CN1704472A - 重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法 - Google Patents
重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1704472A CN1704472A CN 200410019473 CN200410019473A CN1704472A CN 1704472 A CN1704472 A CN 1704472A CN 200410019473 CN200410019473 CN 200410019473 CN 200410019473 A CN200410019473 A CN 200410019473A CN 1704472 A CN1704472 A CN 1704472A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- preparation
- vaccine
- pyl
- bcg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法，属于基因工程技术，菌种保藏号：CGMCC No.1120。本发明首先进行hB7－2(IgC+IgV)片段聚合酶链反应并建立质粒pYL－hB7－2；经质粒转化，E.Coli－pYL－hB7－2单克隆菌落扩增、质粒提取和纯化；电泳、酶切及PCR反应鉴定pYL－hB7－2质粒：卡介苗的电转化，rBCG－hB7－2单克隆菌落的挑选、扩增、鉴定。本发明与野生型卡介苗相比，在达到同样的甚至增加免疫效果的条件下，卡介苗用量降低，从而降低毒副作用；避免了直接使用细胞因子带来的高额费用和反复灌注的缺点；能在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。一次接种可获得强而持久的抗肿瘤免疫。本发明可望为膀胱肿瘤临床治疗提供一种新型制剂。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术，具体是一种重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法。
背景技术
卡介苗(BCG)是一种毒力强的牛型分枝杆菌减毒形成的生物免疫调节剂，具有高度的安全性和极少的严重并发症，全世界广泛用于预防结核病。
膀胱内灌注野生型卡介苗在预防肿瘤复发、治疗残余肿瘤和原位癌等方面已经取得令人满意的临床疗效，但仍有30-45％的病人对腔内卡介苗灌注治疗无反应，此外，腔内卡介苗灌注可引起膀胱局部和全身反应，5％患者可出现严重并发症，0.5％甚至可危及生命，使其预防和治疗浅表膀胱肿瘤受到一定限制。
中国专利1353183公开了“一种重组卡介苗菌株建立及其应用”，该发明通过构建一种携带有两种外源基因即IL-2基因和GFP基因的rBCG，使原有的BCG具有IL-2和GFP的功能，可利用这种rBCG-GFP-IL-2菌株研究BCG或重组BCG的作用原理，同时用猪苓多糖弥补生物制剂的不足，从而建立一种有效消除肿瘤细胞的方法。该发明的技术特征是利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，在穿梭质粒中插入IL-2基因片段，构成复合表达绿色荧光蛋白和白介素2重组BCG(rBCG-GFP-IL-2)菌株。
目前国际国内有将其它细胞因子的基因转入BCG的研究，但尚无采用共刺激分子形成双重刺激信号进行治疗的卡介苗菌株。
发明内容
本发明是为了解决部分膀胱肿瘤病人对膀胱内灌注野生型卡介苗治疗无反应，及野生型卡介苗对部分病人产生严重的毒副反应，而提供一种高效，低副作用，免疫预防及治疗专用的基因重组卡介苗菌株，即重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法
本发明的理论依据：机体对肿瘤的免疫应答主要由T淋巴细胞介导，后者的活化和增殖需两个信号：抗原特异性第一信号和由共刺激分子介导的非抗原特异性的第二信号。缺乏共刺激信号的刺激可导致T细胞免疫耐受或引起活化诱导的T细胞死亡。共刺激因子包括B淋巴细胞激活抗原B7分子等，B7分子是其中最重要的一种，在大多数肿瘤中不表达或弱表达，这是引起肿瘤逃避的重要原因之一。
因此研究一种高效，低副作用，免疫预防与治疗专用的基因重组卡介苗菌苗已成为基础与临床研究的重大课题。重组卡介苗是将卡介苗作为工程菌，利用基因工程技术将外源基因导入卡介苗中，依靠卡介苗在宿主内复制，表达外源抗原，以诱导对多种疾病的特异性体液和细胞免疫。
本发明是按以下技术方案实现的。
一种重组人共刺激分子卡介苗菌株，其表达人共刺激分子B7-2的大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体，在卡介苗中表达，得到具有分泌活性共刺激分子B7-2功能的重组卡介苗菌株rBCG-hB7-2。
一种重组人共刺激分子卡介苗菌株的制备方法，其重构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒，用电穿孔法将重组质粒转化卡介苗。
所述的制备方法，其hB7-2(IgC+IgV)片段聚合酶链反应(PCR)是采用上游引物5′-gctcctctgaagattc-3′、下游引物5′-agctgtaatccaaggaatg-3′。
