CN101134778B - 一种抗食管癌血管内皮细胞的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的可与人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及被人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原结合的单克隆抗体，及其生产的杂交瘤细胞系，以及该抗体在制备可用于治疗人食管癌生长及转移的药剂中的应用。该单克隆抗体可与具有血管形成能力的人食管癌组织的血管原代内皮细胞细胞膜表面的天然抗原结合，以及与人食管癌组织的血管原代内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原结合，体外可以显著抑制人食管癌血管原代内皮细胞的迁移，体内显著抑制人食管癌血管原代内皮细胞的血管形成和破坏已经形成的肿瘤血管的稳定性。本发明还提供了该单克隆抗体的生产细胞系保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2。

Description

一种抗食管癌血管内皮细胞的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种可与人癌组织内的血管内皮细胞结合的抗体及其生产的杂交瘤细胞系，以及该抗体在治疗癌症及其转移中的应用。具体而言，本发明提供了一种可与人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原结合的单克隆抗体，及其在制备可用于治疗人食管癌及其转移的药剂中的应用。

发明背景

食管癌是人类常见肿瘤之一，发病率高、死亡率高，目前食管癌的五年死亡率仍然在90％以上，严重威胁着人类的生命健康。食管癌死亡率高的重要的原因是食管癌手术治疗效果差，术后复发转移率高(可达80-90％)，食管癌对放疗、化疗均不敏感，目前也无其他任何有效的治疗食管癌的药物和手段。因此发展新的抗食管癌的药物，有效地治疗、延缓食管癌演进和转移，对于提高食管癌的疗效，提高5年生存率及降低死亡率具有重大意义。

目前临床上治疗肿瘤的所有手段均不能有效的治疗肿瘤及其转移。普通的化疗药物对肿瘤的杀伤效应有限，同时缺乏靶向性，毒副作用大；且当肿瘤再次复发时，复发的肿瘤细胞通常对化疗药物是耐受的，故此化疗药物治疗肿瘤及其转移的疗效并不理想，放射治疗肿瘤及其转移的效果也不显著。对于食管癌来说，术后放、化疗的作用尤为有限，难以起到提高5年生存率及降低死亡率的作用。目前在临床上尚未有能有效治疗食管癌及其转移的化疗药物和生物制品药物。

肿瘤的发生发展是一个复杂的多步骤、多阶段的过程，而新生肿瘤血管的生成是肿瘤细胞从一个临床前的细胞团进展为临床可见肿瘤的关键步骤，同时肿瘤的进一步的发展和转移都依赖于肿瘤血管的提供营养。与传统的针对肿瘤细胞的治疗策略相比，针对肿瘤血管的治疗策略有以下的一些优点：1由于人体正常组织中新生血管的形成明显低于肿瘤组织，因此该策略仅有很小的副作用，即使延长治疗周期，其副作用也相当有限；2由于肿瘤血管的形成与宿主正常的血管形成的生理机制类似，该策略较少产生耐药性；3由于每个肿瘤血管负责供应成百上千的肿瘤细胞的营养，因此以肿瘤血管为靶的治疗的措施可以产生相当高的抑肿瘤效应；4通过血液循环系统给药的方式，药物能直接的作用于肿瘤血管，能够有效地提高药物的利用效率。肿瘤新生血管是肿瘤组织周围的正常血管获循环的内皮前体细胞在肿瘤微环境的作用下，进入肿瘤组织并最终发育形成肿瘤血管。这一过程主要包括以下一些环节：内皮细胞的增殖、迁移、与细胞外基质的作用、向肿瘤内皮的分化、黏附及成管。抗肿瘤血管的治疗就是要通过抑制肿瘤血管形成的各个环节或直接的破坏业已形成的肿瘤血管，来达到治疗肿瘤的目的。

