CN1100881C - 人、猪共患囊虫病核酸疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，是一种人、猪共患囊虫病的预防及治疗性核酸疫苗。它是由猪带绦虫囊尾蚴的三种保护性抗原基因(cC1、cC3、cC4)组成的融合转录表达单元，与相关细胞因子[猪γ干扰素(IFN-γ)和猪白细胞介素5(IL-5)]基因的共表达单元共同组成的真核生物表达质粒。本核酸疫苗的生产纯化工艺十分简便，理化性质稳定，便于储存和运输，对人、猪共患囊虫病具有有效的免疫保护作用。

Description

人、猪共患囊虫病核酸疫苗

本发明涉及生物技术领域，是一种人、猪共患囊虫病核酸疫苗，特别是由猪带绦虫囊尾蚴保护性抗原基因以及相关细胞因子基因组成的真核生物表达质粒作为具有预防及治疗人、猪共患囊虫病功能的核酸疫苗。

猪带绦虫囊虫病是我国主要的人畜共患病之一，在我国大部分省、市、自治区有着广泛流行区域，特别在华北、东北、西北地区流行十分严重。不仅对养猪业造成了巨大的经济损失，而且直接威胁着广大人民群众的身体健康。由于猪带绦虫及其囊尾蚴的体积较大、结构复杂、生活史伴有宿主转换、体内移行、发育阶段高度变态以及寄生部位多变等特点，决定了宿主的免疫应答相应表现为极其复杂的连锁过程，给囊虫病的预防带来了很大困难。有关囊虫病的免疫保护性研究，目前国内尚未见有意义的报道，国际上仅报道从虫体中提取粗抗原，分离其中一种或几种抗原成分，免疫动物后可检测到一定程度的体液免疫反应(Evans-CA，et al.Immunotherapy for porcine cysticercosis：implications for prevention of human disease.Cysticercosis working Group in Peru.Am-J-Trop-Med-Hyg 1997；56(1)：33-7.Molinari-JL，et al.Field trial for reducing porcine Teania solium cystcercosis in Mexico bv systematic vaccination ofpigs.Vet-Parasitol 1997；69(1-2)：55-63.)，但由于其成分复杂，交叉反应严重且抗原量少，其诊断及预防价值均十分有限。虽然，利用基因工程技术可获得大量的高纯度的亚单位疫苗，并可诱发被免疫动物较强的体液反应(Johnson-KS，et al.Vaccination against ovine cysticercosisusing a defined reconmbinant antigen.Nature 1989；338(6216)：585-7.)，但是，蛋白纯化工艺十分复杂，成本较高，且对单一抗原的体液免疫应答仍难以对复杂的囊虫感染产生十分有效的保护作用。

核酸疫苗作为继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗，正在成为一个新的研究热点。其基本过程是把抗原基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA通过某种方式导入动物体内，使外源抗原基因在活体内表达，激活机体免疫系统、诱发免疫应答反应。其优点是：(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答；(2)能针对多种抗原构建多价疫苗进行多级免疫，使免疫保护更全面；(3)安全性好；(4)免疫保护效果长；(5)生产简便、成本低廉、稳定性好且贮运方便。虽然有学者报道用肥头绦虫的某一抗原基因构建了核酸疫苗(Gabriela Rosas，et al.J.Parasitol.84(3)，p516-523，1998)，但未见人、猪共患猪带绦虫囊虫病核酸疫苗的研究报道。

本发明的目的是提供一种具有广谱、长效、简便、全方位诱导免疫反应等特点的囊虫病核酸疫苗。

本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pcDNA3(购自Invitrogen公司，其序列和物理图谱见该公司的产品目录)；构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用的宿主菌为DH10B(购自GIBCO公司)；插入的外源基因为：猪带绦虫囊尾蚴的三种保护性抗原基因(cC1、cC3、cC4)、细胞因子基因猪γ干扰素(IFN-γ)和猪白细胞介素5(IL-5)，其基因结构分述如下：

(1)猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC1

   a)序列特征：

     长度：1300bp

     类型：核酸

     链数：双链

     几何结构：线性

   b)分子类型：cDNA

   c)来源：猪带绦虫囊尾蚴

   d)序列描述：SEQ ID NO：cC11 GAATTCGAGG ATCCGGGTAC C ATGGCCTAC TGTCGCTCCC TGGTTCATCT ATATGCCCCC61 AATGGAGAGA AGTACAAACC GACTATTACC CCAACACCCG GGTTCTCACC GACCGCTGAT121 GCTGAGCACT TGAAGCGTGC AATGCGAGGA CTTGGCACGA ATGAACGTGC GATCATTGAC181 ATTCTTGGAA ACCGAACTTC AGCCGAAAGA ATGGCCATTC GTGACGCCTA TCCGTCGATT241 TCCAGCAAGA CCCTGCACGA TGCTCTAACC AGCGAGCTGA GTGGCAAGTT CCGGAGGTTC301 GCCTTGTTGC TAATCCAATC ACCGTGGCAG GTGATGGCAG AGGCTCTTTA CGACGCCATG361 AAGGGGGCTG GCACTAAGGA ACGCGTACTC AATGAAATTA TTGCCGGGTG TTCAAAGGAT421 GACATCCCTC AGTTGAAAAA AGCTTTTGAA GAAGTGAGCG GAGGAGAAAC CCTTGATGAT481 GCGATCAAGG GGGACACGAG TGGCGACTAC CGCGAGGCCC TTCTGCTAGC GCTCGCCGGT541 CAGGCTGATG AACCACAGGC GATGCAACTC AAAAACCTAA CACCCTCCAC TCTCAGTCAG601 GTTGTGAATC CCGGCCTTGC TGAAACGGAT GCGAAGGAGC TGTACGCCTG CGGTGAGGGG661 CGCCCGGGCA CAGCAGAGAG TCGTTTCATG CGTCCTATCG TCAATCGCTC ATTCCTTCAA721 TTAAACGCAA CGAATGAGGC TTACAATCGG GCCTACGGTC ACCCGTTGAT TGATGCAATA781 AAGAAGGAGA CGTCGAGAGA CCTTGAGGAC TTTCTCATAA CTAGAGTTCG CTACGCCACT841 GATCGCGCCA GTCTGTTTGC CGAACTCCTT CACTTTGCCA TGAGAGGAGC TGGCACCAAG901 GACTCCACTT TGCAACGTGT TCTTGCCTTG AGGGCTGATA CTGATCTAGG AAGCATCAAG961 GAGAAGTATG CGGAGCTCTA TGGTGAAACC TTGGAAGCGG CAATCAAGGG TGATACTTCT1021 GGTGACTATG AGGCTCTCTG CTTGAAACTC ATCGGCCCTG CATAACTGCA GTGGTGACAA1081 ATTGGTTCCC ACATGCTGGT TAAAGTTCTC CACCTCCTCC TACATCATCT CGTGGTTTTA1141 ATTTCGACTT TTCTGCAGCA CAAATTCCTC GATTAACTCC TTTCTCTGTT CTTCGTCAGT1201 TTGTGGAAGG TTAAACTTGA TGATGAAATT CACTCCAATA AAAATAATGC ACACTTACGT1261 ACTGAGTGTG AGTGCGCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

