CN107854490A - 一种经修饰的t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及一种经修饰的T细胞及其应用。具体地，本申请涉及经修饰的T细胞在制备用于治疗受试者的膀胱癌的药物中的用途，所述经修饰的T细胞经过T细胞重定向复合物的修饰，所述T细胞重定向复合物包含双特异性抗体，所述T细胞重定向复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。此外，本申请还涉及T细胞重定向复合物在制备用于治疗受试者的膀胱癌的药物中的用途，所述T细胞重定向复合物包含双特异性抗体，所述T细胞重定向复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。

Description

一种经修饰的T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及肿瘤治疗所使用的经修饰的T细胞及其应用。经修饰的T细胞经过T细胞重定向复合物的修饰，所述T细胞重定向复合物包括双特异性抗体，其具有针对在T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在患病细胞或病原体上表达的抗原的至少一个结合位点。
背景技术
手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方法。近年来生物细胞免疫疗法又为肿瘤患者提供了新的选择。生物细胞免疫疗法所依靠的细胞免疫应答主要是T淋巴细胞介导的特异性抗肿瘤免疫应答，获得具有抗肿瘤活性的肿瘤特异性T细胞是实现抗肿瘤效应的关键所在。作为一种新兴的、具有显著疗效的抗肿瘤治疗方法，生物细胞免疫疗法避免了传统的手术、放疗的副作用及化疗的弊端，其已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中具有发展前景的一种治疗手段。手术、放疗、化疗联合肿瘤生物细胞免疫疗法，可以精准清除残余肿瘤细胞，防止复发、转移，从而提升患者的生存质量和时间。
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-cell，CAR-T)疗法已进入临床试验阶段。2010年，美国FDA批准前列腺癌免疫治疗药物Sipuleucel-T用于临床应用，至今仅经过数年时间，免疫疗法已取得一系列激动人心的进步，成为人们关注的焦点。经过几十年的临床前和临床研究，免疫疗法正迅速走向成熟。免疫疗法的未来发展值得关注。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术以及T细胞受体(T cell receptor，TCR)嵌合型T细胞(TCR-T)技术作为当前过继性细胞治疗(Adoptive cell therapy，ACT)技术的两大最新的免疫细胞技术，因其能够表达特异性受体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究，从最初的基础免疫研究转变为临床应用。基于合成生物学、免疫学和遗传改造技术，使得合成改造的特异性功能增强的T细胞成为可能。已有研究表明，CD19抗原特异性CAR-T细胞在用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤的临床试验中显示出持续的疾病缓解效果。由于CAR-T/TCR-T技术的优异表现以及广阔的应用前景，其得以进入当前竞争激烈的制药行业并与传统的制药业一较高低。但是，CAR-T技术具有病毒载体的参与，因此需要配置相应的安全控制措施。
膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一。化疗是膀胱癌术后的主要治疗手段，但化疗耐药性的发生常常导致化疗失败，严重威胁患者生命。
在美国，通过定向T细胞的免疫治疗策略，已经展开激素抵抗性前列腺癌及转移性乳腺癌的临床试验。患者表现出很好的耐受，并取得了部分缓解。
然而，目前尚无针对膀胱癌的类似临床试验的报道以及针对膀胱癌的类似基础研究。在膀胱癌等实体肿瘤治疗领域，抗肿瘤过继性细胞疗法尚存在很多需要克服的技术难题，亟需探索可缓解膀胱癌等实体肿瘤进展的靶向性过继性细胞治疗的先进免疫治疗方案。
发明目的
本发明通过使用本发明的经修饰的T细胞，为实体肿瘤特别是膀胱癌治疗领域提供一种以例如HER2和EGFR为肿瘤治疗靶点的治疗膀胱癌的策略，该策略是靶向性极高的T细胞治疗策略。本发明还为患者提供个体化肿瘤治疗选择并为膀胱癌的免疫治疗提供新的策略。
发明内容
本发明涉及以下内容：
本发明第一方面涉及一种用于治疗膀胱癌的T细胞重定向复合物，所述复合物包含双特异性抗体，所述复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。
在一些实施方案中，所述在效应T细胞上表达的抗原可以选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。
在一些实施方案中，所述在效应T细胞上表达的抗原可以为CD3。
在一些实施方案中，所述在靶细胞上表达的抗原可以选自由以下组成的组：EGFR、HER2、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、VEGF、VEGFR和致癌基因产物。
在一些实施方案中，所述在靶细胞上表达的抗原可以为EGFR或HER2。
在一些实施方案中，所述T细胞重定向复合物可以是双特异性抗体，所述双特异性抗体包括结合至所述在效应T细胞上表达的抗原的第一抗体部分和结合至所述在靶细胞上表达的抗原的第二抗体部分。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以选自由以下组成的组：hA20(抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、阿仑珠单抗(抗-CD52)、hLL1(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、RFB4(抗-CD22)、吉妥珠单抗(抗-CD33)、替伊莫单抗(抗-CD20)、利妥昔单抗(抗-CD20)、托西莫单抗(抗-CD20)、GA101(抗-CD20)、巴利昔单抗(抗-CD25)、达利珠单抗(抗-CD25)、依法利珠单抗(抗-CD11a)和莫罗单抗-CD3(抗-CD3受体)；且所述第二抗体部分可以选自由以下组成的组：hR1(抗-IGF-1R)、英利昔单抗(抗TNF-α)、赛妥珠单抗(抗-TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、帕木单抗(抗EGFR)、曲妥珠单抗(抗-HER2/neu)和托珠单抗(抗-IL-6受体)。