所述的制备方法，质粒pYL-hB7-2的建立为pYL-hIFN-α-2B质粒与hB7-2(IgC+IgV)聚合酶链反应(PCR)产物用BamHI和XhoI酶切后连接。
所述的制备方法，其质粒的转化是每管加入感受态细菌，加入pYL-hB7-2质粒，混合后转化，接种到卡那霉素的LB固体培养基上，选择阳性菌落。
所述的制备方法，其单克隆菌落的扩增是挑取单克隆菌落，将其接种到卡那霉素的LB液体培养基中，质粒提取试剂盒提取质粒。
所述的制备方法，其卡介苗的电转化：取卡介苗菌液冰浴后离心、弃上清；预冷甘油洗涤沉淀二次；将质粒DNA溶于液体，然后将感受态卡介苗菌液倒入，充分混合后电转化，再涂布到含卡那霉素的7H10固体培养皿上，3～4周后选取卡那霉素阳性菌落。
所述的制备方法，其rBCG-hB7-2阳性菌落的挑选、扩增及PCR反应产物测序正确，重组卡介苗表达产物经酶联免疫吸附法(ELISA)和淋巴细胞增殖实验验证。
这样制备的重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法，其菌种保藏号：CGMCC No.1120。
本发明的重组卡介苗与野生型卡介苗相比，①由于重组卡介苗能够分泌细胞因子，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下可较野生型卡介苗降低用量，从而降低了毒副作用；②重组卡介苗能够分泌细胞因子避免了直接使用细胞因子带来的高额费用和反复灌注的缺点；③重组卡介苗能够在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。
这种基因工程卡介苗菌株与分枝杆菌佐剂加病原体抗原配制的混合疫苗相比，rBCG集佐剂和载体于一身，兼多种外源基因与活菌株于一体，一次接种可获得强而持久的抗肿瘤免疫。卡介苗菌株rBCG-hB7-2较以前的野生型疫苗具有高效低毒副作用的优点。
本发明结合卡介苗和共刺激分子两者在膀胱癌免疫治疗中的优势：(1)卡介苗：增强肿瘤细胞免疫原性，引诱淋巴细胞等免疫细胞，产生细胞因子。(2)B7：提供共刺激信号，激活淋巴细胞、NK细胞，杀伤肿瘤细胞。这样重组的治疗用卡介苗菌株可以加强第一信号，并同时提供共刺激信号，双重作用可以达到降低卡介苗用量而减少毒副作用，并能明显提高治疗效果的目的。
附图说明
附图为重组PLY-hB7-2质粒图。
图中1hB7-2基因功能区序列、2卡那霉素抗性基因、3大肠杆菌复制起点、4分支杆菌复制起点、5热休克蛋白60启动子、6信号序列。
具体实施方式
一.材料
(一)菌株：大肠杆菌为DH5α，本所保存。卡介苗购自北京生物制品研究所，丹麦I型。
(二)质粒：载体质粒pYL-hIFN-α-2B质粒由美国IOWA大学YI LUO教授提供。含hB7-2cDNA的huB7-2(IgV+C)/pGEX-4T-3质粒由西安医科大学来宝长老师提供。
(三)主要仪器设备
1.酶标仪：SUNRISE TECAN A-5082奥地利
2.恒温培养箱及台式离心机：
3.低温高速离心机：BECKMAN J2-HS美国
4.PCR仪：PERKIN ELEMER GeneAmp PCR System 2400美国
5.电转仪：Genepulser Electroprotocol，美国
(四)主要试剂及溶液配制
1.胶回收试剂盒：E.Z.N.A Gel Extraction Kit
2.纯化试剂盒：TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0
3.质粒提取试剂盒：E.Z.N.A Plasmid Midiprep Kit
4.酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒：ELISA for s-hCD86 DIACLONE公司
5.培养基：Middlebrook 7H9 Broth DIFCO公司美国
Middlebrook 7H10 Agar DIFCO公司美国
6.T4DNA Lingase、BamHI、XhoI、Taq酶、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000均购自TaKaRa公司
7.Tween-80：0442-500ml AMRESCO分装
8.牛血清白蛋白：购自中国医学科学院血研所科技公司
二.方法
(一)hB7-2(IgC+IgV)片段PCR反应：
1.上游引物：5’-gctcctctgaagattc-3’
下游引物：5’-agctgtaatccaaggaatg-3’，50μmol/l。
2.模板质粒：hB7-2(IgV+C)/pGEX-4T-3约100μg/ml，PCR反应体系反应总体积50μl，反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，57℃退火50秒，72℃延伸50秒，最后一次72℃延伸7分钟，共30个循环。
(二)质粒pYL-hB7-2的建立：
1.pYL-hIFN-α-2B质粒与hB7-2(IgC+IgV)PCR产物用BamHI和XhoI酶37摄氏度过夜，电泳后E.Z.N.A胶回收试剂盒按说明回收DNA。
2.连接：
