CN100406564C - 多基因转染肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多基因转染细胞株及其制备方法和一种瘤苗及其制备方法。该细胞株有人IFN-γ基因和人B7-1基因，所用转染细胞为人肺癌肿瘤细胞系A549；一种瘤苗含有多基因转染细胞株A549-IFN-γ-B7-1。利用本发明将人IFN-γ基因和人B7-1基因联合转染A549细胞制成肺癌瘤苗，目前还未见人IFN-γ基因和人B7-1基因联合转染的肺癌疫苗报道；瘤苗的制备是添加相应的免疫佐剂以更加提高免疫原性，诱导更强的免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种将人IFN-γ基因和人B7-1基因转染入人肺癌肿瘤细胞系A549中，建立稳定表达人IFN-γ基因和人B7-1基因的A549细胞系。
背景技术
在肿瘤免疫过程中，T细胞的免疫功能起关键作用。可溶性肿瘤抗原经抗原提呈细胞(APC)摄人后加工成短肽，然后经MHC-II类抗原提呈而激活CD4+T细胞，通过分泌细胞因子促进CD8+细胞的特异杀伤作用。而肿瘤细胞表面的肿瘤抗原在肿瘤细胞内加工为小肽后提呈于表面的MHC-I类分子直接激活CD8+T细胞。肿瘤细胞可能通过多种机制逃逸T细胞的免疫监视。如在多数肿瘤中，MHC-I类分子表达明显减少或丢失，致使CTL对肿瘤细胞上的抗原不能识别，从而肿瘤细胞得以逃避宿主的免疫攻击；共刺激分子是激发诱导有效的细胞免疫应答所必需的，但肿瘤细胞常常缺失B7这一类共刺激分子，从而使CTLs不能有效地对肿瘤产生免疫应答等。
γ-干扰素是细胞分泌的一类功能性蛋白，具有抗病毒、抑制细胞分裂、诱导细胞分化、增强细胞吞噬功能、诱导细胞特定基因表达及调节免疫反应等作用，特别是具有较强的免疫调节作用和多方面的抗肿瘤效应。有文献报导转γ-干扰素基因后可使细胞的MHC-I和MHC-II类分子表达增高，有利于抗原递呈和增强免疫应答；γ-干扰素可直接抑制肿瘤细胞分裂，使肿瘤细胞生长受到抑制，还可通过影响肿瘤细胞的分化和抑制肿瘤的血管生成发挥抗肿瘤的作用。B7(协同刺激分子)是激发诱导有效的细胞免疫应答所必需的。很多具有正常免疫力的宿主并不能有效排除体内的高免疫原性肿瘤，可能是由于肿瘤细胞缺乏T细胞活化的共刺激信号。B7分子家族及其配基CD28/CTLA-4在协同刺激信号的传递中起重要作用。而肿瘤细胞常常缺失B7这一类共刺激分子，从而使CTLs不能有效地对肿瘤产生免疫应答，但如果给该肿瘤细胞转染B7基因后，则可有效地激发T细胞介导的抗肿瘤免疫。
瘤苗就是针对肿瘤细胞逃避肌体免疫监视而成瘤的特点，利用肿瘤抗原激发机体自身的免疫保护机制达到预防及治疗肿瘤的目的。近来肿瘤疫苗已发展成为一种重要的肿瘤生物治疗手段。与手术治疗、放射治疗相比，毒副作用小，特异性高，作用范围更广泛。在肿瘤治疗研究中越来越引起重视。
目前针对各种肿瘤而设计了多种的转基因瘤苗，如将各种细胞因子转染相关的肿瘤细胞以改善肿瘤细胞的遗传背景，提高免疫原性，诱导更强的免疫应答。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，提供一种将人IFN-γ基因和人B7-1基因转染入人肺癌肿瘤细胞系A549中，建立稳定表达人IFN-γ基因和人B7-1基因的A549细胞系及制备的瘤苗。
本发明的一种多基因转染细胞株，该细胞株有人IFN-γ基因和人B7-1基因，所用转染细胞为人肺癌肿瘤细胞系A549。
一种多基因转染细胞株的制备方法，包括以下步骤：
(1)将人IFN-γ基因双酶切装入pLXSN质粒中，经脂质体转染入A549细胞株，G418筛选得阳性克隆，得A549-IFN-γ细胞株；
(2)将人B7-1基因经双酶切装入pIRESpuro质粒，经脂质体转染入A549-IFN-γ细胞株，puromycin筛选得阳性克隆，得多基因转染细胞株A549-IFN-γ-B7-1。
步骤(1)中的人IFN-γ基因经E.CoR I和BamH I酶切。
步骤(2)中的人B7-1基因经E.CoR I和BamH I酶切。
一种瘤苗，它含有本发明所述的多基因转染细胞株。
一种瘤苗的制备方法：将稳定表达的A549-IFN-γ-B7-1细胞株扩增培养，收集对数生长的细胞，用无血清培养基洗细胞数次，计数，分装，得注射液经Co60照射，得人肺腺癌通用瘤苗。