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以是抗CD3抗体且所述第二抗体部分可以是抗EGFR抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以是抗CD3抗体且所述第二抗体部分可以是抗HER2抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分和所述第二抗体部分可以选自由以下组成的组：scFv、Fab和dAb。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以是scFv并且所述第二抗体部分可以是Fab。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以是Fab并且所述第二抗体部分可以是Fab。
本发明第二方面涉及一种制备本发明的T细胞重定向复合物的方法，所述方法包括将靶向在效应T细胞上表达的抗原的部分与靶向在肿瘤细胞上表达的抗原的部分进行偶联。
在一些实施方案中，所述制备方法可以通过将靶向肿瘤细胞的第二抗体(优选地抗EGFR抗体或抗HER2抗体)与靶向T细胞的第一抗体(优选地抗CD3抗体)通过化学交联剂的交联反应进行。
在一些实施方案中，所述化学交联剂可以选自Traut’s Reagent(购自SigmaAldrich)和sulfo-SMCC(购自Sigma Aldrich)。
本发明第三方面涉及一种用于治疗膀胱癌的组合物，所述组合物包括本发明的T细胞重定向复合物。
本发明第四方面涉及一种治疗膀胱癌的方法，包括向受试者施用有效治疗剂量的本发明的T细胞重定向复合物。
在一些实施方案中，所述T细胞重定向复合物可以经由与T细胞结合的部分和与靶细胞结合的部分将T细胞连接至受试者的膀胱癌靶细胞，从而活化所述T细胞来杀灭所述靶细胞。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
在一些实施方案中，所述第二治疗剂可以选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
在一些实施方案中，所述T细胞重定向复合物可以被静脉内施用或皮下施用。
在一些实施方案中，所述受试者的膀胱癌耐受其他化疗抗癌药物的治疗，优选地所述受试者的膀胱癌耐受多柔比星、顺铂、氨甲蝶呤、表阿霉素或长春新碱或其任意组合的治疗。
本发明第五方面涉及一种在个体中将效应T细胞引导至膀胱癌细胞的方法，包括向个体施用本发明的T细胞重定向复合物。
本发明第六方面涉及一种用于制备经修饰的T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从外周血单个核细胞(PBMC)制备活化的T细胞；
2)用本发明的T细胞重定向复合物对T细胞进行修饰。
在一些实施方案中，步骤2)可以通过将解冻的T细胞与所述T细胞重定向复合物发生结合反应来进行。
在一些实施方案中，在所述结合反应中，所述T细胞重定向复合物的浓度可以为20～100ng/106个细胞，反应温度可以为25～40℃且反应时间可以为15～50分钟。
在一些实施方案中，在所述结合反应中，所述T细胞重定向复合物的浓度可以为35～70ng/106个细胞，反应温度可以为30～35℃且反应时间可以为25～40分钟。
本发明第七方面涉及一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞经过本发明的T细胞重定向复合物的修饰。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞可以根据本发明的方法制备得到。
本发明第八方面涉及一种用于测定本发明的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞的抗肿瘤活性的耐药膀胱癌细胞。
本发明第九方面涉及一种用于测定本发明的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞的抗肿瘤活性的稳定表达荧光素酶基因的人膀胱癌细胞系。
本发明第十方面涉及一种用于测定本发明的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞的抗肿瘤活性的人膀胱癌的免疫缺陷鼠模型。
本发明第十一方面涉及一种体外检测本发明的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞的抗肿瘤活性的方法，所述方法应用本发明的耐药膀胱癌细胞、稳定表达荧光素酶基因的人膀胱癌细胞系或人膀胱癌的免疫缺陷鼠模型实施。
本发明第十二方面涉及一种治疗膀胱癌的方法，包括向受试者施用有效治疗剂量的本发明的经修饰的T细胞。
在一些实施方案中，所述T细胞重定向复合物可以经由与T细胞结合的部分和与靶细胞结合的部分将T细胞连接至受试者的膀胱癌靶细胞，从而活化所述T细胞来杀灭所述靶细胞。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
在一些实施方案中，所述第二治疗剂可以选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
在一些实施方案中，所述经修饰的T细胞可以被静脉内施用或皮下施用。
在一些实施方案中，所述T细胞可以来源于所述受试者。
在一些实施方案中，所述受试者的膀胱癌耐受其他化疗抗癌药物的治疗，优选地所述受试者的膀胱癌耐受多柔比星、顺铂、氨甲蝶呤、表阿霉素或长春新碱或其任意组合的治疗。
本发明第十三方面涉及一种用于治疗膀胱癌的组合物，所述组合物包括本发明的经修饰的T细胞。
本发明第十四方面涉及经修饰的T细胞在制备用于治疗受试者的膀胱癌的药物中的用途，所述经修饰的T细胞经过T细胞重定向复合物的修饰，所述T细胞重定向复合物包含双特异性抗体，所述T细胞重定向复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。
在一些实施方案中，所述在效应T细胞上表达的抗原可以选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90；优选可以为CD3。
在一些实施方案中，所述在靶细胞上表达的抗原可以选自由以下组成的组：EGFR、HER2、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、VEGF、VEGFR和致癌基因产物；优选可以为EGFR或HER2。
