JP4606172B2 - 上皮成長因子受容体(egfr)に対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
EGF受容体(EGFR)は170 kDa のタイプ1膜貫通分子である。その発現は、頭部、頸部、乳房、結腸、前立腺、肺、及び卵巣のカルシノーマを含め、数多くのヒト腫瘍で上方調節されていることが見られる。過剰発現の程度が、臨床上の予後のまずさに相関付けられている (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Modjtahedi, et
al. (1994) Int. J. Oncology 4:277-296)。さらに、その発現には、しばしば、とりわけEGFR発現腫瘍細胞によるEGFRリガンド、TGF-α及びEGFの産生が伴うが、このことは、自己分泌ループがこれらの細胞の悪化に参与していることを示している (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Modjtahedi, et
al. (1994) Int. J. Oncology. 4:277-296)。従ってこのようなEGFRリガンドとEGFRとの間の相互作用を遮断すると、腫瘍の成長及び生存を阻害することができる (Baselga, et
al. (1994) Pharmac. Therapeut.
64:127-154)。
44: 1002-1007; Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318)。ヒト腫瘍細胞の一日後に投与した場合、抗EGFR MAbの大半は、無胸腺マウスで腫瘍形成を防ぐ上で効果的だった (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154)。しかしながら、樹立ヒト腫瘍異種移植片を持つマウスに注射した場合、これらのマウスMAb(例えばMAb 225s 及び528)は、部分的な腫瘍の退縮を引き起こしたに過ぎなかった。腫瘍を完全に根絶させるためには、化学療法薬の同時投与が必要だった (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Fan, et al. (1993)
Cancer Res. 53: 4322-4328; Baselga, et al. (1993) J. Natl. Cancer Inst. 85:
1327-1333)。
Ann. Oncol. 11 Suppl 3: 187-190, 2000)。
本発明は、EGFRの発現に関連する疾患、特にEGFR発現性の腫瘍及び自己免疫疾患、を治療及び防止するための優れた抗体治療薬を提供するものである。本抗体は、それらが完全にヒト(ここでは「HuMAbTM」と言及する)であり、従って患者において免疫原性が低いという点で優れている。更に本抗体は、他の抗EGFR抗体に関してこれまで報告されたよりも低い投薬量で治療上有効(例えばEGFR発現細胞の成長及び/又は機能を防止する上でなど)である。加えて、いくつかの実施態様では、本抗体は、補体を活性化しない(例えば標的細胞の補体媒介性溶解を誘導しないなど)という付加的な長所を有し、このことは、治療中の好ましくない副作用を減らす。
(例えばIgG1,κ)抗体である。しかしながら、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、及び IgEを含む他の抗体アイソタイプも本発明の包含するところである。本抗体は全抗体でも、又は、Fab、F(ab')2、Fv 及び鎖Fvフラグメントを含め、抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。
相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な可変重鎖アミノ酸配列を含む。
相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な可変軽鎖アミノ酸配列を含み、このとき条件として前記抗体は2F8ではない。
可変領域を含む。
可変領域を含み、このとき条件として前記抗体は2F8ではない。
(i) 図15(配列番号:5、6、7、8、9、及び10)に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域;
(ii) (i)で規定された配列に対し、少なくとも90% 相同、好ましくは少なくとも95%
相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列;及び
(iii) ヒトEGFRへの結合能を維持した、(i)又は(ii)に規定された配列のいずれか一つのフラグメント、
から成る群より選択される少なくとも1つのCDR配列を含む。
(i)
図15(配列番号:5、6、7、8、9、及び10)に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域;
(ii) (i)で規定された配列に対し、少なくとも90% 相同、好ましくは少なくとも95%
相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列;及び
(iii) ヒトEGFRへの結合能を維持した、(i)又は(ii)に規定された配列のいずれか一つのフラグメント、
から成る群より選択される少なくとも1つのCDR配列を含み、
このとき条件として前記抗体は2F8ではない。
相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は 少なくとも99% 相同な配列、又はヒトEGFRへの結合能を維持したその一フラグメントを含む。
相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列、又はヒトEGFRへの結合能を維持したその一フラグメントを含み、このとき条件として前記抗体は2F8ではない。
少なくとも90% 相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列;及び (iii) ヒトEGFRへの結合能を維持した、(i)又は(ii)に規定された配列の数フラグメント、から選択される少なくとも4つのCDRを含む。
少なくとも90% 相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列;及び (iii) ヒトEGFRへの結合能を維持した、(i)又は(ii)に規定された配列の数フラグメント、から選択される少なくとも4つのCDRを含み、このとき条件として前記抗体は2F8ではない。
少なくとも90% 相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列;又は (iii) ヒトEGFRへの結合能を維持した、(i)又は(ii)に規定された配列の数フラグメント、を含む。
少なくとも90% 相同、好ましくは少なくとも95% 相同、そしてより好ましくは少なくとも98%、又は少なくとも99% 相同な配列;又は (iii) ヒトEGFRへの結合能を維持した、(i)又は(ii)に規定された配列の数フラグメント、
を含み、このとき条件として前記抗体は2F8ではない。
a)EGFRに対する特異性;
b)少なくとも約 107 M-1、好ましくは 約 108 M-1、 109
M-1、 そしてより好ましくは、約 1010 M-1 乃至 1011 M-1 又はそれより高い平衡結合定数(KA)での、EGFRに対する結合親和性;
c)約 10-3 s-1、好ましくは 約 10-4 s-1、より好ましくは、 10-5
s-1、そして最も好ましくは、10-6 s-1 の、EGFRからの解離定数(KD);
d)EGFR発現細胞のオプソニン化能;又は
e) 約 10 mg/ml 以下(例えば in vitroで)の濃度で、ヒトエフェクタ細胞の存在下で、EGFR発現細胞(例えば腫瘍細胞)の成長を阻害する、及び/又は、貪食及び致死を媒介する、能力、
のうちの1つ以上により、特徴付けることができる。
M-1、 より好ましくは少なくとも約 109 M-1 又は 1010 M-1の親和定数で結合し、 約 1 x 10-7 M 以下のIC50で、又は、約 10 mg/ml 以下の in vitro での濃度で、多核白血球(PMN)、単球及びマクロファージなどのヒトエフェクタ細胞によるEGFR発現細胞を成長を阻害、及び/又は、貪食及び致死を媒介、することができる。
樹状細胞肉腫;唾液腺癌;エナメル上皮腫;悪性末梢神経鞘腫瘍;内分泌膵臓腫瘍;又は精上皮腫を含む精巣生殖細胞腫瘍、胎児性癌、卵黄嚢腫瘍、奇形腫及び絨毛上皮腫の治療及び/又は防止のための方法に関する。
又はIL-10)から成る群より選択される一種以上の更なる治療薬を含む。
メトトレキセート;又はカルシポトリエン+光線療法(UVB)との組合せなど、上記の治療法の2つ以上との組合せで投与する。
スタチン類 (例えば、アトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン又は
ロバスタチン)から成る群より選択される一種以上の治療薬との組合せで投与する。
本発明は、上皮成長因子受容体抗原(ここでは「EGFR」と言及される)の発現、特に過剰発現、を特徴とする疾患を治療及び診断するための新規な抗体ベースの治療法を提供するものである。本発明の治療法は、EGFR上に存在するエピトープに結合する、単離されたヒトIgGモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を利用する。本発明に包含される他の単離されたヒトモノクローナル抗体には、IgA、IgG1、IgG4、IgE、IgM、及びIgD抗体、例えばIgG1,κ又はIgG1,γアイソタイプ、あるいはIgG4,κ又はIgG4,γアイソタイプ、がある。ある実施態様では、本ヒト抗体は、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、EGFRに対する複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体(例えばIgG、IgA、及び/又はIgE)を産生できる、トランスジェニック・マウスなどの非ヒトトランスジェニック動物で産生される。このようなトランスジェニック動物は、例えばUS 2003/0017534に開示されたものなど、ポリクローナル抗体を産生するトランスジェニック・ウサギであってもよい。従って、本発明は、EGFRに特異的に結合するヒトポリクローナル抗体も包含する。従って、本発明の数々の局面には、抗体、抗体フラグメント、及びその医薬組成物だけでなく、モノクローナル抗体を産生する非ヒトトランスジェニック動物、B細胞、ホスト細胞トランスフェクトーマ及びハイブリドーマも含まれる。本発明の抗体を用いて、EGFR又は関連する交差反応性の成長因子受容体を発現する細胞を検出する方法や、又は、EGFR発現細胞の成長、分化及び/又は遊走性をin vitro又はin vivoで阻害する方法も、本発明の包含するところである。
(1989) Nature 341:544-546);及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)、がある。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、これらは、VL及びVH領域が対を成して一価の分子を形成するような一個のタンパク質鎖に作製できるようにする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合することができる(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものと、意図されている。更に、抗原結合フラグメントには、(i)免疫グロブリン・ヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド(例えば重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はリンカペプチドを介して軽鎖可変領域に融合した重鎖可変領域)、(ii)ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、及び (iii)
CH2定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域、を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質が含まれる。該ヒンジ領域は、好ましくは、二量体化を防ぐために、一つ以上のシステイン残基をセリン残基に置換する改変が行われているとよい。このような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、更に、US 2003/0118592 及びUS
2003/0133939に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらのフラグメントは、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。
90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994)
Structure 2:1121-1123を参照されたい)。
00/42072、及び、CH2ドメインでのN末端領域を変異させて、FcRIに対する本抗体の結合能を変化させることで、C1qへの本抗体の結合能を減少させ、ひいては本抗体の補体固定能を減少させた抗体を開示したWO
94/29351を参照してもよい。更に、Shields et
al., J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-6604 は、FcγRIII結合を高める組合せバリアント、例えばT256A/S298A、S298A/E333A、及び S298A/E333A/K334Aを教示している。
277:26733を参照されたい。さらに、糖付加の改変はCDCを改変するためにも行うことができる。Shield et al. (2002) J.