近十年来随着分子生物学的快速发展，在分子生物学和遗传学上对肿瘤新生血管形成的各个阶段发生的分子改变及作用机理进行了大量的研究，对其分子机理有了一定了解。如对肿瘤血管内皮细胞增殖的机理研究发现，各种促血管生长因子如VEGF、bFGF、PDGF等与内皮细胞表面的相应受体的作用启动了肿瘤血管内皮细胞的增殖。内皮细胞表达的各种粘附分子如整合素家族的Integrinαv、Integrinβ3，纤连蛋白FN等等，与肿瘤细胞及基质的作用在内皮细胞迁移、粘附中发挥了重要的功能。再如肿瘤内皮细胞标志物类TEM1到TEM8等，均在肿瘤血管的形成中起到重要的作用。另外如孤儿受体Tie-2等均参与了肿瘤内皮细胞的形成肿瘤血管的过程。这些研究结果表明肿瘤血管形成的的分子机理十分复杂，参与的分子和基因相当多，而在这些分子和基因中如何参与肿瘤新生血管的形成，它们之间的相互作用及关系，目前尚有待研究。

2004年2月美国FDA批准了全球第一个抗血管形成药物Avastin(一种抗人VEGF人源化抗体)上市用于临床治疗转移性结肠癌，开创了抗血管形成治疗的先河，不仅为转移性恶性肿瘤病人提供了一种崭新的治疗策略，更重要的这将大大促进抗肿瘤血管形成药物的研究和上市。目前还有不少抗血管形成药物已进入临床1、2期研究。这些抗血管形成药物(包括Avastin)主要是靶向肿瘤血管的血管形成过程中的各个环节。这类药物的缺点是对已经形成的肿瘤血管没有明显的破坏作用，因此这类药物只能抑制肿瘤的生长，而不能破坏已有的肿瘤灶，一旦停药肿瘤将继续生长。这类药物往往用药量大、需长期重复用药。另外由于体内通常存在类似分子的替代途径，在长期用药后会产生耐药性。因此，近年来研制各种直接靶向肿瘤血管内皮细胞的药物受到了科学家的重视。这类药物特点是靶向肿瘤血管内皮细胞本身，直接的破坏已经形成的肿瘤血管，因此不仅可以抑制肿瘤包括原发瘤和转移瘤的生长，还能破坏这些瘤灶，在停药后也不易复发。另外，这类药物用药量相对较小，无须反复用药，不易产生耐药性。在目前已经公知的肿瘤血管靶位中，纤连蛋白(fibronectin，FN)是较为特殊的一类。FN蛋白为异二聚体糖蛋白，属骨细胞外基质非胶原蛋白成份，由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和肝脏产生的一种多功能蛋白质，常规有3个亚型：细胞FN、血浆FN及胎儿FN(FFN)，广泛分布于血浆、全身多种正常组织细胞表面及细胞基质中，不能作为治疗靶位。但FN目前已经发现了约20种剪接变体，其中Onc-FN变体较特异地表达于多种肿瘤组织的血管中，而极少表达于正常组织血管，表现出一定的特异性，但目前仍未发现特异表达于某种特定类型肿瘤血管的FN变体。

综上所述，目前已经有少量抗肿瘤血管形成治疗肿瘤的药物报道，但集中在抗肿瘤新生血管生成的各个环节上；基于肿瘤血管内皮细胞本身的药物鲜有报道，而针对食管癌血管的抗体类药物也未见报道。最重要的是，国内外尚未有治疗食管癌及其转移的生物制品药物和单克隆抗体研发成功的报道。

发明内容

因此，为了克服现有临床治疗现状及抗食管癌抗体药物研发中的不足，本发明的第一个方面在于提供一种单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2产生，即一种新的与人食管癌组织的血管内皮细胞结合，并可在体内抑制食管癌新生血管形成，治疗食管癌及其转移的单克隆抗体。本发明提供的抗人食管癌新生血管治疗食管癌及其转移的单克隆抗体在体外可以与人食管癌组织的血管内皮原代细胞膜表面的天然抗原新的变异体FN-EV1结合及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原人纤连蛋白的一种新的变异体FN-EV1结合，而不与人正常组织中的纤连蛋白FN结合，也不与人食管癌组织的肿瘤细胞质膜表面任何抗原结合，该抗体在体外具有拮抗人食管癌新生血管的形成，破坏已经形成的人食管癌血管的作用，可以显著抑制食管癌的生长和转移。所述的人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原的分子量约为260KD。