在一些实施方案中，所述T细胞重定向复合物可以是所述双特异性抗体，所述双特异性抗体包括结合至所述在效应T细胞上表达的抗原的第一抗体部分和结合至所述在靶细胞上表达的抗原的第二抗体部分。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以选自由以下组成的组：hA20、hA19、阿仑珠单抗、hLL1、hLL2、RFB4、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、GA101、巴利昔单抗、达利珠单抗、依法利珠单抗和莫罗单抗-CD3；且所述第二抗体部分可以选自由以下组成的组：hR1、英利昔单抗、赛妥珠单抗、阿达木单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕木单抗、曲妥珠单抗和托珠单抗。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分可以是抗CD3抗体且所述第二抗体部分可以是抗EGFR抗体；或者，其中所述第一抗体部分可以是抗CD3抗体且所述第二抗体部分可以是抗HER2抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗体部分和所述第二抗体部分可以选自由以下组成的组：scFv、Fab和dAb；可选地，其中所述第一抗体部分可以是scFv并且所述第二抗体部分可以是Fab；或者其中所述第一抗体部分可以是Fab并且所述第二抗体部分可以是Fab。
在一些实施方案中，当所述药物被施用时，可以包括向患有膀胱癌的所述受试者施用有效治疗剂量的所述药物。
在一些实施方案中，当所述药物被施用时，所述T细胞重定向复合物可以经由与T细胞结合的部分和与靶细胞结合的部分将T细胞连接至受试者的膀胱癌靶细胞，从而活化所述T细胞来杀灭所述靶细胞。
在一些实施方案中，当所述药物被施用时，可以进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
在一些实施方案中，所述第二治疗剂可以选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
在一些实施方案中，当所述药物被施用时，所述药物可以被静脉内施用或皮下施用。
在一些实施方案中，所述受试者的膀胱癌可以耐受其他化疗抗癌药物的治疗，优选地所述受试者的膀胱癌耐受多柔比星、顺铂、氨甲蝶呤、表阿霉素或长春新碱或其任意组合的治疗。
本发明第十五方面涉及本发明的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞在制备用于在个体中将效应T细胞引导至膀胱癌细胞的组合物中的用途，其中，当所述组合物被施用时，包括向个体施用所述组合物。
本发明第十六方面涉及本发明的T细胞重定向复合物在制备用于治疗受试者的膀胱癌的药物中的用途，所述T细胞重定向复合物包含双特异性抗体，所述T细胞重定向复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。
本发明第十七方面涉及一种用于治疗膀胱癌的药盒，所述药盒包含本发明的经修饰的T细胞。
根据本发明，使用本发明的T细胞重定向复合物(例如双特异性抗体)制备得到表达显著更高水平的活化标志物CD69且分泌显著更多的IFN-γ和TNF-α的活化的经修饰的T细胞，从而得到对膀胱癌细胞具有显著高效杀伤作用的抗膀胱癌细胞的治疗复合物，其有效杀伤膀胱癌细胞，使其释放显著更高水平的LDH。
本发明为实体癌特别是膀胱癌提供一种具有高效杀伤、技术简洁、可重复性好的优势的治疗方案。
此外，本领域技术人员知晓现有的CAR-T技术需要病毒载体的参与。与现有的CAR-T技术不同，在本申请的T细胞修饰方面，由于没有病毒载体的参与、没有对T细胞进行基因改造且未引入胞内活化域，因此比现有的CAR-T技术更加安全、可控。
双特异性抗体介导的过继性T细胞疗法是一种由双特异性抗体重定向的T细胞介导的肿瘤治疗策略，因其无MHC限制性、具有抗原靶点的靶向特异性和广域性以及T细胞杀伤的最大限度化，使得双特异性抗体疗法具有很大的抗肿瘤潜力并被应用于多种肿瘤的抗肿瘤治疗。因此，本发明还为膀胱癌的免疫治疗提供新的策略。
附图说明
图1：EGFR及HER2在膀胱癌细胞株Pumc-91、T24及其相对应耐药细胞株Pumc-91/ADM及T24/DDP上高表达。通过流式细胞术评价EGFR和HER2分别在人膀胱癌细胞株Pumc-91、T24及其相对应的化疗药物耐药细胞株Pumc-91/ADM及T24/DDP的细胞表面上表达的结果。图1A-1D中：浅灰色部分表示用抗EGFR抗体染色的细胞；深灰色部分表示用抗HER2抗体染色的细胞；且虚线围绕的空白部分表示用不相关的人IgG作为对照抗体染色的细胞。图1A-1D中箭头所示的数值分别示出了通过染色(浅灰色部分)或染色(深灰色部分)除以对照抗体染色(空白部分)获得的平均荧光强度(MFI)值。
图2：制备获得的抗CD3抗体(OKT3)x抗EGFR抗体的双特异性抗体(EGFRBi-Ab)和抗CD3抗体x抗HER2抗体的双特异性抗体(HER2Bi-Ab)的检测以及活化的T细胞(ATCs)的分析。(A)EGFRBi-Ab和HER2Bi-Ab的基于流式细胞术的结合测定。将膀胱癌细胞T24分别与EGFRBi-Ab(0.5μg/mL，浅灰色部分)、HER2Bi-Ab(0.5μg/mL，深灰色部分)或OKT3与和的混合物(0.5μg/mL，虚线围绕的空白部分)一起孵育，并通过用PE标记的抗鼠IgG2a检测Bi-Ab的抗CD3部分来检查Bi-Ab的结合。(B)基于流式细胞术测定EGFRBi-Ab和HER2Bi-Ab的结合的方案。(C-E)活化的T细胞上各细胞特异性表面分子表达的流式细胞术分析。
图3：EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs接触膀胱癌细胞后的活化。以效靶(E/T)比10:1将靶细胞T24(1x104/孔)与EGFRBi-Ab-修饰的ATCs(50ng/EGFRBi-Ab/106ATCs)或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs(50ng/HER2Bi-Ab/106ATCs)在96孔微型板中一起孵育18小时。与OKT3、和的混合物孵育的ATCs作为未修饰的ATCs(即，对照组T细胞)。(A)通过流式细胞术检测对照组T细胞、EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs上的CD69的表达。(B)将T24细胞与a.对照组T细胞、b.EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或c.HER2Bi-Ab-修饰的ATCs一起孵育，并以200x的放大倍数分别采集实时图像。