扩增培养所用的培养基为1640全培养基。
每0.2ml注射液中含细胞因子GM-CSF 45单位。
Co60照射为100rad×50min。
本发明具有如下优点：
(1)将人IFN-γ基因和人B7-1基因联合转染A549细胞制成肺癌瘤苗。目前还未见人IFN-γ基因和人B7-1基因联合转染的肺癌疫苗报道。
(2)在瘤苗的制备是添加相应的免疫佐剂以更加提高免疫原性，诱导更强的免疫应答。
附图说明
图1是本发明的实施例的pLXSN-IFN-γ质粒酶切电泳鉴定；
图1中：1-MARK，1kbDNA Ladder；2-pLXSN质粒；3-鉴定pLXSN-IFN-γ质粒；
图2是本发明的实施例的pIRESpuro-B7-1质粒酶切电泳鉴定；
图2中：1-MARK，1kbDNA Ladder；2-pIRESpuro质粒；3-鉴定pIRESpuro-B7-1质粒。
具体实施方式
以下通过实施例进一步对本发明进行描述：
实施例1、A549-IFN-γ-B7-1细胞株的制备：
(1)将基因两端带有E.CoR I和BamH I酶切序列的人IFN-γ基因(中科院生物化学研究所)(genebank，HUGO Gene Nomenclature Committee，HPRD：00957，MIM：147570)和pLXSN质粒(中科院生物化学研究所)分别加入E.CoR I和BamH I内酶，37℃酶切1小时，酶切产物分别经PCR产物纯化试剂盒纯化，两个纯化产物经T4DNA连接酶24℃，1小时反应连接，转化大肠杆菌DH5α，Amp+培养基筛选阳性克隆，挑半个单菌落于5mLSOB液体培养基中，37℃300rpm，6小时，质粒抽提试剂盒提取质粒，经E.CoR I和BamH
I酶切，电泳鉴定(如图1所示)。鉴定证明含pLXSN-IFN-γ的阳性单菌落的另一半与5mLSOB液体培养基37℃，300rpm，6小时扩增，扩增菌体加到200mLLB液体培养基中37℃300rpm，12小时，大量质粒抽提试剂盒提取质粒，即得pLXSN-IFN-γ质粒。
(2)IFN-γ转染A549细胞：将A549细胞(购自中科院上海细胞所细胞库)铺入6孔培养板中，每孔用含7％胎牛和7％小牛血清的1640培养基培养，37℃，5％CO2培养24小时，铺入的细胞量为2～3×105个，细胞贴壁。将2μgpLXSN-IFN-γ质粒、40μ llipofectamine脂质体混合，加无血清的1640培养基至100μL，室温静止15-30分钟，形成DNA-lipofectamine脂质体的混合物。将培养A549细胞的细胞培养液去除，加入无血清1640培养液800μL，同时加入200μLDNA-lipofectamine脂质体的混合物，混匀，于37℃、5％CO2下培养6小时后，吸掉上层液体，每孔加入5mL1640完全培养液过夜(10小时以上)，做细胞恢复。
(3)转IFN-γ基因阳性细胞筛选：每孔加入不同浓度的(0.2％-0.6％)G418进行筛选。两周后筛选出具有G418抗性的A549转基因细胞株，即A549-IFN-γ细胞株。
(4)将基因两端带有E.CoR I和BamH I酶切序列的人B7-1基因(中科院生物化学研究所)(genebank，HUGO Gene Nomenclature Committee，HPRD：00202，MIM：112203)和pIRESpuro质粒(中科院生物化学研究所)分别加入E.CoR I和BamH I内酶，37℃酶切1小时，酶切产物分别经PCR产物纯化试剂盒纯化，两个纯化产物经T4DNA连接酶24℃，1hr反应连接，转化大肠杆菌DH5α，Amp+培养基筛选阳性菌落，挑半个单克隆于5mLSOB液体培养基中，37℃，300rpm，6小时，质粒抽提试剂盒提取质粒，质粒经E.CoR I和BamH I酶切，经电泳鉴定(如图2所示)。鉴定证明含pIRESpuro-B7-1的阳性单菌落的另一半于5mLSOB液体培养基37℃，300rpm，6小时扩增，扩增菌体加到200mLLB液体培养基中37℃300rpm，12小时，大量质粒抽提试剂盒提取质粒，即得pIRESpuro-B7-1质粒。