目前，现有技术中尚未关于FN-EV1等报道，也没有针对FN-EV1的抗体的报道。

本发明的第二个方面在于提供上述单克隆抗体在制备可用于治疗人食管癌及其转移的药剂中的应用。

本发明的第三个方面在于提供可分泌产生上述单克隆的小鼠杂交瘤细胞系。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种新的抗人食管癌新生血管的单克隆抗体。使用该单克隆抗体，可在体内抑制人食管癌新生血管的形成，破坏已经形成的食管癌血管，从而抑制食管癌组织的生长和转移。

首先，本发明提供的新的抗人食管癌新生血管，治疗食管癌及其转移的单克隆抗体可用于治疗食管癌及其转移，所述单克隆抗体的特征在于其包含但不限于：(1)与人食管癌血管内皮原代细胞膜表面的天然抗原FN-EV1结合，与人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原FN-EV1结合；(2)不与人食管癌细胞膜表面任何蛋白结合；(3)体外可以显著抑制人食管癌血管内皮原代细胞的迁移(抑制率＞50％)，这种与食管癌血管内皮细胞形成新生肿瘤血管密切相关的细胞功能；(4)在体内具有拮抗人食管癌血管形成，破坏已经形成的人食管癌血管的治疗食管癌及其转移作用；(5)由小鼠杂交瘤细胞系HRECEC1D2分泌产生，该小鼠杂交瘤细胞系HRECEC1D2于2006年7月5日保藏于地址为北京市海淀区中关村北一条13号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1749。

通过将该单克隆抗体以适宜的注射方式，例如静脉注射、腹腔注射等方式注射入机体内，使其进入血液循环扩散至全身，该单克隆抗体即可与特定的食管癌血管内皮细胞结合并发挥生物学功能，抑制食管癌血管内皮原代细胞的迁移，从而抑制体内食管癌新生血管的形成，破坏食管癌血管的稳定性从而达到治疗食管癌及其转移的作用。另一方面，采用该单克隆抗体，以目前技术领域内公知的技术方法，例如免疫沉淀、免疫亲和层析等方法，可以方便特异地获得较高纯度的该抗体识别的抗原，从而进一步利用目前技术领域内公知的技术方法，例如质谱分析等方法，鉴定该抗原。由于该抗原与食管癌血管内皮细胞功能密切相关，可能在食管癌新生血管的形成中发挥重要作用，因此可以采用目前技术领域内公知的多种技术方法以该抗原为药物作用靶点研发出新的其它食管癌及其转移的靶向治疗药物。

根据本发明的一个实施方式，本发明提供的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌产生，而该杂交瘤细胞系是由融合小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和免疫人食管癌血管内皮细胞来源的单细胞的小鼠的脾细胞融合后经筛选、鉴定获得的。具体地，人食管癌血管内皮原代细胞洗涤固定后免疫正常BALB/c小鼠。采用间接免疫荧光实验监测免疫小鼠抗血清中的抗人食管癌血管内皮原代细胞抗体的滴度，待特异性抗体滴度超过1∶20000后冲击免疫一次，3天后处死小鼠，取脾制备单细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用甲基纤维素平板法制备杂交瘤克隆。待克隆生长后将其分别挑取至96孔板培养。采用活细胞免疫荧光测定各个克隆与活的人食管癌血管内皮原代细胞的结合情况，挑选阳性克隆进一步培养鉴定。