| 10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μl酶切后hB7-2(IgC+IgV) 0.3pmol酶切后pYL-hIFN-α-2B质粒 0.03pmolT4DNA Ligase 1μl加水到25μl |
16℃水浴中过夜连接，加入2.5μl的3M NaAC，加入62.5μl的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟，离心回收沉淀，用70％冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥。25～50μl双蒸消毒水溶解，取10～20μl即可转化到100μl感受态大肠杆菌中。
(三)质粒的转化：
1.每管加入100μl感受态细菌，加入1μl pYL-hB7-2质粒，充分混合，冰浴30分钟。
2.将样品置于42℃热休克45秒，以增加表达载体转化率。
3.再次冰浴5分钟，每管加入0.9ml 42℃LB培养基，混匀。
4.在37℃水浴培养1小时30分钟。
5.将200μl转化后样品接种到含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃孵育24～48小时。选择阳性菌落。
(四)E.Coli-pYL-hB7-2单克隆菌落的扩增、质粒提取和纯化：
1.单克隆菌落的扩增。
挑取单克隆菌落，将其接种到10ml含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm振荡培养10小时。
2.E.Z.N.A Plasmid Midiprep Kit质粒提取试剂盒提取质粒，按试剂盒说明提取质粒，500μl高纯水重悬DNA。水的体积依实验中DNA浓度而定。
(五)电泳、酶切及PCR鉴定pYL-hB7-2质粒：
pYL-B7-2的PCR及测序引物：
上游-5’----ATCTTACCCATACGACGTCC----3’
下游-5’-----GTTAACTACGTCGACATCG---3’
1.PCR反应体系：反应总体积50μl；PCR反应体系反应总体积50μl，反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，57℃退火50秒，72℃延伸50秒，最后一次72℃延伸7分钟，共30个循环。1％琼脂糖电泳，观察结果位置正确。
2.测序：将上述构建的pYL-B7-2质粒扩增后电泳，切胶纯化回收。上述引物送TaKaRa公司进行测序。
(六)卡介苗的电转化：
1.取卡介苗菌液(600nm处OD值为0.5左右)50ml，冰浴1.5小时后4000rpm离心10分钟。
2.弃上清，10％4℃预冷甘油20ml洗涤沉淀二次。
3.准备：将5-15μg质粒DNA(溶于10-20μl液体)置于1.5ml管中。然后将100μl感受态卡介苗菌液倒入，使总体积不超过150μl，充分混合。加入到0.1cm的电转杯中。
4.电转条件：电压1.8KV，电容25μF，电阻100Ω，0.1cm电转杯。
5.电转后处理：电转后迅速将1ml不合卡那霉素的7H9培养基加入到电转杯中。混匀后转入7ml试管，180rpm振荡培养5小时。取200ul上述培养液涂布到含30ug/ml卡那霉素的7H10固体培养皿上，封口膜严密封好培养皿，3～4周后选取阳性菌落。
(七)rBCG-hB7-2单克隆菌落的挑选、扩增及聚合酶链反应(PCR)模板的制备：
1.调取单个菌落接种到含有30μg/ml卡那霉素的10ml 7H9液体培养基中，150rpm，37℃振荡培养。
2.当600nm处OD值为1.0左右时，取1ml菌液，10000rpm离心10分钟。
3.去上清，用双蒸水洗涤沉淀三遍，离心去上清，在沉淀物中加入30μl双蒸水，混匀，煮沸10分钟。
4.10000rpm离心10分钟后，取上清液2μl作为模板进行PCR反应。
(八)rBCG-hB7-2阳性菌落的鉴定：
pYL-B7-2的PCR及测序引物：
上游-5’----ATCTTACCCATACGACGTCC----3’
下游-5’-----GTTAACTACGTCGACATCG---3’
1.聚合酶链反应(PCR)反应：反应总体积50μl；PCR反应体系反应总体积50μl，反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，57℃退火50秒，72℃延伸50秒，最后一次72℃延伸7分钟，共30个循环。1％琼脂糖电泳，观察结果位置正确。
2.测序：
将上述PCR产物电泳，切胶纯化回收，测其含量后制作测序模板，送TaKaRa公司进行测序。。
(九)rBCG-hB7-2表达产物的鉴定
1.酶连免疫吸附法(ELISA)测定：
取出1ml上述经鉴定的重组rBCG-hB7-2菌液，10000rpm离心10分钟。取上清液作为分泌到细菌外表达hB7-2产物含量测定的样品。将上述离心后菌液的沉淀用双蒸水洗涤三遍，离心后在沉淀物中加入100ul双蒸水，混匀后超声破碎。破碎后10000rpm离心10分钟，取其上清液作为细菌内样品，测定hB7-2含量。
ELISA测定方法：取上述样品100μl，加到已包被抗体的96孔板中，按试剂盒说明操作，490nm处测定。每号标本取三份。每份样品测两孔。根据标准曲线计算出样品含量，取平均值作为最终结果。细菌内外样品含量分别为10.5和3.8U/ml。
2.淋巴细胞增殖实验：