(5)人B7-1基因转染A549-IFN-γ细胞：将A549-IFN-γ细胞铺入6孔培养板中，每孔用含7％胎牛和7％小牛血清的1640培养基培养，37℃，5％CO2培养24小时，铺入的细胞量为2-3×105个，细胞贴壁。将pIRESpuro-B7-1质粒与lipofectamine脂质体以1∶20(含2μg质粒40μl脂质体)的比例混合，加无血清的1640培养基至100μL，室温静止15-30分钟，形成DNA-l ipofectamine脂质体的混合物。将培养A549-IFN-γ细胞的细胞培养液去除，加入无血清1640培养液800μL，同时加入200μLDNA-lipofectamine脂质体的混合物，混匀，培养6小时后，吸掉上层液体，每孔加入5mL1640完全培养液过夜(10小时以上)，做细胞恢复。
(6)转基因阳性细胞筛选：每孔加入嘌呤霉素(puromycin)1mg/mL进行筛选。两周后筛选出具有嘌呤霉素抗性的转基因细胞株，即A549-IFN-γ-B7-1细胞株。
实施2、瘤苗的制备：
稳定表达的A549-IFN-γ-B7-1细胞株经1640全培养基扩增培养，收集对数生长的细胞，用无血清培养基洗细胞数次，计数，分装，使每0.2ml注射液中含A549-IFN-γ-B7-1细胞1×106，细胞因子GM-CSF 45单位，肿瘤细胞特异性抗原(S180裂解物)；Co60照射(100rad×50min)，得人肺腺癌通用瘤苗。实施例3、A549-IFN-γ细胞株IFN-γ基因表达的测定：
A549-IFN-γ细胞株基因表达的测定：用ELISA试剂盒分别测定A549细胞株和A549-IFN-γ细胞株IFN-γ总的表达量和细胞外的分泌量。取对数生长期的A549细胞株和A549-IFN-γ细胞株，1640无血清培养液洗三次，收集细胞，计数，每个细胞株分成2组，每组细胞浓度为1×106个细胞/mL。于37℃无血清培养中培养24小时，第1组冻融三次，离心，取上清液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ含量，即细胞IFN-γ总表达量；第2组取细胞外培养液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ含量，即IFN-γ向细胞外分泌的量。实验结果如表1所示。
表1.A549细胞株和A549-IFN-γ细胞株IFN-γ含量的测定*
| 细胞外分泌量 | 总表达量 | |
| A549-IFN-γ | 10pg/ml | 45pg/ml |
| A549 | - | - |
*为一式三份的平均数
实施例4、A549-IFN-γ-B7-1细胞株B7-1基因表达测定：
A549-IFN-γ-B7-1细胞株B7-1基因表达测定：分别收集1×104个A549细胞和A549-IFN-γ-B7-1细胞，采用间接免疫荧光法，用FITC标记的鼠抗人单克隆抗体，流式细胞仪测B7-1分子的表达变化。
表2.A549-IFN-γ-B7-1细胞株B7-1基因表达量的测定*
| 组 | 空白对照 | A549 | A549-IFN-γ-B7-1 |
| B7-1分子的表达(％Gated) | 1.47 | 11.6 | 78.5 |
*为一式三份的平均数
如表2结果可见，A549-IFN-γ-B7-1细胞B7-1分子表达为78.5％，是原A549细胞株B7-1分子表达(11.6％)的5.9倍。证明转染成功，并高表达B7-1蛋白。
实施例5、小鼠动物实验：
(1)动物抑瘤实验
NIH纯种小鼠购自浙江大学医学院动物中心(合格证：医动字22-9601018)，雄性，健康，体重为18-20g随机分为6组，每组10只。每组于第1d，6d，14d分别进行三次预防注射瘤苗0.2ml/只小鼠，于第15d接种S180，每只小鼠右前肢皮下接种0.5×104个S180肿瘤细胞/0.2ml生理盐水液。第21d和第28d进行两次治疗注射瘤苗0.2ml/只小鼠。在实验中设生理盐水为空白对照组，A549-IFN-γ-B7-1细胞、A549细胞为平行组。实验结果如表3所示。
表3.人肺腺癌通用瘤苗对小鼠S180的抑制作用与A549-IFN-γ-B7-1细胞、A549细胞作用的比较
注：IP为腹腔注射
实验结果显示接种转基因细胞(A549-IFN-γ-B7-1)的小鼠抑瘤率大于80％，添加GM-CSF后特异性肿瘤细胞裂解物的瘤苗抑瘤率可达100％。对照组生理盐水组和A549组抑瘤率为10％，这是因为小鼠因为注射的外界刺激引起了机体的免疫反应，增加了对肿瘤的抵抗力。