根据本发明的提供的多个实施方式，结合实验阳性的克隆被进一步采用MTT法测定其抑制食管癌血管内皮原代细胞增殖的能力，采用基质胶包被的trans-well试验测定其抑制食管癌血管内皮原代细胞侵袭的能力，采用划痕试验测定其抑制食管癌血管内皮原代细胞迁移的能力。最后，杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体被证明对人食管癌血管内皮原代细胞迁移的抑制率为68％。根据本领域公知的知识可以判断，由于食管癌血管内皮细胞的迁移能力直接并显著地影响食管癌血管内皮细胞在体内形成肿瘤血管的能力和血管的稳定性，因而可以推知杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单克隆抗体将可能在体内治疗食管癌及其转移中具有显著作用。进一步，采用人食管癌细胞系NEC与人食管癌血管内皮原代细胞建立了人源化食管癌血管移植瘤模型，采用仅含杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单克隆抗体的PBS溶液注射入荷有人源化食管癌血管移植瘤的小鼠体内进行治疗食管癌及其转移的试验，结果与单纯的PBS对照组相比，HECEC1D2单克隆抗体治疗可以抑制食管癌NEC移植瘤的生长，对瘤重的抑制率最大达到71.21％，对肺转移抑制率最大可达100％。表明HECEC1D2单克隆抗体在体内单独使用即可抑制食管癌的生长和转移。

因此，本发明提供了一种新的抗食管癌新生血管的单克隆抗体，该单克隆抗体可在体内抑制食管癌的生长和转移。

本发明涉及的单克隆抗体的优越之处在于：

1)抑制人食管癌血管内皮原代细胞的迁移这一与转移密切相关的功能。具有上述作用的单抗尚未见到报道。

2)可在动物模型的体内抑制人食管癌的生长和转移。

3)由自行制备的保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌产生，并非产生自己有的杂交瘤细胞系。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了由上述单克隆抗体在制备可用于治疗人食管癌及其转移的药剂中的应用。根据本发明第一个方面提供的单克隆抗体及其在动物模型体内可以抑制人食管癌血管内皮细胞形成新生肿瘤血管和破坏已有血管的稳定性的特性，并根据本领域内公知的知识，将很容易推知当将足够浓度的纯化的该单克隆抗体的溶液注射入人体，这些抗体将能通过血液循环进入到食管癌组织，并与食管癌血管内皮细胞结合，通过与在人体外和动物实验中相同的机制抑制人食管癌血管内皮细胞在食管癌组织中形成新的肿瘤血管并破坏已经形成的食管癌血管的稳定性破坏，即可能起到治疗人食管癌及其转移的药效。因此，该单克隆抗体可用于直接制备可用于治疗人食管癌及其转移的药剂溶液。另外，根据本领域内公知的知识，将很容易推知将其他药物有效成分与该单克隆抗体制成复方或联合使用，仍然可以发挥治疗人食管癌及其转移的药效。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了可分泌产生上述单克隆的小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2。该细胞系可以用来生产本发明涉及的单克隆抗体。具体的但不仅限于，可以采用各种现有的杂交瘤培养基培养该杂交瘤细胞，收获培养上清，从上清中采用公知的各种纯化方法获得纯化的单克隆抗体。

下面将结合实施例来说明如何实施本发明所述的新的抗食管癌血管的单克隆抗体，如何将其用于制备可用于治疗人食管癌及其转移的药剂，以及如何采用本发明提供的可分泌产生上述单克隆的保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2生产该单克隆抗体。

通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

附图说明

图1：检测小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2产生单克隆抗体的抗原分子量的Western blotting图谱。泳道M：高分子量蛋白标准；泳道A：人食管癌血管内皮原代细胞蛋白提取物；泳道B：人食管癌血管内皮原代细胞培养上清。

图2：HECEC1D2单克隆抗体的SDS-PAGE图谱。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：HECEC1D2单克隆抗体的大约55KD大小的抗体重链和大约25KD大小的抗体轻链。

具体实施方式

实施例1制备与人食管癌血管内皮细胞膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体

采用人食管癌血管原代内皮细胞免疫Bal b/c鼠制备抗食管癌血管内皮细胞的单克隆抗体，并采用活细胞免疫荧光筛选与人食管癌血管内皮原代细胞膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。具体地，采用植物凝集素法在从人食管癌组织中分离人食管癌血管内皮原代细胞，常规免疫Balb/c鼠，直至免疫小鼠血清抗人食管癌血管内皮原代细胞的滴度达到1∶50,000后，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合形成杂交瘤。采用甲基纤维素平板法制备杂交瘤克隆，待克隆生长后将其分别挑取至96孔板培养。从96孔板中收集每个杂交瘤克隆的培养上清，该上清中含有这个克隆分泌的单克隆抗体。人食管癌血管内皮原代细胞以7500/孔接种96孔板，继续培养36小时至50％汇合。细胞经含1％BSA的PBS洗涤后，每孔中分别加入一个杂交瘤克隆的培养上清100ul，室温孵育2小时；1％BSA的PBS洗涤五次后，加入生物素标记二抗室温反应30分钟；再次1％BSA的PBS洗涤五次后Cy3标记Avidin室温反应30分钟；1％BSA的PBS洗涤五次后，荧光显微镜镜检判断人食管癌血管内皮原代细胞膜表面抗原结合的鼠单克隆抗体。共获得56株抗食管癌内皮细胞表面膜抗原鼠单抗，均以HECEC+孔板号来命名，其中一株被命名为HECEC1D2。

实施例2检测HECEC1D2单抗与人食管癌血管内皮原代细胞分泌到基质中的抗原的结合情况

采用Western blot法检测单抗培养上清对人食管癌血管内皮原代细胞分泌到基质中的抗原结合。具体地，采用Western blot法。收集培养了5天的人食管癌血管内皮原代细胞的培养上清，与Western blot上样缓冲液混合并变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳2小时后进行转膜，转膜使用0.2微米孔径的PVDF膜，转膜2小时，使蛋白吸附到PVDF膜上。然后用封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBS/T缓冲液)，室温孵育2小时。然后在封闭液按1∶10的稀释度加入HECEC1D2单抗培养上清，进行一抗反应，4摄氏度过夜。第二天，用PBS/T洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。然后加入封闭液稀释的HRP标记的抗鼠二抗，室温反应45分钟。PBS/T洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。用鲁米那的显影液显影，用X光片曝光，结果在X光片上观察到抗原蛋白的显影条带，表明HECEC1D2单抗可与人食管癌血管内皮原代细胞分泌到基质中的抗原结合。

实施例3鉴定杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗结合的人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原的分子量。

可以采用Western blot的方法初步鉴定HECEC1D2单抗结合的人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原的分子量。具体举例，收取食管癌组织的血管内皮细胞100万，从细胞中提取约0.2ml的蛋白，用Bradford法测量蛋白浓度。收集培养了5天的人食管癌血管内皮原代细胞的培养上清，用Bradford法测量蛋白浓度。分别取从食管癌组织的血管内皮细胞的蛋白和30ug人食管癌血管内皮原代细胞的培养上清蛋白10ug，以及蛋白分子量标志物进行还原的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳2小时后进行转膜，转膜使用0.2微米孔径的PVDF膜，转膜2小时，使蛋白吸附到PVDF膜上。然后用封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBS/T缓冲液)，室温孵育2小时。然后在封闭液按1∶10的稀释度加入HECEC1D2单抗培养上清，进行一抗反应，4摄氏度过夜。第二天，用PBS/T洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。然后加入封闭液稀释的HRP标记的抗鼠二抗，室温反应45分钟。PBS/T洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。用鲁米那的显影液显影，用X光片曝光，可直接在X光片上观察到抗原蛋白的显影条带。X光片显示食管癌组织的血管内皮细胞的蛋白中抗原分子量与人食管癌血管内皮原代细胞的培养上清中抗原分子量相同，与蛋白分子量标志物对比约为260KD。

实施例4鉴定杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗结合天然抗原的序列分析。

可以采用质谱的方法鉴定HECEC1D2单抗结合的人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原的部分序列。具体举例：采用Protein G从交瘤细胞系HECEC1D2培养上清中纯化单克隆抗体5mg，偶联到法玛西亚公司生产的0.3克溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B上，制成抗原亲和纯化柱。用20倍柱床体积的PBS(pH7.4)洗抗原亲和纯化柱。取用50ml培养了5天的人食管癌血管内皮原代细胞的培养上清通过抗原亲和纯化柱，流速0.2ml/分钟。用10倍柱床体积的PBS(pH7.4)洗柱。以0.1M的甘氨酸(PH2.5)洗脱层析柱上HECEC1D2单克隆抗体结合的抗原，流速1ml/min，分管收集，每管1ml，同时用1M Tris调其PH至7.4左右，洗脱至OD280＜0.01。将洗脱的第2、3、4、5管的洗脱液各1ml合并后通过真空干燥进行浓缩到200ul，加入胰蛋白酶进行酶切，将抗原切成多肽。将这些多肽送入质谱仪，质谱仪将随机测定其中部分多肽的序列。质谱鉴定出了其中的一些肽段的氨基酸序列(表1)。这些序列均是人纤连蛋白的氨基酸序列，但并不包含人纤连蛋白所有的氨基酸序列。因此，HECEC1D2单克隆抗体结合的抗原是一种与人纤连蛋白同源的人纤连蛋白的变异体，我们命名为FN-EV1。

表1，质谱鉴定出的FN-EV1部分肽段的氨基酸序列

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实施例5鉴定杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗不与人正常的纤连蛋白FN结合。

可以采用Western blot的方法鉴定HECEC1D2单抗不与人正常的纤连蛋白FN结合。具体举例，从SIGMA公司购买人正常的纤连蛋白FN，以及人正常的纤连蛋白FN的抗体。将等量的人正常的纤连蛋白FN分别加入两个平行的上样孔进行还原的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳2小时后进行转膜，转膜使用0.2微米孔径的PVDF膜，转膜2小时，使蛋白吸附到PVDF膜上。然后用封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBS/T缓冲液)，室温孵育2小时。将两个平行的电泳条带用剪刀分开，然后分别与人正常的纤连蛋白FN的抗体，及按1∶10的稀释度加入HECEC1D2单抗培养上清，进行一抗反应，4摄氏度过夜。第二天，用PBS/T洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。然后加入封闭液稀释的HRP标记的抗鼠二抗，室温反应45分钟。PBS/T洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。用鲁米那的显影液显影，用X光片曝光，结果可直接在X光片上观察到人正常的纤连蛋白FN的抗体与FN蛋白结合的显影条带，而不能观察到杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗与FN蛋白结合的显影条带。

实施例6鉴定杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗不与人食管癌细胞膜表面的任何抗原结合。

将3种人食管癌细胞EC-9706、Yes2、KYES30分别以7500/孔接种96孔板，继续培养36小时至50％汇合。细胞经含1％BSA的PBS洗涤后，每孔中分别加入HECEC1D2的培养上清100ul，室温孵育2小时；1％BSA的PBS洗涤五次后，加入生物素标记二抗室温反应30分钟；再次1％BSA的PBS洗涤五次后Cy3标记Avidin室温反应30分钟；1％BSA的PBS洗涤五次后，荧光显微镜镜检判断HECEC1D2产生的单抗与人食管癌细胞膜表面的任何抗原的结合情况。结果未见任何阳性染色的荧光，表明杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗不与人食管癌细胞膜表面的任何抗原结合。

实施例7鉴定杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗的抗原FN-EV1与人正常的纤连蛋白FN具有不同的组织分布。

可以采用免疫组织化学的方法鉴定鉴定杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗的抗原FN-EV1以及人正常的纤连蛋白FN的组织分布。具体举例，人体组织标本石腊包埋切片，常规脱腊水化，PBS缓冲液洗2次，每次3分钟。3％H2O2甲醇溶液室温处理10分钟以去除内源性过氧化物酶，双蒸水洗2次，每次1分钟。PBS缓冲液洗1次，持续5分钟。切片浸在0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中于92-98℃水浴中处理10-15分钟修复抗原，室温冷却后，用PBS缓冲液洗2次，每次5分钟。加10％羊血清室温封闭30分钟，以1∶200稀释的人正常的纤连蛋白FN的抗体(购自SIGMA公司)，或按1∶10的稀释HECEC1D2单抗培养上清，分别与两张平行的人体组织标本石腊包埋切片4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5分钟。加生物素标记的抗兔的二抗IgG，37℃孵育40分，PBS冲洗，5分钟×3次。加HRP(辣根酶过氧化物酶)标记的链霉卵白素37℃作用40分钟，PBS冲洗，5分钟×3次。滴加DAB(二甲基联苯胺)溶液显色5-10分钟，自来水冲洗，苏木素复染，酒精盐酸分色，梯度乙醇脱水，封片。从显微镜下可以观察到杂交瘤细胞系HECEC1D2产生的单抗结合的抗原FN-EV1与人正常的纤连蛋白FN在组织分布上显著不同，FN-EV1主要分布于食管癌血管内皮，而较少的分布于人体正常的血管；人正常的纤连蛋白FN在人体所有的血管中都有较强的分布。