(2)猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC3

   a)序列特征：

     长度：694bp

     类型：核酸

     链数：双链

     几何结构：线性

   b)分子类型：cDNA

   c)来源：猪带绦虫囊尾蚴

   d)序列描述：SEQ ID NO：cC31 GGCTTGGCGG GTTCACTAGC CGTACTCCTT TCGTTACCTC ACCCTAATCA TCAAA ATGAA61 TATGATCCGT CAAAATTTCC ACGATGAATG CGAAGTGGGC ATCAATCGTC AAATTAACAT121 GGAGCTCTAC GCCAGCTACC TCTACCTAGC TATGTCTCAA CACTTTGACC GGGAAGACGT181 CGCCCTTCCA GGCTTCAAGA AATTTTTTGC CAAGGCCTCG GAAGAGGAGC GTGAACACGC241 GATAAAGCTC ATGTGTTATC AATGTAAACG TGGTGGCCGC ATTGTCTATC AAGACATTGC301 CAAACCCCAG AAAAGTGAAT GGGCAACCGG TCTGGAAGCC ATGGAAACGG CGCTCAAAAT361 CGAGCGAGAG GTCAATGAGT CCCTCCTTGC TTTGTGTGAT GTCGCTGTCA AACACAGCGA421 CAACCATTTC TCTGATTTCT TGGAAAATGA ATACTTGGGA GAACAAGTAG ACGCTATTAA481 GCAGTTGGCA GACTATGTGA CAAACCTCCG TCGATGCGGA CCCGGACTGG GAGAGTATCT541 ATTTGACAAG GAAACCCTTA ACGGTGGTGA GGACTAAAAA AACCAGCTGT GCTCGGGGCA601 ATTTTTTGTT CCTTTCTCTT TGCCATGTTG TGATTTACAA AAACTATTCA CAATTATGAC661 TAATCTTTAC CAAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAA

(3)猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC4

   a)序列特征：

     长度：1776bp

     类型：核酸

     链数：双链

     几何结构：线性

   b)分子类型：cDNA

   c)来源：猪带绦虫囊尾蚴

   d)序列描述：SEQ ID NO：cC41 CCTACTGGAG  ATGAAAGGCA TATCTGGCCC ACTAGTTTTA GCAATCTTCA CGACATGTTT61 TGGCTCATCA TTTCTCTTGG GCTACAACCT GGGCGTCGCA AATCTGCCTG GAGATAACAT121 CAAGAAATTT CTGGTTAACT ACTACAAGCC GGACAACTCA TCTGCTTTGA ATGCCAACTT181 CCTCTACGGA CAGGTAACCT CCGTGCTGGT CATCTGTGCC GCCATTGCAG CCTTCACGTG241 TGGTTGGGTT GCTGACGGCC TGGGCAGAAA GCGCAGTCTG ATGGTGAACA ACGGCATTGG301 CATTGTGGGA TCAGTAATCT CCTCTGTGTG TGTGGTGGCA AATCAGCCTG CTTTGCTGTA361 TGTGGGACGT GCGATCAGTG GTCTGAACAG CGGTCTGAGC ATTGGCATCG CAGCGATGTT421 CCTCACGGAG ATTGCGCCAC GCCATCTGCG GGGCATGATT GGAGCCTGCA ACCAACTGGC481 TATCACCATC GGCATTGTCA TCTCCTACGT GCTCACGCTG TCGCACCTTC TGAACACACC541 TACCCTCTGG CCAGTCGCCA TGGGCGTCGG CGCCATTCCT GCTGTGATCG CTCTCATCAT 601 TTCCCCCTTC ACCGTTGAGT CGCCGCGTTG GCTCTACCTC AAGAAGAAGG ATGAGAAAGC661 TGCGCGCGAA GCCTTCGCTC GCATCAATGG CTCCGAGAAT GTGGATATGT TCATCGCCGA721 GATGCGTGAA GAGCTAGAGG TAGCCCAGAA CCAACCAGAG TTCAAATTTA CTGAGCTCTT781 CCGTCGCAGA GATCTTCGCA TGCCTGTCAT CATAGCGGTT CTCATTCAAG TCATGCAGCA841 ACTCTCAGGA ATTAATGCTG TGGTTGCGAA TTCCTCGGAG ATGTTGAAAA GTGCCAAGGT901 GTCGCCAGAC ATGCTGGAGT ACTTTGTGGT AGGTCTGGGC CTGCTCAACG TCATCTGCAC961 AATCGTGGCG CTGCCGCTGC TGGAAAAGGC GGGTCGGCGC ACCCTTCTGT TATGGCCTTC1021 CCTCGTAGTG GCAATAATAC TGCTGCTTCT GGTGATCTTC GTCAATATCG CCAACTACGG1081 AGGCGTCGTA AACAAGACGC CCTTCGTTCT CGTTTCTGCC GTCCTCGTCT TCATTTATGT1141 CGCCGCTTTC GCCATGGGTC TTGGCCCAAT GCCTGCGCTC ATCGTCGCCG AAATCTTCCG1201 TCAGGGTCCT CGCGCCGCCG CCTATTCCCT CAGTCAAAGC ATTCAGTGGG CCTGCAATCT1261 CATTGTCGTA GCCTCATTTC CTTCGCTCAA CGAGCTATTA AAGGGCTACG TTTATCTGCC1321 GTATCTGGTT GTGGTGGCAG TTTGCTGGGT GGTATTCTTC CTCTTCATGC CGGAGACAAA1381 GAATCGCACC TTTGATGAGG TGGCACGGGA TCTGGCCTTC GGGAGCATCG TGGTGGGTAA1441 ACGCACTGCG GCGCTACAAG CTCCCGTCTT CACCAAGGAG GACGAGGAGG CCGCTACCGC1501 CCTCCGCCGC AGCGACGAAG AGGACGCCAA GGTCGACGCC TAGACTACTC TCTTCACTTT1561 TCCCCCCTTC CTCATCTCTT CATAAAGTGC TGCACTCCCT CCTGTTGTTT GTGTCTCCGT1621 TTTCCCCCAT TCACGCATTC ACTTGCCTTC CATCTCTTTT TACTCAACCT CCGTAGACAA1681 GGTTACTGCG AGGCCAACTC TTCCCTCTCC ATTCTTCCTA TAGATGCGGA AGGTCAGTCA1741 GGATTTCACC ATAGTTTTTG ATGATGAAAA AAAAAA

(4)猪γ干扰素基因(IFN-γ)

   a)序列特征：

     长度：626bp

     类型：核酸

     链数：双链

     几何结构：线性

   b)分子类型：cDNA

   c)来源：猪外周血B细胞

   d)序列描述：SEQ ID NO：IFN-γ1 CTGCAGGTCA ACGGATCATC TTCAGATCAG CTATTGCAGA AGAAAGGTCA GCCAAGCGCT61 CTGGGCCTGA TCGACTGTAT ATAGGAGCTT CTGATTTCAA CCAGAAGCTA ACTCTCTCCG121 AAACAATGAG TTATACAACT TATTTCTTAG CTTTTCAGCT TTGCGTGACT TTGTGTTTTT181 CTGGCTCTTA CTGCCAGGCG CCCTTTTTTA AAGAAATAAC GATCCTAAAG GACTATTTTA241 ATGCAAGTAC CTCAGATGTA CCTAATGGTG GACCTCTTTT CTTAGAAATT TTGAAGAATT301 GGAAAGAGGA GAGTGACAAA AAAATAATTC AGAGCCAAAT TGTCTCCTTC TACTTCAAAT361 TCTTTGAAAT CTTCAAAGAT AACCAGGCCA TTCAAAGGAG CATGGATGTG ATCAAGCAAG421 ACATGTTTCA GAGGTTCCTA AATGGTAGCT CTGGGAAACT GAATGACTTC GAAAAGCTGA481 TTAAAATTCC GGTAGATAAT CTGCAGATCC AGCGCAAAGC CATCAGTGAA CTCATCAAAG541 TGATGAATGA TCTGTCACCA AGATCTAACC TAAGAAAGCG GAAGAGAAGT CAGACTATGT601 TCCAAGGCCA GAGAGCATCA AAATAA

(5)猪白细胞介素5基因(IL-5)

   a)序列特征：

     长度：838bp

     类型：核酸

     链数：双链

     几何结构：线性

   b)分子类型：cDNA

   c)来源：猪外周血B细胞

   d)序列描述：SEQ ID NO：IL-51 ATGCACTTTC TTTGCCCAAA GCAAACACTG AGCATTTGAG AGCCATGAGA ATGCTTCTGC61 ATTTGAGTTT GCTAGCTCTT GGGGCTGCCT ATGTTTCTGC CATTGCTGTA CAAAGTCCCA121 TGAATAGGCT GGTGGCAGAG ACCTTGGCAC TGCTCTCCAC TCATCGAACT CTACTGATAG181 GCGACGGGAA CCTGATGATT CCTACTCCTG AACATAACAA TCACCAACTG TGCATTGAAG241 AAGTCTTTCA GGGTATAGAC ACATTAAAGA ATCGCACTGT GCCGGGGGAT GCTGTGGAAA301 AGCTTTTCCG AAACTTGTCT TTAATAAAAG AACACATAGA CCGCCAAAAA AAAAAGTGTG361 GAGGAGAAAG ATGGAGAGTA AAAAAGTTCC TAGACTACCT GCAAGTGTTT CTTGGTGTAA421 TAAACACTGA GTGGACAATG GAAAGTTGAG ATGAAACTGG GTTATTGCAG TGAAAGATTC481 TGTAGGAGAA GAAGAATGTT ATTTTTTGCA ATGAGAATGA GGCCCAACCA AGGGTCAGTG541 TAATTAAACT TCAGATGCAA AGCAATTTTT CAGGCATACT GCTACTTTGC TGCTCACATA601 GGCAGAAAGG ATAAAAATAA AATATTTGAG ATATATTTCA GATATCAGAA TCATCGAAGT661 CTTTTCCTCC AGTGTGCTCC AGGCAAAATA AATATGTACT TCAATCTTAT TTAACACAAC721 ATTCTGTAAA ATGTCTATTA ACTTAATATT TATGTATGAA ATGATTGAGA ATTTCATAAA781 TCAATATTTA TTTCAGGTTG GGCTATGTTC CAATAAAACA AAAATAAACA ACTGATTC

上述基因的克隆方案均可采用反转录PCR的方法进行，该方法的大致流程为：根据上述基因的两端序列设计PCR引物，然后以各自组织来源的RNA为模板，行反转录PCR扩增相应基因的cDNA，再将扩增产物克隆测序即可。具体方法及反应体系参见《分子克隆》(科学出版社，1992年出版)相关章节。

附图说明：

图1  含cC1、cC3、cC4融合抗原基因及IFN-γ和IL-5基因的共表达质粒图谱

图2  IFN-γ和IL-5完整转录翻译单元的构建流程图

图3  保护性抗原cC1、cC3、cC4融合基因完整转录翻译单元的构建流程图

图4  核酸疫苗pEF-cC134FL的构建流程图

图5  免疫接种后仔猪体内的抗原抗体水平时间曲线图

图6  含cC1、cC3、cC4抗原基因的融合表达质粒图谱

图7  含cC1、cC2、cC3、cC4、cC5抗原基因的共表达质粒图谱

图8  本核酸疫苗与其他相关疫苗免疫动物后体内的抗体效价比较

图9  本核酸疫苗与其他相关疫苗的免疫保护率比较

本核酸疫苗的结构是以真核表达载体——pcDNA3为骨架的重组质粒DNA分子(大体结构见图1)。全长约8.6kb(千碱基对)，除含有质粒复制起始位点(ColEl)、卡那霉素抗性基因(Kana^R)等元件外，还包含了三个完整的真核转录翻译单元：猪γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)以及猪带绦虫囊尾蚴的三种保护性抗原的融合基因(cC1、cC3、cC4)；每个单元均含有真核转录翻译所必需的元件：真核启动子(PEF即延长因子启动子)、相应的编码基因及3’端的多聚腺苷酸(BGH pA)。总体上说，本疫苗是一个可在真核细胞中融合表达猪带绦虫囊尾蚴的三种保护性抗原、并可共表达猪γ干扰素和白细胞介素5的重组质粒DNA。如用于注射人体，亦可将猪γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)基因换成人干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)基因，构建方法相同。

本核酸疫苗的构建过程如图2、图3、图4所示。图2显示了IFN-γ和IL-5完整的真核转录翻译单元的构建流程：首先利用反转录PCR的方法从猪的RNA中分别扩增得到IFN-γ和IL-5基因cDNA的编码区，克隆测序确认后，将其定向插入含EF启动子和pA的真核表达载体pEF-G中，形成pEF-IFN-γ和pEF-IL-5重组质粒，用相应的限制性内切酶将包含PEF和pA的完整真核转录翻译单元切下，用T4 DNA多聚酶补平末端备用。(具体反应体系及实验方案参见前述《分子克隆》相关内容)

图3显示了保护性抗原融合基因转录翻译单元构建流程：首先用相应的限制性内切酶将已克隆测序的cC1、cC3、cC4基因的编码区从PUC质粒上切下，并在体外将该三片段相互连接，组成cC1、cC3、cC4融合基因；与此同时，酶切处理pEF-G后，将其与融合基因连接，组成pEF-cC134融合表达质粒，再用Notl和Sal1将完整真核转录翻译单元切下，用T4DNA多聚酶补平末端备用。

图4显示含有三个完整的真核转录翻译单元的重组质粒的构建流程：首先用相应的限制性内切酶将pcDNA-3上的卡那霉素抗性基因(Kana^R)及复制子(ColEl)切下，补平后与cC1、cC3、cC4融合基因完整真核转录翻译单元连接；再用相应的限制性内切酶将连接产物切开补平后，与包含PEF和pA的IFN-γ完整真核转录翻译单元连接；同理连接包含PEF和pA的IL-5完整真核转录翻译单元；最终构建形成可融合表达猪带绦虫囊尾蚴的三种保护性抗原，并可共表达猪γ干扰素和白细胞介素5的重组表达质粒pEF-cC134FL，此即人、猪共患囊虫病核酸疫苗。将其导入宿主菌即成工程菌。

上述质粒构建过程以及将本核酸疫苗pEF-cC134FL导入宿主菌制成工程菌所用的技术手段均为常规的CaCl₂转化法。具体实施方案为：先将宿主菌DH10B于50ml LB培养基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠，PH7.0)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.4时，在4℃下，以5000rpm的转速离心，收集宿主菌；用40ml冰预冷的100mmol/L的CaCl₂溶液重悬，冰浴30分钟；再以5000rpm的转速4℃下离心，收集宿主菌；去除上清后，用1-2ml冰预冷的100mmol/L的CaCl₂溶液重悬，制成感受态细胞备用。取200μl感受态细胞与10μl连接产物混匀后，冰浴30分钟，42℃热处理90秒，冰浴2分钟，加入800μl的LB，于37℃培养1小时后，取200μl转化产物涂布于含有相应抗生素的LB琼脂平板上，37℃培养12-24小时后，即可获得单克隆的含有重组质粒的宿主菌。在本发明中，最终将构建的核酸疫苗以该方法导入宿主菌DH10B而建成工程菌——DH10B(pEF-cC134FL)。本发明根据需要可选用其他细胞因子(如白细胞介素1IL-1、白细胞介素4IL-4等)，通过其旁分泌作用，增强机体的抗虫能力。构建的基本骨架也可用其他真核质粒表达载体(如pCI Promega公司产品等)。

本发明核酸疫苗的培养扩增及精制可用上述工程菌株，通过常规的细菌培养、质粒扩增和纯化(详见前述《分子克隆》相关内容)。

培养方式一般为液体培养。少量扩增时可用空气摇床振荡培养；用于工业性生产时需用细菌发酵罐行高密度悬浮通气培养。对培养基中的培养源无特殊的要求，一般用LB液体培养基，如需高密度培养，则可选用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化钠，PH7.0)或SOC液体培养基(含2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化钠、20mmol/L葡萄糖、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl₂ PH7.0)。必要时也可添加动、植、矿物油等作为消泡剂。培养温度一般为37℃，培养时间及收集细菌的时机决定于培养基、培养方式以及通气量等条件的设置。

从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，可采用一些常规的方法。例如可用去垢剂SDS裂解菌体，利用质粒DNA和染色体DNA变复性特征的差异，通过对DNA的变性和复性的处理，将质粒DNA和染色体DNA分开；再利用质粒DNA与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力等方面的差别进行进一步的纯化，并去除内毒素。具体地说，存在于复性液中的质粒DNA经过脱盐处理后，可用阴离子交换树脂(如DEAE Sepharose)进行交换，然后用TE(含10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)缓冲液解吸，即可制得高纯度的质粒DNA(具体见制造例)。经分装、冻干，即可获得半透明片状的本发明核酸疫苗纯品。本品理化性质十分稳定，可于常温下保存与运输，使用前，用注射用水溶解即可。

本核酸疫苗的体外表达及检测，是将所构建的核酸疫苗通过电穿孔法转染COS7细胞，培养一周后，用ELISA法检测cC134融合蛋白、IFN-γ和IL-5，结果表明均有表达；用细胞病变抑制试验检测IFN-γ的活性，比活为10⁶IU/mg；MTT法检测IL-5的活性，比活为10⁴IU/mg。说明本发明构建的核酸疫苗确可在哺乳动物细胞中表达。

本核酸疫苗的体内表达及检测，是将获得的核酸疫苗纯品免疫仔猪后，用ELISA法检测血清中的抗原、抗体水平(见实验1)，结果如图5：曲线1为猪血清中抗cC134的抗体效价，曲线2为猪血清中cC134融合抗原水平。结果表明本核酸疫苗免疫动物后，不但可表达猪带绦虫囊尾蚴的抗原，而且可有效诱导体内的免疫应答反应；同时，从抗体水平的升高使抗原水平下降，说明抗体能有效中和抗原，具有免疫保护作用。

为验证本发明的优越性，我们将其与我室构建的、基于相同免疫保护性抗原的多种其它疫苗分别免疫仔猪，然后从体内抗体效价和免疫保护率两方面进行比较。用于比较的疫苗分别为：cC134融合抗原亚单位疫苗、细胞因子(IL-5、IFN-γ)与cC134融合抗原亚单位疫苗联合免疫、cC134多价融合表达核酸疫苗(图6)及cC12345多价共表达核酸疫苗(即含猪带绦虫囊尾蚴保护性抗原基因cC1、cC2、cC3、cC4、cC5的共表达质粒如图7)，结果如下：

(1)被免疫仔猪的抗体效价时间曲线：结果如图8所示，图中曲线1为本发明构建的

   多价复合核酸疫苗(pEF-cC134FL)免疫后的抗体效价，曲线2为融合表达核酸

   疫苗(pEF-cC134)免疫后的抗体效价，曲线3为细胞因子与亚单位疫苗联合免

   疫后的抗体效价，曲线4为cC134融合亚单位疫苗免疫后的抗体效价，曲线5为

   共表达核酸疫苗(pEF-cC12345)免疫后的抗体效价。可见本发明构建的多价复

   合核酸疫苗所诱发抗体效价的峰值最高，持续时间最长。提示免疫保护效果最好。

   (具体方法见实验2)

(2)比较各疫苗间绝对保护率和有效保护率之间的区别：具体方法见实验3，结果如

   图9所示。图中柱1为亚单位疫苗的免疫保护率，柱2为细胞因子与亚单位疫苗

   联合免疫后的免疫保护率，柱3为融合表达核酸疫苗(pEF-cC134)的免疫保护

   率，柱4为共表达核酸疫苗(pEF-cC12345)的免疫保护率，柱5为本发明核酸

   疫苗(pEF-cC134FL)的免疫保护率。结果表明本发明构建的多价复合核酸疫苗

   免疫动物后，对囊尾蚴虫卵攻击的绝对保护率和有效保护率均高于其他种类疫

   苗。

以上两个实验的结果表明：本发明构建的多价复合核酸疫苗较亚单位疫苗、共表达核酸疫苗(pEF-cC12345)及无细胞因子的融合表达核酸疫苗(pEF-cC134)具有更为全面和有效的免疫保护作用。其理论依据在于：首先，融合表达的抗原蛋白分子cC134不但保持了多价的优点，而且因其分子量较大，所以其免疫原性较抗原分子共表达载体表达产生的各自独立的小分子抗原蛋白的免疫原性强，因而能更为有效地激发免疫应答反应。其次，细胞因子在活化淋巴细胞和调节免疫反应方面有着重要作用，某些细胞因子在寄生虫感染性疾病中的作用十分重要。有研究表明[Heath A.W，Devey.ME，Brown.IN.Interferon-gamma as an adjuvant inimmunocompromised mice.Immunology 1989；67：520；Heath.AW，Playfair.JHL.Cytokine-antigen vaccines.Nature 1993；364-493：Mochizuki M，Bartels J，Mallet AI，et al.IL-5 induces eotaxin：a possible mechanism ofselective eosinophil recruitment in helminth infection and atpy.J Immunol 1998 Jan 1；160(1)：60-68]，IL-1可抑制某些寄生虫蠕虫的发育，IL-5可促使嗜酸性粒细胞的增殖，增强机体抗虫能力，IFN-γ能抑制胞内弓形虫的增埴，且与抗原结合时有较好的免疫佐剂作用，据此，构建细胞因子与抗原蛋白融合表达或共表达核酸疫苗免疫动物，利用细胞因子的免疫佐剂及共分泌和旁分泌作用，在抗原所在局部发挥免疫调节作用，可获得满意的免疫保护效果。

本核酸疫苗的生产纯化十分简便，理化性质稳定，便于储存和运输，且免疫保护作用全面、有效，加之成本低廉，应用范围广泛(包括地域和免疫人群)，使其具有较强的实用性。

使用本发明的工程菌制备猪带绦虫囊虫病核酸疫苗成品的实施例：

从-80℃冰箱中取出冻存的工程菌株——DH10B(pEF-cC134FL)，于室温融化后，用接种环蘸取少量菌液划线接种于1.5％的LB琼脂平板(含卡那霉素50ug/ml)上，37℃培养过夜后，取单克隆接种于50ml LB液体培养基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠，卡那霉素50ug/ml，PH7.0)中，37℃振荡培养40小时，作为种子液。按1∶20的比例将种子液接种于1升SOC液体培养基中(在前述成分的基础上，另含卡那霉素50ug/ml)，于37℃剧烈振摇培养25小时；加氯霉素至终浓度为170ug/ml，于37℃剧烈振摇继续培养16小时。将菌液于4℃以6000rpm的转速离心10分钟；去上清，取菌体，将其重悬于30ml的碱裂解法的溶液I(含50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris.Cl、10mmoL/L EDTA PH8.0)中加溶菌酶40mg，加60ml溶液II(0.2mol/L NaOH和I％SDS)，缓慢颠倒5次混匀，室温放置5分钟。加45ml冰预冷的溶液III(含钾离子3mol/L、乙酸根5mol/L)，缓慢颠倒数次混匀，冰浴10分钟；于4℃以10000rpm离心10分钟，取上清，过500ml G25柱除盐后，上20ml DEAE Sepharose阴离子交换柱，待结合吸附完毕后，按盐离子(Cl^-)浓度从低到高(0～1mol/L)渐进的梯度洗脱法，用10个柱体积的PBS(PH8.0)和氯化钠溶液缓慢清洗阴离子交换柱，收集260nm处吸收峰的洗脱液，得到核酸疫苗的粗品。然后进一步纯化，加2倍体积的无水乙醇沉淀，12000rpm 4℃离心10分钟，去上清，用70％的乙醇漂洗凉干后，溶于PBS(PH8.0)溶液中，即得本发明核酸疫苗的纯品；用紫外分光光度法定量后，再按每份10mg/ml分装、冻干制成成品。

本发明的免疫方案是：免疫接种时，用25％的注射用葡萄糖盐水1ml溶解后，肌肉注射即可，剂量为1mg/kg体重(也可与局麻药利多卡因10mg联合注射，以利疫苗吸收)。一次接种即可获得有效免疫保护，如需加强，每年追加免疫一次即可。

实验1  免疫接种后体内的抗原抗体水平检测试验

将本发明核酸疫苗(pEF-cC134FL)按1mg/kg体重接种0～1周龄的仔猪后，每周耳部取血1ml，分离血清，以囊虫病患者的富集血清为抗体、体外表达的cC134融合蛋白为抗原，用ELISA法检测免疫接种后仔猪体内的特异抗原、抗体水平，制作时间曲线。结果如图5。

实验2  本核酸疫苗与其他相关疫苗免疫动物后的抗体效价比较试验

将五十只0～1周龄的仔猪随机分为五组，每组均按1mg/kg体重，分别接种等量的亚单位疫苗、细胞因子与亚单位疫苗联合免疫、多价共表达核酸疫苗(图6)、多价融合表达核酸疫苗(图7)以及本发明构建的多价复合核酸疫苗(图1)，每周耳部取血1ml，分离血清，用ELISA法检测免疫接种后仔猪体内的特异抗体水平制作时间曲线，结果如图8。

实验3  本核酸疫苗与其他相关疫苗间绝对保护率和有效保护率之间的比较试验

将六十只0～1周龄的仔猪随机分为六组，第一组为阴性对照，其余各组均按1mg/kg体重，分别接种等量的亚单位疫苗、细胞因子与亚单位疫苗联合免疫、多价共表达核酸疫苗(图6)、多价融合表达核酸疫苗(图7)以及本发明构建的多价复合核酸疫苗(图1)，四周后，喂食囊尾蚴虫卵；八周后，观察体内囊尾蚴数量，全身未见囊尾蚴的个体数为绝对保护数，与阴性对照相比，囊尾蚴数量减少的个体数为有效保护数，保护数除以每组个体数则为保护率。实验结果见图9。