(2)MTT法观测接种瘤苗的小鼠淋巴细胞对肺癌细胞的特异杀伤作用
为进一步观察转基因疫苗特异性抗肿瘤作用，分别以A549、A549-IFN-γ、Hela为靶细胞，接种转基因疫苗的小鼠淋巴细胞为效应细胞，同时注射生理盐水的小鼠的淋巴细胞为对照组效应细胞。MTT法观测接种瘤苗的小鼠淋巴细胞对肺癌细胞的特异杀伤作用。
将A549细胞和A549-IFN-γ-B7-1细胞、Hela细胞以8×104个细胞/孔量接种于96孔板上，37℃培养24小时，作为靶细胞，实验小鼠(NIH)分别于第1d、4d、7d接种三次瘤苗，对照组小鼠注射生理盐水，分别于第15d、27d、45d取其脾脏，常规淋巴细胞分离法得效应细胞，将效应细胞加到上述三种靶细胞中，效靶比为10∶1，同时设效应细胞和靶细胞的空白对照。实验结果如表3所示。
表3转基因疫苗免疫小鼠淋巴细胞对不同的靶细胞杀伤性比较(15d)
注：-为空白对照；效应细胞SL-γ-B7-1为注射转基因细胞小鼠的淋巴细胞；SL-NC为注射生理盐水的对照组小鼠的淋巴细胞。实验结果如表4、表5所示。
表4转基因疫苗免疫小鼠淋巴细胞对不同的靶细胞杀伤性比较(27d)
注：-为空白对照；效应细胞SL-γ-B7-1为注射转基因细胞小鼠的淋巴细胞；SL-NC为注射生理盐水的对照组小鼠的淋巴细胞。
表5转基因疫苗免疫小鼠淋巴细胞对不同的靶细胞杀伤性比较(45d)
注：-为空白对照；效应细胞SL-γ-B7-1为注射转基因细胞小鼠的淋巴细胞；SL-NC为注射生理盐水的对照组小鼠的淋巴细胞。
结果发现，接种转基因疫苗的小鼠淋巴细胞不仅对A549、A549-IFN-γ-B7-1细胞有较强的特异杀伤，而对异种的Hela细胞也有一定的杀伤作用，杀伤率为14～17％，但其抑瘤作用比前两者为低，对此现象的解释是由于肿瘤细胞可能具有共同抗原，或是转基因疫苗引起的非特异抑瘤作用所致；实验中注射转基因瘤苗的小鼠15d(瘤苗免疫的8d)、27d(瘤苗免疫的20)、45d(瘤苗免疫的38d)淋巴细胞杀伤的结果显示杀伤率都大于60％，特异杀伤率较高，且三次无明显差别，表明转基因细胞疫苗确实能引起小鼠免疫系统对A549细胞的特异免疫杀伤；虽经过38天后其免疫能力并没有下降，提示该疫苗经三次注射免疫后，可在机体内诱导激发并维持较长时间的针对肺癌细胞的特异性强杀伤能力。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种多基因转染细胞株，其特征在于：该细胞株有人IFN-γ基因和人B7-1基因，所用转染细胞为人肺癌肿瘤细胞系A549。
2.一种多基因转染细胞株的制备方法，其特征依次包括以下步骤：
(1)将人IFN-γ基因双酶切装入pLXSN质粒中，经脂质体转染入A549细胞株，G418筛选得阳性克隆，得A549-IFN-γ细胞株；
(2)将人B7-1基因经双酶切装入pIRESpuro质粒，经脂质体转染入A549-IFN-γ细胞株，嘌呤霉素puromycin筛选得阳性克隆，得多基因转染细胞株A549-IFN-γ-B7-1。
3.根据权利要求2所述的多基因转染细胞株的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的人IFN-γ基因经EcoRI和BamHI酶切。
4.根据权利要求2所述的多基因转染细胞株的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的人B7-1基因经EcoRI和BamHI酶切。
5.一种瘤苗，其特征在于：它含有权利要求1或2所述的多基因转染细胞株。
6.一种权利要求5所述瘤苗的制备方法，其特征在于：将稳定表达的A549-IFN-γ-B7-1细胞株扩增培养，收集对数生长的细胞，用无血清培养基洗细胞数次，计数，分装，得注射液经Co60照射，得人肺腺癌通用瘤苗。
7.根据权利要求6所述的瘤苗的制备方法，其特征在于：扩增培养所用的培养基为1640全培养基。
8.根据权利要求6所述的瘤苗的制备方法，其特征在于：每0.2ml注射液中含细胞因子GM-CSF 45单位。
9.根据权利要求6所述的瘤苗的制备方法，其特征在于：Co60照射为100rad×50min。
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