实施例8筛选鉴定抑制人食管癌血管内皮原代细胞迁移的单克隆抗体

采用划痕迁移筛选鉴定抑制人食管癌血管内皮原代细胞迁移的单克隆抗体。具体举例，以5,000/孔的密度接种人食管癌血管内皮原代细胞至96孔培养板，待细胞36小时生长形成完全汇合单层，采用200ul吸头划痕，划痕宽度约为550-750um。然后置换细胞培养基为1∶2稀释的HECEC1D2单抗培养上清，继续培养2天，每隔12-24小时测定划痕宽度。根据划痕宽度的差异判断单抗对人食管癌血管内皮原代细胞迁移的抑制作用。HECEC1D2单抗上清组迁移距离是SP2/0上清对照组迁移距离的68％，两者有统计学显著性差异(P＜0.01)。具体数据见表2

表2HECEC1D2单抗上清对人食管癌血管内皮原代细胞迁移的抑制作用

实施例9小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体抑制人食管癌组织在动物体内生长和转移

采用将人食管癌细胞系NEC和人食管癌血管内皮原代细胞混合接种到裸鼠皮下，建立人源化血管的食管癌动物模型。具体举例，以1×106NEC+4×106人食管癌血管内皮原代细胞/只的数量接种至4-6周龄裸鼠后背右侧皮下，5-7天后长出移植瘤，这种食管癌的移植瘤中即含有人食管癌血管内皮原代细胞形成的人源化食管癌血管，其占移植瘤中总血管的密度的30％左右。采用HECEC1D2分泌的单克隆抗体注射到荷有人源化血管的食管癌移植瘤小鼠腹腔内进行治疗。具体举例，36只5-6周龄的雌性BALB/c裸小鼠按分为6组，每组6只。前5组动物按上述建立人源化血管的食管癌动物模型的方式接种每只裸鼠。第6组动物仅接种NEC细胞100万，作为不加内皮的对照组。给药途径为腹腔注射，所用抗体为Protein A纯化的抗体，纯度大95％以上，用PBS进行稀释，注射体积0.2ml/只/次。前5组包括：(1)高剂量治疗组：用10mg/kg/次HECEC1D2单抗治疗，接种肿瘤细胞后次日开始腹腔内抗体注射治疗，每天1次，连续5天；相同剂量，每周2次，连续治疗3周；(2)低剂量治疗组，用2.5mg/kg/次HECEC1D2单抗治疗，接种肿瘤细胞后次日开始腹腔内抗体注射治疗，每天1次，连续5天；相同剂量，每周2次，连续治疗3周；(3)成瘤后治疗组，在细胞接种后，肿瘤长到0.2cm3时开始用10mg/kg/次HECEC1D2单抗注射治疗，连续5天，；以后以相同的剂量，每周2次；(4)PBS对照治疗组，用PBS进行治疗，腹腔注射时间同高剂量治疗组；(5)正常鼠IgG对照治疗组，用10mg/kg/次正常鼠IgG治疗，腹腔注射时间同高剂量治疗组。接种肿瘤细胞后第5天后开始测量移植瘤大小，按公式：瘤体积＝π/6·长径·短径2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。第35天时收获肿瘤，测瘤重。计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重量-治疗组瘤重量)/对照组瘤重量×100％。显著性检验采用t检验。解剖个组老鼠，观察鼠肺的食管癌转移情况。成瘤后治疗组、低剂量治疗组、高剂量治疗组移植瘤瘤重的抑制率分别为56.29％、59.34％和71.51％，p＜0.01。对食管癌肺转移的抑制率分别是50％、50％和100％。具体数据见表3，表4