Biol. Chem., 277:26733を参照されたい。更に、CDCを改変するために、ガラクトシル化の改変を行うこともできる。更に、GntIIを発現するように操作することで、糖の形が変わり、ADCC活性が高くなったモノクローナル抗体を発現させるCHO細胞株を開示したWO 99/54342、及びUmana et al., Nat. Biotechnol. (1999)
17:176 を参照されてもよい。抗体のフコース含有量を減らし、それによりADCC活性を高める更なる方法は、US
2003/0115614 及びW0 03/0035835に開示されている。
Factors (1992) 3:4-10、EP 154 316 及び EP 401 384に解説されているような、当業で公知のPEG化反応により、行わせることができる。ここに開示及び請求するように、SEQ ID NO: 1-12に示す配列は、「保存的配列改変」、即ち、当該ヌクレオチド配列にコードされた、又は、当該アミノ酸配列を含有する、本抗体の結合特性に有意に影響しない又は変化させないようなヌクレオチド及びアミノ酸配列改変、を含む。このような保存的配列改変には、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、付加及び欠失、がある。また、例えば部位指定変異誘発法及びPCR媒介変異誘発法など、当業で公知の標準的な技術によっても、SEQ ID NO:1-12に改変を導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当業で定義されている。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当業で定義されている。これらのファミリーには、塩基性の側鎖を持つアミノ酸(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性の側鎖を持つアミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷の極性側鎖を持つアミノ酸(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性の側鎖を持つアミノ酸(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を持つアミノ酸(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を持つアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)、がある。このように、ヒト抗EGFR抗体の中で予測される重要でないアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に置換することが好ましい。
(J.
Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを用い、Blossum 62 マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4にし、レングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして、決定することができる。
al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402が解説するとおりに利用することができる。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを利用する場合、各プログラムの(例えばXBLAST 及びNBLAST)のデフォルト・パラメータを利用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov. を参照されたい。
F. Ausubel, et al., ed. Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,
New York (1987)を参照されたい。
本発明のモノクローナル抗体(MAb)は、従来のモノクローナル抗体法、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術など、を含む多様な技術により作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション法が基本的には好適であるが、モノクローナル抗体を作製する他の技術、例えばBリンパ球のウィルス又は腫瘍形成性形質転換など、も利用することができる。
al. (1994) Nature 368(6474): 856-859)。従って、このマウスの示すマウスIgM又はκの発現は低く、免疫処置に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子がクラス・スイッチング及び体細胞変異を起こすことにより高親和ヒトIgGκモノクローナルが生じる (Lonberg, N. (1994) Handbook of
Experimental Pharmacologyで113:49-101レビューされた 上記のLonberg, N. et al. (1994) ; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern.
Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, 及びHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y.
Acad. Sci 764:536-546)。HuMAbマウスの作製は、下の項II及びTaylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;
Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature
Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J.
12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et
al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology
113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;
Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and
Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature
Biotechnology 14: 845-851に詳細に解説されており、これらすべての内容全体を引用をもってここに援用することとする。さらに、すべてLonberg 及びKay、並びにジェンファーム・インターナショナル社に付与された米国特許第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,789,650号;第5,877,397号;第5,661,016号;第5,814,318号;第5,874,299号;及び第5,770,429号;Surani et al.の 米国特許第5,545,807号;1998年6月11日に公開された国際公報WO 98/24884;1994年11月10日に公開されたWO 94/25585;1993年6月24日に公開された WO 93/1227;1992年12月23日に公開されたWO 92/22645;1992年3月19日に公開されたWO 92/03918を参照されたく、これらのすべての開示全体を、引用をもってここに援用することとする。代替的には、実施例2で解説するHCO12トランスジェニックマウスを用いてヒト抗EGFR抗体を作製することができる。
EGFRに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製するためには、HuMAbマウスをLonberg, N. et al. (1994) Nature
368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature
Biotechnology 14: 845-851 及び WO 98/24884に解説されたようにEGFR抗原の精製もしくは濃縮製剤及び/又はEGFR発現細胞で免疫することができる。好ましくは、当該マウスは1回目の輸注時に6乃至16週齢であるとよい。例えば、EGFR抗原(例えばEGFRを発現するLNCaP細胞から精製されたもの)の精製もしくは濃縮製剤(5乃至20μg)を用いて、HuMAbマウスを腹腔内により免疫することができる。EGFR抗原の精製もしくは濃縮製剤を用いた免疫処置でも抗体が生じない場合、腫瘍細胞株など、EGFR発現細胞でマウスを免疫して、免疫応答を促進することもできる。
標準的なプロトコルに基づき、マウス脾細胞を単離し、PEGでマウス骨髄腫細胞株に融合させることができる。次に、こうして出来たハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。例えば免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単個細胞懸濁液を、50%PEGで、P3X63-Ag8.653非分泌性マウス骨髄腫細胞 (ATCC, CRL 1580)の数の6分の1に融合させる。細胞を平底の微量定量プレートに約2×105になるようにプレートし、20%ウシクローン血清、18%「653」調整培地、5%オリゲン(IGEN社)、4 mM L-グルタミン、1 mM L~グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50 単位/ml ペニシリン、50 mg/ml ストレプトマイシン、50 mg/ml ゲンタマイシン及び1×HAT (シグマ社;HATは融合から24時間後に加える)を含有する選択培地で2週間インキュベートする。2週間後、HATをHTに取り替えた培地で細胞を培養する。次に個々のウェルをELISAによりヒト抗EGFRモノクローナルIgM及びIgG抗体についてスクリーニングする。広汎なハイブリドーマ成長が起きたら培地を通常10乃至14日後に観察する。抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートし、再度スクリーニングし、ヒトIgG、抗EGFRモノクローナル抗体についてまだ尚陽性であれば、限界希釈により少なくとも2回、サブクローニングすることができる。次に安定なサブクローンをin vitroで培養して、少量の抗体を組織培養培地中に生じさせ、特徴付けに向ける。
本発明のヒト抗体は、当業で公知のように、組換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション法の組合せなどを用いて、ホスト細胞トランスフェクトーマで作製することもできる (Morrison, S. (1985) Science
229:1202)。
(1990)に解説されている。当業者であれば、調節配列の選択を含め、発現ベクタのデザインは、形質転換させようとするホスト細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等の因子に依るであろうことは理解されよう。哺乳動物ホスト細胞発現にとって好適な調節配列は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を命令するウィルス配列、例えばサイトメガロウィルス (CMV)、シミアン・ウィルス
(SV40)、アデノウィルス、(例えばアデノウィルス主要後期プロモータ (AdMLP)) 及びポリオーマ由来のプロモータ及び/又はエンハンサなど、がある。代替的には、例えばユビキチン・プロモータ又はβ-グロビン・プロモータなど、非ウィルス性の調節配列を用いてもよい。
Biol. 159:601-621に解説された通りにDHFR選択マーカと一緒にUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:4216-4220に解説された通りに用いられるdhfr-CHO細胞を含む)、NS/0 骨髄腫細胞、COS 細胞及びSP2.0 細胞がある。特にNS/0骨髄腫細胞と用いる場合、別の好適な発現系は、WO 87/04462、WO 89/01036 及びEP 338 841GSに開示された遺伝子発現系である。本抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクタを哺乳動物ホスト細胞内に導入する場合、このホスト細胞内で抗体が発現できるために充分な時間、又はより好ましくは、このホスト細胞を成長させる培養基中に本抗体が分泌されるために充分な時間、このホスト細胞を培養することにより、本抗体を産生させる。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養基から回収することができる。
代替的には、クローニングされた抗体遺伝子を、例えばscFv抗体を作製するためのE.
coliなどの微生物などの原核細胞、藻類や昆虫細胞を含む他の発現系で発現させることができる。さらに、本抗体は、ヒツジ及びウサギからの乳中に、又は、ニワトリの卵中に、又はトランスジェニック植物中になど、非ヒトトランスジェニック動物中に産生させることができる。例えばVerma, R., et al. (1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect
and mammalian expression systems. J.Immunol.Meth. 216:165-181; Pollock, et
al. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant
antibodies. J.Immunol.Meth. 231:147-157; 及びFischer, R., et al. (1999). Molecular farming of recombinant
antibodies in plants. Biol.Chem. 380:825-839を参照されたい。
抗体は、標的抗原と、主に6番目の重鎖及び軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を通じて相互作用する。このために、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側の配列よりも個々の抗体間で多様である。CDR配列は大半の抗体−抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型抗体由来のCDR配列を、異なる特性を持つ異なる抗体由来のフレームワーク領域内に移植した形で含有する発現ベクタを構築することにより、特定の天然発生型抗体の特性を模倣した組換え抗体を発現させることが可能である(例えばRiechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones,
P. et al., 1986, Nature 321:522-525; and Queen, C. et al.,
1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033を参照されたい)。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系配列は、B細胞成熟中のV(D)J接合により形成される、完全に集合した可変遺伝子を含まないこととなるため、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖細胞系遺伝子配列はまた、高親和二次レパートリ抗体の配列からも、可変領域全体にわたって個々に均一に異なるであろう。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域のアミノ末端で部分では相対的に頻繁には起きない。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域1のアミノ末端部分と、フレームワーク領域4のカルボキシ末端部分では、あまり頻繁には起きない。さらに、多くの体細胞変異は、本抗体の結合特性を大きくは変化させない。この理由で、もとの抗体のものと同じ結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直すためにも、特定の抗体の全DNA配列を得る必要はない(あらゆる目的のために、引用をもってここに援用することとする1999年3月12日出願のPCT/US99/05535を参照されたい)。CDR領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的には充分であることが多い。この部分的配列を用いて、どの生殖細胞系可変及びジョイニング遺伝子セグメントが、組換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、この生殖細胞系配列を用いて、可変領域の消失部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダ配列は、タンパク質の成熟中に切断されるため、最終的な抗体の特性には寄与しない。これが理由で、発現コンストラクトのために対応する生殖細胞系リーダ配列を用いる必要がある。消失配列を加えるために、クローニングされたcDNA配列を合成オリゴヌクレオチドにライゲーション又はPCR増幅法により組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を、一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、PCR増幅で組み合わせて、完全に合成の可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスは、消失又は含有又は特定の制限部位や、あるいは、特定のコドンの最適化など、いくつかの長所を有する。
(1)ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRであって、但しこの場合、前記ヒト重鎖CDRのうちの少なくとも1つが、図15(配列番号:5、6、及び7)に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRと;(2)ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖 CDRであって、但しこの場合、前記ヒト軽鎖CDRのうちの少なくとも1つが、図15(配列番号:8、9、及び10)に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖 CDRと、を含む抗体を調製するステップを含み、但し前記抗体はEGFRへの結合能を保持している。
(1)EGFR発現生存細胞への結合;
(2)EGFRへの高親和結合;
(3)EGFRの固有のエピトープへの結合(それにより、補完的な活性を持つモノクローナル抗体を組み合わせて用いた場合に、同じエピトープへの結合をめぐった競合が起きる可能性をなくす);
(4)EGFR発現細胞のオプソニン化;及び/又は
(5)ヒトエフェクター細胞の存在下でのEGFR発現細胞の成長阻害、貪食及び/又は致死の媒介;
など、の保持について選抜されてもよい。
本発明のヒトモノクローナルEGFR抗体の結合を特徴付けるには、免疫したマウスの血清をELISAなどで検査することができる。簡単に説明すると、微量定量プレートを、PBSに入れた0.25μg/mlの精製EGFRで被覆した後、5%ウシ血清アルブミンPBS溶液で遮断する。EGFR免疫マウスから採った血漿の希釈液を各ウェルに加え、37℃で1乃至2時間、インキュベートする。このプレートをPBS/Tweenで洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗ヒトIgG Fc特異ポリクローナル試薬と一緒に37℃で1時間、インキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質(1mg/ml)で展開させ、405乃至650のODで分析する。好ましくは、最も高い抗体価を生じるマウスを融合に用いるとよい。
ヒトモノクローナル抗EGFR抗体は、EGFRへの特異的結合に加え、EGFR発現細胞の貪食及び致死を媒介するそれらの能力についても、検査することができる。モノクローナル抗体活性のin vitroでの検査は、in vivoモデルでの検査前の最初のスクリーニングとなるであろう。簡単に説明すると、健康なドナーからの多核白血球(PMN)又は他のエフェクタ細胞をフィッコール・ハイパック密度遠心分離法で精製した後、混入赤血球を溶解させることができる。洗浄したPMNを、10%熱不活化ウシ胎児血清を添加したRPMI中に懸濁させ、51Crで標識したEGFR発現細胞と、様々なエフェクタ細胞対腫瘍細胞の比(−エフェクタ細胞:腫瘍細胞)で混合することができる。次に、精製済みのヒト抗EGFR IgGを様々な濃度で加えることができる。 無関係のヒトIgGを陰性コントロールとして用いることができる。検定は、37℃で0−120分間かけて行うことができる。51Crの培養上清への放出を測定することで、試料を細胞溶解について検定することができる。さらに抗EGFRモノクローナルを相互に組み合わせて検査して、複数のモノクローナル抗体で細胞溶解が高められるかを調べることもできる。
1)EGFR発現生存細胞への結合;
2)EGFRへの結合の高親和性;
3)EGFR上の固有のエピトープへの結合(それにより、補完的な活性を持つモノクローナル抗体を組み合わせて用いた場合に、同じエピトープへの結合をめぐった競合が起きる可能性をなくす);
(4)EGFR発現細胞のオプソニン化;及び/又は
(5)ヒトエフェクター細胞の存在下でのEGFR発現細胞の成長阻害、貪食及び/又は致死の媒介。
さらに別の局面では、本発明は、EGFRに、好ましくは高親和性で、特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現することのできるトランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物を提供するものである。ある好適な実施態様では、トランスジェニックマウス(HuMAbマウス)などの本非ヒトトランスジェニック動物は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。ある実施態様では、トランスジェニックマウスなどの本非ヒトトランスジェニック動物は、EGFR抗原の精製もしくは濃縮製剤、及び/又は、EGFR発現細胞で免疫されている。好ましくは、トランスジェニックマウスなどの本非ヒトトランスジェニック動物は、V-D-J組換え及びアイソタイプ・スイッチングを起こすことにより、EGFRに対して複数のアイソタイプのヒトモノクローナル抗体(例えばIgG、IgA 及び/又は IgE)を産生することができる。アイソタイプ・スイッチングは、例えば古典的又は非古典的なアイソタイプ・スイッチングなどで起きるものでもよい。
et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)を参照されたい)。前述のトランスジェニック動物のそれぞれの場合、機能的に再編成された異種重鎖及び軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子が、このトランスジェニック動物のB細胞の大部分で見られる(少なくとも10パーセント)。
mg/mlであろう。IgMからIgGへのスイッチを行うことのできる導入遺伝子がトランスジェニックマウスに導入されている場合、成体マウスの血清IgG対IgMの比は好ましくは約10:1である。IgG対IgMのこの比は幼若マウスではずっと低くなるであろう。おおざっぱに言って、当該脾臓及びリンパ節B細胞の約10%を越えるもの、好ましくは40乃至80%が、ヒトIgGタンパク質のみを発現する。
(1)ヒトVL遺伝子セグメント及びヒトJLセグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、及び(2)ヒトCL遺伝子セグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域、から成るヒト配列軽鎖と;
(1)ヒトVH遺伝子セグメント、選択的にD領域、及びヒトJHセグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び(2)ヒトCH遺伝子セグメントにコードされたポリペプチド配列に実質的に同一なポリペプチド配列を有する定常領域、から成るヒト配列重鎖と
を含む。
I.再編成のない重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物;
II.再編成のない重鎖及び再編成のない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物;
III.再編成される重鎖及び再編成のない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物;及び
IV. 再編成される重鎖及び再編成される軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物。
(この場合の内因性軽鎖遺伝子はノックアウトされておらず、アレル排除により劣性とならなければならない)の通りである。
本発明のさらに別の実施態様では、EGFRに対するヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を誘導体化するか、又は、例えば別のペプチド又はタンパク質(例えばFab'フラグメント)などの別の機能分子に連結して、複数の結合部位又は標的エピトープに結合する二重特異的又は多重特異的分子を作製することができる。例えば、本発明の抗体又は抗原結合部分は、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド又は結合ミメティックなど、1つ以上の他の結合分子に(例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的結合又は他の方法により)機能的に連結することができる。
抗FcγRI MAb 22、MAb 22のF(ab')2フラグメントは、メダレックス社(ニュージャージー州アナンデール)から入手することができる。他の実施態様では、抗Fcγ受容体抗体は、ヒト化型のモノクローナル抗体22(H22)である。H22抗体の作製及び特徴付けはGraziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 及び PCT/US93/10384に解説されている。H22抗体産生細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに1992年11月4日に指定番号HA022CL1で寄託され、受託番号CRL
11177を受けている。
(Morton,
H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。FcαRIに、IgAリガンド結合ドメイン以外で結合する、A3、A59、A62及びA77と同定された4種類のFcαRI特異的モノクローナル抗体が解説されている。(Monteiro, R.C. et
al., 1992, J. Immunol. 148:1764)。
Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい)がある。他の方法にはPaulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83)、及びGlennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)が解説したものがある。好適な結合剤は
両者ともピアース・ケミカル社(イリノイ州ロックフォード)から入手できるSATA 及びスルホ-SMCCである。
(RIA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば成長阻害)、又はウェスタン・ブロット検定法などにより、確認することができる。これらの検定法はそれぞれ、大まかに言って、目的のタンパク質−抗体複合体の存在を、この複合体に特異的な標識済みの試薬(例えば抗体)により検出するものである。例えばFcR-抗体複合体は、この抗体-FcR複合体を認識して特異的に結合する、例えば酵素に結合させた抗体又は抗体フラグメントなどを用いて、検出することができる。代替的には、当該の複合体を、多種の他の免疫検定法のいずれかを用いて検出することもできる。例えば、本抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ
(RIA)で用いることができる (例えば引用をもってここに援用するWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training
Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい)。放射性同位元素は、γカウンター又はシンチレーション」・カウンター、あるいはオートラジオグラフィの使用などの手段により、検出することができる。
別の局面では、本発明は、細胞毒、薬物又は放射性同位元素などの治療部分に結合させたヒト抗EGFRモノクローナル抗体又はそのフラグメントを特徴とする。細胞毒に結合させた場合、これらの抗体複合体は「イムノトキシン」と呼ばれる。細胞毒又は細胞傷害性作用薬には、細胞にとって有害(例えば致死させる)なあらゆる物質が含まれる。例にはタキソール、シトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体、がある。治療的作用薬には、限定はしないが、抗代謝産物(例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えばメクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU) 及びロムスチン (CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、及びcis-ジクロロジアミンプラチナム(II) (DDP) シスプラチン)、アントラサイクリン (例えばダウノルビシン(以前のダウノマイシン)、及びドキソルビシン)、抗生物質(例えばダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン(AMC))、及び抗有糸分裂剤(例えばビンクリスチン及びビンブラスチン)、がある。本発明の抗体に結合させることができる治療的細胞毒の他の例には、カリケアミシン及びデュオカルマイシンがある。本発明の抗体を、放射性ヨウ素などの放射性同位元素に結合させて、癌などのEGFR関連疾患を治療するための細胞傷害性放射性医薬を作製することもできる。
Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,
Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.,
"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd
Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,
"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review",
in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et
al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective
Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in
Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.),
pp. 303-16 (Academic Press 1985), 及び Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照されたい。
別の局面では、本発明は、薬学的に許容可能な担体と一緒に調合された、本発明のヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を1つ又は組み合わせで含有する、医薬組成物などの組成物を提供するものである。ある好適な実施態様では、本組成物は、複数(例えば二種以上)の単離された本発明のヒト抗体又はその抗原結合部分の組合せを含有する。好ましくは、本組成物の抗体又はその抗原結合部分の各々が、EGFRの別個の、予め選択されたエピトープに結合するとよい。
例えばSustained and Controlled Release Drug
Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel
Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27)。
(例えばV.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。標的決定成分の例には、葉酸又はビオチン(例えばLow et al.の米国特許第5,416,016号を参照されたい);マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 153:1038);抗体 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob.
Agents Chemother. 39:180);その様々な種が本発明の調合物や、本発明の分子の構成成分を成していてもよいサーファクタントプロテインA受容体 (Briscoe et al. (1995) Am. J.
Physiol. 1233:134);p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol.
Chem. 269:9090);があり、さらにK. Keinanen; M.L.
Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods
4:273を参照されたい。本発明の一実施態様では、本発明の治療用化合物をリポソーム中に調合する。より好適な実施態様では、当該リポソームが標的決定成分を含む。最も好適な実施態様では、当該リポソーム中の治療用化合物を、腫瘍又は感染に近位の部位への大量注射により送達する。当該組成物は、注射筒での注入が容易な程度に流動性でなくてはならない。それは、製造及び保管条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られていなくてはならない。
本発明の組成物(例えばEGFRに対するヒトモノクローナル抗体及びその誘導体/複合体)は、in vitro 及びin vivo で診断上及び治療上の実用性を有する。例えばこれらの分子を、多種の異常を治療、予防又は診断するために、in vitro 又はex vivoなどの培養中の細胞や、又は、in vivoなど対象中の細胞に投与することができる。ここで用いる用語「対象」には、ヒト及び非ヒト動物が包含されるものと、意図されている。好適なヒト動物には、EGFRの発現、典型的には異常な発現(例えば過剰発現)を特徴とする異常を有するヒトの患者が含まれる。例えば本発明の方法及び組成物は、膀胱、乳房、結腸、腎臓、卵巣、前立腺、腎細胞、扁平細胞、肺(非小細胞)、並びに頭部及び頸部の腫瘍細胞などを含め、EGFRを発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする異常など、腫瘍形成性異常を持つ対象を治療するために、用いることができる。本発明の方法及び組成物はまた、例えば自己免疫疾患、癌、乾癬、又は炎症性関節炎、例えばリウマチ性関節炎、全身性紅斑性狼蒼随伴関節炎、又は乾癬性関節炎などの他の異常を治療するためにも、用いることができる。本発明の用語「非ヒト動物」には、例えばほ乳動物及び非哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類等、あらゆる脊椎動物が含まれる。
et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360、及びEP 0365 997に解説されているように、131I、90Y、105Rh、インジウム-111等の放射性核種に結合させることができる。
の用量を21日毎に静脈内投与される。
又は IL-10)に対する免疫抑制性抗体から成る群より選択される一種以上の更なる治療薬を含む。
の桁であるが、治療目的に応じて様々であろう。一般的には、この量は、EGFR発現腫瘍細胞などの標的細胞を位置特定したり、貪食などにより細胞致死を起こさせるには、充分であろう。投与経路も様々であってよい。
vivo又はin vitroで位置確認するための方法を提供する。この検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素コファクターなどであってよい。
vivo又はin vitroでFc発現細胞の存在を検出する、又は、その量を定量する方法を提供するものである。本方法は、(i)検出可能なマーカに結合させた本発明の組成物(例えば多重もしくは二重特異的分子)又はその一フラグメントを対象に投与するステップと、(ii)前記検出可能なマーカを検出する手段に前記対象を暴露して、Fc発現細胞を含有する区域を特定するステップと、を含む。
材料及び方法
抗原: トランスジェニックマウスを、A431ヒト類上皮癌細胞株 (CRL-1555、ロット203945、ヴァージニア州マナサス、ATCC )及びシグマ・ケミカル社(製品E 3641 ロット109H4108 及び 20K4079)から入手した可溶性上皮成長因子受容体
(EGFR)で免疫した。可溶性EGFRは使用時まで-20℃乃至-80℃で保存されていた。
抗EGFR抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(メリーランド州ロックビル、ATCC、HB-8508)から得た;無関係のIgG1抗体として用いた無関係のヒトIgGアイソタイプコントロール (ジェンマブ社);及び間接的免疫蛍光法のための二次抗体として用いたヤギ抗マウスIgG(H+L)のフルオレセイン-イソチオシアネート(FITC)結合F(ab')2フラグメント(カリフォルニア州サンフランシスコ、プロトス)、FITC結合F(ab')2ウサギ-α-ヒトIgG (デンマーク、グロストラップ、ダコ社)。
IU/ml ペニシリン、及び4 mM L-グルタミン(すべてギブコBRL社)を加えたRPMI 1640培地(ギブコBRL社)で培養した。細胞が成長して付着性になったときに、これらをトリプシン-EDTA のPBS (スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社)溶液を用いて剥がした。腫瘍モデルでは、前記細胞は常に対数期で用いられている。細胞を安定なEGFR発現及びマイコプラズマ混入についてテストしてから、各実験を行う。
mlのSFMで希釈し、1000gで10分間、遠心分離した。骨髄腫細胞を50 mlの遠心分離試験管中に採集した。次に、脾細胞及び骨髄腫細胞を3回、1000gで遠心分離して洗浄し、30-40
ml のSFMに再懸濁させた。
1.
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Ca及びMgのないD-PBS、ハイクローンD-PBS#SH30013.03、又はシグマP 3813。
2.
PBS-T (洗浄緩衝液)、0.05% Tween 20を含有するPBS、シグマP-1379。
3.
PBS-T プラス1% BSA (シグマA 9647)。これは遮断緩衝液及び試料緩衝液として役立てる。
4.
ELISA プレート、Nunc イムノ-プレート F96 Maxisorp 442404。
5.
抗ヒトIgGγ鎖特異抗体、ジャクソン・イムノRリサーチ#109-006-098。
6.
アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトγ鎖特異IgG、ジャクソン・イムノ・リサーチ#109-056-098。代替物は、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトκ、シグマA 3813を用いること。
7.
アイソタイプ特異的ELISAに用いるためのアルカリホスファターゼ標識抗ヒトIgG1、又はIgG3、サザン・バイオテクノロジー#9050-04&9210-04。
8.
p ニトロフェニル(pNPP)、シグマN2765、又はシグマ・ファスト・タブレット・キット N-2770。
9.
pNPP 基質及び緩衝液−2つの選択肢:
A.
ジエタノールアミン緩衝液:97 ml のジエタノールアミン、シグマD-2286と0.1g MgCl2、6H2O 及び800 ml Di 水を混合する。pH を9.8に調節し、最終体積を1.0 L にDi 水で調節する。pNPPの20 mg 錠、シグマ N-2765を1錠、20 mlのジエタノールアミン緩衝液当たり加える。
B.
シグマ・ファスト pNPP タブレット・セット、シグマN-2770: 緩衝剤タブレット1錠及び
pNPPタブレット1錠を20 ml のH2Oに溶解させる。
10.
405nmのフィルタを付けたELISAプレート・リーダ。
11.
上皮成長因子受容体(EGFR)、シグマE 3641、ビオチン標識EGF (EGF-B)、モラキュラー・プローブ E-3477。
12. ビオチン標識抗EGFR MAb又はヒト抗体。
13. 陰性コントロール用の非特異的ヒト抗体、又は精製ヒトIgG1κ、シグマ I-I3889。
14. 自動ELISA プレート洗浄機:Titertek
MAP C。
(シグマA-3813) を PBS-T と1% BSAの1:5000 に溶かしたものの混合液を加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、プレート洗浄機で4回、洗浄し、pNPP基質を加えた。プレートを10-60分間インキュベートし、405 nm での吸光度をELISAプレート・リーダで読み取った。
遮断検定法: 抗EGFR抗体がEGFRに結合する上に、ビオチン標識した上皮成長因子の上皮成長因子受容体(EGFR)への結合を遮断することを立証するために、Nunc Maxisorp プレートを、PBSに0.4μg/mlになるように溶かした100μl/ウェルのEGFRで、4℃で一晩、又は、室温で2時間かけて、被覆した。プレートをPBS-Tで3回、洗浄し、100μl /ウェルのPBS-Tプラス1% BSAを加えて、プラスチック表面上の非特異的部位を遮断し、少なくとも15分間インキュベートしてから試料を添加した。テストしようとする試料の希釈液をPBS-T プラス1% BSAに入れて添加した。上清を最小で1:3になるようにPBS-T 1% BSAで希釈してからELISAプレートに添加した。試料及び標準を100μlウェルになるように添加し、30分間、室温でインキュベートしてから、20μl/ウェルのビオチン標識EGFを0.5μg/mlになるように加え、プレートを1時間インキュベートした(これは既にプレート上にある試料溶液に加える)。代替的には、試料を1時間インキュベートし、洗浄し、100μl/ウェルのEGF−ビオチンを0.1μg/mlになるように加え、1時間インキュベートすることもできる。プレートを3回洗浄し、ストレプトアビジン・アルカリホスファターゼを1:2000の希釈度で含有する100μl /ウェルのPBS-T 1% BSAを加え、1時間インキュベートした。プレートを4回洗浄し、pNPP基質を加え、吸光度を405 nmで読み取った。
1.
1つ以上のT-175 フラスコに入ったコンフルエントA431 細胞 (ATCC CRL 1555)。A431細胞 をDMEM プラス10 % FCS中で培養する。
2.
トリプシン-EDTA溶液、シグマ T-3924。
3.
ビオチン標識EGF。約5μg/mlのストック溶液を調製し、10μl / ウェルを用いる。
4.
丸底96 ウェルプレート。
5.
PBS、無菌。
6.
PBS プラス1% BSA プラス0.02 % アジ化ナトリウム(FACS緩衝液)。
7.
PE-標識ストレプトアビジン、シグマS 3402。1:20 にFACS 緩衝液で希釈する。
8.
PE-標識又はFITC標識抗ヒトIgG、FCγ特異的、ファーミンジェン34164X、34165X。
9.
96ウェルプレート用のスイング籠及びアダプタ(ベックマン社)で低速遠心分離。
10.
FACS。
11.
BD FACS 試験管。
1580、ロットF-15183 オリジン−ハイブリドーマ・クローニング・ファクター (アイジェン社21001). OPI サプルメント(シグマ社 O-5003)ユタ州ローガン、ハイクローン社のウシ胎児血清 (SH30071 ロット番号ALE10321、及びAGH6843) 。オリゲン・フリーズ培地(アイジェン社、#210002)
20 及び1% ニワトリ血清(ギブコ BRL社)) で遮断後、ELISA緩衝液で希釈したモノクローナル抗体を加え、1時間、37℃でインキュベートした。次にこのプレートを3回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG Fc特異(ペンシルバニア州ウェスト・グレース、ジャクソン社)と一緒に1時間、37℃でインキュベートした。この検定液をABTS (ドイツ、マンハイム、ロシュ・ダイアグノスティックス社)で30分間、展開させた。吸光度をマイクロプレート・リーダ(カナダ、ウィヌースキ、バイオテック社)で415 nmで測定した。遮断実験に関しては、プレートを50μlの遮断剤のELISA緩衝液溶液と一緒に10分間、予めインキュベートしてから、50μlの完全ヒト抗体を加えた。マウス血清中のヒトIgGを判定するために、ELISAプレートをウサギ抗ヒトカッパ、軽鎖(ダコ社)で、96ウェル微量定量プレート(グライナー社)に容れたPBS中で、一晩かけて被覆した。このプレートをELISA緩衝液 (PBS/0.05%Tween20 及び1% ニワトリ血清)100μl/ウェル、で遮断した後、ELISA緩衝液で希釈したマウス血清を加え、1時間、37℃でインキュベートした。次にこのプレートを3回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ウサギ F(ab')2フラグメント抗ヒトIgG (ダコ社)と一緒に1時間、37℃でインキュベートした。この検定液をABTS (ロシュ社)で30分間、展開させた。吸光度をマイクロプレート・リーダ(バイオテック社)で415nmで測定した。
1995)が解説したように、1ウェル当たり100μlの溶解緩衝液を用いて調製した。50μlのA431細胞抽出物を、SDSナトリウム-PAGEと、抗ホスホチロシン抗体(ケンタッキー州、トランスダクション・ラボラトリーズ社、PY20)、ヤギ抗マウスIgG-HRP抗体(トランスダクション・ラボラトリーズ社)を用いた免疫ブロット法と、ECL検出法とで分析した。TGF-α(ニュージャージー州ロッキーヒル、プレポテック社)による刺激の場合、24ウェル・プレート(NUNC社)に容れたA431細胞のサブコンフルエント培養物を一晩、低血清培地(0.5%)で処理した。抗体を10又は0μg/mlの固定した用量、加え、上述のようにインキュベートした。細胞を次第に量を多くしたTGF-αで刺激した。細胞を上述のように処理した。
885-889に解説されたものを少し改良した方法で単離した。簡単に説明すると、ヘパリン−抗凝固血をフィッコール勾配で層にした。遠心分離後、エフェクタ細胞を中間相から採集し、残った赤血球を低張溶解で取り除いた。サイトスピン・プレパラートを用いて、単離された細胞の純度を評価すると95 %より高かった。トリパン・ブルー圧排法で判定した細胞の生存率は95%を越えた。
931-939)。単離されたヒト白血球をエフェクタ源として用いた。簡単に説明すると、腫瘍標的を100μCi51Crと一緒に2時間、インキュベートした。培養基で3回洗浄した後、5×103個の標的細胞を、50μlの単離エフェクタ細胞及び感作MAbを様々な濃度で培養基で希釈して含有する丸底組織培養プレートに加えた。最終体積は200μlであり、エフェクター対標的細胞の比(E:T)は80:1であった。この検定液を一晩、37℃でインキュベートし、遠心分離で停止させた。三対にした上清中でクロム放出を測定した。細胞傷害率を以下の式を用いて計算した:
%特異的溶解 = 実験cpm − 自発的cpm ×100
最大cpm − 自発的cpm
但し、最大51Cr放出は、ZAP-オグロビン(R)(10% 最終濃度)を標的細胞に加えることで判定され、基礎放出値は、感作抗体及びエフェクタ細胞の非存在下で測定された。抗体が媒介する、非細胞性の細胞傷害性(エフェクタ細胞なし)が、ごく低レベル、これらの検定条件下で観察された(<5% 特異的溶解)。
vivo通過後にフローサイトメトリ及び免疫組織化学法によって安定なEGFR発現についてテストした。薬物動態を調べるために、腫瘍のある、又は、ないマウスに2F8抗体をi.p. 注射した。この注射の前及び後の6週間、週毎の血液試料を尾の静脈から採血した。試料をヒトIgG
ELISAで分析した。
CMDターゲティング・ベクタの構築
プラスミドpICEmuは、mu遺伝子に延びる、Balb/Cゲノム・ラムダ・ファージ・ライブラリから得られたマウスIg重鎖遺伝子座のEcoRI/XhoI断片を含有する(Marcu et al. Cell 22:
187, 1980)。このゲノム断片をプラスミドpICEMI9HのXhoI/EcoRI部位にサブクローニングした
(Marsh et
al; Gene 32, 481-485, 1984)。pICEmuに含まれたこれら重鎖配列は、muイントロン・エンハンサのちょうど3'側に位置するEcoRI部位の下流から、mu遺伝子の最後の膜貫通エキソンのほぼ1kb下流に位置するXhoI部位まで延びる。しかし、このmuスイッチ反復領域の大半は、E. coli内を継代させて欠失させてある。ターゲティング・ベクタは以下の通りに構築された。1.3 kb のHindIII/SmaI 断片をpICEmuから切り取り、HindIII/SmaIで消化したpBluescript(カリフォルニア州ラホーヤ、ストラタジーン社)内にサブクローニングした。このpICEmu断片は、Cmu1のほぼ1 kb 5'側に位置するHindIII部位からCmu1内にあるSmaI部位まで延びる。その結果得られたプラスミドをSmaI/SpeIで消化し、pICEmu由来の、Cmu1の3'側のSmaI部位から最後のCmuエキソンのちょうど下流に位置するXbaI部位まで延びる約4 kb のSmaI/XbaI 断片を挿入した。その結果得られたプラスミドpTAR1をSmaI部位で直線化し、neo発現カセットを挿入した。このカセットは、マウスホスホグリセレートキナーゼ(pgk)プロモータ(XbaI/Taq1断片Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74)の転写制御下にあると共に、pgkポリアデニレーション部位(PvuII/HindIII 断片;Boer et
al. (1990) Biochemical
Genetics 28: 299-308) を含有するneo遺伝子から成る。このカセットは、プラスミドpKJ1 (Tybulewicz et
al. (1991) Cell 65:
1153-1163に解説がある)から得たが、このpKJ1プラスミドから前記neoカセットをEcoRI/HindIII断片として切り出し、EcoRI/HindIIIで消化したpGEM-7Zf(+)内にサブクローニングして、pGEM-7 (KJ1)を作製した。このneoカセットを、pGEM-7 (KJ1)からEcoRI/SalI消化により切り出し、平滑末端にしてから、プラスミドpTAR1のSmaI部位にゲノムCmu配列とは反対の方向でサブクローニングした。その結果得られたプラスミドをNot Iで直線化し、単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ(tk)カセットを挿入して、Mansour et al. (1988) Nature 336:
348-352が解説した通りに、相同組換え体を持つESクローンを濃縮できるようにした。このカセットは、Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163が解説したように、マウスpgkプロモータ及びポリアデニレーション部位を両端に持つtk遺伝子のコーディング配列から成る。その結果得られたCMDターゲティング・ベクタは、前記重鎖遺伝子座に合計でほぼ5.3 kb の相同性を含有し、neo発現カセットが一番目のCmuエキソンの非反復SmaI部位に挿入されているような変異mu遺伝子を生ずるよう、デザインされている。このターゲティング・ベクタを、ES細胞内に電気穿孔注入する前に、プラスミド配列内で切断するPvuIで直線化した。
AB-1 ES 細胞 (McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62:
1073-1085) を有糸分裂不活性期のSNL76/7 細胞支持細胞層(同書)上で、基本的には解説 (Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL
Press, p. 71-112のRobertson, E.
J. (1987))された通りに成長させた。直線化させたCMDターゲティング・ベクタを、電気穿孔法でAB-1細胞に、Hasty et al. (Hasty, P. R. et
al. (1991) Nature 350: 243-246)で解説された方法により注入した。注入後の細胞を100 mm 皿に、1-2×106細胞/皿の密度になるようにプレートした。24時間後、G418 (200マイクログラム/mlの活性成分)及び FIAU (5×10-7M)を培地に加え、薬物耐性クローンを8乃至9日間、展開させた。クローンを摘みだし、トリプシン処理し、2つの部分に分割し、さらに展開させた。その後各クローン由来の細胞の半分を凍結させ、残りの半分を、ベクタと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
(Laird,
P. W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19 : 4293)が解説した通りに前記クローンから単離された。単離されたゲノムDNAをSpeIで消化し、muイントロン・エンハンサとmuスイッチ領域との間の配列にハイブリダイズするプローブAである915 bp のSacI 断片でプローブした。プローブAは、野生型遺伝子座の9.9 kbのSpeI断片と、CMDターゲティング・ベクタと相同組換えを起こしたmu遺伝子座の判断材料となる7.6kbのバンドとを検出する(neo発現カセットはSpeI部位を含有する)。サザン・ブロット解析でスクリーニングした1132 個のG418及びFIAU 耐性クローンのうち、3個が、mu遺伝子座での相同組換えを示す7.6 kb のSpeI バンドを示した。これら3個のクローンを酵素BglI、BstXI、及びEcoRI でさらに消化して、当該ベクタがmu遺伝子に相同的に組み込まれたことを確認した。プローブAとハイブリダイズした場合、BglI、BstXI、又はEcoRI で消化した野生型DNAのサザン・ブロットでは、それぞれ15.7、7.3、及び12.5 kbの断片が生ずるが、標的決定されたmu対立遺伝子の存在は、それぞれ7.7、6.6、及び14.3 kbの断片で示される。SpeI消化により検出された3個の陽性クローンはすべて、neoカセットがCmu1エキソンへ挿入されたことの判断材料となる、予想通りのBglI、BstXI、及びEcoRI制限断片を示した。
264番、272番及び408番と指定した3つの標的設定されたESクローンを解凍し、C57BL/6J胚盤胞にBradley (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford:
IRL Press, p. 113-151)の解説通りに注入した。注入された胚盤胞を偽妊娠メスの子宮に移して、注入されたES細胞及びホストの胚盤胞を由来とする細胞の混合物であるキメラマウスを作製した。このキメラへのES細胞の寄与度は、黒色のC57BL/6Jバックグラウンド上に見える、ES細胞系由来の野鼠色の皮の量により視覚的に判断できる。クローン272及び408では、ごく低いパーセンテージでキメラが生じた(即ち、野鼠色の着色率が低い)が、クローン264では、高率でオスのキメラが生じた。これらのキメラをC57BL/6Jメスと交配し、ES細胞ゲノムの生殖細胞伝播を示す野鼠色の仔を作った。尾の生検で得たDNAをBgII消化し、サザン・ブロット分析して、標的設定されたmu遺伝子のスクリーニングを行った(ES細胞DNAの分析について上述した通り)。野鼠色の仔のほぼ50%が、野生型のバンド15.7kbに加え、ハイブリダイズした7.7kbのBgIIバンドを示し、標的設定されたmu遺伝子の生殖細胞伝播が実証された。
neoカセットをCmu1に挿入したことでIg重鎖遺伝子が不活性化したかどうかを調べるために、クローン264キメラを、JH遺伝子セグメントを欠失させて重鎖発現を不活性化させるJHD変異がホモ接合型になったマウスと交配した(Chen et al, (1993) Immunol. 5: 647-656)。4匹の野鼠色の仔を得た。血清を1月齢のこれら動物から得、ELISAで検定してマウスIgMの存在を調べた。4匹の仔のうち2匹がIgMを完全に欠いていた(表2を参照されたい)。4匹の動物を、尾の生検で得たDNAをBgII消化し、プローブA(図1を参照されたい)にハイブリダイズさせ、さらにStuI消化し、475bpのEcoRI/StuI断片(同書)にハイブリダイズさせる、といったサザン・ブロット分析で遺伝子型決定したところ、血清IgMを発現できない当該動物は、重鎖遺伝子座の一方の対立遺伝子がJHD変異を持ち、他方の対立遺伝子がCmu1変異を持つものであることが実証された。JHD変異がヘテロ接合型となったマウスは野生型のレベルの血清Igを示す。これらのデータは、Cmu1変異はmu遺伝子の発現を不活性化することを実証するものである。
(CMD/JHD)、JHD変異についてヘテロ接合型のマウス (+/JHD)、野生型 (129Sv ×C57BL/6J)F1 マウス(+/+)、及び、JHD変異がホモ接合型のB細胞欠損マウス(JHD/JHD)について、ELISAで検出された血清IgMレベルを示す。
HCO12ヒト重鎖導入遺伝子
80 kb のpHC2 のインサート(Taylor et al.,
1994, Int. Immunol., 6: 579-591)及び25 kbのpVx6のインサートを同時注入することで、HCO12導入遺伝子を作製した。プラスミドpVx6
を以下に解説するように構築した。
DNA 断片をプラスミド・ベクタpSP72 (ウィスコンシン州マジソン、プロメガ社)内にサブクローニングして、プラスミドp343.7.16を作製した。生殖細胞系ヒトVH5-51
(DP-73)遺伝子を、ほぼ5 kbの5' 側フランキング及び1 kb の3' 側フランキングゲノム配列と一緒に含む、7 kbのBamHI/HindIII
DNA断片を、pBR322ベースのプラスミド・クローニング・ベクタpGP1f (Taylor et al.