图4：EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对膀胱癌细胞的杀伤作用。将靶细胞(Pumc-91、Pumc-91/ADM、T24和T24/DDP；1x104/孔)与EGFRBi-Ab-修饰的ATCs(50ng/EFGRBi-Ab/106ATCs)或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs(50ng/HER2Bi-Ab/106ATCs)在96-孔微型板中一起孵育。在18h时收集以E/T比5:1或10:1的共培养物的上清液并进行乳酸脱氢酶(LDH)活性测定以确定各组T细胞对Pumc-91和T24细胞(A和C)以及其相对应的化疗药物耐药细胞株Pumc-91/ADM及T24/DDP(B和D)的杀伤作用。与OKT3、和的混合物孵育的ATCs作为对照组T细胞。数据为三次测定的平均值±SD。**，P<0.01；***，P<0.001。
图5：EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对膀胱癌细胞分泌的毒性细胞因子IFN-γ(图5A)和TNF-α(图5B)。将靶细胞(Pumc-91、Pumc-91/ADM、T24和T24/DDP；1x104/孔)与EGFRBi-Ab-修饰的ATCs(50ng/EFGRBi-Ab/106ATCs)或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs(50ng/HER2Bi-Ab/106ATCs)在96-孔微型板中一起孵育。在18h时收集以E/T比10:1的共培养物的上清液并分别使用IFN-γ和TNF-αELISA试剂盒检测各组T细胞分别与Pumc-91和T24细胞(a和c)以及其相对应的化疗药物耐药细胞株Pumc-91/ADM及T24/DDP(b和d)孵育后细胞因子的产生。与OKT3、和的混合物孵育的ATCs作为对照组T细胞。数据为三次测定的平均值±SD。**，P<0.01；***，P<0.001。
图6：EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对稳定表达荧光素酶的膀胱癌细胞的杀伤作用。根据下文材料和方法部分所描述的利用慢病毒感染法构建稳定表达荧光素酶基因的膀胱癌细胞株T24-luc及其化疗药物耐药株T24/DDP-luc，并通过荧光素酶定量分析法评价T24-luc(A)及其化疗药物耐药株T24/DDP-luc(B)的活细胞数量(横轴)与荧光强度(纵轴)的关系。将靶细胞(T24-luc或T24/DDP-luc，1x104/孔)与EGFRBi-Ab-修饰的ATCs(50ng/EFGRBi-Ab/106ATCs)或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs(50ng/HER2Bi-Ab/106ATCs)在96-孔微型板中一起孵育。孵育18h后，利用荧光素酶定量分析法检测E/T比1:1、5:1和20:1时各组T细胞对T24-luc(C)以及其相对应的化疗药物耐药细胞株T24/DDP-luc(D)的杀伤作用。与OKT3、和的混合物孵育的ATCs作为对照组T细胞。数据为三次测定的平均值±SD。***，P<0.001。
具体实施方式
本申请中的“T细胞”意指T淋巴细胞，简称T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥细胞免疫功能的细胞。
本申请中的“效应T细胞”意指T细胞接受抗原刺激后，经过增殖，分化形成的细胞。效应T细胞与靶细胞接触而激发颗粒胞吐，所释放的穿孔素通过聚合作用而在靶细胞表面形成小孔，从而介导杀伤作用。同时，效应T细胞还能释放出免疫活性物质--淋巴因子，如干扰素(IFN)，例如IFN-γ；肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF-α等。
本申请中的“经修饰的T细胞”意指经过本申请的T细胞重定向复合物修饰的T细胞。用于修饰T细胞的T细胞重定向复合物可以为双特异性抗体，优选为抗CD3抗体x抗EGFR抗体的双特异性抗体或抗CD3抗体x抗HER2抗体的双特异性抗体。
本申请中的“靶细胞”意指能够被本申请的经修饰的T细胞靶向的细胞。靶细胞例如可以为膀胱癌细胞，例如来自膀胱癌患者的膀胱癌细胞、Pumc-91细胞、T24细胞以及其相对应的化疗药物耐药细胞株Pumc-91/ADM细胞和T24/DDP细胞等。
本申请中的“在靶细胞上表达的抗原”意指在靶细胞(例如膀胱癌细胞)上表达的抗原，例如EGFR或HER2。
本申请中的“抗体”意指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段(例如，“scFv”、“Fab”、“dAb”等)。无论结构怎样，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体以及标记的抗体等。
本申请中的“抗CD3抗体”、“抗EGFR抗体”和“抗HER2抗体”可以通过本领域公知的方法合成或购买获得。
本申请中的“双特异性抗体(bispecific antibody；Bi-Ab)”是可以同时结合两个不同靶标的抗体。双特异性抗体可以同时结合两个不同的抗原，一端靶向免疫细胞的表面分子，如T细胞的表面分子CD3，另一端靶向肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原(tumorassociated antigen，TAA)(例如EGFR或HER2)或主要组织相容性复合体-多肽复合物。
产生双特异性抗体的许多方法是已知的(参见，例如美国专利号7,405,320)。双特异性抗体可通过四价体瘤方法产生，所述方法包括使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤融合(Milstein和Cuello,Nature 1983；305:537-540)。融合的杂交瘤能够合成两个不同重链和两个不同轻链，其可随机缔合以得到具有10个不同抗体结构的异质性群体，其中只有一种(占总抗体分子的1/8)具有双特异性。产生双特异性抗体的另一种方法使用异双官能交联剂来化学偶联两个不同单克隆抗体，以使得所得杂合偶联物结合至两个不同靶点(Staerz等人,Nature 1985,314:628-631；Perez等人,Nature 1985,316:354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上是两个IgG分子的杂合偶联物，其缓慢扩散至组织中并且从循环中快速移除。双特异性抗体也可通过将两个亲本单克隆抗体中的每一个还原成相应的半分子，然后混合并允许再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA 1986,83:1453-1457)。另一替代方案涉及使用适当接头使两种或三种经过单独纯化的Fab'片段化学交联。
本申请中的“T细胞重定向复合物”是指赋予T细胞靶向性的复合物。
本申请中的抗原“结合位点”即为抗体上存在的、可以与抗原决定簇特异性识别与结合的相应位点。
本申请中的“效靶比”意指效应细胞数量与靶细胞数量的比。本申请中的“效靶比”在1:1至100:1的范围以内，例如，1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1等。
在本申请中，“在效应T细胞上表达的抗原”可以例如选自由以下组成的组：CD2、CD3，CD4，CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90；优选为CD3。
本申请中的“EGFR”和“HER2”是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的成员，该家族有4个成员，其中EGFR为表皮生长因子受体1的简称，且HER2为表皮生长因子受体2的简称。
本申请中的药物可通过静脉注射、皮下注射、腹腔注射、脑室灌注等方式施用。
本申请中的“有效治疗剂量”指在患者中有效发挥生理功效的剂量。“有效治疗剂量”在109个ATCs/周至1012个ATCs/周的范围以内，例如，109个ATCs/周、1010个ATCs/周、1011个ATCs/周或1012个ATCs/周。
实施例
下面结合实施例对本发明作出进一步的详细说明，它们绝不以任何方式被解释为对本发明的范围的限制。
材料和方法
一.细胞培养
人膀胱癌细胞系T24(由Chinese Academy of Sciences Culture Collection提供)；人膀胱癌细胞株Pumc-91(由北京协和医学院医院的细胞实验室提供)。
耐药膀胱癌细胞株T24/DDP的制备按照赵嫚等(赵嫚等，《标记免疫分析与临床》，2015年4月第22卷第4期，第338-341页)描述的方法进行。简而言之，通过将T24暴露在浓度梯度上升(从0.01μg/mL至0.60μg/mL)的顺铂6个月制备而成。
耐药膀胱癌细胞株Pumc-91/ADM的制备按照张敏等(张敏等，《医学研究杂志》，2009年，第70-72页)描述的方法进行。简而言之，通过采用剂量递增、终浓度为1.0μg/mL的多柔比星培养一年制备而成。
细胞培养使用的试剂购自Gaithersburg,MD,USA。细胞培养根据谭玉珍(谭玉珍，《实用细胞培养技术》，2010年，高等教育出版社)描述的方法进行。
二.从外周血单个核细胞(PBMCs)制备活化的T细胞(activated T cells,ATCs)
采用Ficoll密度梯度离心法从来自北京血库的健康人供体细胞制备PMBC；
将1×106个/mL的PMBC接种在添加了10％胎牛血清和抗CD3单抗(OKT3；eBioscience,San Diego,CA,USA)、抗CD28(eBioscience)、100IU/mL的IL-2(Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)的RPMI-1640培养基(购自Gaithersburg,MD,USA)中培养，每隔2～3天添加含IL-2(100IU/mL)的新鲜培养基培养14天后冻存。
三.抗-CD3抗-EGFR双特异性抗体(EFGRBi-Ab)和抗-CD3抗-HER2双特异性抗体(HER2Bi-Ab)的合成以及与活化的T细胞的结合
1.抗-CD3抗-EGFR双特异性抗体(EFGRBi-Ab)和抗-CD3抗-HER2双特异性抗体(HER2Bi-Ab)的合成
1)缓冲液配制
缓冲液A：称取7.1628g Na2HPO4·12H2O、1.754g NaCl和0.58g EDTA，加入蒸馏水至终体积200mL，将pH调节为7.2。
缓冲液B：称取0.292g NaCl、0.3722g EDTA，加入蒸馏水至终体积100mL。用NaOH将pH调节为8.0。
2)试剂配置(溶于DMSO)
sulfo-SMCC试剂：称取1mg sulfo-SMCC粉末溶于500μL DMSO中。
Traut’s Reagent试剂：称取1mg Traut’s Reagent粉末溶于500μL DMSO中。
3)偶联方法
3-1)取100μg抗-EGFR抗体(Merck Serono,Darmstadt,Germany)或抗-HER2抗体(Roche,Indianapolis,IN,USA)溶于50μL缓冲液A中，使其浓度达到2mg/mL。加入1μL sulfo-SMCC试剂，轻柔混匀。室温孵育1小时，用PD-10脱盐柱去除游离的sulfo-SMCC(2.5mL样品上样，3.5mL缓冲液A洗脱，收集洗脱液3.5mL)。
3-2)利用30KD浓缩管将抗CD3抗体(OKT3)的缓冲液换成缓冲液B，使其浓度达到100μg/50μL。加入0.4μL Traut’s Reagent试剂，混匀。室温孵育1小时，用PD-10脱盐柱去除游离的Traut’s Reagent(2.5mL样品上样，3.5mL缓冲液A洗脱，收集洗脱液3.5mL)。
3-3)将上面步骤3-1)和3-2)中获得的3.5mL洗脱液立即混匀，获得7mL溶液。利用30KD浓缩管浓缩到200μL体积，4℃过夜反应，获得双特异性抗体。
2.抗-CD3抗-EGFR双特异性抗体(EFGRBi-Ab)和抗-CD3抗-HER2双特异性抗体(HER2Bi-Ab)与活化的T细胞的结合
将冻存的ATCs解冻，用浓度为50ng/106细胞的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab室温反应30分钟进行修饰，洗涤细胞以去除未结合的抗体。将未进行偶联的抗-EGFR抗体(50ng/106细胞)、抗-HER2抗体(50ng/106细胞)和抗-CD3 mAb(OKT3)(50ng/106细胞)的混合物预培养的ATCs用于作为未修饰ATCs对照，即对照组T细胞。
四.流式细胞术分析
为了检测细胞表面表达的EGFR或HER2，将膀胱癌细胞(T24、T24/DDP、Pumc-91、Pumc-91/ADM，各1x106个)在抗-EGFR抗体或抗-HER2抗体中冰浴30分钟，并用抗人IgG-PE(BioLegend,San Diego,CA,USA)染色。用不相关的人IgG作为对照抗体进行染色。
为检测结合到膀胱癌细胞的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab，先将T24细胞系与EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab共孵育30分钟。以未进行偶联的抗-EGFR抗体(Merck Serono,Darmstadt,Germany)、抗-HER2抗体(Roche,Indianapolis,IN,USA)和抗-CD3mAb(OKT3)的混合物作为阴性对照。然后用PE标记的抗鼠IgG2a检测EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab的抗-CD3结构域。
将根据以上第二项的描述获得的活化的T细胞解冻，加入抗-人CD3-FITC、抗-人CD4-PE、抗-人CD8-APC和抗-人CD56-APC，并通过流式细胞术检测活化的T细胞上各细胞特异性表面分子的表达。
为了检测ATCs上表达的CD69，将从T24细胞系和ATCs人工培养物中分离的细胞与抗-人CD69-PE和抗-人CD3-FITC共孵育。
抗-人CD3-FITC、抗-人CD69-PE、抗-人CD4-PE、抗-人CD8-APC、抗-人CD56-APC和抗鼠IgG2a-PE二抗购自eBioscience。
采用Guava flow cytometrometer Easycyte(Guava Technologies,Hayward,CA,USA)检测细胞，采用FlowJo软件(7.6.1版)(Tree Star Inc.,Asland,OR,USA)分析流式数据。
五.抗肿瘤体外试验
采用乳酸脱氢酶(LDH)活性测定试剂盒(Sigma-Aldrich)按供应商的说明书进行细胞毒性测定，用光学显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)获得实时图像。将膀胱癌细胞(包括Pumc-91、T24及其相对应的化疗药物耐药细胞株Pumc-91/ADM和T24/DDP)按1×104/孔的浓度,每组设置3个复孔接种在96孔板中，按照效靶比5:1和10:1加入效应细胞—EGFRBi-Ab修饰的ATCs、HER2Bi-Ab修饰的ATCs，或未修饰的ATCs(即，对照组T细胞)。将效应T细胞和肿瘤细胞在37℃反应18小时。收集上清液，测定LDH活性，并评价各组效应T细胞对膀胱癌细胞的杀伤作用。
六.ELISA检测
将靶细胞(包括Pumc-91、T24及其化疗药物耐药衍生细胞Pumc-91/ADM和T24/DDP)按1×104/孔的浓度，每组设置3个复孔接种在96孔板中，按照效靶比10:1加入EGFRBi-Ab修饰的ATCs、HER2Bi-Ab修饰的ATCs或未修饰的ATCs(即，对照组T细胞)。将效应细胞和肿瘤细胞在37℃反应18小时。收集上清液，采用人细胞因子酶联免疫试剂盒(eBioscience)按供应商的说明书定量测定INF-γ和TNF-α。
七.稳定表达荧光素酶的膀胱癌细胞系T24-luc及膀胱癌顺铂耐药细胞系T24/DDP-luc的建立及荧光素酶定量分析
根据(Huamin Han等,PLoS One 2011,6(11):e26380)描述的方法，利用慢病毒载体pLL3.7(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及包装质粒pLP1(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、pLP2(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和pVSVG(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，将luc基因(Juan Ma等,PLoS One 2013,8(8):e73261)导入膀胱癌细胞系T24及膀胱癌顺铂耐药细胞系T24/DDP，构建稳定表达荧光素酶的膀胱癌细胞系T24-luc及膀胱癌顺铂耐药细胞系T24/DDP-luc。
将T24-luc或T24/DDP-luc细胞数量经系列倍比稀释为32000个、16000个、8000个、4000个、2000个和1000个，分别接种到96孔板中并设置3个复孔。加入底物荧光素酶(luciferin，Gold Bio)，使荧光素酶终浓度为150μg/mL。利用Amix小动物三维活体成像系统(Spectral instruments imaging)测定靶细胞生物发光强度，评价荧光强度与细胞数量的关系。
八.荧光素酶定量分析法检测细胞杀伤效果
将膀胱癌细胞(T24-luc或其相对应的化疗药物耐药细胞株T24/DDP-luc)，按1×104/孔的浓度接种在96孔板中,每组设置3个复孔。按照效靶比1:1、5:1和20:1加入效应细胞—EGFRBi-Ab修饰的ATCs、HER2Bi-Ab修饰的ATCs或未修饰的ATCs(即，对照组T细胞)。另外设置2组不加入效应细胞的膀胱癌细胞，每组设置3个复孔，作为靶细胞本底组。将靶细胞和效应细胞混匀，在37℃培养箱中反应18小时，加入底物荧光素酶(luciferin，Gold Bio)，使荧光素酶终浓度为150μg/mL。利用Amix小动物三维活体成像系统(Spectralinstruments imaging)测定靶细胞生物发光强度，评价各组效应T细胞对膀胱癌细胞的杀伤作用。各组T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝(本底组靶细胞荧光强度-实验组靶细胞荧光强度)/本底组靶细胞荧光强度x 100％。
九.统计学分析和重复性
全部实验都重复三次。采用Graphpad Prism 5软件分析数据，结果用平均值±SD表示。采用未配对的学生t检验(student’s t-test)(双侧试验)或曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)进行两组之间的比较。进行单因素方差分析(ANOVA)，然后进行多因子比较。p<0.05视为具有统计学意义。在附图中，将与对照相比具有显著差异的数值用星号标记出。
实施例1.EGFR和HER2在人膀胱癌细胞表达
用流式细胞术评价了人源肌肉浸润型膀胱癌细胞(包括Pumc-91和T24)及其化疗药物耐药衍生细胞(Pumc-91/ADM和T24/DDP)上表达的EGFR和HER2。采用人源抗人EGFR抗体或抗人HER2抗体染色除以对照抗体染色测得的平均荧光强度(MFI)值。如图1所示，EGFR与HER2在膀胱癌细胞株及其相对应耐药株上均表达。
实施例2.EGFRBi-Ab、HER2Bi-Ab和ATCs的制备和特征
根据材料和方法部分的描述，构建了可识别T细胞表面的CD3和膀胱癌细胞上的EFGR或HER2的双特异性抗体EGFRBi-Ab和HER2Bi-Ab。
分别测定所制备的EGFRBi-Ab和HER2Bi-Ab的抗EGFR和抗HER2特性。将膀胱癌细胞T24用EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab染色，然后添加抗鼠IgG2a-PE检测双特异性抗体的抗-CD3结构域。只有功能性的双特异性抗体可以结合T24细胞，采用抗鼠IgG2a-PE二抗检测结合到T24细胞上的双特异性抗体的鼠源抗-CD3 mAb(OKT3)的部分。在对照组中，抗-EGFR抗体(Merck Serono,Darmstadt,Germany)、抗-HER2抗体(Roche,Indianapolis,IN,USA)和抗-CD3 mAb(OKT3)未进行偶联。抗-EGFR抗体和抗-HER2抗体可以结合到T24细胞，但是不能被抗鼠IgG2a-PE二抗所识别。如图2A所示，对于双特异性抗体的染色，超过95％的T24细胞群检测到阳性染色的细胞，MFI值(平均荧光强度值)分别为7.38和4.03。基于EGFRBi-Ab和HER2Bi-Ab的结合实验的流式细胞术检测原理如图2B所示。
为了得到足够数量的效应细胞，用IL-2扩增经抗-CD3和抗-CD28单抗联合刺激的经Ficoll密度梯度离心法提取的外周血单个核细胞(PBMC)，培养14天后通过流式细胞术(FACS)分析效应细胞组成。细胞群包含几乎95％～96％的CD3+细胞，其中有63.2％的CD3+CD8+细胞(图2C)，和30.3％的CD3+CD4+细胞(图2D)。大部分CD3-细胞群是CD56阳性的(图2E)。因此，这些数据表明效应细胞主要是ATCs和少量的NK细胞群组成。
实施例3.EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs接触膀胱癌细胞后活化
除非另有说明，否则随后的所有实验选择50ng/106个细胞的浓度的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab来修饰ATCs，将未进行偶联的抗-CD3 mAb(OKT3)、抗-EGFR抗体和抗-HER2抗体的混合物预培养的ATCs作为未修饰的对照ATCs(即对照组T细胞)。在效靶比为10:1时测定了EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对T24细胞的抗肿瘤效应。孵育18小时后，通过流式细胞术分析的结果在图3A中显示，与未修饰的ATCs(图3A，a)比较，双特异性抗体EGFRBi-Ab(图3A，b)或HER2Bi-Ab(图3A，c)修饰的T细胞的活化标志物CD69表现出更高的表达。此外，如图3B所示，实时图像证明，EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs能够与培养的T24细胞结合，成簇集聚在靶细胞旁边(参见图3B，b和c)，而未修饰的对照ATCs不能够结合和集聚(图3B，a)。这表明EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs被T24细胞特异性地活化。
实施例4.EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对膀胱癌细胞的杀伤作用
采用LDH活性分析评价了EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对人源膀胱癌细胞Pumc-91、T24、Pumc-91/ADM和T24/DDP的杀伤作用。如图4A-4D所示，在效靶E/T比为5:1和10:1时，与EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs共培养的膀胱癌细胞释放的LDH的浓度显著高于与未修饰ATCs(即对照组T细胞)共培养的膀胱癌细胞所释放的LDH浓度。这表明EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对靶细胞膀胱癌细胞具有显著的杀伤作用。
实施例5.EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对膀胱癌细胞分泌的毒性细胞因子
为进一步分析T细胞来源的细胞毒性细胞因子，检测了效靶比为10:1的细胞共培养上清液的IFN-γ和TNF-α的浓度。IFN-γ和TNF-α的检测结果分别在图5A和5B中示出。如图5A和5B所示，将效应细胞分别与靶细胞Pumc-91(参见图5A，a；和图5B，a)、T24(参见图5A，c；和图5B，c)、Pumc-91/ADM(参见图5A，b；和图5B，b)和T24/DDP共培养时(参见图5A，d；和图5B，d)，与未修饰的对照ATCs(即，对照组T细胞)相比，EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs可产生显著更高水平的IFN-γ和TNF-α的分泌。
实施例6.利用荧光素酶定量分析法检测EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对膀胱癌细胞的杀伤作用
如材料和方法部分所描述的，构建稳定表达荧光素酶的膀胱癌细胞系T24-luc及其相对应的顺铂耐药细胞系T24/DDP-luc。将T24-luc或T24/DDP-luc经系列倍比稀释分别接种到96孔板中以检测分析细胞生物发光情况。如图6A(T24-luc)和6B(T24/DDP-luc)所示，细胞的荧光强度和活细胞数量之间存在非常好的线性关系，说明利用荧光强度可以定量检测活细胞的数量。
接下来，采用荧光素酶定量分析法评价了EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs对T24-luc(图6C)和T24/DDP-luc(图6D)的杀伤作用。如图6C和6D所示，随着效靶比1:1，5:1和20:1的递增，各组T细胞对靶细胞的杀伤均呈现上升趋势。在任一给定效靶比的情况下，与对照组T细胞相比，EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs均展示出显著更强大的杀伤效果。