提取健康人外周血，用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞，用野生型卡介苗作为第一信号，以野生型卡介苗上清液为对照，上述rBCG-hB7-2上清液为实验组，与淋巴细胞混合培养72小时后进行MTT法检测，490nm处测量吸光度。淋巴细胞增殖指数平均为3.5。
pYL-B72测序结果：
atggctcctctgaagattcaagcttatttcaatgagactgcagacctgccatgccaatttgc
aaactctcaaaaccaaagcctgagtgagctagtagtattttggcaggaccaggaaaacttgg
ttctgaatgaggtatacttaggcaaagagaaatttgacagtgttcattccaagtatatgggc
cgcacaagttttgattcggacagttggaccctgagacttcacaatcttcagatcaaggacaa
gggcttgtatcaatgtatcatccatcacaaaaagcccacaggaatgattcgcatccaccaga
tgaattctgaactgtcagtgcttgctaacttcagtcaacctgaaatagtaccaatttctaat
ataacagaaaatgtgtacataaatttgacctgctcatctatacacggttacccagaacctaa
gaagatgagtgttttgctaagaaccaagaattcaactatcgagtatgatggtattatgcaga
aatctcaagataatgtcacagaactgtacgacgtttccatcagcttgtctgtttcattccct
gatgttacgagcaatatgaccatcttctgtattctggaaactgacaagacgcggcttttatc
ttcacctttctctatagagcttgaggaccctcagcctcccccagaccacattccttggatta
cagcttag
Claims (8)
1.一种重组人共刺激分子卡介苗菌株，其特征在于表达人共刺激分子B7-2的大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体，在卡介苗中表达，得到具有分泌活性共刺激分子B7-2功能的重组卡介苗菌株rBCG-hB7-2。
2.一种重组人共刺激分子卡介苗菌株的制备方法，其特征在于重构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒，用电穿孔法将重组质粒转化卡介苗。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于hB7-2(IgC+IgV)片段聚合酶链反应(PCR)是采用上游引物5’-gctcctctgaagattc-3’、下游引物5’-agctgtaatccaaggaatg-3’。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于质粒pYL-hB7-2的建立为pYL-hIFN-α-2B质粒与hB7-2(IgC+IgV)聚合酶链反应(PCR)产物用BamH I和Xho I酶切后连接。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于质粒的转化是每管加入感受态细菌，加入pYL-hB7-2质粒，混合后转化，接种到卡那霉素的LB固体培养基上，选择阳性菌落。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于单克隆菌落的扩增是挑取单克隆菌落，将其接种到卡那霉素的LB液体培养基中，质粒提取试剂盒提取质粒。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于卡介苗的电转化： 取卡介苗菌液冰浴后离心、弃上清；预冷甘油洗涤沉淀二次；将质粒DNA溶于液体，然后将感受态卡介苗菌液倒入，充分混合后电转化，再涂布到含卡那霉素的7H10固体培养皿上，3～4周后选取卡那霉素阳性菌落。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于rBCG-hB7-2阳性菌落的挑选、扩增及聚合酶链反应产物测序正确，重组卡介苗表达产物经ELISA和淋巴细胞增殖实验验证。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100194732A CN100352512C (zh) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | 重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100194732A CN100352512C (zh) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | 重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1704472A true CN1704472A (zh) | 2005-12-07 |
| CN100352512C CN100352512C (zh) | 2007-12-05 |
