимулированные макрофаги способствуют дальнейшему синтезу ИЛ-15 и активации Тклеток, продолжая таким образом данный цикл. Кроме указанных эффектов в отношении ТХЕ-α и макрофагов ИЛ-15 активирует также нейтрофилы и воздействует на локальную секрецию иммуноглобулина В-клетками, в частности на синтез ревматоидного фактора.

Согласно этому антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для предупреждения или блокирования вышеперечисленных эффектов ИЛ-15, которые вызывают КА, и, таким образом, могут быть использованы для лечения данного заболевания. Например, антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для подавления воспаления и/или предупреждения хемотаксиса активированных лимфоцитов, участвующих в развитии КА.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для подавления развития структурных повреждений у пациентов с ревматоидным артритом, которые давали неадекватную реакцию на метотрексат, или для уменьшения признаков и симптомов, а также задержки появления структурных нарушений у пациентов со средним до тяжелого активным ревматоидным артритом, включая больных, которых ранее безуспешно лечили ЭМАКЭ.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для блокирования или подавления других эффектов ИЛ-15. ИЛ-15 экспрессируется в различных клетках и тканях, включая моноциты и макрофаги, фибробласты, дендритные клетки и кератиноциты. Кератиноциты являются основным компонентом эпидермиса и эпителиальной выстилки слизистой ткани. Контроль роста кератиноцитов опосредуется сложным комплексом цитокинов и факторов роста, ряд которых продуцируют сами кератиноциты. ИЛ-15 из кератиноцитов участвует в процессах кумуляции, пролиферации и выживаемости Т-клеток в псориазных бляшках. Известно множество заболеваний, при которых повышается число кератиноцитов, что приводит к гиперплазии эпидермиса, обусловливающей, по меньшей мере, некоторые из симптомов, связанных с заболеванием. Данные заболевания включают такие хронические заболевания, как псориаз и атопический дерматит, а также состояния, как, например, хроническая экзема кистей рук, контактный дерматит, вирусные бородавки (ассоциированные с №ν (вирусом папилломы человека)), кожная Т-клеточная лимфома, нарушения заживления ран, такие как плохо заживающие раны при диабете. Соответственно в изобретении представлены способы лечения или профилактики данных нарушений посредством введения пациентам человеческого

- 28 015897 антитела против ИЛ-15, соответствующего изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Например, антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для блокирования или подавления паракератоза при псориазе, снижения толщины эпидермиса при псориазе и уменьшения пролиферации кератиноцитов при псориазе.

ИЛ-15 модулирует также функцию кишечных эпителиальных клеток (см. статью Кетескег и соавт., Са81гоеп1его1оду, 111:1706-13 (1996)). В частности, ИЛ-15 может вызывать модификации эпителиальных клеток слизистой оболочки и клеточных линий кишечного эпителия и, вследствие этого, участвует в патогенезе воспалительного заболевания кишечника, например заболевания брюшной полости. Роль ИЛ-15 в данных заболеваниях показана на основании избирательной сверхпрезентации клеток ИЛ-15+ в тонкой кишке нелеченых пациентов с заболеванием брюшной полости (см. патентную заявку \νϋ 00/02582). Так, показано, что ИЛ-15 непосредственно участвует в инициации и течении заболевания брюшной полости. Соответственно в другом варианте осуществления человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие данному изобретению (т.е. ингибирующие провоспалительные эффекты ИЛ-15), могут быть использованы для лечения и/или профилактики заболевания брюшной полости посредством введения антитела пациенту в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения.

Кроме того, авторами данного изобретения обнаружено, что ИЛ-15 способствует также образованию новых кровеносных сосудов, т.е. процессу, называемому неоваскуляризацией или ангиогенезом. Соответственно еще одно применение антител, соответствующих изобретению, включает профилактику или лечение заболеваний с участием неоваскуляризации. Кроме воспалительных заболеваний данные заболевания включают многие формы рака, которые зависят от неоваскуляризации или характеризуются неоваскуляризацией.

Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для блокирования или ингибирования эффектов ИЛ-15, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, таким как ВИЧ. Соответственно другое применение антител, соответствующих изобретению, включает профилактику или лечение инфекционных заболеваний, например ВИЧ-1.

Например, антитела могут быть использованы ш νίΙΐΌ или ш у|уо для диагностики ряда заболеваний, опосредованных ИЛ-15. В частности, антитела могут быть использованы для детекции уровней ИЛ-15 или уровней клеток, которые на поверхности мембраны содержат ИЛ-15, или он связан с их рецепторами (связанный с рецептором человеческий ИЛ-15). Затем может быть установлена корреляция определения данных уровней ИЛ-15 с определенными симптомами заболевания. Альтернативно, антитела могут быть использованы для ингибирования или блокирования функции ИЛ-15, которая, в свою очередь, может препятствовать появлению или ослаблять симптомы заболевания, вызываемые функцией ИЛ-15.

Как описано ранее, человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть введены с одним или более других терапевтических агентов, например иммунодепрессантом или противовоспалительным агентом, для усиления общего противовоспалительного эффекта. Антитело может быть связано с агентом (таким, как иммунокомплекс) или может быть введено отдельно от агента. В последнем случае (раздельное введение), антитело может вводиться до, после или одновременно с агентом. Подходящие терапевтические агенты включают среди прочих противовоспалительные агенты, ИМАКИ (противоревматические лекарственные препараты, модифицирующие заболевание), иммунодепрессанты, химиотерапевтические агенты и агенты для лечения псориаза. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть также введены в сочетании с радиотерапией.

В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с другими антителами, такими как СИ4-специфические антитела и ИЛ-2специфические антитела. Считают, что комбинация данных человеческих антител с СИ4специфическими антителами или ИЛ-2-специфическими антителами особенно эффективна для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов.

В объем данного изобретения входят также наборы, содержащие человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, и (необязательно) инструкции по применению. Кроме того, набор может содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммунодепрессанты, или одно или более дополнительных человеческих антител, соответствующих изобретению (например, человеческое антитело, обладающее комплементарной активностью, которое связывается с эпитопом на антигене ИЛ-15, отличном от эпитопа связывания первого человеческого антитела).

Соответственно пациентам, леченным антителами, соответствующими изобретению, можно дополнительно ввести (до, одновременно или после введения человеческого антитела, соответствующего изобретению) другой терапевтический агент, такой как противовоспалительный агент, который усиливает или повышает терапевтический эффект человеческих антител.

В еще одном варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть использованы для того, чтобы направить соединения (например, терапевтические агенты, метки, цитотоксины, иммунодепрессанты и т.п.) на клетки, с поверхностью которых связан ИЛ-15 (например, связанный с мембраной или связанный с рецептором ИЛ-15) путем присоединения данных соеди

- 29 015897 нений к антителу. Таким образом, изобретение представляет также способы локализации ех νίνο, ίη νίνο или ίη νίίτο клеток, экспрессирующих ИЛ-15 и рецептор ИЛ-15 (например, с определяемой меткой, такой как радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента).

Другие варианты осуществления изобретения описаны в последующих примерах.

Данное изобретение далее иллюстрируется последующими примерами, которые не следует истолковывать, как дальнейшее ограничение. Содержание списка последовательностей, чертежей и всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, приведенных на протяжении данной заявки, специально введено в данном контексте в виде ссылки.

Примеры

Пример 1. Создание Сти-направленных мышей.

Конструирование СМЛ-направленного вектора.

Плазмида р1СЕти содержит фрагмент Η^ΚΙ/ΧΙιοΙ локуса тяжелой цепи мышиного 1д, охватывающий ген ти, который получен из геномной библиотеки Ва1Ь/С в фаге А (см. статью Магси и соавт., Се11, 22:187 (1980)). Данный геномный фрагмент субклонируют в сайты ΧΗοΙ/ε^ΚΙ плазмиды р1СЕМ19Н (см. статью Магкй и соавт., Семе, 32:481-485 (1984)). Последовательности тяжелой цепи, включенные в р1СЕти, находятся ниже по ходу транскрипции сайта ЕсοКI, расположенного сразу 3' от интронного энхансера ти в сторону сайта Х1юЕ расположенного приблизительно через 1 т.п.н. вниз по ходу транскрипции от последнего трансмембранного экзона гена ти; однако большую часть участка повтора переключения ти подвергают делеции путем пассажа в Е. той.

Направленный вектор конструируют следующим образом. Фрагмент НшйШ/8та[ размером 1,3 т.п.н. вырезают из рГСЕти и субклонируют в рВйюкспрк разрезанный Н^ηбIII/ЗтаI (З^а^ето, Ьа •кПа, СА). Данный фрагмент рГСЕти располагается от сайта НтбШ, находящегося на расстоянии приблизительно 1 т.п.н. 5' от Сти1, до сайта Зтаф находящегося в Сти1. Полученную плазмиду разрезают с помощью 8таI/8реI и делают инсерцию фрагмента ЗтаЕХЫй длиной приблизительно 4 т.п.н. из рГСЕти, располагающуюся 3' от сайта 8таI в Сти1 в направлении к сайту ХЬаЕ находящемуся по ходу транскрипции непосредственно после последнего экзона Сти. Полученную плазмиду рТАК1 линеаризуют по сайту 8та! и вводят экспрессионную кассету ικο. Данная кассета состоит из гена ικο под контролем транскрипции мышиного промотора фосфоглицераткиназы (рдк) (фрагмент ХЫ-й/Тарй см. статью Абга и соавт., Сене, 60:65-74 (1987)) и содержит сайт полиаденилирования рдк (фрагмент РνиII/Н^ηбIII, см. статью Вοе^ и соавт., Вюсйешка Сеηеί^сκ, 28:299-308 (1990)). Данную кассету получают из плазмиды рКЛ (описано в статье Τ\ΓιιΠ\νχζ и соавт., Се11, 65:1153-1163 (1991)), из которой кассету ικο вырезают в виде фрагмента ЕсοΚI/Н^ηбIII и субклонируют в рСЕМ-72£ (+), разрезанную ЕсοΚI/Н^ηбIII с образованием рСЕМ-7 (КЛ). Кассету ικο вырезают из рСЕМ-7 (КЛ) с помощью ЕсοКI/8а1I, делают тупые концы и субклонируют в сайт 8таI плазмиды рТАК1 в ориентации, противоположной геномным последовательностям Сти. Полученную плазмиду линеаризуют с помощью Νοί Ι и вводят кассету тимидинкиназы вируса простого герпеса (ίΦ) для обеспечения обогащения клонами ЕЗ, несущими гомологичные рекомбинанты, как описано в статье Маηκοи^ и соавт. (см. №Ште, 336:348352 (1988)). Данная кассета состоит из кодирующей последовательности гена ίΦ, фланкированного мышиным промотором рдк и сайтом полиаденилирования, как описано в статье Τ\ΓιιΕ\νχζ и соавт. (см. Се11, 65:1153-1163 (1991)). Полученный в результате СМЛ-направленный вектор приблизительно на 5,3 т.п.н. гомологичен локусу тяжелой цепи и сконструирован для генерации мутантного гена ти с инсерцией экспрессионной кассеты ικο в уникальном сайте 8таI первого экзона Сти. Перед электропорацией в клетки ЕЗ направленный вектор линеаризуют с помощью РνиI, разрезающей плазмидные последовательности.

Генерация и анализ целевых клеток ЕЗ.

Клетки ЕЗ АВ-1 (см. статью МсМайοη А.Р. и Вгаб1еу А., Се11, 62:1073-1085 (1990)) выращивают на фидерных слоях митотически неактивных клеток ЗМЬ76/7 (1Ь1б.) в основном, как описано Κο^τίκοη ЕД. (см. монографию Тератокарциномы и эмбриональные стволовые клетки - практический подход (Τе^аίοса^с^ηοтаκ аий ЕтЬ^Ыс Зίет Се11к: а РгасРса1 Арргоасй) под ред. ЕД. Κο^τίκοη, Οχίοτά: ШЬ Ргекк, с. 71-112 (1987)).

Линеаризованный СМЛ-направленный вектор электропорируют в клетки АВ-1 способом, описанным Нак1у и соавт. (см. статью Нак1у Р.К. и соавт., М-Щие, 350:243-246 (1991)). Подвергшиеся электропорации клетки помещают на чашки диаметром 100 мм с густотой 1-2 х10⁶ клеток/чашку. Через 24 ч в среду добавляют С418 (в концентрации 200 мкг/мл по активному компоненту) и НАЛ (5х10^-7 М) и позволяют развиваться клонам с лекарственной устойчивостью в течение 8-9 дней. Клоны отбирают, трипсинизируют, делят на две части и продолжают размножать. Затем половину клеток, полученных из каждого клона, замораживают, а другую половину анализируют на наличие гомологичной рекомбинации между вектором и последовательностями-мишенями.