具体地，在低效靶比1:1时，对照组T细胞对T24-luc的杀伤率为15％，而经本申请的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs对该细胞株的杀伤率可达到约60％；另一方面，对照组T细胞对耐药株T24/DDP-luc的杀伤率为10％，而经本申请的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs对该耐药株的杀伤率可达到约40％。由此可知，无论是细胞株T24-luc或其对应的耐药株T24/DDP-luc，本申请的经修饰的T细胞的杀伤作用均远远优于对照组T细胞，杀伤作用的差异达到统计学显著水平(P<0.001)。也就是说，本申请的EGFRBi-Ab-修饰的ATCs或HER2Bi-Ab-修饰的ATCs在低效靶比时就能够展现出对膀胱癌细胞的显著优于对照组T细胞的高效杀伤作用。
尤其值得注意的是，本申请的经修饰的T细胞能够在耐药株T24/DDP-luc中实现与在非耐药株T24-luc中相似的杀伤作用，这一研究成果为化疗药物耐药膀胱癌的治疗提供了新的选择。
随后，随着效靶比的升高，本申请经修饰的T细胞的杀伤作用得到进一步增强，且与对照组的差异均达到统计学显著水平(P<0.001)。
具体地，在效靶比5:1时，对照组T细胞对T24-luc的杀伤率为30％，而经本申请的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs对该细胞株的杀伤率可达到约90％；另一方面，对照组T细胞对耐药株T24/DDP-luc的杀伤率为20％，而经本申请的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs对该耐药株的杀伤率可达到约80％。在更高效靶比20:1时，对照组T细胞对T24-luc的杀伤率为50％，而经本申请的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs对该细胞株的杀伤率可达到约100％；另一方面，对照组T细胞对耐药株T24/DDP-luc的杀伤率为40％，而经本申请的EGFRBi-Ab或HER2Bi-Ab修饰的ATCs对该耐药株的杀伤率可达到约90％。

Claims (18)

1.经修饰的T细胞在制备用于治疗受试者的膀胱癌的药物中的用途，所述经修饰的T细胞经过T细胞重定向复合物的修饰，其中所述T细胞重定向复合物包含双特异性抗体，且所述T细胞重定向复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述在效应T细胞上表达的抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90；优选为CD3。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述在靶细胞上表达的抗原选自由以下组成的组：EGFR、HER2、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、VEGF、VEGFR和致癌基因产物；优选为EGFR或HER2。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述T细胞重定向复合物是所述双特异性抗体，所述双特异性抗体包括结合至所述在效应T细胞上表达的抗原的第一抗体部分和结合至所述在靶细胞上表达的抗原的第二抗体部分。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述第一抗体部分选自由以下组成的组：hA20、hA19、阿仑珠单抗、hLL1、hLL2、RFB4、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、GA101、巴利昔单抗、达利珠单抗、依法利珠单抗和莫罗单抗-CD3；且所述第二抗体部分选自由以下组成的组：hR1、英利昔单抗、赛妥珠单抗、阿达木单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕木单抗、曲妥珠单抗和托珠单抗。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述第一抗体部分是抗CD3抗体且所述第二抗体部分是抗EGFR抗体；或者，其中所述第一抗体部分是抗CD3抗体且所述第二抗体部分是抗HER2抗体。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述第一抗体部分和所述第二抗体部分独立地选自由以下组成的组：scFv、Fab和dAb；可选地，其中所述第一抗体部分是scFv并且所述第二抗体部分是Fab；或者其中所述第一抗体部分是Fab并且所述第二抗体部分是Fab。
8.根据权利要求1所述的用途，其中，当所述药物被施用时，包括向患有膀胱癌的所述受试者施用有效治疗剂量的所述药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，当所述药物被施用时，所述T细胞重定向复合物经由与T细胞结合的部分和与靶细胞结合的部分将T细胞连接至受试者的膀胱癌靶细胞，从而活化所述T细胞来杀灭所述靶细胞。
10.根据权利要求8所述的用途，其中，当所述药物被施用时，进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
12.根据权利要求8所述的用途，其中，当所述药物被施用时，所述药物被静脉内施用或皮下施用。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者的膀胱癌耐受其他化疗抗癌药物的治疗，可选地所述受试者的膀胱癌耐受多柔比星、顺铂、氨甲蝶呤、表阿霉素或长春新碱或其任意组合的治疗。
14.在权利要求1-13任一项中定义的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞在制备用于在个体中将效应T细胞引导至膀胱癌细胞的组合物中的用途，其中，当所述组合物被施用时，包括向所述个体施用所述组合物。
15.在权利要求1-13任一项中定义的T细胞重定向复合物在制备用于治疗受试者的膀胱癌的药物中的用途，所述T细胞重定向复合物包含双特异性抗体，所述T细胞重定向复合物包括针对在效应T细胞上表达的抗原的至少一个结合位点和针对在靶细胞上表达的抗原的至少一个结合位点。
16.一种用于测定在权利要求1-13任一项中定义的所述T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞的抗肿瘤活性的稳定表达荧光素酶基因的人膀胱癌细胞系。
17.一种体外检测在权利要求1-13任一项中定义的T细胞重定向复合物或经修饰的T细胞的抗肿瘤活性的方法，所述方法应用根据权利要求16所述的稳定表达荧光素酶基因的人膀胱癌细胞系。
18.一种用于治疗膀胱癌的药盒，所述药盒包含在权利要求1-13任一项中定义的经修饰的T细胞。
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