根据以上实验可以证明，本发明构建的多价复合核酸疫苗能有效地诱发机体的免疫应答反应，并能高效防止囊尾蚴的感染和囊虫病的发生。

Claims (4)

1、一种人、猪共患囊虫病核酸疫苗，其特征在于由真核表达载体基本骨架ρcDNA-3、猪带绦虫囊尾蚴抗原基因和细胞因子基因组成。

2、按权利要求1所述的人、猪共患囊虫病核酸疫苗，其特征在于所述的猪带绦虫囊尾蚴抗原基因为保护性抗原基因cC1、cC3、cC4，其序列分别为：猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC11 GAATTCGAGG ATCCGGGTAC C ATGGCCTAC TGTCGCTCCC TGGTTCATCT ATATGCCCCC61 AATGGAGAGA AGTACAAACC GACTATTACC CCAACACCCG GGTTCTCACC GACCGCTGAT121 GCTGAGCACT TGAAGCGTGC AATGCGAGGA CTTGGCACGA ATGAACGTGC GATCATTGAC181 ATTCTTGGAA ACCGAACTTC AGCCGAAAGA ATGGCCATTC GTGACGCCTA TCCGTCGATT241 TCCAGCAAGA CCCTGCACGA TGCTCTAACC AGCGAGCTGA GTGGCAAGTT CCGGAGGTTC301 GCCTTGTTGC TAATCCAATC ACCGTGGCAG GTGATGGCAG AGGCTCTTTA CGACGCCATG361 AAGGGGGCTG GCACTAAGGA ACGCGTACTC AATGAAATTA TTGCCGGGTG TTCAAAGGAT421 GACATCCCTC AGTTGAAAAA AGCTTTTGAA GAAGTGAGCG GAGGAGAAAC CCTTGATGAT481 GCGATCAAGG GGGACACGAG TGGCGACTAC CGCGAGGCCC TTCTGCTAGC GCTCGCCGGT541 CAGGCTGATG AACCACAGGC GATGCAACTC AAAAACCTAA CACCCTCCAC TCTCAGTCAG601 GTTGTGAATC CCGGCCTTGC TGAAACGGAT GCGAAGGAGC TGTACGCCTG CGGTGAGGGG661 CGCCCGGGCA CAGCAGAGAG TCGTTTCATG CGTCCTATCG TCAATCGCTC ATTCCTTCAA721 TTAAACGCAA CGAATGAGGC TTACAATCGG GCCTACGGTC ACCCGTTGAT TGATGCAATA781 AAGAAGGAGA CGTCGAGAGA CCTTGAGGAC TTTCTCATAA CTAGAGTTCG CTACGCCACT841 GATCGCGCCA GTCTGTTTGC CGAACTCCTT CACTTTGCCA TGAGAGGAGC TGGCACCAAG901 GACTCCACTT TGCAACGTGT TCTTGCCTTG AGGGCTGATA CTGATCTAGG AAGCATCAAG961 GAGAAGTATG CGGAGCTCTA TGGTGAAACC TTGGAAGCGG CAATCAAGGG TGATACTTCT1021 GGTGACTATG AGGCTCTCTG CTTGAAACTC ATCGGCCCTG CATAACTGCA GTGGTGACAA1081 ATTGGTTCCC ACATGCTGGT TAAAGTTCTC CACCTCCTCC TACATCATCT CGTGGTTTTA1141 ATTTCGACTT TTCTGCAGCA CAAATTCCTC GATTAACTCC TTTCTCTGTT CTTCGTCAGT1201 TTGTGGAAGG TTAAACTTGA TGATGAAATT CACTCCAATA AAAATAATGC ACACTTACGT1261 ACTGAGTGTG AGTGCGCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC31 GGCTTGGCGG GTTCACTAGC CGTACTCCTT TCGTTACCTC ACCCTAATCA TCAAAATGAA61 TATGATCCGT CAAAATTTCC ACGATGAATG CGAAGTGGGC ATCAATCGTC AAATTAACAT121 GGAGCTCTAC GCCAGCTACC TCTACCTAGC TATGTCTCAA CACTTTGACC GGGAAGACGT181 CGCCCTTCCA GGCTTCAAGA AATTTTTTGC CAAGGCCTCG GAAGAGGAGC GTGAACACGC241 GATAAAGCTC ATGTGTTATC AATGTAAACG TGGTGGCCGC ATTGTCTATC AAGACATTGC301 CAAACCCCAG AAAAGTGAAT GGGCAACCGG TCTGGAAGCC ATGGAAACGG CGCTCAAAAT361 CGAGCGAGAG GTCAATGAGT CCCTCCTTGC TTTGTGTGAT GTCGCTGTCA AACACAGCGA421 CAACCATTTC TCTGATTTCT TGGAAAATGA ATACTTGGGA GAACAAGTAG ACGCTATTAA481 GCAGTTGGCA GACTATGTGA CAAACCTCCG TCGATGCGGA CCCGGACTGG GAGAGTATCT541 ATTTGACAAG GAAACCCTTA ACGGTGGTGA GGACTAAAAA AACCAGCTGT GCTCGGGGCA601 ATTTTTTGTT CCTTTCTCTT TGCCATGTTG TGATTTACAA AAACTATTCA CAATTATGAC661 TAATCTTTAC CAAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAA猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC41 CCTACTGGAG  ATGAAAGGCA TATCTGGCCC ACTAGTTTTA GCAATCTTCA CGACATGTTT61 TGGCTCATCA TTTCTCTTGG GCTACAACCT GGGCGTCGCA AATCTGCCTG GAGATAACAT121 CAAGAAATTT CTGGTTAACT ACTACAAGCC GGACAACTCA TCTGCTTTGA ATGCCAACTT181 CCTCTACGGA CAGGTAACCT CCGTGCTGGT CATCTGTGCC GCCATTGCAG CCTTCACGTG241 TGGTTGGGTT GCTGACGGCC TGGGCAGAAA GCGCAGTCTG ATGGTGAACA ACGGCATTGG301 CATTGTGGGA TCAGTAATCT CCTCTGTGTG TGTGGTGGCA AATCAGCCTG CTTTGCTGTA361 TGTGGGACGT GCGATCAGTG GTCTGAACAG CGGTCTGAGC ATTGGCATCG CAGCGATGTT421 CCTCACGGAG ATTGCGCCAC GCCATCTGCG GGGCATGATT GGAGCCTGCA ACCAACTGGC481 TATCACCATC GGCATTGTCA TCTCCTACGT GCTCACGCTG TCGCACCTTC TGAACACACC541 TACCCTCTGG CCAGTCGCCA TGGGCGTCGG CGCCATTCCT GCTGTGATCG CTCTCATCAT601 TTCCCCCTTC ACCGTTGAGT CGCCGCGTTG GCTCTACCTC AAGAAGAAGG ATGAGAAAGC661 TGCGCGCGAA GCCTTCGCTC GCATCAATGG CTCCGAGAAT GTGGATATGT TCATCGCCGA721 GATGCGTGAA GAGCTAGAGG TAGCCCAGAA CCAACCAGAG TTCAAATTTA CTGAGCTCTT781 CCGTCGCAGA GATCTTCGCA TGCCTGTCAT CATAGCGGTT CTCATTCAAG TCATGCAGCA841 ACTCTCAGGA ATTAATGCTG TGGTTGCGAA TTCCTCGGAG ATGTTGAAAA GTGCCAAGGT901 GTCGCCAGAC ATGCTGGAGT ACTTTGTGGT AGGTCTGGGC CTGCTCAACG TCATCTGCAC961 AATCGTGGCG CTGCCGCTGC TGGAAAAGGC GGGTCGGCGC ACCCTTCTGT TATGGCCTTC1021 CCTCGTAGTG GCAATAATAC TGCTGCTTCT GGTGATCTTC GTCAATATCG CCAACTACGG1081 AGGCGTCGTA AACAAGACGC CCTTCGTTCT CGTTTCTGCC GTCCTCGTCT TCATTTATGT1141 CGCCGCTTTC GCCATGGGTC TTGGCCCAAT GCCTGCGCTC ATCGTCGCCG AAATCTTCCG1201 TCAGGGTCCT CGCGCCGCCG CCTATTCCCT CAGTCAAAGC ATTCAGTGGG CCTGCAATCT1261 CATTGTCGTA GCCTCATTTC CTTCGCTCAA CGAGCTATTA AAGGGCTACG TTTATCTGCC1321 GTATCTGGTT GTGGTGGCAG TTTGCTGGGT GGTATTCTTC CTCTTCATGC CGGAGACAAA1381 GAATCGCACC TTTGATGAGG TGGCACGGGA TCTGGCCTTC GGGAGCATCG TGGTGGGTAA1441 ACGCACTGCG GCGCTACAAG CTCCCGTCTT CACCAAGGAG GACGAGGAGG CCGCTACCGC1501 CCTCCGCCGC AGCGACGAAG AGGACGCCAA GGTCGACGCC TAGACTACTC TCTTCACTTT1561 TCCCCCCTTC CTCATCTCTT CATAAAGTGC TGCACTCCCT CCTGTTGTTT GTGTCTCCGT1621 TTTCCCCCAT TCACGCATTC ACTTGCCTTC CATCTCTTTT TACTCAACCT CCGTAGACAA1681 GGTTACTGCG AGGCCAACTC TTCCCTCTCC ATTCTTCCTA TAGATGCGGA AGGTCAGTCA1741 GGATTTCACC ATAGTTTTTG ATGATGAAAA AAAAAA