1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295)内にクローニングして、プラスミドp251fを作製した。pGP1f、pGP1k を由来とする新しいクローニング・ベクタを、EcoRV/BamHIで消化し、生殖細胞系ヒトVH3-23
(DP47)遺伝子をほぼ4 kbの5' 側フランキング及び5 kb の3' 側フランキングゲノム配列と一緒に含む、10 kbのEcoRV/BamHI DNA
断片に連結した。その結果得られたプラスミドp112.2RR.7をBamHI/SalI で消化し、p251fの7 kbの精製済みBamHI/SalI インサートに連結した。その結果得られたプラスミドpVx4をXhoIで消化し、p343.7.16の8.5 kbの XhoI/SalI インサートに連結した。
Manual, 2nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview NY)が解説したように半日齢(C57BL/6J x DBA/2J)F2 胚の前核に同時注入した。これらの注入を受けた胚から発生したマウスから、V×6及びHC2の両方を由来とする配列を含むトランスジェニックマウスの3つの個別の株を確立した。これらの株を(HCO12)14881、(HCO12)15083、及び(HCO12)15087と命名する。次にこれらの3つの株のそれぞれを、実施例1で解説したCMD変異、JKD 変異 (Chen et al.
1993, EMBO J. 12: 811-820)、及び(KCo5)9272 導入遺伝子(Fishwild et al.
1996, Nature Biotechnology 14: 845-851)を含むマウスに交配した。その結果得られるマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖導入遺伝子を、内因性マウス重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座の破壊についてホモ接合型であることをバックグラウンドとして発現する。
2つの異なる株のマウスを用いてEGFR反応性ヒトモノクローナル抗体を作製した。株((CMD)++; (JKD)++; (HCo7)11952+/++; (KCo5)9272+/++) (ここで「HCO7マウス」と言及する、及び株
((CMD)++; (JKD)++; (HCo12)15087+/++; (KCo5)9272+/++) (ここで「HCO12マウス」と言及する)。これらの株のそれぞれは、内因性重鎖(CMD)及びカッパ軽鎖(JKD)遺伝子座の破壊についてホモ接合型である。両方の株とも、ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子(HCo7)を含むが、個々の動物は、#11952の挿入についてはヘミ接合型又はホモ接合型である。2種の株は、用いたヒト重鎖導入遺伝子の点で異なる。マウスはHCo7又はHCo12導入遺伝子のいずれかについてヘミ接合型又はホモ接合型だった。CMD変異は実施例1で上述されている。(HCo12)15087 マウスの作製は実施例2で解説されている。JKD 変異 (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) 及び(KCo5)9272 (Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851) 及び(HCo7)11952 マウスは、米国特許第5,770,429号及び第5,545,806号 (Lonberg &
Kay, 6/23/98)に解説されている。
P3 X63 ag8.653 骨髄腫細胞株 (ATCC CRL 1580、ロットF-15183)を融合に用いた。最初のATCCバイアルを解凍し、培養で展開させた。凍結バイアルの種ストックをこの展開物から調製した。細胞の新鮮なバイアルを融合から1乃至2週前に解凍した。
2-メルカプトエタノール (ギブコBRL、21985-023)を含有する高グルコースDMEM (セルグロー社メディアテック、#10013) を用いて、A431細胞及び骨髄腫細胞を培養した。
3% オリジン−ハイブリドーマ・クローニング・ファクター(アイジェン社、21001)、OPI補助剤 (シグマ社、O-5003)、1.1×10-3Mのオキサロ酢酸、 4.5×10-4Mのピルビン酸ナトリウム、及び 24国際単位/L ウシインシュリン、HAT (シグマ社、H 0262) 1.0 ×10-4M ヒポキサンチン、4.0×10-7 M アミノプテリン、1.6 ×10-5M
チミジン、又はHT (シグマ社、H0137) 1.0×10-4M
ヒポキサンチン、1.6×105M チミジン を含む更なる培地補助剤を、該ハイブリドーマ成長培地に加えた。
ハイブリドーマ2F8の結合親和性をBIAcore 3000 (スウェーデン、ウプスラ、バイアコア社)を用いて判定した。シグマ社から購入したA431細胞から精製したEGFRをCM5 チップ上に、メーカの指示通りに固定した。抗体2F8は5.47 (±0.52)×108M-1の平衡結合定数(KA)を有していた。
抗原陽性ハイブリドーマが24ウェル・プレート内で確立してすぐ、競合的ELISA検定法を最初の定性検定法として用いた。大まかには、強力な競合(80-100%)があることは、抗体が、競合する抗体と同じエピトープ又は、競合する抗体と近いところの抗原領域に結合することを示唆する。50%より低い競合率は、抗体及びその競合物質が、抗原のうちで近くない領域に結合することを示唆する。最初の検定は、その多くが1ウェル当たり1個を越えるハイブリドーマを含有した未クローニングのハイブリドーマの上清を用いて行った。それ以降の検定は、最初のウェルのサブクローンを用いて行われた。図1及び2は、(図1及び2のデータは、MAb 225との競合程度に基づいて並べられている)粗細胞培養上清を用いた場合ですら、225及び528抗体と類似又は同一のエピトープに結合する抗体を特定できることを示す。またこの実験では、マウス20241由来又はマウス20242及び20243由来の抗体の競合的結合パターンの分布が異なることが明らかになった。例えば、#20241マウス由来の最初の7種の抗体(図1)は、MAb 225 及び528の両方と強く競合する。20241由来の残りの抗体は
225 及び528 抗体と中程度又は弱く、競合した。20242及び20243マウス由来の5種の抗体
(1H6、2F8、1A8、5C5、及び8E1)は、強い競合を抗体225に対して示し、MAb 528由来のものには全く示さないか、又は弱い競合を示した(図2)。マウス20242及び20243由来の抗体2F6、8A12、5F12、6B3、及び6D9はMAb 225 及び528の両方と競合したが、その競合は225抗体との方がより強かった。これらのマウス由来の他の抗体は、市販のMAbとは競合しないか、又は弱く競合した。
さらに抗原陽性サブクローンをEGF/EGFR遮断検定法で評価した。これらの検定法には、MAb 225 及び/又は 528と強力に競合する抗体や、225又は528に対し弱競合性又は非競合性の抗体のサブクローンが含まれた。いくつかの抗体を培地で展開させ、プロテインAクロマトグラフィで精製した。図5及び6は、ELISAでは225抗体の中程度乃至強力な競合物質である抗体2F8、5F12、及び6B3が、EGFのEGFRへの結合の強力な遮断剤であることを示す。これは、ヒトA431類上皮腫癌細胞によるELISAフォーマット又はFACSで行った検定でも明白である。両方の検定で、これらヒト抗体はMAb 225と同程度又はより良好であった。抗体2F8、5F12、6B3、及び6E9はまた、A431細胞の表面に対しても同様な結合特性を有する(図7)。
511-529; Gill, et al. (1984) J. of Biol. Chem. 259(12):7755-7760)。2F8抗体は、様々な評価全体にわたって、6B3及び5F12抗体と同様又はより良好であった。
A431細胞に対し、フローサイトメトリ、ELISA、及び、リガンド誘導性自己リン酸化の阻害、を用いて阻害実験を行った。マウスMAb 225 又は 525を陽性コントロールとして用いた。無関係のヒトIgG アイソタイプ・コントロールをアイソタイプ・コントロールとして用いた。一種類のヒト抗体2F8を更なる実験のすべてに選択した。この抗体をここでは「Humax-EGFRTM」とも言及する。図8は、2F8の濃度依存的なEGF遮断能を示す。2F8 及びm225は同じ程度に遮断するが、EGFの遮断能の方が小さい。
2F8の腫瘍細胞活性化阻害能を評価するために、EGF惹起性細胞応答、例えば内因性チロシンキナーゼ活性の活性化及び随伴性の細胞増殖など、に2F8 が及ぼす影響を調べた。EGF又はTGF-αがEGFRに結合した後に起きる最初の事象の1つは、受容体の自己リン酸化の誘導である。EGFをA431細胞と一緒にインキュベートすると、EGFRのチロシンリン酸化が起きる(Mr 170,000) (図10A)。2F8は受容体キナーゼ活性自体は活性化しなかったが、この抗体はEGF惹起性EGFRチロシンリン酸化を用量依存的態様で遮断し、完全な遮断は濃度が16.6 nM (抗体:EGF モル比、20:1、図10A)のときに起きた。細胞を抗体で処理すると、TGF-αは、チロシンリン酸化は2F8により濃度66 nM (抗体:TGF-αモル比、7,3:1、図10B)のときに完全に遮断されたことを示した。
(HN5及びMDA-MB468、パネルB及びC)で得られた。外因性EGFは培養株に全く添加されなかったため、これらの結果は、2F8の自己分泌刺激遮断能、ひいては自己分泌EGF/TGF-α誘導性腫瘍細胞活性化の阻害能を示すものである。
ADCCは腫瘍細胞を抗体が認識したときに惹起される強力な免疫エフェクター機序である。2F8の存在下におけるヒトPMN細胞のA431細胞致死能を評価するために、A431細胞に51Crを取り込ませた後、抗体及びエフェクタ細胞(PMN)と一緒に一晩、インキュベートした。インキュベート後、クロム放出を測定した。図14に示すように、2F8はヒトPMNを用いてA431細胞に対するADCCを誘導することができる。2F8はA431標的細胞の45%にPMN誘導性溶解を媒介することができ、この率は、MAb 425で観察されるものより高い(図14)。
HuMAb 2F8が腫瘍形成を妨げる能力を無胸腺マウスモデルで示すために、6(6)匹のマウスのグループに、0(0)日目に200μlのPBSに入れた3×106個の腫瘍細胞を脇腹に皮下注射した。その後、マウスに1日目 (75μg/200μl)、3日目 (25μg/200μl)、及び5 日目(25μg/200μl)(矢印)に、腹腔内HuMAb 2F8(塗りつぶした四角)又はコントロールとしてヒトIgG1-κMAb(白抜き丸)のいずれかを注射した(図14)。データを平均腫瘍体積+SEMとして提示し、同様な結果を示した3つの個別の実験の代表とする。
SRαプロモータ並びにネオマイシン耐性及びDHFR選択マーカ(メダレックス社)を含有する、定常領域ベクタpIESRα中の断片をクローニングするために最適なコザック配列及び適した制限部位を含むプライマを用いたPCRにより、2F8抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。該pIESRα-2F8 ベクタを図16に示す。該pIESRα-2F8プラスミドの可変領域を配列決定して正確な配列であることを確認した。
51Cr放出検定で実験を行って、2F8による、A431細胞のADCC誘導能を検査した。
(カナダ、セント・ブルーノ、ウィセント社)、50
IU/ml ペニシリン、及び50μg/mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地(オランダ、バイオホイッテカー社)で培養された2-5×106個のA431細胞を、100μCi Na2 51CrO4(スウェーデン、ウプサラ、アマーシャム・バイオサイエンセズ社)で37℃で1時間、震盪しながら標識した。この細胞をPBSで3回、洗浄し、培地中に 1 ×105個の 細胞/mlになるように再懸濁させた。標識後の細胞を96ウェル・プレート(5×103個の細胞、50μl/ウェル中) に分散させ、2F8 T又はm225を培養基に入れて20μg/ml乃至0.02ng/ml(最終濃度)の範囲にした50μlの10倍連続希釈液と一緒に(室温で、30分間)、プレインキュベートした。抗体なしの培養基を加えて自発的な51Cr放出を判定し、そしてtriton X-100(1% 最終濃度)を加えて最大の51Cr放出を判定した。その後、単離されたばかりのヒト末梢血単核細胞 (PBMC) をウェルに(5×105細胞/ウェル)に(標的細胞:エフェクタ細胞の比=1:100)で加え、この細胞を37℃で一晩、インキュベートした。翌日に上清を回収して、ガンマ・カウンタで1分当たり(cpm)の計数を判定することで51Crの放出を測定した。細胞傷害率を以下の式:
%特異的溶解 =(実験での放出(cpm)−自発的放出(cpm)/(最大の放出(cpm)−自発的放出(cpm)×100
Tが低い受容体占有率でADCCを誘導できることを示唆している。このことは、 ADCCが、in vivoでの抗腫瘍活性で重要な役割を果たしている可能性を示している。
2種の連続実験を行って、大変進行性の高い成長を示すと共に、異なる供給業者からのマウスを用いて得られた異種移植マウスモデルの樹立A431腫瘍の成長の、2F8による阻害能を判定した。
当業者であれば、日常的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
ここに引用された全特許、係属中特許出願及び他の公開文献の全文を、引用をもってここに援用する。従属請求項に開示された実施態様のいずれの組合せも、本発明の範囲内にあると考えられる。
Claims (14)
- ヒトEGFRまたはそのフラグメントに結合し、かつヒトEGFRへの結合能を維持した、単離されたヒトモノクローナル抗体を、EGFR関連疾患を治療又は予防するために有効な量を含む、EGFRの発現により媒介される疾患を治療又は防止するための組成物であって、
該抗体が、IgG1、IgA、IgE、IgM、IgG4、及びIgD 抗体から成る群より選択され、かつ配列番号: 5のCDR1、配列番号: 6のCDR2、及び配列番号: 7のCDR3を含む重鎖CDR領域と、配列番号: 8のCDR1、配列番号: 9のCDR2、及び配列番号: 10のCDR3を含む軽鎖CDR領域とを含み、
該疾患が以下からなる群より選択される、前記組成物:
子宮/子宮頸管癌、食道癌、膵臓癌、胃癌、多形性神経膠芽腫を含む神経膠芽腫、小児期星状細胞腫を含む星状細胞腫、グリオーマ、神経芽腫、胃腸管の神経内分泌腫瘍、細気管支肺胞上皮癌、瀘胞樹状細胞肉腫、唾液腺癌、エナメル上皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、内分泌膵臓腫瘍、精上皮腫を含む精巣生殖細胞腫瘍、胎児性癌、卵黄嚢腫瘍、奇形腫及び絨毛上皮腫。 - 疾患が以下からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物:
子宮/子宮頸管癌、食道癌、膵臓癌、胃癌。 - 前記抗体が5乃至75mg/m2の用量で投与されるための、請求項1又は2に記載の組成物。
- 化学療法薬、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗乾癬薬、抗ウィルス剤、心臓血管作用薬、放射線治療法、温熱療法、移植、手術、日光療法及び光線療法から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項1又は2に記載の組成物。
- ナイトロジェン・マスタード、アジリジン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、プラチナ錯体、非古典的なアルキル化剤、葉酸類似体、プリン類似体、アデノシン類似体、ピリミジン類似体、置換ウレア、抗腫瘍抗生物質、エピポドフィロトキシン、微小管剤、カンプトテシン類似体、酵素、サイトカイン、モノクローナル抗体、組換え毒素及びイムノトキシン、癌遺伝子治療法、癌ワクチン、放射線治療法、温熱療法、移植、及び手術から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- (i)MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a、CD20、及び CD58に対する免疫抑制性抗体、(ii)それらのリガンドに対する抗体、及び(iii)可溶性IL-15R 及びIL-10、から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノレート・モフェチル、コルチコステロイド、メトトレキセート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、ブレキナー、レフルノミド、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン、6-メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス (FK-506)、OKT3、抗胸腺細胞グロブリン、移植、及び手術から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- アスピリン、他のサリチル酸塩、ステロイド系薬物、NSAID (非ステロイド系抗炎症剤)、Cox-2阻害剤、及びDMARD(疾患修飾抗リウマチ薬)から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- コールタール、ビタミンA、アントラリン、カルシポトリエン、タラゾテン、コルチコステロイド、メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、エタネルセプト、アレファセプト、エファルジマブ、6-チオグアニン、ミコフェノレート・モフェチル、タクロリムス (FK-506)、ヒドロキシウレア、日光療法、及び光線療法から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- ガンシクロビル、フォスカーネット、及びシドフォビルから成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- ジゴキシン、アセチルサリチル酸、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アミオダロン、リドカイン、ジソピラミド、フレカイニド、プロパフェノン、ヴェラパミル、ドーパミン、グリセリルトリニトレート(ニトログリセリン), モノ亜硝酸イソソルビド、ニコランディル、アテノロール、メトプロロール、ピンドロール、イスラジピン、ラシジピン、ニフェジピン、ジルチアゼム、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、チアジド類、フロセミド、ブメタニド、スピロノラクトン、及びスタチン類(例えばアトルバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン又はロバスタチン)から成る群より選択される一種以上の治療の施与と組み合わせて用いる、請求項4に記載の組成物。
- 前記抗体がそれぞれ配列番号:2および配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むIgG重鎖の可変領域およびカッパ軽鎖の可変領域を含む抗体である、請求項1、2、3、6、7、8、9、10、又は11のいずれかに記載の組成物。
- ヒトEGFRまたはそのフラグメントに結合し、かつヒトEGFRへの結合能を維持した、単離されたヒトモノクローナル抗体の軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクタと、薬学的に許容可能な担体とを含む、EGFRの発現により媒介される疾患を治療又は防止するための組成物であって、
該抗体が、IgG1、IgA、IgE、IgM、IgG4、及びIgD 抗体から成る群より選択され、かつ配列番号: 5のCDR1、配列番号: 6のCDR2、及び配列番号: 7のCDR3を含む重鎖CDR領域と、配列番号: 8のCDR1、配列番号: 9のCDR2、及び配列番号: 10のCDR3を含む軽鎖CDR領域とを含み、
該疾患が以下からなる群より選択される、前記組成物:
子宮/子宮頸管癌、食道癌、膵臓癌、胃癌、多形性神経膠芽腫を含む神経膠芽腫、小児期星状細胞腫を含む星状細胞腫、グリオーマ、神経芽腫、胃腸管の神経内分泌腫瘍、細気管支肺胞上皮癌、瀘胞樹状細胞肉腫、唾液腺癌、エナメル上皮腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、内分泌膵臓腫瘍、精上皮腫を含む精巣生殖細胞腫瘍、胎児性癌、卵黄嚢腫瘍、奇形腫及び絨毛上皮腫。 - 前記発現ベクタが、それぞれ配列番号:2および配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むIgG重鎖の可変領域およびカッパ軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の組成物。
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