            表3 1D2单抗对移植瘤瘤重的影响

            表4 1D2单抗对移植瘤肺转移的影响

实施例10小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体Ig亚类的鉴定

采用单克隆抗体分型试剂盒鉴定HECEC1D2分泌的单克隆抗体Ig亚类。具体举例：使用SouthernBiotech公司的isotyping试剂盒鉴定HECEC1D2单抗的类和亚类。将捕获抗体(2.5μg/ml)加入96孔酶标板，4℃下孵育16h。用1％BSA/PBS室温下封闭酶标板1h。加入杂交瘤上清(1∶2)，室温下作用1h。加入HRP标记的各种类型二抗(HRP-labeledgoat anti-mouse IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，κorλ，1∶2000)，室温下作用1h，显色，测OD 450值。根据个亚型OD 450大小判断HECEC1D2分泌的单克隆抗体为IgG1类单抗，轻链为κ型。

实施例11小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体结合抗原特性的鉴定

采用免疫亲和的办法鉴定HECEC1D2分泌的单克隆抗体结合抗原特性。具体举例：采用Protein G从交瘤细胞系HECEC1D2培养上清中纯化单克隆抗体5mg，偶联到法玛西亚公司生产的0.3克溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B上，制成抗原亲和纯化柱。用20倍柱床体积的PBS(pH7.4)洗抗原亲和纯化柱。取用50ml培养了5天的人食管癌血管内皮原代细胞的培养上清通过抗原亲和纯化柱，流速0.2ml/分钟。用10倍柱床体积的PBS(pH7.4)洗柱。以0.1M的甘氨酸(PH2.5)洗脱层析柱上HECEC1D2单克隆抗体结合的抗原，流速1ml/min，分管收集，每管1ml，同时用1M Tris调其PH至7.4左右，洗脱至OD280＜0.01。将洗脱的第2、3、4、5管的洗脱液各取10微升进行还原的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳2小时。采用银染的方法显示聚丙烯酰胺凝胶上电泳的蛋白条带，并与蛋白质分子量标志物进行对比，发现HECEC1D2单克隆抗体结合的抗原分子量为260KD左右。

实施例12小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体的生产

培养小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2可以生产HECEC1D2单克隆抗体。培养方式可以采用培养瓶培养与可以采用发酵罐等方法，培养液可以采取有血清培养基或无血清培养基。具体举例：用培养瓶培养小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2，培养基采用Gibco公司的无血清培养基。小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2悬浮在无血清培养基中培养，培养条件为37℃，5％的二氧化碳。到细胞密度达到1×10⁶/ml后，离心收取培养上清，HECEC1D2单克隆抗体就存在于培养上清中。

实施例13小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体的纯化

采用亲和纯化等方法可以从小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2培养的上清中纯化小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2分泌的单克隆抗体。具体举例：采用Protein G亲和纯化的方法。将小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2培养的上清通过Protein G亲和柱，HECEC1D2被结合到亲和柱上，用10倍柱床体积的PBS(pH7.4)洗柱。以0.1M的甘氨酸(PH2.5)洗脱层析柱上HECEC1D2单克隆抗体，即可得到纯化的HECEC1D2单克隆抗体。纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，在还原电泳中可以看到HECEC1D2单克隆抗体在55KD左右的重链，25KD处的轻链(图2)。

Claims (5)

1.一种单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HECEC1D2产生。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体为小鼠IgG1型单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体与人食管癌组织的血管内皮细胞天然膜抗原及由人食管癌组织的血管内皮细胞分泌到细胞基质中的天然抗原FN-EV1结合，而不与人正常组织中的纤连蛋白FN结合，也不与人食管癌组织的肿瘤细胞质膜表面抗原结合。

4.一种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于治疗人食管癌及其转移的药剂中的应用。

5.一种保藏号为CGMCC No.1749的小鼠杂交瘤细胞系HRECEC1D2的杂交瘤细胞株，其特征在于，其分泌产生如权利要求1所述的单克隆抗体。

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