Анализ ДНК проводят путем гибридизации саузерн-блоттингом. ДНК изолируют из клонов, как описано Ьагоб и соавт. (см. статью Ьайб Р.^. и соавт., Шс1ею Ас1бк Кек., 19:4293 (1991)). Выделенную геномную ДНК разрезают ЗреI и зондируют фрагментом Заб из 915 пар осн., зондом А (см. фиг. 1),

- 30 015897 который гибридизуется с последовательностью между интронным энхансером ти и участком переключения ти. Зонд А определяет фрагмент 8реI из 9,9 т.п.н. из локуса дикого типа и диагностическую полосу размером 7,6 т.п.н. из локуса ти, прошедшую гомологичную рекомбинацию с СМБнаправленным вектором (экспрессионная кассета пео содержит сайт 8реЦ Из 1132 клонов, устойчивых к 0418 и ПАИ, которые проверены саузерн-блоттингом, у 3 обнаруживают полосу 8реI размером 7,6 т.п.н., указывающую на гомологичную рекомбинацию в локусе ти. Данные 3 клона далее разрезают ферментами ВдИ, В8ΐXI и ЕсоКТ чтобы удостоверится, что вектор гомологично интегрирован в ген ти. Будучи гибридизованы с зондом А, полосы, полученные при саузерн-блоттинге ДНК дикого типа, при разрезании ВдИ, ВзЖ или ЕсоК образуют фрагменты размером 15,7, 7,3 и 12,5 т.п.н. соответственно, тогда как присутствие целевого аллеля ти определяют по фрагментам размером 7,7, 6,6 и 14,3 т.п.н. соответственно. Все 3 положительных клона, выявленные по разрезанию Зре^ демонстрируют присутствие ожидаемых рестрикционных фрагментов ВрП, В8ΐXI и ЕсоШ, диагностирующих инсерцию кассеты пео в экзон Сти1.

Получение мышей, несущих мутантный ген ти.

Три целевых клона Е8, обозначаемых номерами 264, 272 и 408, оттаивают и инъекцией вводят в бластоцисты С57ВБ/61, как описано Вга!1еу (см. раздел, написанный Вга!1еу А. в монографии Тератокарциномы и эмбриональные стволовые клетки - практический подход (Тега1осагсшота8 ап! ЕтЬгуошс 81ет Се118: а Ргасйса1 Арргоасй) под ред. ЕД. КоЬег&оп, 0х1ог!: ЖБ Рге88, с. 113-151 (1987)). Инъецированные бластоцисты переносят с матки псевдобеременных самок для получения химерных мышей, представляющих смесь клеток, происходящих из введенных клеток Е8, и бластоцисты хозяина. Степень участия клеток Е8 в создании химеры можно визуально определить по количеству окрашивания шерсти агути, ведущего начало из клеточной линии Е8, на черном фоне С57ВБ/61. Клоны 272 и 408 приводят к образованию только низкопроцентных химер (т. е. низкого процента пигментации агути), но клон 264 приводит к образованию высокопроцентных химер-самцов. Данные химеры скрещивают с самками С57ВБ/61 и получают потомство агути, указывающее на передачу генома клеток Е8 через зародышевую линию. Скрининг целевого гена ти проводят саузерн-блоттингом ДНК, разрезанной В§И, из биоптатов хвоста (как описано выше для анализа ДНК клеток). Приблизительно 50% потомства агути показывает гибридизацию полосы ВдИ размером 7,7 т.п.н. в дополнение к полосе дикого типа размером 15,7 т.п.н., демонстрируя передачу целевого гена ти через зародышевую линию.

Анализ трансгенных мышей на функциональную инактивацию гена ти.

Для определения инактивирует ли инсерция кассеты пео в Сти1 ген тяжелой цепи Ι§, клон химеры 264 скрещивают с мышью, гомозиготной по мутации .4II), которая инактивирует экспрессию тяжелой цепи в результате делеции сегментов гена ΊΗ (см. статью Сйеп и соавт., ^типоГ, 5:647-656 (1993)). Получают четыре потомка агути. От данных животных в возрасте 1 месяца получают сыворотку и анализируют ее с использованием ЕЫ8А на присутствие мышиного Ι§Μ. У двух из четырех потомков ΙρΜ полностью отсутствует (см. табл. 1). Генотипирование четырех животных с помощью анализа саузерн-блоттингом ДНК из биоптатов хвоста путем разрезания ВдИ и гибридизации с зондом А (см. фиг. 1) и разрезания 8ΐιιΙ и гибридизации с фрагментом ЕсоМ^М размером 475 т.п.н. (1Ы!.) демонстрирует, что животные, не способные к экспрессии сывороточного Ι§Μ, являются животными, у которых один аллель локуса тяжелой цепи несет мутацию ΊΗϋ, а другой аллель - мутацию Сти1. Мыши, гетерозиготные по мутации ΊΗϋ, представляют уровни сывороточного Ι§ дикого типа. Данные результаты демонстрируют, что мутация Сти1 инактивирует экспрессию гена ти.

Мышь	Сывороточный 1дМ (мкг/мл)	Генотип Н-цепи 1д
42	<0,002	смо/лчэ
43	196	+/6НО
44	<0,002	СМО/ϋΗϋ
45	174	+/ϋΗϋ
129хВ1_6Е1	153	+/+
ΰΗϋ	<0,002	лчо/ϋΗϋ

В таблице представлены уровни сывороточного Ι§Μ, определенные с помощью ЕЫ8А, у мышей, несущих обе мутации, ί'ΜΙ) и ШБ, ^ΜΏ/ΜΏ), у мышей, гетерозиготных по мутации ШБ (+/ШБ), у мышей дикого типа (1298ν хС57ВЬ/61)Б1 (+/+) и у мышей с дефицитом В-клеток, гомозиготных по мутации ШБ (ΙΗϋ/ΙΗϋ).

- 31 015897

Пример 2. Получение трансгенных мышей НСΟ12.

Трансген человеческой тяжелой цепи НСΟ12.

Трансген НСΟ12 генерируют совместной инъекцией инсерционного сегмента рНС2 размером 80 т.п.н. (см. статью Тау1ог и соавт., Ιηΐ. Iттиηο1., 6:579-591 (1994)) и инсерционного сегмента рУх6 размером 25 т.п.н. Плазмиду рУх6 конструируют, как описано выше.

Фрагмент ДНК НтФП/ЗаИ размером 8,5 т.п.н., содержащий ген УН1-18 (ΌΡ-14) зародышевой линии человека, вместе с 5'-фланкирующей последовательностью размером приблизительно 2,5 т.п.н. и З'-фланкирующей геномной последовательностью размером 5 т. п. н. субклонируют в плазмидный вектор рЗР72 (Рготеда, Майкоп, νΙ) с целью генерации плазмиды рЗ4З.7.16. Фрагмент ДНК ВаШе/НшбШ размером 7 т.п.н., содержащий ген УН5-51 (ЭР-7З) зародышевой линии человека вместе с 5'фланкирующей последовательностью размером приблизительно 5 т.п.н. и З'-фланкирующей геномной последовательностью размером 1 т.п.н. клонируют в вектор для клонирования на основе плазмиды рВКЗ22 р6Р1 Р (см. статью Тау1ог и соавт., ΝιιοΕίο ЛсЛк Кек., 20:6287-6295 (1992)) с целью генерации плазмиды р251Г. Новый вектор для клонирования, полученный из р6Р1Г, р6Р1к (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1З), разрезают с помощью ЕсоКУ/ВатШ и лигируют во фрагмент ДНК ЕсоКУ/ВатШ размером 10 т.п.н., содержащий ген зародышевой линии человека УНЗ-2З (ЭР47) вместе с 5'-фланкирующей последовательностью размером приблизительно 4 т.п.н. и З'-фланкирующей геномной последовательностью размером 5 т.п.н. Полученную плазмиду р1112.2КК.7 разрезают с помощью ВатШ/ЗаП и лигируют с очищенным инсерционным сегментом ВатНЕЗаИ размером 7 т.п.н. р251Г. Полученную плазмиду рУх4 разрезают с помощью ΧΙμΙ и лигируют с инсерционным сегментом ХйоЕЗаИ размером 8,5 т.п.н. рЗ4З.7.16.

Получают клон, содержащий ген УН1-18 в той же ориентации, что два других гена У. Затем данный клон, обозначенный рУх6, разрезают с помощью и очищенный инсерционный сегмент размером 26 т.п.н. инъецируют совместно с очищенным инсерционным сегментом рНС2 размером 80 т.п.н. в молярном соотношении 1:1 в пронуклеусы полудневных эмбрионов (С57ВЬ/61хПВА/21)Р2, как описано Нодап и соавт. (см. монографию В. Нодап и соавт. Лабораторное руководство по манипуляциям с мышиными эмбрионами (Машри1аЕпд Ше Мышь ЕтЬгуо, А ЬаЬогаФгу Мапиа1), 2 изд., 1994, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Р1ат\зе\у ΝΥ). Из мышей, развивающихся из инъецированных эмбрионов, получают три независимые линии трансгенных мышей, содержащих последовательности как из Ух6, так и из НС2. Данные линии обозначают ^^12)14881, (НСΟ12)15083 и ^№12)15087. Затем каждую из трех линий скрещивают с мышами, содержащими мутацию СМЭ, описанную в примере 1, мутацию ГКО (см. статью Сйеп и соавт., ЕΜВΟ I., 12:811-820 (199З)) и трансген (КСо5)9272 (см. статью Είκ1ι\νί1ά и соавт., №11иге Вю1есйпо1оду, 14:845-851 (1996)). Полученные в результате мыши экспрессируют трансгены тяжелой и к-легкой цепей человеческого иммуноглобулина на фоне, гомозиготном в плане разрушения эндогенных локусов мышиной тяжелой и к-легкой цепей.

Пример З. Продукция человеческих моноклональных антител против ИЛ-15.

Трансгенных мышей НСо12 и НСо7, генерированных как описано выше и полученных из Мебагех, Зап 1оке, СА, ИЗА, иммунизируют подкожно (ЗС), внутрибрюшинно (ГР) или внутривенно (ΙΥ) человеческим рекомбинантным ИЛ-15 (ЬИЛ-15, Ептипех согр., Зеай1е, ИЗА) с добавлением либо полного адъюванта Фрейнда (СРА, партия по. 121024ЬА, Э|Гсо ЬаЬогаШпек, Ое1гой, МкЫдап, ИЗА), либо неполного адъюванта Фрейнда (ЮРА, партия по. 121195ЬА, ОГГсо). В некоторых случаях для иммунизации используют ЬИЛ-15, связанный с КЬН (гемоцианином из моллюска Ме даШига сгепи1а!а (блюдечко)). После нескольких бустерных иммунизации НИЛ-15 с добавлением полного или неполного адъюванта Фрейнда сыворотку мышей тестируют на присутствие человеческих антител, направленных против ИЛ-15.

- З2 015897

Схемы иммунизации трансгенных мышей, приводящие к образованию конечных клонов 146В7, 146Н5, 404Е4 и 404А8

Мышь по. 146 (Нсо12), ГО 995-146, самка

170699	8С	12 мкг НИЛ-15 в СЕА (полный адъювант Фрейнда)(ОИсо, Партия по. 1210241-А)
010799	ЗС	12 мкг НИЛ-15 в 1СЕА (неполный адъювант Фрейнда) (ОИсо, Партия по. 1211951-А)
150799	ЗС	12 мкг КИЛ-15 в 1СЕА
020899	ЗС	12 мкг КИЛ-15-КШ в 1СЕА
070999	ЗС	12 мкг КИЛ-15-КШ в ЮРА
280999	ЗС	12 мкг КИЛ-15-К1_Н в СЕА
111099	IV	30 мкг КИЛ-15 в РВЗ
121099	IV	30 мкг ПИЛ-15 в РВЗ
151099		слияние лимфатических узлов и клеток селезенки данной мыши с ЗР2/0

Мышь по. 404 (НСо7), ГО 997-404, самка

201099 ΙΡ 25 мкг 11ИЛ-15-КШ в СЕА (ЮТсо, партия по. 1210241А)

031199 ΙΡ 12,5 мкг 11ИЛ-15, 12,5 мкг ЬИЛ-15-ΚΙ.Η, 25 мкг в 1СЕА (ϋίΐοο, партия по. 1211951-А)

101199 IV 12,5 мкг КИЛ-15, 12,5 мкг ИЛ-15-КШ

121199 IV 12,5 мкг НИЛ-15, 12,5 мкг НИЛ-15-КЬН

191199 слияние лимфатических узлов и клеток селезенки данной мыши с 8Р2/0

Среда для культивирования.

Среда для слияния партнеров (РРМ).

В среду Дульбекко в модификации I8соνе8 добавляют 100 Ιϋ (международных единиц)/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата Ν^ 0,5 мМ β-меркаптоэтанола (ЫГе ТесНпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со11ап4) и 10% инактивированной нагреванием сыворотки телячьих эмбрионов (НуС1опе, ШаН, И8А).

Среда для селекции слияний (Р8М).

РРМ с добавлением 30 мл фактора клонирования гибридом Опдеп (ЮЕ^ ОаИНегкЬигд, МЭ, И8А), НАТ (1 флакон, концентрация, рекомендуемая изготовителем, 81дта СЬет1са1 Со., 81. Ьошк, МО, И8А) и 0,5 мг/мл канамицина (ЫГе ТесНпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со11ап4).

Среда для клонирования слияний (РСМ).

РРМ с добавлением 20 мл фактора клонирования гибридом Опдеп (ЮЕ^ ОаИНегкЬигд, МЭ, И8А), НАТ (1 флакон, концентрация, рекомендуемая изготовителем, 81дта СЬет1са1 Со., 81. Ьошк, МО, И8А) и 0,5 мг/мл канамицина (ЫГе ТесРпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со11ап4).

Получение гибридом: слияние клеток селезенки и лимфатических узлов с клетками миеломы 8Р2/0.

Для получения гибридом у мышей удаляют селезенку, паховые и парааортальные лимфатические узлы. Суспензии отдельных клеток селезенки и лимфатических узлов смешивают с клетками миеломы 8Р2/0 при соотношении клеток 1:2. Клетки центрифугируют и осадок осторожно ресуспендируют в 1 мл полиэтиленгликоля (50% мас./об. в РВ8 (фосфатно-буферного раствора), 81дта-А14псР, 1тпе, ИК) при 37°С. После взбалтывания клеток в течение 60 с добавляют 25 мл РРМ-2 и инкубируют клетки при 37°С в течение 30-60 мин. После инкубирования клетки культивируют при концентрации клеток 0,75х10⁵ клеток/лунку (в 100 мкл) в 96-луночных платах с Р8М. Через 3 дня в каждую лунку добавляют 100 мкл Р8М.

Слияние селезенки и лимфатических узлов мышей НСо7 и НСо12, иммунизированных НИЛ-15, приводит к генерации нескольких гибридом, продуцирующих антитела, направленные против ИЛ-15. Выделяют следующие четыре стабильных клона, продуцирующих полностью человеческие антитела против ИЛ-15: (1) 146ЬуВ7Р7В7 (название изменено на 146В7); (2) 146ЭЕ2Е12А3Н5 (название изменено на 146Н5); (3) 404СО11В7Е4 (название изменено на 404Е4) и (4) 404РВ12Е7А8 (название изменено на 404А8). Все данные клоны принадлежат к подклассу человеческого 1дО1/к.

Скрининг гибридом.

Между 7 и 11 днями после слияния проводят скрининг лунок на присутствие человеческих антител с использованием следующих вариантов ЕП8А.

- 33 015897

ЕЫ8А для скрининга присутствия человеческих 1дС в супернатантах культур.

Для проведения ЕЫ8А с целью детекции присутствия человеческих антител 1дС 100 мкл/лунку кроличьих антител против α-к-легких цепей (ЭЛКО, С1о81гир, Эсптагк) в концентрации 0,9 мкг/мл добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Ыипс Мах18огр (инкубирование в течение ночи при комнатной температуре). После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; ЫГе Тесйпо1од1е8, РаЫеу, 8со11апП) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС), добавляют супернатанты культур. После инкубирования в течение 1,5 ч платы отмывают и добавляют кроличье антитело против α-цепи человеческого 1дС (фрагменты ЕаЬ2), конъюгированное с пероксидазой хрена (ОАКО, С1о81гир, Эептагк), в концентрации 0,5 мкг/мл, разведенное в РВ8ТС. После инкубирования в течение 1 ч лунки отмывают и добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3этилбензтиазолинсульфокислоту, Воске П1адпо8Йс8, Маппйе1т, Сегтапу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А ЕБ808 (ВюЛек Иъ/гитепК Атоозкк УТ, И8А).

ЕЫ8А для скрининга присутствия ИЛ- 15-специфических антител.

Лунки, содержащие человеческие антитела 1дС/к, далее тестируют на присутствие человеческих антител против ИЛ-15 с использованием ИЛ-15-специфического ЕЫ8А. Для проведения ЕЫ8А 100 мкл/лунку ИЛ-15 в концентрации 1 мкг/мл добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Ыипс Мах18огр (инкубирование в течение ночи при комнатной температуре). После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; ЫГе Тесйио1од1е8, Ра181еу, 8со11апй) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС), вносят супернатанты культур. После инкубирования в течение 1,5 ч платы отмывают и добавляют Ес α-человеческого 1дС, конъюгированное с пероксидазой хрена ЛасЫоп 1ттипе гезеагск, Аез/ Сгоуе, Репи8у1уап1а, И8А) в разведении 1/5000 в РВ8ТС. После инкубирования в течение 1 ч лунки отмывают и добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3этилбензтиазолинсульфокислоту, Воске П/адповйсб, Мапийе1т, Сегтапу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А ЕБ808 (ВюЛек Иъ/гитепК Атоозкк УТ, И8А).

Субклонирование гибридом.

Для получения стабильных клеточных линий против ИЛ-15 субклонируют гибридомы путем ограничивающего разведения клеток (до концентрации 0,5 клетки/лунку) в 96-луночных платах.

Субклоны тестируют через приблизительно 10 дней с помощью вышеописанного ЕЫ8А для ИЛ15. Во время нескольких процедур субклонирования Е8М заменяют в фазах через ЕСМ на ЕРМ. Изотип субклонов определяют с помощью ЕЫ8А, как описано ниже.

Определение изотипа антитела против ИЛ-15 с помощью ЕЫ8А.

Для проведения ЕЫ8А изотипа 100 мкл/лунку Ес против человека в концентрации 1 мкг/мл (1аскзоп 1ттипо гезеагск) добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Мтс Мах18огр (инкубирование в течение ночи при комнатной температуре). После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; ЫГе Тескио1од^е8, Ра181еу, 8со11апй) и Твин20 (0,05%; РВ8ТС) вносят супернатанты культур. После инкубирования в течение 1,5 ч платы отмывают и добавляют мышиное а-Ни1дС1, конъюгированное со щелочной фосфатазой (2утеб, р1аа18, 1апф, или мышиное α- Ни1дС3, конъюгированное с пероксидазой хрена (Ζνιικά). После инкубирования в течение 1 ч лунки отмывают и добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислоту, Воске П/адпобЕсб, Маппет, Сегтапу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А ЕБ808 (ВюЛек Иъ/гитепК АтоозИ, УТ, И8А).

Пример 4. Специфичность полностью человеческих антител против ИЛ-15 в отношении эпитопов.

Для осуществления терапевтической функции или ингибирования индуцируемых ИЛ-15 провоспалительных эффектов ИЛ-15-специфические антитела должны распознавать эпитопы ИЛ-15, участвующие во взаимодействии с цепью ИЛ-ΣΒβ и/или γ-цепью рецептора ИЛ-15.

С целью оценки специфичности в отношении эпитопов полностью человеческих антител против ИЛ-15 146В7,146Н5, 404А8 и 404Е4 используют мутантные белки (описанные в статье Рейй и соавт.). Используемые мутанты ИЛ-15 включают мутант ИЛ-15 01088 (остаток С1п в положении 108 заменен 8ег; мутация в γ-цепи центра взаимодействия) и мутант Ό88Ο1088 (остаток С1п в положении 108 заменен 8ег и Азр в положении 8 заменен 8ег; мутации в центрах взаимодействия ИЛ-15 обеих, β- и γцепей).

ЕЫ8А для определения связывания кИЛ-15-специфических антител 146В7, 147Н5, 404А8 и 404Е4 с кИЛ-15 и мутантными белками ИЛ-15.

Для проведения ЕЫ8А 100 мкл ИЛ-15 или мутантного белка ИЛ-15 в концентрации 1 мкг/мл добавляют в фосфатно-буферном растворе (РВ8) в платы для проведения ЕЫ8А Ыипс Мах18огр для покрытия. После блокирования платы с помощью РВ8 с добавлением куриной сыворотки (2%; ЫГе Тескпо^щех, Ра181еу, 8со11апй) и Твин-20 (0,05%; РВ8ТС) инкубируют серийные разведения кИЛ-15специфических антител. После отмывания добавляют Ес α-человеческого 1дС, конъюгированное с пе

- 34 015897 роксидазой (1аск§оп Iттипе гекеагсН, \Уе51 Сгоуе, Репину каша, и8А) в разведении 1/5000 в РВ8ТС. После отмывания добавляют субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис-3-этилбензтиазолинсульфокислоту, КосНе П1адпо81зс8, МаппЬе1т, Оегтапу) согласно протоколу изготовителя и определяют связывание антитела при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А ЕБ808 (Вюбек Н+гитепК ХУтооШк УТ, и8А).

Связывание полностью человеческих специфических в отношении ИЛ-15 антител 146В7, 146н5, 404А8 и 404Е4 с НИЛ-15 и мутантными белками ИЛ-15 01088 и Ω88Ο1088 представляют на фиг. 1. Ни 146В7, ни 146Н5 не способны связываться с данными мутантными белками ИЛ-15. Поскольку оба мутанта несут мутацию 01088, эпитоп, распознаваемый 146В7 и 146Н5, находится в важных доменах ИЛ15, которые взаимодействуют с γ-цепью рецептора ИЛ-15. Оба, 404А8 и 404Е4, способны связывать мутантные белки, потому что данные антитела распознают эпитоп, находящийся вне доменов ИЛ-15, которые взаимодействуют с β- и γ-цепями. Оба, как 146В7, так и 146Н5, связываются с ИЛ-15 в области, которая взаимодействует с γ-цепью рецептора ИЛ-15. Это согласуется с данными, полученными в анализах пролиферации с использованием полностью человеческих антитела против ИЛ-15, соответствующих данному изобретению. Как подробно описано ниже, ни 404А8, ни 404Е4 не способны к ингибированию индуцируемой ИЛ-15 пролиферации клеток СТЬЬ-2 и человеческих РВМС. Оба, 146В7 и 146н5, могут ингибировать индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию. Кроме того, ингибирование пролиферации достигают блокированием взаимодействия ИЛ-15 с γ-субъединицей рецептора ИЛ-15.

Пример 5. Последовательности У_н- и У_ь-областей 146В7.

Нуклеотидную и рассчитанную аминокислотную последовательность реаранжированных У_н- и У_ъ-доменов 146В7 определяют с использованием следующих процедур. Данные последовательности дают информацию, касающуюся использованных семейств зародышевых линий У_н и У_ъ; точечные мутации в данных последовательностях зародышевых линий обусловлены созреванием аффинности Вклеток во время иммунизации животного.

Получение РНК.

Тотальную РНК готовят из 5х10⁶ клеток гибридомы 146В7 с использованием РНКзола (ВюдепеХ, Роо1е, Епд1апб) в соответствии с протоколом изготовителя.

Получение кДНК.

кДНК РНК из 146В7 готовят из 3 мкг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы АМУ с буфером (КосНе ПхадпокНск СтЬн, МаппНет, Оегтапу), олиго-б(Т)15 (Рготеда, Мабкоп, ^, и8А), бЫТР (дезоксинуклеозидтрифосфат) (ВоеНгшдег МаппНепп согр., и8А) и РНКзина (Рготеда) в соответствии с протоколом изготовителя.

ПЦР-праймеры, используемые для амплификации У_н- и У_ъ-областей с целью клонирования.

Используемые пары праймеров ν_Η· ₽В1 5'-праймеры

(1)	АВ62	САд	дТК	САд	СТд	дТд	САд	ТС
(21	АВ63	5Ад	дТд	САд	СТд	КТд	дАд	ТС
(31	АВ65	дАд	дТд	САд	СТд	дТд	САд	ТС
	У_н лидерные 5'-праймеры
(4)	АВ65	АТд	ддс	Тдд	АСС	Тдд	АдС	АТС
(5)	АВ86	АТд	дАА	ТТд	ддд	СТд	АдС	Тд

- 35 015897

(в)	ΑΘ87	АТд	дАд ТТТ ддН СТд АдС	Тд
(7)	АВ88	АТд	ААА САС СТд Тдд ТТС	ТТС
(8)	АВ89	АТд	ддд ТСА АСС дСС АТС	СТ
	ν_Η 3'-праймер
(9)	АВ90	ТдС	САд ддд дАА дАС СдА	Тдд
ν_κ-
	РВ1 5’-праймеры
(1)	АВ8	ВАС	АТС САд АТд АУС САд	тс
(2)	АВ9	дУС	АТС УАд АТд АСС САд	тс
(3)	АВ1О	дАТ	АТТ дТд АТд АСС САд	АС
(4)	АВ11	дАА	АТТ дТд ТТд АСА САд	тс
(5)	АВ12	дАА	АТО/ дТА АТд АСА САд	тс
(6)	АВ13	дАТ	дТТ дТд АТд АСА САС	тс
(7)	АВ 14	дАА	АТТ дТд СТд АСТ САд	тс
	ν_κ лидерные 5'-праймеры:
(8)	АВ123	ССС	дСТ Сад СТС СТд ддд	СТС СТд
(9)	АВ124	ССС	ТдС ТСА дСТ ССТ ддд	дСТ дС
(Ю)	АВ125	ССС	АдС дСА дет ТСТ СТГ	ССТ ССТ дС
(11)	АВ 126	АТд	дАА ССА Тдд ААд ССС	САд САС АдС
	ν_κ З'-лидерный праймер
(12)	АВ16	Сдд	дАА дАТ дАА дАС АдА	тд

Условия ПЦР (полимеразной цепной реакции), используемые для амплификации У_Н- и У_ьобластей с целью клонирования.

ПЦР проводят с помощью полимеразы Αтр1^Τа^ ро1утегазе (Регкш Е1тег) при использовании системы ПЦР СепеАтр 9700 (Регкш Е1тег Аррйей ВшзузЧетз, Ρо8ΐе^ Сйу, СА, И8А).

Протокол цикла ПЦР

94° 2' циклов 94° 30

65° 30, минус 1°/цикп

72° 30 циклов 94° 30”

55° 30”

72° 30

72° 10' охлаждение до 4°

Клонирование У_Н и У_ь в системе вектора рСЕМΤ I.

После анализа продуктов ПЦР на агарозном геле данные продукты очищают на колонках для микроцентрифуги 8-400 или 8300 (АтешКат РКагтас1а Вш1есК 1пс., Р18са1а^ау, Ν4, И8А) или с помощью набора для гель-экстракции О1АЕХ II (01адеп СтЬН, Нййеи, Сегтапу). Для каждого эксперимента 2 независимо амплифицированных с использованием ΡВ1 или лидерных праймеров продукта ПЦР каждой У_Н- и У|,-области клонируют в систему I вектора рСЕМΤ (Рготеда) в соответствии с протоколом изготовителя.

После трансформации в Е. сой ЭН5а проводят скрининг отдельных клонов путем ПЦР колоний с использованием праймеров Τ7 и 8Р6, 30 циклов при 55°. Плазмидную ДНК из каждой отдельной колонии очищают с использованием минипрепаративного набора 01аргер (01адеп). Для дальнейшего анализа проводят разрезание продукта с помощью №о1/Ж11 (ΝΉ Вш1аЬ8, Ипйей Кшдйот и ВосКе 0|адпо5Ес5) и анализ на агарозном геле.

- 36 015897

Секвенирование.

У-области секвенируют после клонирования в систему I вектора рСЕМТ. Праймеры Т7 и Зр6 (Еигодепбес. Ьшк. Ве1дшт) используют в комбинации с набором последовательностей: Готовый к употреблению реакционный набор для секвенирования с терминатором цикла (Тегтшабог Сус1е Зесщепсшд Яеабу Яеасйоп К1б) АВ1 РгЬт В1дИуе (АррНеб Вюкукбетк. ХУагппдЮп. Ишбеб Кшдбот) согласно протоколу. Реакции проводят на секвенаторе АВ1 РЯ1ЗМ 377 (РЕ Аррйеб Вюкукбетк) и анализируют последовательности с помощью программы ИИАЗбаг. Зес.|тап11. Затем последовательности сравнивают с помощью элайнмента с последовательностями У-гена зародышевой линии в УВАЗЕ (\\л\лу.шгссре.сат.ас.ик/1тб-6ос/риЬ11с/тбго.Шт).

Клонирование и секвенирование У_Н- и У_ъ-области 146В7.

У_Н- и Уь-области из гибридомы 146В7 амплифицируют с помощью ПЦР и клонируют в систему I вектора рСЕМТ с целью определения последовательности кДНК. Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности представляют на фиг. 2 (ЗЕС ГО N0: 1 и 2) и фиг. 3 (ЗЕС ГО N0: 3 и 4) соответственно. Указаны также каркасный сегмент (ЕЯ) и гипервариабельные участки (СИЯ).

Семейство зародышевой линии.

У_Н-области 146В7 согласно данным элайнмента в У-базе представлено: У_Н5-51 (подгруппа У_Н5). И2-15/И2 (сегмент И_Н). 6Н4Ь (сегмент б_Н). Семейство зародышевой линии У_ь-области 146В7 согласно данным элайнмента в У-базе представлено: А27 (подгруппа У_к111) и б_К2 (сегмент б_К). Дополнительная информация. касающаяся доменов У_Н и У_ь. представлена в базе данных КаЬаб 1Шр://нптипо.Ьте.п\\т1.еби/или 1Шр://\\л\л\-.УЬа5е.сот.

Пример 6. Характеристики аффинности связывания 146В7.

Аффинность 146В7 анализируют с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (ЗРЯ) с помощью прибора В1АС0ЯЕ 3000 с целью определения биомолекулярных взаимодействий белков согласно следующим процедурам. Определяют изменения в сигнале ЗРЯ на поверхностном слое. вызываемые биомолекулярным связыванием. и они означают изменения в концентрации массы в поверхностном слое. Аффинность выражают с помощью следующих определений: к_а = константа скорости ассоциации (М^-1 с^-1); кб = константа равновесия диссоциации (с^-1); КА = константа равновесия ассоциации = к_а/к_б (М^-1) и К_с = константа равновесия диссоциации = к,|/к., (М).

Для получения значения аффинности 146В7 к человеческому ИЛ-15 (1ИЛ-15) проводят различные процедуры. Человеческий рекомбинантный ИЛ-15 от двух различных производителей (1ттипех согр.. Зеаббе. ИЗА апб Рергобесй. Яоску Н111. N6. ИЗА) связывают с сенсорным чипом СМ5. Соединение. связанное с сенсорным чипом. определяют как лиганд. В других экспериментах в качестве лиганда используют 146В7.

В каждом варианте кинетического анализа связывание аналита. 146В7 или 1ИЛ-15. адаптированного к лиганду. связанному с сенсорным чипом. сравнивают со связыванием с эталонным контрольным сенсорным чипом СМ5. Тестируют серийные разведения аналита (0. 3.125. 6.25. 12.5. 25. 50 мкг/мл). Кривые ассоциации и диссоциации аппроксимируют для мономерного взаимодействия в соответствии с моделью Ьапдтшг 1:1 для определения к_а и к_б и для вычисления К_А и К_с. Все данные анализируют с использованием программы ВIА-Еνа1иаΐ^οη. версия 3.1. Для бивалентного взаимодействия используют модель бивалентного аналита. Все анализы корректируют относительно смещающейся базовой линии.

Для определения аффинности антитела 146В7 данную аффинность антитела 146В7 измеряют относительно человеческого рекомбинантного ИЛ-15. полученного от двух производителей. 1ттипех и Рергобесй. на приборе В1АС0ЯЕ 3000. Моновалентное взаимодействие определяют с использованием 146В7 в качестве лиганда и 1ИЛ-15 в качестве аналита (аппроксимация кривой Ьапдтшг 1:1).

Аффинность 146В7 к ИЛ-15 (1ттипех Согр.) измеряют следующим образом:

константа скорости ассоциации к_а: 1.07 (± 0.17)х 10⁵ М^-1 с^-1 константа скорости диссоциации к_б: 6.56 (± 0.09)х10^-3 с^-1константа равновесия ассоциации КА: 1.55 (+ 0.21)х 10⁷ М^-1константа равновесия диссоциации Кс : 6.59 (± 0.88)х 10^-8 М Для определения авидности 146В7 в качестве лиганда используют ИЛ-15 (1ттипех Согр.) и в качестве аналита используют 146В7. При анализе полученных данных с использованием аппроксимации кривой Ьапдтшг (1:1). отражающей бивалентное взаимодействие антитела. определяют авидность антитела.

Авидность 146В7 в отношении ИЛ-15 (1ттипех Согр.) измеряют следующим образом:

константа скорости ассоциации к_а: 7.30 (± 0.81)х10⁵ М^-1 с^-1 константа скорости диссоциации к_б: 1.45 (+ 2.05)х 10^-3 с^-1константа равновесия ассоциации КА: 5.03 (+ 3.40)х 10⁸ М^-1константа равновесия диссоциации Кс: 1.55 (+ 1.24)х10^-9 М Определяют также аффинность и авидность 146В7 в отношении ИЛ-15. полученного от Рергобесй. Не обнаруживают никаких важных различий в аффинности или авидности ИЛ-15. полученного из раз

- 37 015897 ных источников.

Как описано в примере ниже, касающемся подавления индуцируемой человеческим интерлейкином-15 (НИЛ-15) пролиферации клеток СЬЬЬ-2 и РВМС полностью человеческим антителом против ИЛ-15, 146В7 подавляет доза-зависимым образом индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию, что измеряют по включению [³Н]-тимидина. 1С₅₀ - концентрация 50% ингибирования, как более функциональное определение аффинности, на основании данных экспериментов по подавлению пролиферации по расчетам составляет 3,1 + 0,91 нМ. Данное значение 1С₅₀ согласуется с авидностью, измеряемой с помощью прибора В1АСОКЕ 3000 (КО 1,5 нМ) при использовании 146В7 в качестве лиганда и рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и подтверждает значения аффинности и авидности, полученные в данной работе.

Пример 7. Ингибирование индуцируемой НИЛ-15 продукции ΤΝΡ-α полностью человеческими антителами против ИЛ-15.

Эффект полностью человеческих антител против ИЛ-15 146В7,146Н5, 404Е4 и 404А8 на индуцируемую ИЛ-15 продукцию ΤΝΡ-α изучают с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), выделенных от здоровых добровольных участников эксперимента с использованием следующих процедур. Для оценки специфичности ИЛ-15 исследуют также эффект данных антител на опосредуемую ИЛ-2 продукцию ΤΝΡ-α.

Культура клеток.

Культуры поддерживают в КРМ1-1640 с добавлением 2мМ Ь-глутамина, 100 Ιυ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все вещества приобретают в фирме Ь1Ре ТесЬпо1од1е8, Рак1еу, 8соНапб) и 10% инактивированной нагреванием сыворотке телячьих эмбрионов (НуС1опе, ШаН, и8А).

Очистка мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

В свежую человеческую кровь, взятую у добровольных участников эксперимента после согласия на основе полученной информации, добавляют гепарин для предохранения от свертывания. Очистку РВМС осуществляют путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколла (РНагтас1а, иррка1а, 8\\'ебеп).

Тест-соединение.

НИЛ-15, партия по: 6870-011, 1ттипех согр., 8еаН1е, ^акЫпдоп, и8А.

НИЛ-2, СЫгоп Вепе1их ΒV, Атйегбат, ТНе №1Нег1апбк.

Используемые полностью человеческие антитела: 146В7 (серия 070101), 146В7КИ1^07, 404А8 (серия 030101), 404Е4 (серия 080101) и изотипическое контрольное антитело Т1 (97-2В11-2В12, серия 190900).

Ингибирование индуцируемой человеческим ИЛ-15 (НИЛ-15) или НИЛ-2 продукции ΤΝΡ-α в РВМС с помощью антител против ИЛ-15.

РВМС культивируют в трех или четырех повторностях в 96-луночных плоскодонных платах в концентрации 1,5х10⁵ клеток/лунку в присутствии и в отсутствие НИЛ-2 или НИЛ-15 и с добавлением или без добавления антитела против ИЛ-15. Изотипическое контрольное антитело (Т1) включают в качестве отрицательного контроля. Конканавалин А (в концентрации 2,5 мкг/мл, Са1ЬюсНет) добавляют в качестве положительного контроля для пролиферации. Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37°С и содержании 5% СО₂. Супернатанты собирают для определения количества человеческого ΤΝΡ-α с помощью ЕЫ8А (υ-СуΤесН, икесНН Τίκ №1Нег1апбк).

Эффекты 146В7 и изотипического контрольного антитела тестируют в отношении опосредованной ИЛ-15 продукции ΤΝΡ-α в РВМС. 146В7 подавляет опосредованную ИЛ-15 продукцию ΤΝΡ-α доза-зависимым образом, тогда как изотипическое контрольное антитело не подавляет индуцированную ИЛ-15 продукцию ΤΝΡ-α (см. фиг. 4). Представлены данные по двум здоровым добровольным участникам эксперимента. 404Е4 и 404А8 не способны подавлять индуцированную ИЛ-15 продукцию ΤΝΡ-α.

Для того чтобы убедиться в специфичности антител против ИЛ-15, оценивают их эффект на опосредованную НИЛ-2 продукцию ΤΝΡ-α. 146В7 не индуцируют никакого ингибирования опосредованной ИЛ-2 продукции ΤΝΡ-α (см. фиг. 5). Не обнаруживают никакого доза-зависимого ингибирования опосредованной НИЛ-2 продукции ΤΝΡ-α ни со стороны 404Е4, ни со стороны 404А8.

Доза-зависимое ингибирование опосредованной НИЛ-15 продукции ΤΝΡ-α отмечают только у 146В7, но не у 404Е4 и 404А8. Подавляющий эффект является специфическим для НИЛ-15; не происходит ингибирование ИЛ-2-опосредованной продукции ΤΝΡ-α.

Пример 8. Ингибирование индуцируемой человеческим интерлейкином-15 (НИЛ-15) пролиферации клеток СТЬЬ-2 и РВМС полностью человеческими антителами против ИЛ-15.

Антитела 146В7, 46Н5, 404Е4 и 404А8 тестируют в отношении их способности подавлять пролиферацию Τ-клеток с использованием клеток СТЬЬ-2 (см. статью СШЬ и соавт., 1978) и мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с помощью следующих процедур.

- 38 015897

Культура клеток.

Культуры поддерживают в КРМ1-1640 с добавлением 2мМ Ь-глутамина, 100 ΐυ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все вещества фирмы ЫГе ТесНпо1од1е5. Ра1к1еу, 8со!1апй) и 10% инактивированной нагреванием сыворотке телячьих эмбрионов (НуС1опе, и!аН, υδΆ). Клетки СТЬЬ-2 (см. статью ΟΪ11Ϊ8 и соавт., 1978) поддерживают в вышеупомянутой среде с добавлением 36 единиц НИЛ-2/мл (СЫгоп Вепе1их ΒV, Атйегйат, ТНе ЫеШейапйк) при дефиците НИЛ-2 в течение 3-4 дней до начала эксперимента. Клетки СТЬЬ-2 трижды промывают перед использованием.

В свежую человеческую кровь, взятую у добровольных участников эксперимента после согласия на основе полученной информации, добавляют гепарин для предохранения от свертывания. Очистку РВМС осуществляют путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколла (РНагтас1а, иррка1а, 8\\'ейеп).

Тест-соединение.

НИЛ-15, партия по: 6870-011, 1ттипех согр., 8еаН1е, ’№а8Ыпд1оп, и8А.

НИЛ-2, СН1гоп Вепе1их ΒV, Атйегйат, ТНе Ые!Нег1апйк.

Антитела против ИЛ-15, используемые для анализа СТЬЬ-2 в данной работе, представляют на фиг. 6: 146В7, 146Н5, 404А8, 404Е4.

Антитела против ИЛ-15, используемые для анализа РВМС: 146В7 (серия 070101), 404А8 (серия 030101) и 404Е4 (серия 080101).

Ингибирование индуцируемой человеческим ИЛ-15 (НИЛ-15) или НИЛ-2 пролиферации СТЬЬ-2 антителами против ИЛ-15.

В каждом эксперименте клетки засевают в трех повторностях в 96-луночные платы по 5х10³ клеток/лунку в присутствии или в отсутствие НИЛ-2 или НИЛ-15. Для оценки эффекта на пролиферацию добавляют каждое из четырех антител против ИЛ-15. Клетки инкубируют в течение 16 ч при 37°С и при содержании 5% СО₂. За 4 ч до сбора (Нагуек1ег 96 МасН II М, ТОМТЕС, Огапде СТ, и8А) добавляют [³Н]-тимидин (1 мКи/лунку, АтегкНат ЫГе 8с1епсек, ЬННе СНа1Гоп!, ВисШпНаткЫге, иК).

Как представляют на фиг. 6, 146В7 и 146Н5 снижают пролиферацию клеток СТЬЬ-2, индуцируемую ИЛ-15, доза-зависимым образом, что отражается в уменьшении включения [³Н]-тимидина. Оба, как 404Е4, так и 404А8, не способны блокировать индуцируемую ИЛ-15 пролиферацию клеток СТЬЬ2.

Ингибирование индуцируемой человеческим ИЛ-15 (НИЛ-15) или НИЛ-2 пролиферации РВМС антителами против ИЛ-15.

РВМС культивируют в трех повторностях в 96-луночных платах с υ-образным дном (Ыипс, №1де Ыипс 1п1егпа1юпаН Иептагк), по 5х10⁴ клеток/лунку в присутствии или в отсутствие НИЛ-2 или НИЛ-15 и антител против ИЛ-15. Конканавалин А (2,5 2,5 мкг/мл, Са1ЬюсНет) добавляют в качестве положительного контроля для пролиферации. Клетки инкубируют в течение 72 ч при 37°С и содержании 5% СО₂. За 16 ч до сбора (Нагуек1ег 96, ТОМТЕС, Огапде СТ, и8А) добавляют [³Н]-тимидин (1 мКи/лунку, АтегкНат Ь1Ге 8с1епсек, ЬН11е СНа1Гоп!, ВисШпНаткЫге, иК).

146В7 обладает способностью ингибировать индуцируемое ИЛ-15 включение [³Н]-тимидина дозазависимым образом и, следовательно, ингибировать пролиферацию (1С₅₀ = 3,1 + 0,91 нМ).(фиг. 7) Оба, как 404Е4, так и 404А8, не способны блокировать пролиферацию РВМС, индуцируемую НИЛ-1 (фиг. 89). 146Н5 не тестируют в соответствии с данными, полученными в предварительно проведенных экспериментах. Для того чтобы удостовериться в специфичности 146В7, 404Е4 и 404А8 в отношении ИЛ-15, данные антитела оценивают также по их эффектам в отношении 1Ь-2-опосредованной пролиферации. Ни одно из тестируемых антител против ИЛ-15 не обладает эффектом на пролиферацию, индуцируемую 1Ь-2 (см. фиг. 7-9).

Пример 9. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 связывается с человеческим ИЛ-15, присутствующим на человеческих РВМС.

Тест-соединения.

Человеческие РВМС получают от здоровых добровольных участников эксперимента после согласия на основе полученной информации. Используют антитело 146В7 (серия по. МИХ015), Мейагех 1ЫС., МЛрНак, СА, и8А.

Биотинилирование 146В7 и человеческого 1дС.

Ν-гидроксисукцинимидобиотин (81дта) сначала разводят в ДМСО (диметилсульфоксид) (конечная концентрация 100 мг/мл), а затем в 0,1 М ЫАНСО₃ (конечная концентрация 1 мг/мл, 81дта). На 1 мг антитела, разведенного в 1 мл, добавляют 600 мкл раствора биотина (в темноте, экспозиция 2 ч, при комнатной температуре). Раствор антитела-биотина диализуют в кассете для диализа 8Нйе-а-1ухег™ (10,000 МVСО, Р1егсе, РегЬю 8с1епсе, Ые1Нег1апйк) (в течение ночи при 4°С) для удаления несвязанного биотина. На следующий день проводят спектрофотометрическое определение концентрации биотинилированных антител (иНгокрес 2100рго) при ОИ (оптической плотности) 280 нм.

- 39 015897

Стимуляция периферической крови.

Для индукции ИЛ-15 кровь берут из вены здоровых добровольных участников эксперимента. РВМС культивируют в ΗΡΜΙ 1640 (Вю^Ыбакег Еигоре) с добавлением пенициллина (5 ед./мл), стрептомицина (50 мкг/мл), Ь-глутамина (2 мМ) (Вю^Ыбакег Еигоре) и 10% сыворотки телячьих эмбрионов (0рйтит С241, Ми1бсе11, ХУбегИ Ιπο.) максимум в течение 2 дней (37°С) и проводят стимуляцию 500ед./мл ШЫ^(интерферона^) (Воебппдег ШдеШет).

Проточная цитометрия.

Клетки предварительно инкубируют с 10% человеческой сывороткой АВ (СЬВ, Атбегбат, №111ейапбк) в №ΜΙ 1640 (Вю^Ыбакег Еигоре) с добавлением пенициллина (5 ед./мл), стрептомицина (50 мкг/мл), Ь-глутамина (2 мМ) (Вю^Ыбакег Еигоре) и 10% сыворотки телячьих эмбрионов (0рйтит С241, Ми1бсе11, ХУбегИ Ιηα). После нарушения проницаемости клеточной мембраны (пермеабилизации) (20 мин, 4°С с использованием набора Су!ойх/Су!орегт™, Вес1оп Оюкшкоп, 8ап О1едо, СА) и отмывания в буфере РегшЖакй (набор Су!ойх/Су!орегт™) РВМС проявляют ИЛ-15 с помощью проточной цитометрии. Для достижения постоянной проницаемости используют буфер Регш/^акй (набор Су1ойх/Су!орегт™) в течение всей процедуры проявления. Затем после инкубирования клеток с биотинилированным 146В7 или биотинилированным ЫдС1 (20 мкг/мл, 30 мин, 4°С) и отмывания в буфере РегшЖакй клетки инкубируют со стрептавидин-фикоэритрином (ΌΛΚ0) в течение 30 мин (4°С). После анализа с помощью проточной цитометрии (РАС8 СаИЬиг, Вес!оп Оюкшкоп) при установке дискриминационного окна на моноциты определяют интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец с использованием программного обеспечения СеИОией Рго. Данные показывают коэффициент стимуляции (8.Ι.), который вычисляют следующим образом: 8.Ι. = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания).

Иммуноцитохимия.

Для детекции ИЛ-15, присутствующего в человеческих моноцитах, делают препараты образцов цельной крови с помощью цитоцентрифуги. После осаждения 5х10⁴ клеток (200 мкл) на покровные стекла для микроскопирования 8ирегГгой®-Р1и8(Мепхе1), покровные стекла подсушивают на воздухе (< 60 мин), фиксируют в 2% параформальдегиде/РВ8 (8 мин, 4°С), промывают в РВ8 и снова подсушивают на воздухе. Перед окрашиванием у препаратов, полученных с помощью цитоцентрифуги, нарушают клеточную мембрану в РВ8 с добавление 0,1% сапонина (РВ88), который впоследствии используют во всей процедуре окрашивания. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, инкубируют с 0,05% (об./об.) пероксидом водорода (Н₂0₂), разведенным в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,8, 20 мин, при комнатной температуре). После отмывания в РВ88 активность эндогенного биотина блокируют в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для блокирования биотина, Vесΐο^ ЬаЬ., ОАК0). После отмывания с помощью РВ88 центры неспецифического связывания блокируют посредством инкубирования препаратов, полученных с помощью цитоцентрифуги, с 10% (об./об.) человеческой объединенной сывороткой АВ (СЬВ, Атбегбат, №!бег1апб8) (30 мин) в РВ88. После этого препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, инкубируют с биотинилированным первичным антителом (60 мин при комнатной температуре) и (после отмывания в РВ88) со стрептавидином, комплексированным с биотинилированной пероксидазой хрена (бгер!АВСотр1ех/НКР, ОАК0; разведение 1:100 в РВ88, содержащим 2% человеческой сыворотки АВ, в течение 30 мин при комнатной температуре). После отмывания в РВ88 препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, инкубируют с 3-амино-9-этилкарбазолом (0,5 мг/мл) и Н₂0₂ (0,01%) в буфере на основе цитрата натрия (50 мМ, рН 4,9) в течение 10 мин (при комнатной температуре) с целью детекции активности НКР (пероксидазы хрена). Препараты, полученные с помощью цитоцентрифуги, отмывают под струей водопроводной воды в течение 5 мин, проводят контрастное окрашивание гематоксилином (ОАК0) в течение одной минуты, отмывают под струей водопроводной воды в течение еще 5 мин и заключают в ГагатошП или глицергель (ОАК0).

Проточная цитометрия.

Связывание 146В7 со стимулированными ΙΕΝ-γ человеческими моноцитами представлено на фиг. 10. Биотинилированное 146В7 связывается с нестимулированными моноцитами, демонстрируя присутствие ИЛ-15 в нестимулированных клетках. Стимуляция моноцитов с помощью ΙΕΝ-γ приводит к повышению связывания 146В7 с клетками при достижении максимума на первый день культивирования. Контрольное антитело ЫдС1 демонстрирует слабое связывание с нестимулированными моноцитами. Стимуляция с помощью ΙΕΝ-γ повышает связывание ЫдС1, обусловленное повышенной экспрессией рецепторов Есу на моноцитах.

Иммуноцитохимия.

На фиг. 11 представляют окрашивание человеческих моноцитов 146В7 или контрольным антителом ЫдС1. Прозрачное красное окрашивание цитоплазмы наблюдают после инкубирования клеток с 146В7, но не с контрольным антителом. Соответственно 146В7 связывает 1ИЛ-15 в моноцитах, и данное связывание возрастает после стимуляции ΙΕΝ-γ. На фиг. 11 показывают также, что окрашивание ИЛ-15 в основном является внутриклеточным.

- 40 015897

Пример 10. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 связывает ИЛ-15 в тканях по данным иммуногистохимии.

Тест-соединения.

Образцы ткани человеческой пораженной псориазом кожи получают после согласия на основе полученной информации. Ьошке УШабкеп, Отделение дерматологии, Университетская больница Сеп1ойе, Сорепйадеп, Ьептагк.

Антитело 146В7 (серия по. МОх015), Мебагех, Мйрйак, СА, И8А.

Биотинилирование 146В7 и человеческого !с|С.

№гидроксисукцинимидобиотин (81дта) сначала разводят в ДМСО (конечная концентрация 100 мг/мл), а затем в 0,1 М NΑНСОз (конечная концентрация 1 мг/мл, 81дта). На 1 мг антитела, разведенного в 1 мл, добавляют 600 мкл раствора биотина (в темноте, экспозиция 2 ч, при комнатной температуре). Раствор антитела-биотина диализуют в кассете для диализа кНбе-а-1ухег™ (10,000 М^СО, Р1егсе, РегЫо 8с1епсе, №Шег1апбк) (в течение ночи при 4°С) для удаления несвязанного биотина. На следующий день проводят спектрофотометрическое определение концентрации биотинилированных антител (ИЙгокрес 2100рго) при ОЬ 280 нм.

Иммуногистохимия.

Ткани хранят при -80°С до проведения анализа. После оттаивания срезы тканей фиксируют в ацетоне (10 мин при комнатной температуре) и подсушивают на воздухе. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы срезы инкубируют с 0,05% (об./об.) пероксидом водорода (Н₂О₂), разведенным в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,8, 20 мин, при комнатной температуре). После отмывания в РВ8-Твин 20 (РВ8Т, 0,05% об./об.) активность эндогенного биотина блокируют в соответствии с инструкциями изготовителя (набор для блокирования биотина, УесЮг ЬаЬ., ЭАКО). После отмывания с помощью РВ8Т центры неспецифического связывания блокируют посредством инкубирования срезов с 10% (об./об.) человеческой объединенной сывороткой АВ (СЬВ, Атйегбат, №Шег1аибк) (30 мин) в РВ8Т. Сыворотку удаляют промоканием, а затем инкубируют срезы с биотинилированным первичным антителом (146В7 или ЫдС1), разведенным в РВ8, содержащим 2% человеческой сыворотки АВ, в течение 60 мин при комнатной температуре. Срезы отмывают в РВ8Т. После отмывания в РВ8Т все срезы тканей инкубируют со к1гер1АВСотр1ех/НКР (ПАКО; 1:100, разведенном в РВ8, содержащим 2% человеческой сыворотки АВ в течение 30 мин при комнатной температуре). После отмывания в РВ8Т срезы инкубируют с 3-амино-9-этилкарбазолом (0,5 мг/мл) и Н₂О₂ (0,01%) в буфере на основе цитрата натрия (50 мМ, рН 4,9) в течение 10 мин (при комнатной температуре) с целью детекции активности НВР. Срезы отмывают под струей водопроводной воды в течение 5 мин, проводят контрастное окрашивание гематоксилином (ПАКО) в течение одной минуты, отмывают под струей водопроводной воды в течение еще 5 мин и заключают в Рагатоип! или глицергель (ЭАКО).

Результаты.

Прозрачное окрашивание цитоплазмы кератиноцитов в пораженной псориазом коже наблюдают после окрашивания срезов тканей 146В7, но не контрольным антителом (см. фиг. 12; 146В7 окрашивает ИЛ-15-положительные кератиноциты, полученные из псориазных бляшек).

Пример 11. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 блокирует ИЛ-15 в химерных тканях типа мышь 8СГО-человек, что приводит к значительному подавлению воспаления как в тканях, пораженных псориазом, так и в тканях, пораженных артритом.

Тест-соединения.

Синовиальная ткань получена от пациентов с ювенильным ревматоидным артритом после согласия на основе полученной информации; А1ехе1 Сгош, Отделение детской ревматологии, Медицинский центр детской больницы, Стсшиай, ОЫо, И8А.

Биоптаты кератом - образцы ткани получены после согласия на основе полученной информации. Ьошке УШабкеп, Отделение дерматологии, Университетская больница Сеп1ойе, Сорепйадеп, Ьептагк.

Антитело 146В7 (серия по. МОх015), Мебагех 1пс., Аппапба1е, N1, И8А для экспериментов с целью исследования псориаза.

Антитело 146В7 (серия по. 15-ООВЭ1^07), Мебагех 1пс.,Аппапба1е, N1, И8А для экспериментов с целью исследования ревматоидного артрита.

Блокирование ИЛ-15 в химерных синовиальных тканях типа мышь 8СГО-человек.

Образцы свежей синовиальной ткани получают от пациентов с ювенильным ревматоидным артритом после хирургических операций по замене сустава. Образцы отбирают в стерильных условиях. Измельченные фрагменты ткани из целого образца синовиальной ткани тщательно перемешивают, добиваясь гомогенности каждого препарата. Измельченные ткани (2-4 трансплантата/животное; 100 мг/один участок) трансплантируют подкожно в области спины мышей ЗСГО^ОО (басккоп ЬаЬогаЮпек). Каждое животное получает 146В7 (500 мкг, внтурибрюшинно (1.р.)) или РВ8 в день имплантации трансплантата и в дни 7, 14 и 21 после имплантации. Животных умерщвляют в день 28 после имплантации. Синовиальные трансплантаты вырезают и помещают в формалин для окрашивания Н&Е (гематоксилином/эозином).

- 41 015897

Количественная оценки окрашивания Η&Ε тканей, полученных из химерных синовиальных тканей типа мышь 8СГО-человек (модификация методики, предложенной в статье ЬеНг и соавт., 1. И|к1осНет. Су!осНет., 1997, 45:1559).

После получения цифровых изображений (2600x2060, _)рд) срезов химерных синовиальных тканей типа мышь 8СГО-человек с использованием объектива х10 (2е1кк тюгоксоре; программа Ахюуйюп), данные анализируют с помощью компьютера, используя программу РНо!окНор, версия 6.0 (АбоЬе 8ук!етк, МоиШаш У1ете, СА) и уменьшают разрешение до 1300x1300 пиксел.

В каждом срезе выбирают шесть х10 полей для наилучшего отражения общего окрашивания ткани на целом предметном стекле. После отбора всех окрашенных ядер (волшебная палочка на темном ядре при допуске 10) строят график оптической плотности выбранной площади и регистрируют среднюю интенсивность окрашивания (после выбора команды гистограммы аналогичного изображения). Затем выбирают фон и проводят количественную оценку окрашивания (волшебная палочка на фоне при допуске 10). Интенсивность окрашивания рассчитывают как разницу между окрашиванием ядер и окрашиванием фона. Это определяет цитохимический коэффициент в произвольных единицах. Данные представляют как среднее значение и к.е.т. (стандартная ошибка). Данные анализируют с использованием критерия Стьюдента.

Блокирование ИЛ-15 в химерных пораженных псориазом тканях типа мышь 8СГО-человек.

Биоптаты кератом получают из псориазных бляшек двух пациентов, делят и трансплантируют мышам С.В-17 8С1Э (Засккоп БаЬогаЮпек). Через три недели после трансплантации мыши получают РВ8 (плацебо), СкА (циклоспорин А)(8апбох) в дозе 10 мг/кг на каждый второй день в течение 15 дней или 146В7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляют и из каждого ксенотрансплантата берут пункционную биопсию 4 мм. Биоптаты фиксируют в формалине для заключения в парафин и окрашивают Η&Ε (фиг. 15) и на ядерный антиген Κί-67 (фиг. 16).

Количественная оценка иммуногистохимического окрашивания тканей из химерных пораженных псориазом тканей типа мышь 8СГО-человек.

Окрашенные Η&Ε срезы оценивают по толщине эпидермиса (мкм), степени паракератоза (от 0 до 3) и числу воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое эпидермиса. Срезы, окрашенные на Κί-67, оценивают по числу циклирующих (митотически активных) кератиноцитов/мм² среза. Вычисляют средние значения для 4 мышей в каждой группе лечения и суммируют данные по каждому пациенту как среднее значение и к.е.т.

Модель 8СГО/КА.

Микроскопическое исследование срезов показывает, что наиболее темноокрашенные ядра находятся на инфильтрующихся клетках. Вследствие этого число ядер (измеренное как относительная площадь поверхности) считают мерой инфильтрации. Инъекция 146В7 уменьшает число клеток, инфильтрующихся в воспаленную синовиальную ткань, по сравнению с введением носителя (см. фиг. 13А, р<0.05). На фиг. 13В и 13С проиллюстрированы эффекты 146В7 (фиг. 13С) на инфильтрацию клеток в ксенотрансплантат синовиальной ткани и показывает уменьшение числа клеток с темными ядрами по сравнению с введением носителя (фиг. 13В).

Модель 8СГО/псориаз.

На фиг. 14 представляют мышей 8СГО/псориаз, леченных 146В7 или контрольным препаратом. По сравнению с носителем (РВ8) инъекции 146В7 снижают тяжесть псориаза, определенную по толщине эпидермиса, который измеряют от рогового слоя до начала ограничивающей сети (см. фиг. 14А): РВ8 (177,8 ± 42,2 мкм), СкА (91,0 ± 15,2 мкм), 146В7 (62,5 ± 9,1 мкм).

Уменьшение толщины наблюдают также при измерении от рогового слоя до самой глубокой части ограничивающей сети (см. фиг. 14В): РВ8 (433,8 ± 32,1 мкм), СкА (303,8 ± 62,9 мкм) и 146В7 (208,0 ± 33,8 мкм). Степень паракератоза также снижается при лечении 146В7 (см. фиг. 14С): РВ8(1,6 ± 0,4), СкА (1,3 ± 0,3), 146В7 (0,5 ± 0,3). Более того, 146В7 снижает число воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое дермы (см. фиг. 14Ό): РВ8(33,3 ± 1,9 мононуклеарных клеток), СкА (19,4 ± 8,5), 146В7(16,4 ± 0,1). Экспрессия человеческого белка Κί-67 жестко связана с пролиферацией клеток. В период интерфазы антиген может быть обнаружен исключительно в ядре, тогда как во время митоза большая часть белка переходит на поверхность хромосом. Тот факт, что белок Κί-67 присутствует на всех активных фазах клеточного цикла (С(1), 8, 0(2) и митоза), но отсутствует в покоящихся клетках (0(0)), делает его хорошим маркером для определения так называемой фракции роста данной популяции клеток. 146В7 снижает число циклирующих кератиноцитов Κ1-67+ (см. фиг. 14Е): РВ8 (247,9 ± 77,0), СкА (116,0 ± 24,1), 146В7 (73,8 ± 9,9).

Воздействие 146В7 подавляет инфильтрацию воспалительных клеток в воспаленную ткань на человеческих моделях ревматоидного артрита на 8СГО. Более того, у мышей 8СГО с имплантированными человеческими псориазными бляшками лечение с помощью 146В7 снижает тяжесть псориаза по сравнению с лечением СкА. Действительно, лечение 146В7 приводит к сильному снижению воспаления, толщины эпидермиса, числа делящихся кератиноцитов и тяжести паракератоза у человека/мышей 8СГО.

- 42 015897

Пример 12. Человеческое антитело против ИЛ-15 146В7 распознает связанный с рецептором ИЛ15.

Тест-соединения.

ЫдС1-человеческое контрольное антитело (81дта).

Антитело 146В7-Мебагех 1пс., Аипаиба1е, N1, И8А. МИх015.

Клетки Кар с конститутивной экспрессией ИЛ-15Ка (МагДи О1еише. Теиотик Кекеагсй ЬаЬога1огу. 8оиШатр1ои Сеиега1 Нокрйа1. 8оиШатр1ои. и.К.).

Биотинилирование 146В7 и человеческого 1с.|С.

Ν-гидроксисукцинимидо-биотин (8щта) сначала разводят в ДМСО (конечное разведение 100 мг/мл). а затем в 0.1 М ΝΑΗ00₃ (конечное разведение 1 мг/мл. 81дта). На 1 мг антитела. разведенного в 1 мл. добавляют 600 мкл раствора биотина (в темноте. экспозиция 2 ч. при комнатной температуре). Раствор антитела-биотина диализуют в кассете для диализа кПбе-а-Кхег™ (10000 Μ\νί.Ό. йегсе. РегЬю 8с1еисе. Nеΐйе^1аибк) (в течение ночи при 4°С) для удаления несвязанного биотина. На следующий день проводят спектрофотометрическое определение концентрации биотинилированных антител (ШХгокрес 2100рго) при 0Ό 280 нм.

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15Ка в ЕЬ18А.

После покрытия (в течение ночи при комнатной температуре) плоскодонных планшетов для микротитрования (Огешег) ИЛ-15Ка (Κ&Ό куЧетк. Мшпеаройч ΜΝ. И8А) платы инкубируют с РВ8 и куриной сывороткой (2%. при комнатной температуре. 60 мин). Затем после отмывания в РВ8 (с добавлением 0.05% Твин 20: РВ8Т) платы инкубируют с различными разведениями немеченого ИЛ-15 (50 мкл. при комнатной температуре. 1ттииех. 8еаИ1е. И8А). Через 10 мин в лунки добавляют биотинилированные антитела (50 мкл) в различных концентрациях (экспозиция 90 мин при комнатной температуре). После отмывания в РВ8Т платы инкубируют (60 мин при комнатной температуре) со стрептавидинполипероксидаза хрена (СЬВ. АтЧегбат. №Хйег1аибк). разведенным 1:10000 в РВ8Т-С (РВ8Т и 2% куриная сыворотка). Наконец. платы отмывают. а затем инкубируют с АВТ8 (азино-бис-3этилбензтиазолинсульфокислотой. Косйе О1адиокйск. Маиийе1т. Оегтаиу) в буфере АВТ8 согласно протоколу изготовителя. Цветную реакцию останавливают 2% щавелевой кислотой (50 мкл). Связывание определяют при длине волны 405 нм с помощью ридера для ЕЫ8А ЕБ808 (Вю-Тек 1икХгитеи1к. Утооккг УТ. Ц8А).

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15-ИЛ-15К на клетках Кар.

Клетки Ка_р предварительно инкубируют (20 мин при 4°С) с 10% человеческой объединенной сывороткой АВ (СЬВ. АтЧегбат. №Хйег1аибк) в буфере ЕАС8 (РВ8. 0.05% В8А. 0.02% NΑN0₃). Клетки Ка_р (в концентрации 1-2х10₅ клеток/мл) помещают в лунки и добавляют 50 мкл немеченого ИЛ-15 в нескольких концентрациях (разведенного в буфере ЕАС8 с 10% человеческой сывороткой АВ). После инкубирования клеток в течение 30 мин (при 4°С) и двукратного промывания в буфере ЕАС8 в лунки добавляют 50 мкл биотинилированного антитела (146В7 или 11П1С1) (экспозиция 30 мин при 4°С). После двукратного отмывания в буфере ЕАС8 в каждую лунку добавляют 50 мкл стрептавидинфикоэритрина (экспозиция 30 мин при 4°С). После двукратного отмывания в буфере ЕАС8 клетки отбирают в 200 мл буфера ЕАС8 и определяют интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец после анализа с помощью проточной цитометрии (ЕАС8 СаДЬиг. ВесЮи Иккюкои) с использованием программного обеспечения Серией. Данные представляют коэффициент стимуляции (8.Ι.). который вычисляют следующим образом: 8.1. = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания).

ЕЫ8А.

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15/ИЛ-15К в ЕЬ18А представляют на фиг. 17. Связывание 146В7 усиливается при повышении концентраций ИЛ-15. связывающегося со своим рецептором. Не обнаруживают никакие эффекты связывания контрольного антитела с ИЛ-15 или ИЛ-15К.

Связывание с клетками Ка_р. экспрессирующими ИЛ-15К.

Связывание 146В7 с комплексом ИЛ-15/ИЛ-15К на клетках Кар представляют на фиг. 18. 146В7 связывается с комплексом ИЛ-15/ИЛ-15К доза-зависимым образом. Не обнаруживают никакого связывания ЫдО1 с комплексом ИЛ-15/ИЛ-15К на клетках Кар (см. фиг. 18).

146В7 способно связывать ИЛ-15 после связывания данного цитокина с его рецептором. 146В7 связывается с эпитопом на ИЛ-15. который не участвует в связывании с рецептором.

Ссылки.

ВаХйои 1.М.. Майш Κ.ν.. Иехксйтаии К.М.. Теккег 1.К.. 8сЫй Μ.Η.. Кеук1оие Е.С.. Оеиоуеке М.С.. Vаккο М.С.. Моге1аиб Ь/ν.. Vеаνе^ А.Ь. Магкеикои 1. и Ешск В.К. Сравнение эффекта этанерцепта и метотрексата у пациентов с ранней стадией ревматоидного артрита (А сотрапкои о! еХаиегсер! аиб теХйоХгехаХе ш раДеШк \νί11ι еаг1у гйеитаХо1б агбшРк). Ν. Еид1. 1. Меб.. 343:1586-93 (2000).

Еейшдег Т.А. и Сабщип М.А. Интерлейкин-15 - биология и участие в развитии заболеваний человека (1и1ег1еикш 15: Ью1оду аиб ге1еуаисе 1о йитаи б1кеаке). В1ооб. 97:14-28 (2001).

Е1кйМ1б И.М.. ОЦоиией 8.Ь. Веидоесйеа Т.. Нибкои И.У.. Нагбшд Е.. Ветйагб 8.Ь. 1оиек Ό.. Кау

- 43 015897

К.М., Шддтк К.М., Зскгатт З.К. и ЬопЬегд Ν. Высокоавидные человеческие моноклональные антитела Ιβ61< из нового клона трансгенных мышей, несущих минилокус (Н1дк-а\збЦу китап Ιβ61< топос1опа1 апйЬобкк Ггот а ηονе1 кйат оГ тткосик йапкдешс тке), №йиге Ьюкскп., 14:845-51 (1996).

61Шк З., Регт М.М., Ου V. и Зтйк К.А. Фактор роста Т-клеток, параметры образования и количественный микроанализ активности (Т се11 дготе!к ГасЮг: рагатекгк оГ ргобисйоп апб а циапШаЖе т1сгоаккау Гог ас!кйу), Е Тттипок, 120:2027-З2 (1978).

Кеппебу М.К. и соавт. Обратимые дефекты Т-клеточных линий натуральных киллеров и клеток памяти СЭ8 у мышей с дефицитом ИЛ-15 (Кеνе^к^Ь1е беГес!к ш па!ига1 кШег апб тетогу СЭ8 Т се11 1шеадек ш ΙΚ-15 бебскп! тке), Е Ехр. Меб., 191:771-80 (2000).

Китап Ι., Уатег В. и №е1кеп ΟΉ. Интерлейкин-15 и его роль в хронических воспалительных заболеваниях (ЛШбеикш 15 апб йк го1е т скгопк тПаттаЮгу бкеакек), ШПатт. Кек., 47:285-9 (1998).

Кйрре1 ГН. Биотерапия ревматоидного артрита (Вю1одк Легару Гог гкеита!о1б айкббк), Ν. Епд1. Г. Меб., З4З:1640-1 (2000).

Кок1ег 6. и Мбккш С. Непрерывные культуры слитых клеток, секретирующих антитело заданной специфичности (Сопбпиоик сийигек оГ Гикеб се11к кесгейпд апйЬобу оГ ргебебпеб кресйгсйу), Ыакге, 256:495-7 (1975).

Ыи С.С., Регикыа В. и Υοиηд ΕΌ. Выявление роли ИЛ-15 в развитии НК-клеток (Тке етегдтд го1е оГ ΙΚ-15 ш ΝΕ-сеИ беνе1οртеηΐ), Iттиηο1. Тобау, 21:11З-6 (2000).

Ыоуе11 Ό.Ε, 61аптш Е.Н., КеГГГ А., Сатектее11 6.Ό., ЗЖегтап Е.О., №с1оп ЕЕ, Зкт кЭ., Себика А., Потейе Ν.Έ, Юа11асе С.А., Юкктоге Г. и Ртск В.К. Применение этанерцепта у детей с многосуставным ювенильным ревматоидным артритом (Е1апегсер1 ш скббгеп тейк ро1уабки1аг днепбе гкеита!о1б айкббк). Объединенная группа для проведения исследований в области детской ревматологии (Реб1аГбс Ккеита!о1оду Со11аЬога1ке З!ибу 6гоир), Ν. Епд1. Г. Меб., З42:76З-9 (2000).

Маки Ε.Ν. и Тау1ог Р.С. Антицитокиновая терапия ревматоидного артрита (Апк-су1окте !кегару Гог гкеита!о1б айкгйк), Аппи. Ке\'. Меб., 51:207-29 (2000).

Мсктек ЕВ., а1-Мидка1ек Г., Рк1б М., Ьеипд В.Р., Ниапд Р.Р., О1хоп К., ЗШггоск К.О., Юбкткоп Р.С. и Ыете Ρ.Υ. Роль интерлейкина-15 в миграции и активации Т-клеток при ревматоидном артрите (Тке го1е оГ ЛШбеикш 15 п Т-се11 т1дгакоп апб асЖайоп т гкеита!о1б абкгЫк), №11. Меб., 2:175-82 (1996).

МЛппек ЕВ., Ьеипд В.Р., ЗШггоск К.О., Рк1б М. и Ыете Ρ.Υ. Интерлейкин-15 опосредует зависимую от Т-клеток регуляцию продукции фактора некроза опухолей-α при ревматоидном артрите (к11ег1еик1п-15 теб1а1ек Т сек-берепбеп! геди1айоп оГ (итог песгокк ГасЮг- а1рка ргобисйоп ш гкеитаЮ1б аг1кгй1к), Ыак Меб., З:189-95 (1997).

Мсктек ЕВ. и Ыете Ρ.Υ. Провоспалительная роль интерлейкина-15 в развитии синовита при ревматоидном артрите Цпкгкикт 15: а рго1пГ1атта1огу го1е т гкеитак1б айкгйк κуηονй^κ), Iттиηο1. Тобау, 19:75-9 (1998).

Οрреηке^те^-Μа^кк и соавт., Г. Скп. Iηνеκί^д., 101:1261-72 (1997).

Рейй О.К., Воппей Т.Р., Екептап Г., Згткакап З., Рах!оп К., Веегк С, Ьупск Ό., МШег В., Υοкΐ Г., СгаЬккт К.Н. и Сотко1х \ν.Β. Исследование зависимости структуры-функции интерлейкина-15 с использованием сайт-специфического мутагеназа, конъюгирования с полиэтиленгликолем и моделирования на основе гомологии (З1гис1иге- Гипскоп к(иб1ек оГ кИег1еикт-15 иктд кйе-кресШс ткадепекк, ро1уе1ку1епе д1усо1 сощидабоп, апб кото1оду тобекпд), Г. Вю1. Скет., 272:2З12-8 (1997).

Киска1х и соавт., Г. Iттиηο1., 160:5654-60 (1998).

Vа1бтаηи Т., Тадауа Υ. и ВатГогб К. Интерлейкин-2, Интерлейкин-15 и их рецепторы (1п(ег1еик1п2, 1п1ебеикт-15, апб (кек гесерЮгк. Λΐ. Ке\'. Iттиηο1. 16:205-26 (1998).

Vа1бтаηи Т.А., Ьикок З. и Тадауа Υ., Противоположные роли ИЛ-2 и ИЛ-15 в существовании и гибели лимфоцитов. Возможности применения в химиотерапии. (Сопйаккпд Ко1ек оГ Ю-2 апб ΙΚ-15 ш (ке ЫГе апб Ьеа1к оГ Ьутркосукк. кирНсакопк Гог Iттиηοΐке^ару), Iттиηйу, 14:105-110 (2001).

Юа1бтапп Т.А. и Тадауа Υ. Многоаспектная регуляция экспрессии Интерлейкина-15 и роль данного цитокина в дифференцировке НК-клеток и реакции хозяина на внутриклеточных патогенов (Тке тиШГасекб геди1абоп оГ киег1еикт-15 ехргеккюп апб (ке го1е оГ Инк суЮкте ш ΝΙ< се11 ббГегепбабоп апб кок! гекропке !о 1п1гасе11и1аг ра!кодепк), Аппи. Ке\'. Iттиηο1., 17:19-49 (1999).

Эквивалентные решения.

Компетентные специалисты в данной области признают или имеют возможность установить при использовании не более чем рутинных экспериментов множество эквивалентных решений конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в данном контексте. Предусматривается, что данные эквивалентные решения охватываются следующей формулой изобретения. Предполагается, что любая комбинация вариантов осуществления, раскрываемых в зависимых пунктах формулы, входит в объем изобретения.

Включение посредством ссылки.

Все публикации, патенты и находящиеся на стадии рассмотрения патентные заявки, приведенные в данном контексте, таким образом, включены в виде ссылки во всей их полноте.

- 44 015897

Перечень последовательностей <110> Генмаб А/С < 120> Выделенное человеческое моноклональное антитело к интерлейкину-15 (варианты) и способ лечения или предупреждения нарушения у человека, связанные со сверхэкспрессией последнего < 130> АМ1-001СР2РС <150> 10/379741 <151 > 2003-03-05 <150> 10/374932 <151> 2003-02-26 <150> из 60/314,73 <151> 2001-08-23 <150> из 10/226615 <151> 2002-08-23 <160> 31 <170> Гаа18Е<5 Гог λνίηάο’Λ'ί Уегаоп 4.0 <210> 1 <211> 390 <212> ΟΝΑ <213> Ното 8ар1епз <220>

<221> СЦЗ <222> (1)...(390) <400> 1

дад

дьд

сад

сед

дед

сад

есе

дда

дса

дад

дед

ааа

аад

ссс

ддд

дад

48

О1и

νθΐ

О1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

О1и

1

5

10

15

есе

сед

аад

асе

есс

еде

аад

дее

есе

дда

еас

еСс

еее

асе

еас

96

Зег

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

С1у

Туг

РЬе

ТЬг

Туг

20

25

30

Сдд

аес

ддс

ьдд

дьд

сдс

сад

аед

ссс

ддд

ааа

ддс

сСд

дад

еае

аед

144

Тгр

Не

С1у

Тгр

Уа1

Агд

01п

Мее

Рго

(31у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Туг

Мее

35

40

45

ддд

аес

еае

ссе

дде

дас

есе

дае

аес

ада

еас

аде

сед

есс

еее

192

С1у

Не

11е

Туг

Рго

<31у

Азр

Зег

Азр

ТЬг

Агд

Туг

Зег

Рго

Зег

рке

50

55

60

саа

ддс

сад

дес

асе

аес

еса

дсс

дас

аад

есс

аес

аде

асе

дсс

еас

240

61П

С1у

(31п

Уа1

ТЬг

11е

Зег

А1а

Азр

Ьуз

Зег

т1е

Зег

ТЫ

А1а

туг

65

70

75

80

сед

сад

аде

сед

аад

дсс

есд

дас

асе

дсс

аед

е&е

еас

еде

288

Ьеи

О1п

Тгр

Зег

Ьеи

Ьуз

А1а

Зег

Азр

ТЬг

А1а

мее

Туг

Суз

85

30

95

дед

ада

ддд

дде

аас

ьдд

аас

еде

еее

дас

еас

ьдд

ддс

сад

дда

асе

336

А1а

Агд

Сг1у

<Э1у

Азп

Тгр

Азп

Суа

РЬе

Азр

Туг

Тгр

<31у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

сЪд

дес

асе

дес

есс

еса

дсс

есс

асе

аад

ддс

сса

£сд

дес

еее

есс

384

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

рье

Рго

115

120

125

сед дса 390

Ьеи А1а

0

- 45 015897 <210> 2 <211> 130 <212> РКТ <213> Ното 5ар1епа <400> 2

£1и

νβΐ

<31п

Ьеи

Уа1

О1п

Зег

<31у

А1а

<31и

Уа1

Ьуз

РГО

61у

О1и

1

5

10

15

Зег

Ъеи

Ъув

Не

Зег

Суз

ъуз

Уа1

Зег

<51у

Туг

РНе

РЬе

ТИг

Туг

20

25

30

Тгр

Не

01у

Тгр

Уа1

Агд

О1п

Мер

Рго

З1у

Ьуз

<31у

Ьеи

<31и

Туг

МеЕ

35

40

45

О1у

Не

Туг

Рго

<31у Азр

Зег

Азр

ТИг

Агд

Туг

Зег

Рго

Зег

РИе

50

55

60

Θΐη

С1у

<31п

Уа1

ТИг

Не

Зег

А1а

АЗр

Ьуз

Зег

Не

Зег

ТИг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

Тгр

Зег

Ъеи

Ьуз

А1а

Зег

Азр

ТИг

А1а

МеП

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Я1у

С1у

Азп

Тгр

Аап

Суз

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

<31п

Й1у

ТНг

100

105

110

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

Зег

ТИг

ьуз

(31у

Рго

Зег

Уа1

РИе

Рго

115 120 125

Ъеи А1а

130 <210> 3 <211> 357 <212> ΠΝΑ <213> Ното 8ар1еп8 <220> <221> СЭ8

даа

аНЬ

днд

еед

асд

сад

НсН

сса

ддс

асе

сЪд

нее

сед

нее

сса

ддд

48

С1и

Не

Уа1

ьеи

ТИг

С1п

Зег

Рго

С1у

ТЫ

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

<31у

1

5

10

15

даа

ада

дес

асе

сЪС

Нсс

Идс

адд

дсс

адН

сад

адН

деъ

аде

96

(31и

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Зег

Уа1

Зег

20

25

30

Нас

ННа

до с

Сдд

Нас

сад

ааа

ссЪ

ддс

сад

даН

ссс

адд

сЪс

сСс

144

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

<31п

С1п

Ьуз

Рго

О1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

35

40

45

аНс

НаН

дде

дса

Нсс

сдс

адд

дес

асЪ

ддс

аЬе

сса

дас

адд

Ыс

адН

192

Не

Туг

(31у

А1а

Зег

Агд

А1а

ТНг

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

ддс

адН

ддд

нсЬ

ддд

аса

дас

НЪс

асЬ

сЪс

асе

аНс

аде

ада

сНд

дад

240

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

РЬе

ты

ьеи

ТНг

Не

Зег

Агд

Ьеи

С1и

65

70

75

80

ССЬ

даа

дай

еъе

дса

д^д

НаЪ

Нас

Сдн

сад

едд

НаЬ

ддр

аде

Ьса

сас

288

Рго

С1и

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

Агд

Туг

О1у

Зег

ΗΪ3

35

90

95

асп

НИИ

ддс

сад

ддд

асе

аад

сНд

дад

аНс

аде

еда

асЬ

дъд

дсп

дса

336

ТНс

РНе

С1у

С1п

<31у

ТНг

Ьуз

Ьеи

(Пи

Не

Зег

Агд

ТНг

Уа1

А1а

100

105

НО

сса

ССЬ

дне

сне

аПс

Ыс

ссд

357

Рго

Зег

Уа1

РИе

Не

РНе

Рго

115

<210> 4 <211> 119 <212> РКТ <213> Ното 8ар1епз <400> 4

01и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

<31у

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

<31у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

αΐη

Зех

Уа1

Зег

20

25

30

Туг

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

С1п

Ьуз

Рго

О1у

(31п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

35

40

45

Не

Туг

С1у

А1а

Зег

Агд

А1а

ТЬг

<31у

11е

Рго

Авр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

С1у

Зег

О1у

Зег

С31у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ахд

Ьеи

01и

65

70

75

80

Рго

<31и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

01п

Агд

Туг

С1у

Зег

Н1з

90 95

ТЬг РЬе С1у <31п 01у ТЬг Ьуз Ьеи (Э1и Не Зег Агд ТЬг 7а1 А1а А1а

100 105 110

Рго Зег 7а 1 РЬе 11е РЬе Рго

115 <210> 5 <211> 5 <212> РКТ <213> Ното кар1епз <400> 5

ТЬг туг Тгр 11е 31у

5 <210> 6 <211> 17 <212> РКТ <213> Ното кар1епз <400> 6

11е 11е Туг Рго 31у Азр Зег Азр ТЬг Агд Туг Зех Рго Зег РЬе Θΐη С1у 15 10 15 <210> 7 <211>8 <212> РКТ <213> Ното 8ар1евн <400> 7 е1у Авп Тгр Азп Суз РЬе Аар Туг

5 <210> 8 <211> 12 <212> РКТ <213> Ното 8ар1еп5 <400> 8

Агд А1а Зег О1п Зег 7а1 Зег Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10 <210> 9 <211> 7 <212> РКТ

- 47 015897

<213> Ното 5ар1еп5
<400> 9 С1у А1а Зег Агд Агд А1а ТЬг 1 5
<210> 10 <211> 8 <212> РК.Т <213> Ното 8ар1епв
<400> 10 С1п Агд Туг С1у Зег Зег Ню ТЬг 1 5
<210> 11 <211> 20 <212> ΏΝΑ <213> Ното 5ар1еп5
<400> 11 саддкксадс ЬддЬдсадЬс	20
<210> 12 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното 5ар1еп8
<400> 12 еаддЬдсадс ЬдкЬддадЬс	20
<210> 13 <211> 20 <212> ΏΝΑ <213> Ното заргепз
<400> 13 даддкдсадс ЬддЬдсадЬс	20
<210> 14 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното зар!епв
<400> 14 аЬддаскдда сскддадсак	20
<210> 15 <211> 21 <212> ΟΝΑ <213> Ното гарделя
<400> 15 сакддааеьд дддсЪдадсЬ д	21
<210> 16 <211> 20

- 48 015897

<212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар1епз
<400> 16 аЬддадЬЫ:д дгсЬдадсГд	20
<210> 17 <211> 21 <212> ΟΝΛ <213> Ното 5ар1еп8
<400> 17 аЪдааасасс СдЬддЬЬсИС с	21
<210> 18 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното 8ар1епз
<400> 18 аЬддддЬсаа ссдссаРссЬ	20
<210> 19 <211> 21 <212> ΟΝΑ <213> Ното зардела
<400> 19 Ьдссаддддд аадассдаЬд д	21
<210> 20 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното κιρίβικ
<400> 20 гасаСссада СдауссадЬс	20
<210> 21 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното 8ар1еП5
<400> 21 дусаЬсугда Ьдасссадес	20
<210> 22 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното 5ар1епя
<400> 22 даРаЬЬдСда Сдасссадас	20
<210> 23 <211> 20 <212> ΌΝΑ <213> Ното аарюпа

- 49 015897 <400> 23 даааеЪдЬдЬ ЬдасгсадЪс <210> 24 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното зардела <40О> 24 даааЪт/дБга ЬдасасадЪс <210> 25 <211> 20 <212> ОМА <213> Ното 5ар1епа <400> 25 даСдГЬдСда Ъдасасадис <210> 26 <211> 20 <212> ϋΝΑ <213> Ното зардела <400> 26 даааЬСдСдс ЬдасЪсадСс <210> 27 <211> 24 <212> ΠΝΑ <213> Ното 8ар1еп8 <400> 27 сссдсЬсадс Ьссиддддси ссСд <210> 28 <211> 23 <212> ϋΝΑ <213> Ното 8ар£епз <400> 28 сссЬдсСсад сьсссддддс сдс <210> 29 <211> 26 <212> ϋΝΑ <213> Ното бар1е115 <400> 29 сссадсдсад сББсБсЬЛсс ЬссЪдс <210> 30 <211> 27 <212> ΠΝΑ <213> Ното 8ар1еп8 <400> 30 абддаассаЪ ддаадсссса дсасадс <210> 31 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> Ното 8ар1еп8 <400> 31 сдддаадаЬд аадасадаЬд 20

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение человеческого моноклонального антитела, которое специфически связывается с эпитопом человеческого ИЛ-15, взаимодействующим с γ-цепью рецептора ИЛ-15 (ИЛ-15К), и содержит по меньшей мере одну последовательность СОК тяжелой цепи и по меньшей мере одну последовательность СОК легкой цепи, выбранные из группы, включающей 8ЕО Ш N0: 5, 6 или 7 для тяжелой цепи и 8ЕО Ш N0: 8, 9 или 10 для легкой цепи, или гомологичные им по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательности или фрагменты указанных выше последовательностей, которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15, для производства лекарственного средства для лечения заболеваний соединительной ткани, глазных заболеваний, неврологических заболеваний, заболеваний печени, гематологических заболеваний, легочных заболеваний, злокачественных новообразований, эндокринологических заболеваний, сосудистых заболеваний, гинекологических заболеваний, анкилозирующего спондилита, саркоилеита, болезни Стилла взрослых, системной красной волчанки, язвенного колита, послеоперационного энтероколита, болезни Крона, отторжения аллотрансплантата, болезни трансплантат против хозяина, аллергической контактной экземы, буллезного пемфигоида, послеожоговых гипертрофированных рубцов, красного лишая и сепсиса.

- 50 015897

2. Применение по п.1, где указанное антитело содержит 8ЕО ГО Ν0: 7 или гомологичную ей по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательность или фрагменты указанных выше последовательностей, которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

3. Применение по п.1, где указанное антитело содержит 8ЕО ГО Ν0: 5 и 8 или 8ЕО ГО Ν0: 6 и 9 либо 8ЕО ГО Ν0: 7 и 10 или гомологичные им по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательности или фрагменты указанных выше последовательностей, которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

4. Применение по п.1, где указанное антитело содержит по меньшей мере четыре последовательности СОВ, выбранные из группы, включающей 8ЕО ГО Ν0: 5, 6, 7, 8, 9 и 10 или гомологичных им по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательности или фрагменты указанных последовательностей, которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

5. Применение по п.1, где указанное антитело содержит 8ЕО ГО Ν0: 5, 6, 7, 8, 9 и 10 или гомологичные им по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательности или фрагменты указанных последовательностей, которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15.

6. Применение по п.1, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО Ν0: 2 или с гомологичной ей по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательностью.

7. Применение по п.1 или 6, где указанное антитело содержит вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО Ν0: 4 или с гомологичной ей по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98-99% последовательностью.

8. Применение по любому из пп.1-7, где указанное антитело ингибирует цис-передачу сигнала через γ-цепь ИЛ-15В путем специфического связывания с эпитопом на домене человеческого ИЛ-15, взаимодействующем с γ-цепью, и которое ингибирует транс-передачу сигнала на соседние клетки, которые экспрессируют γ-цепь или β- и γ-цепи как часть ИЛ-15В или другого цитокинового рецептора.

9. Применение по любому из пп.1-7, где указанное антитело нарушает сборку α-, β- и γ-цепей ИЛ15В.

10. Применение по любому из пп.1-7, где указанное антитело ингибирует сборку комплекса цитокинового рецептора по меньшей мере на двух соседних клетках, при этом одна из соседних клеток экспрессирует α-цепь, а остальные соседние клетки экспрессируют β- и γ-цепи как часть рецептора ИЛ-15 или другого цитокинового рецептора.

11. Применение по п.9, где указанное антитело также ингибирует сборку комплекса цитокинового рецептора по меньшей мере на двух соседних клетках, при этом одна из соседних клеток экспрессирует α-цепь, а остальные соседние клетки экспрессируют β- и γ-цепи как часть рецептора ИЛ-15 или другого цитокинового рецептора.

12. Применение по любому из пп.1-11 для производства лекарственного средства для лечения заболеваний соединительной ткани, глазных заболеваний, неврологических заболеваний, нарушений печени, гематологических заболеваний, легочных заболеваний, злокачественных новообразований, эндокринологических заболеваний, сосудистых заболеваний, гинекологических заболеваний, анкилозирующего спондилита, саркоилеита, болезни Стилла взрослых, системной красной волчанки, язвенного колита, послеоперационного энтероколита, болезни Крона, отторжения аллотрансплантата, болезни трансплантат против хозяина, аллергической контактной экземы, буллезного пемфигоида, послеожоговых гипертрофированных рубцов, красного лишая и сепсиса.

13. Применение человеческого моноклонального антитела, охарактеризованного в любом из пп.112, для лечения заболеваний, опосредованных ИЛ-15, где указанное антитело вводится отдельно, совместно или последовательно с модифицирующим заболевание антиревматическим лекарственным веществом (ОМАВЭ), выбранным из группы, включающей ИЛ-10, растворимый ИЛ-15В, антитело против ИЛ-6В, СΤ^Α4Iд и антитело против СГО20; иммунодепрессантом, выбранным из группы, включающей микофеноловую кислоту, мофетил микофенолят, кортикостероиды, соли золота, сульфазалазин, антималярийные препараты, бреквинар, лефлуномид, мизорибин, 15-дезоксиспергуалин, 6меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус и антитимоцитарный глобулин; иммуносупрессивным человеческим моноклональным антителом, выбранным из группы, включающей МНС, СЭ2, СО3, СЭ7, СЭ28, В7, (4)40, СП45, ИФН-γ, ΤΝΡ-α, ИЛ-2В, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, СГОНа, СГО20 или СЭ58, или другие лиганды; агентом для лечения псориаза, выбранным из группы, включающей антралин, калипотрин, таразотен, этанерцепт, алефацепт, эфалицумаб, 6-тиогуанин, мофетил микофенолят, такролимус гидроксимочевину и инфликсимаб; лечением псориаза, выбранным из

- 51 015897 группы. включающей облучение иВУ (широкополосный и узкополосный ультрафиолет В). облучение иУА (ультрафиолет А) и фототерапию.

14. Композиция. включающая фармацевтически приемлемый носитель. человеческое моноклональное антитело. охарактеризованное в любом из пп.1-12. и другой терапевтический агент. выбранный из группы. включающей модифицирующее заболевание антиревматическое лекарственное вещество (ВМАЯЗ). выбранное из группы. включающей ИЛ-10. растворимый ИЛ-15Я. антитело против ИЛ-6Я. СТЬА41д и антитело против СЭ20: иммунодепрессант. выбранный из группы. включающей микофеноловую кислоту. мофетил микофенолят. кортикостероиды. соли золота. сульфазалазин. антималярийные препараты. бреквинар. лефлуномид. мизорибин.

15-дезоксиспергуалин. 6-меркаптопурин. циклофосфамид. рапамицин. такролимус и антитимоцитарный глобулин; агент для лечения псориаза. выбранный из группы. включающей антралин. калипотрин. таразотен. этанерцепт. алефацепт. эфалицумаб. 6тиогуанин. мофетил микофенолят. такролимус гидроксимочевину и инфликсимаб; иммуносупрессивное человеческое моноклональное антитело. выбранное из группы. включающей МНС. СЭ2. СЭ3. СЭ7. СИ28. В7. СИ40. СВ45. ИФН-γ. ЮТ-а. ИЛ-2Я. ИЛ-4. ИЛ-5. ИЛ-6. ИЛ-7. ИЛ-8. ИЛ-10. СЭ11а. СВ20 или СЭ58. или другие лиганды.