3、按权利要求1所述的人、猪共患囊虫病核酸疫苗，其特征在于所述的细胞因子基因为猪γ干素(IFN-γ)和猪白细胞介素5(IL-5)。

4、按权利要求1所述的人、猪共患囊虫病核酸疫苗，其特征在于所述的猪带绦虫囊尾蚴抗原基因为保护性抗原基因cC1、cC3、cC4，其序列分别为：猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC11 GAATTCGAGG ATCCGGGTAC C ATGGCCTAC TGTCGCTCCC TGGTTCATCT ATATGCCCCC61 AATGGAGAGA AGTACAAACC GACTATTACC CCAACACCCG GGTTCTCACC GACCGCTGAT121 GCTGAGCACT TGAAGCGTGC AATGCGAGGA CTTGGCACGA ATGAACGTGC GATCATTGAC181 ATTCTTGGAA ACCGAACTTC AGCCGAAAGA ATGGCCATTC GTGACGCCTA TCCGTCGATT241 TCCAGCAAGA CCCTGCACGA TGCTCTAACC AGCGAGCTGA GTGGCAAGTT CCGGAGGTTC301 GCCTTGTTGC TAATCCAATC ACCGTGGCAG GTGATGGCAG AGGCTCTTTA CGACGCCATG361 AAGGGGGCTG GCACTAAGGA ACGCGTACTC AATGAAATTA TTGCCGGGTG TTCAAAGGAT421 GACATCCCTC AGTTGAAAAA AGCTTTTGAA GAAGTGAGCG GAGGAGAAAC CCTTGATGAT481 GCGATCAAGG GGGACACGAG TGGCGACTAC CGCGAGGCCC TTCTGCTAGC GCTCGCCGGT541 CAGGCTGATG AACCACAGGC GATGCAACTC AAAAACCTAA CACCCTCCAC TCTCAGTCAG601 GTTGTGAATC CCGGCCTTGC TGAAACGGAT GCGAAGGAGC TGTACGCCTG CGGTGAGGGG661 CGCCCGGGCA CAGCAGAGAG TCGTTTCATG CGTCCTATCG TCAATCGCTC ATTCCTTCAA721 TTAAACGCAA CGAATGAGGC TTACAATCGG GCCTACGGTC ACCCGTTGAT TGATGCAATA781 AAGAAGGAGA CGTCGAGAGA CCTTGAGGAC TTTCTCATAA CTAGAGTTCG CTACGCCACT841 GATCGCGCCA GTCTGTTTGC CGAACTCCTT CACTTTGCCA TGAGAGGAGC TGGCACCAAG901 GACTCCACTT TGCAACGTGT TCTTGCCTTG AGGGCTGATA CTGATCTAGG AAGCATCAAG961 GAGAAGTATG CGGAGCTCTA TGGTGAAACC TTGGAAGCGG CAATCAAGGG TGATACTTCT1021 GGTGACTATG AGGCTCTCTG CTTGAAACTC ATCGGCCCTG CATAACTGCA GTGGTGACAA1081 ATTGGTTCCC ACATGCTGGT TAAAGTTCTC CACCTCCTCC TACATCATCT CGTGGTTTTA1141 ATTTCGACTT TTCTGCAGCA CAAATTCCTC GATTAACTCC TTTCTCTGTT CTTCGTCAGT1201 TTGTGGAAGG TTAAACTTGA TGATGAAATT CACTCCAATA AAAATAATGC ACACTTACGT1261 ACTGAGTGTG AGTGCGCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC31 GGCTTGGCGG GTTCACTAGC CGTACTCCTT TCGTTACCTC ACCCTAATCA TCAAA ATGAA61 TATGATCCGT CAAAATTTCC ACGATGAATG CGAAGTGGGC ATCAATCGTC AAATTAACAT121 GGAGCTCTAC GCCAGCTACC TCTACCTAGC TATGTCTCAA CACTTTGACC GGGAAGACGT181 CGCCCTTCCA GGCTTCAAGA AATTTTTTGC CAAGGCCTCG GAAGAGGAGC GTGAACACGC241 GATAAAGCTC ATGTGTTATC AATGTAAACG TGGTGGCCGC ATTGTCTATC AAGACATTGC301 CAAACCCCAG AAAAGTGAAT GGGCAACCGG TCTGGAAGCC ATGGAAACGG CGCTCAAAAT361 CGAGCGAGAG GTCAATGAGT CCCTCCTTGC TTTGTGTGAT GTCGCTGTCA AACACAGCGA421 CAACCATTTC TCTGATTTCT TGGAAAATGA ATACTTGGGA GAACAAGTAG ACGCTATTAA481 GCAGTTGGCA GACTATGTGA CAAACCTCCG TCGATGCGGA CCCGGACTGG GAGAGTATCT541 ATTTGACAAG GAAACCCTTA ACGGTGGTGA GGACTAAAAA AACCAGCTGT GCTCGGGGCA601 ATTTTTTGTT CCTTTCTCTT TGCCATGTTG TGATTTACAA AAACTATTCA CAATTATGAC661 TAATCTTTAC CAAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAA猪带绦虫囊尾蚴的保护性抗原基因cC41 CCTACTGGAG  ATGAAAGGCA TATCTGGCCC ACTAGTTTTA GCAATCTTCA CGACATGTTT61 TGGCTCATCA TTTCTCTTGG GCTACAACCT GGGCGTCGCA AATCTGCCTG GAGATAACAT121 CAAGAAATTT CTGGTTAACT ACTACAAGCC GGACAACTCA TCTGCTTTGA ATGCCAACTT181 CCTCTACGGA CAGGTAACCT CCGTGCTGGT CATCTGTGCC GCCATTGCAG CCTTCACGTG241 TGGTTGGGTT GCTGACGGCC TGGGCAGAAA GCGCAGTCTG ATGGTGAACA ACGGCATTGG301 CATTGTGGGA TCAGTAATCT CCTCTGTGTG TGTGGTGGCA AATCAGCCTG CTTTGCTGTA361 TGTGGGACGT GCGATCAGTG GTCTGAACAG CGGTCTGAGC ATTGGCATCG CAGCGATGTT421 CCTCACGGAG ATTGCGCCAC GCCATCTGCG GGGCATGATT GGAGCCTGCA ACCAACTGGC481 TATCACCATC GGCATTGTCA TCTCCTACGT GCTCACGCTG TCGCACCTTC TGAACACACC541 TACCCTCTGG CCAGTCGCCA TGGGCGTCGG CGCCATTCCT GCTGTGATCG CTCTCATCAT601 TTCCCCCTTC ACCGTTGAGT CGCCGCGTTG GCTCTACCTC AAGAAGAAGG ATGAGAAAGC661 TGCGCGCGAA GCCTTCGCTC GCATCAATGG CTCCGAGAAT GTGGATATGT TCATCGCCGA721 GATGCGTGAA GAGCTAGAGG TAGCCCAGAA CCAACCAGAG TTCAAATTTA CTGAGCTCTT781 CCGTCGCAGA GATCTTCGCA TGCCTGTCAT CATAGCGGTT CTCATTCAAG TCATGCAGCA841 ACTCTCAGGA ATTAATGCTG TGGTTGCGAA TTCCTCGGAG ATGTTGAAAA GTGCCAAGGT901 GTCGCCAGAC ATGCTGGAGT ACTTTGTGGT AGGTCTGGGC CTGCTCAACG TCATCTGCAC961 AATCGTGGCG CTGCCGCTGC TGGAAAAGGC GGGTCGGCGC ACCCTTCTGT TATGGCCTTC1021 CCTCGTAGTG GCAATAATAC TGCTGCTTCT GGTGATCTTC GTCAATATCG CCAACTACGG1081 AGGCGTCGTA AACAAGACGC CCTTCGTTCT CGTTTCTGCC GTCCTCGTCT TCATTTATGT1141 CGCCGCTTTC GCCATGGGTC TTGGCCCAAT GCCTGCGCTC ATCGTCGCCG AAATCTTCCG1201 TCAGGGTCCT CGCGCCGCCG CCTATTCCCT CAGTCAAAGC ATTCAGTGGG CCTGCAATCT1261 CATTGTCGTA GCCTCATTTC CTTCGCTCAA CGAGCTATTA AAGGGCTACG TTTATCTGCC1321 GTATCTGGTT GTGGTGGCAG TTTGCTGGGT GGTATTCTTC CTCTTCATGC CGGAGACAAA1381 GAATCGCACC TTTGATGAGG TGGCACGGGA TCTGGCCTTC GGGAGCATCG TGGTGGGTAA1441 ACGCACTGCG GCGCTACAAG CTCCCGTCTT CACCAAGGAG GACGAGGAGG CCGCTACCGC1501 CCTCCGCCGC AGCGACGAAG AGGACGCCAA GGTCGACGCC TAGACTACTC TCTTCACTTT1561 TCCCCCCTTC CTCATCTCTT CATAAAGTGC TGCACTCCCT CCTGTTGTTT GTGTCTCCGT1621 TTTCCCCCAT TCACGCATTC ACTTGCCTTC CATCTCTTTT TACTCAACCT CCGTAGACAA1681 GGTTACTGCG AGGCCAACTC TTCCCTCTCC ATTCTTCCTA TAGATGCGGA AGGTCAGTCA1741 GGATTTCACC ATAGTTTTTG ATGATGAAAA AAAAAA所述的细胞因子基因为猪γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素5(IL-5)。按权利要求2、4所述的人、猪共患囊虫病核酸疫苗，其特征在于所述的猪带绦虫囊尾蚴保护性抗原基因cC1、cC3、cC4为融合表达基因。按权利要求4所述的人、猪共患囊虫病核酸疫苗，其特征在于所述的猪带绦虫囊尾蚴保护性抗原基因cC1、cC3、cC4，与所述的细胞因子基因猪γ干扰素(IFN-γ)和猪白细胞介素5(IL-5)的关系是共表达关系。

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