Family
ID=35576451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100194732A Expired - Lifetime CN100352512C (zh) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | 重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100352512C (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100406564C (zh) * | 2006-02-28 | 2008-07-30 | 浙江大学 | 多基因转染肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法 |
| CN101793837B (zh) * | 2009-02-04 | 2012-06-06 | 中国科学院电子学研究所 | 卡介苗活菌数快速检测的仪表装置及方法 |
-
2004
- 2004-06-04 CN CNB2004100194732A patent/CN100352512C/zh not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100406564C (zh) * | 2006-02-28 | 2008-07-30 | 浙江大学 | 多基因转染肿瘤细胞株及其瘤苗的制备方法 |
| CN101793837B (zh) * | 2009-02-04 | 2012-06-06 | 中国科学院电子学研究所 | 卡介苗活菌数快速检测的仪表装置及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100352512C (zh) | 2007-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116396974B (zh) | 非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用 | |
| CN101063142A (zh) | 人乳头瘤病毒16型dna疫苗和基因佐剂及其应用 | |
| CN103012577B (zh) | 一种重组猪白细胞介素4及其编码基因和表达方法 | |
| CN1704472A (zh) | 重组人共刺激分子卡介苗菌株及其制备方法 | |
| CN1597931A (zh) | 重组干扰素卡介苗菌株及其制备方法 | |
| CN103012578B (zh) | 一种重组猪白细胞介素2及其编码基因和表达方法 | |
| CN103232544A (zh) | 一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
| CN101061136A (zh) | 具有白介素－2中和能力的免疫治疗制剂 | |
| CN101049508A (zh) | 携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗 | |
| CN1100881C (zh) | 人、猪共患囊虫病核酸疫苗 | |
| CN1255542C (zh) | 融合型幽门螺杆菌粘附素基因工程疫苗的制备方法 | |
| CN113304254A (zh) | 一种微小隐孢子虫Cp15重组侵入型乳酸菌活载体疫苗 | |
| CN1944644A (zh) | HIV－1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法 | |
| CN101045923A (zh) | 生产一种白细胞介素类似物的方法 | |
| CN105176897A (zh) | 一种表达GnRH/M2融合多肽的重组工程菌株及其构建和应用 | |
| CN1954886A (zh) | 新型猪白细胞介素2和6基因表达质粒抗感染制剂的应用技术 | |
| CN100335628C (zh) | 分泌人干扰素－α2a的重组卡介苗及其构建方法 | |
| CN1238506C (zh) | 用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA基因工程重组体 | |
| CN1185261C (zh) | 白细胞介素－2/粒细胞－巨噬细胞集落剌激因子融合蛋白 | |
| CN1116411C (zh) | 转人血管抑素(Angiostatin)基因藻的制备方法 | |
| CN1163609C (zh) | 表达载体pBVIL1及其构建方法和用途 | |
| CN1654474A (zh) | 重组幽门螺杆菌热休克蛋白60 | |
| CN1232643C (zh) | 一种核酸疫苗 | |
| CN1216911C (zh) | 重组人白细胞介素－4，其编码核酸及其应用 | |
| CN1710072A (zh) | 分泌人白介素－2的重组卡介苗及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |