CN103127498A - 重组抗原组合物、疫苗、制备该抗原组合物的载体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组抗原组合物、疫苗、制备该抗原组合物的载体和方法。所述抗原优选重组幽门螺旋杆菌抗原，所述重组幽门螺旋杆菌抗原包括幽门螺旋杆菌抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和霍乱毒素CT-B蛋白。本发明利用CT-A2与CT-B蛋白的亲和性，形成CT-A2-5CT-B的嵌合结构，从而通过幽门螺旋杆菌抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白形成效价更高的抗原。同时，利用CT-B增强免疫的作用，起到增强本发明的抗原免疫原性的效果。另外，本发明的重组抗原构成的嵌合蛋白抗原刺激黏膜产生分泌型IgA免疫。

Description

重组抗原组合物、疫苗、制备该抗原组合物的载体和方法

技术领域

本发明涉及免疫领域，特别是重组抗原领域，尤其是用于幽门螺旋杆菌感染免疫的抗原、疫苗及其制备方法和载体。 

背景技术

在疫苗制备领域，许多种抗原由于自身抗原性较低或者分子太小等原因而不能激发足够的免疫反应，从而限制了其疫苗开发的可能性和疫苗的有效性。为了克服这一困难，目前采用了许多种方法增加抗原的免疫原性，例如，使用免疫佐剂。常用的佐剂可分为四类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。 

现有佐剂的作用机制包括：(1)改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解和排除，从而延长抗原在体内的滞留时间，避免频繁注射从而更有效地刺激免疫系统；(2)刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力；(3)刺激淋巴细胞的增生和分化，可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度；(4)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应。另外，改变多肽结构也是增强其免疫原性的有效手段。Senpuku等(1996)发现将pAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段免疫所激发的抗rpAc抗体明显升高。因此认为，将多肽偶联成束能显著增强其免疫原性。 

为了提高目的抗原的免疫原性，人们一直致力于开发更有效更安全的免疫佐剂，以用于疫苗的制备应用。霍乱毒素(choleratoxin，CT)是由霍乱弧菌 产生的分子量为84KD的肠毒素，是一种强有力的免疫佐剂，其作用机制是通过抑制口服抗原的免疫耐受而发挥免疫促进作用。但由于毒性作用、超敏反应等的存在使其应用受到了一定的限制。霍乱毒素由由一个A亚单位(分子量为2707KD)和5个B亚单位(每个分子量为11.7KD)组成。A亚单位是霍乱肠毒素的毒性物质，B亚单位是结合单位，后者可与小肠粘膜上皮细胞上神经苷脂(GM1受体)结合，结合后的毒素分子变构，使A亚单位脱离B亚单位进入细胞膜，同时双硫键降解，分为A1，A2两条多肽，A1为毒  性部分。由于A1亚基的有毒特性，所以不能直接应用于人体。CT-B亚基彼此连接形成五聚体(参见图1)，然后与CT-A2环绕形成AB5结构(参见图2)。CT-B具有增强免疫作用，目前认为是迄今为止最有效最安全的黏膜免疫佐剂之一。 

另一方面，虽然如胃炎，胃溃疡及十二指肠球部溃疡胃炎相关的疾病可能由多种致病因素引起，但研究发现，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)是最常见的病因。HP是世界上感染率最高的细菌之一，据报道，90％的亚洲人和欧洲人60％感染幽门螺旋杆菌，如不治疗将持续感染，引发慢性胃炎、消化性溃疡，甚至导致胃癌。世界卫生组织和美国国立卫生院经过多年研究，已经将HP列为胃癌的首要致癌因子。另外，抗生素以及抗溃疡药物化学治疗药物已经被用于治疗胃炎相关的疾病，在此背景下，抗生素广泛的大剂量应用甚至滥用导致了耐药性菌株的产生，并出现了一些药物的副作用，使得患者的耐受性变差。研究表明耐药性幽门螺旋杆菌引起胃癌的风险更大。在这种情况下，研制一种有效的疫苗可能是预防和治疗幽门螺旋杆菌所导致的消化道疾病的有效途径。 

在疫苗的研发过程中，人们发现，抗原的选择对于疫苗的效果影响巨大，而且单一抗原构建的单效价疫苗经常难以产生足够的免疫应答，从而难以产生完全有效的保护作用。因此，如何选择有效的抗原并构建成多效价的抗原是当前针对幽门螺旋杆菌的疫苗研究中的重要挑战。 

应明确指出的是，虽然上述内容在“背景技术”的标题下描述，但是并 不代表申请人承认上述内容全部为现有技术。相反，为了引出本发明的发明内容，加入了发明人的分析和引申，因此这一部分不应被简单地视为现有技术。 

发明内容

为了增强抗原的免疫原性和免疫佐剂的有效性，本发明提供了一种重组抗原组合物，包括：抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白；和霍乱毒素CT-B蛋白。利用CT-A2与CT-B的结合特性，能够形成上述融合蛋白与CT-B的复合物结构，从而增大了抗原的有效体积。同时，已知霍乱毒素是一种强有力的免疫佐剂，能够抑制抗原的免疫耐受，从而发挥其免疫促进作用。并由于一个CT-A2可以结合多个CT-B而加强了CT-B的效价，从而增强了整个抗原组合物的免疫原性。 

在优选的实施方式中，所述抗原包括选自由幽门螺旋杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原等组成的组中的至少一种。利用这些抗原组合物，能够分别增加幽门螺旋杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原的免疫原性，利于构建更加有效的疫苗。 

在进一步优选的实施方式中，本发明提供了一种重组幽门螺旋杆菌抗原组合物，包括幽门螺旋杆菌抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和霍乱毒素CT-B蛋白。借助霍乱毒素CT-A2亚基和霍乱毒素CT-B蛋白本身能够结合的性质，增大抗原的有效体积。因此，本发明的重组幽门螺旋杆菌抗原组合物能够有效增强幽门螺旋杆菌抗原的免疫原性，利于构建更加有效的疫苗。 

在一个优选的实施方式中，所述幽门螺旋杆菌抗原选自幽门螺旋杆菌尿素酶(UreaseB，UreB)、幽门螺旋杆菌CagA蛋白(细胞毒素相关基因的表达产物)和幽门螺旋杆菌中性白细胞激活蛋白(NAP)中的至少一种。这几种抗原均是目前已知的幽门螺旋杆菌抗原中无毒性、抗原性强而且相对保守的抗原，更加适合用于疫苗中。 

在更优选的实施方式中，所述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和所 述霍乱毒素CT-B蛋白的摩尔比为1∶5。在此比例下，CT-B形成五聚体并与CT-A2亚基结合，进一步提高了该抗原组合物的免疫原性。 

本发明还提供了一种疫苗，包括上述的抗原组合物中的至少一种。 

本发明还提供了一种载体组合物，包括表达上述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白的载体和表达霍乱毒素CT-B蛋白的载体。其中表达上述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白的载体为包括上述抗原的基因和霍乱毒素CT-A2亚基的基因的表达载体；所述表达霍乱毒素CT-B蛋白的载体为包括霍乱毒素CT-B蛋白的基因的表达载体。如本领域普通技术人员所公知，所述表达载体中还应包括表达目的蛋白质所必需的元件，例如启动子、终止子、可选的标记基因等。 

所述表达载体可以是原核表达载体或真核表达载体，例如，pET系列等原核载体、酵母表达载体、昆虫杆状病毒表达载体等。使用原核和真核表达载体制备目的蛋白的方法和试剂为本领域所公知，可参见本领域常用工具书，例如冷泉港实验室编写的《分子克隆实验指南》((美)萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，北京，科学出版社出版)、《细胞实验指南》((美)D.L.斯佩克特等著，黄培堂等译，北京科学出版社出版)等。 

在一个优选的实施方式中，所述载体表达的所述幽门螺旋杆菌抗原选自幽门螺旋杆菌尿素酶、幽门螺旋杆菌CagA蛋白和幽门螺旋杆菌中性白细胞激活蛋白中的至少一种。 

另外，本发明提供一种表达宿主菌，所述宿主菌中包括上述的载体组合物所包含的载体中的至少一种。 

本发明还提供一种制备幽门螺旋杆菌疫苗的方法，包括用上述的载体组合物中的载体分别表达所述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和霍乱毒素CT-B蛋白，然后将这两种蛋白混合，并复性使这两种蛋白结合形成嵌合蛋白。 

在一个优选的实施方式中，上述制备方法中所述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和霍乱毒素CT-B蛋白混合的摩尔比为1∶5。在此比例下，CT-B形成五聚体并与CT-A2亚基结合，进一步提高了该抗原组合物的免疫原性。 

本发明还提供了上述的抗原组合物在制备用于治疗或预防相关疾病中的应用。上述的重组幽门螺旋杆菌抗原组合物可以用于制备疫苗，预防幽门螺旋杆菌相关疾病，还可以通过激发机体的免疫反应在相关疾病的治疗中发挥一定的作用。 

附图说明

图1为电脑模拟的CT-B立体结构图； 

图2为电脑模拟的CT-B与CT-A2结合的立体结构图； 

图3为对本发明一个实施方式中的载体进行双酶切鉴定的电泳结果图，其中各个泳道所用样品分别为：M：DL10000DNA Marker；泳道1、2、3、4：PET-28a-UreB-CTA2双酶切；泳道5、6、7、8：PET-28a-CagA-CTA2双酶切；泳道9、10、11、12：PET-28a-NAP-CTA2双酶切； 

图4为根据本发明的实施方式制备的UreB-CTA2和NAP-CTA2融合蛋白的蛋白质电泳图，其中各个泳道所用样品分别为：M：SDS-PAGE低分子量标准蛋白Marker；泳道1：IPTG诱导前含PET-28a-UreB-CTA2的BL21-DE3菌体；泳道2：IPTG诱导后含PET-28a-UreB-CTA2的BL21-DE3菌体；泳道3：IPTG诱导前含PET-28a-NAP-CTA2的BL21-DE3菌体；泳道4：IPTG诱导后含PET-28a-NAP-CTA2的BL21-DE3菌体； 

图5为根据本发明的实施方式制备的CagA-CTA2融合蛋白的蛋白质电泳图，其中各个泳道所用样品分别为：M：SDS-PAGE低分子量标准蛋白Marker；泳道1：IPTG诱导前含PET-28a-CagA-CTA2的BL21-DE3菌体；泳道2：IPTG诱导后含PET-28a-CagA-CTA2的BL21-DE3菌体； 

图6为根据本发明的实施方式制备的UreB-CTA2/5CTB嵌合蛋白的蛋白电泳图，其中各个泳道所用样品分别为：M：SDS-PAGE低分子量标准蛋白Marker；泳道1：UreB-CTA2和单体CTB透析后，非还原电泳；泳道2：UreB-CTA2和单体CTB透析前，非还原电泳；泳道3：UreB-CTA2透析后，，非还原电泳；泳道4：UreB-CTA2还原电泳。； 

图7为根据本发明的实施方式嵌合蛋白(UreB-CTA2/5CTB)免疫原性反应血清型IgA抗体检测图； 

图8为根据本发明的实施方式嵌合蛋白(UreB-CTA2/5CTB)免疫原性反应分泌型IgA抗体检测图。 

具体实施方式

候选疫苗的制备需要有效的抗原，用有效抗原免疫机体才能刺激机体产生系统的免疫应答，而后预防机体的感染。 

在用于疫苗的抗原制备中，本发明采用了CT-A2-CT-B系统来增大抗原体积并利用CT的免疫佐剂功能增强抗原的免疫原性。可以采用这一系统的抗原包括但不限于：幽门螺旋杆菌相关抗原、伤寒抗原、流感HA抗原等。 

针对这些抗原均可以采用本领域已知的方法制备相应的抗原与CT-A2的融合蛋白，然后与CT-B蛋白一起使用，达到增强免疫原性的目的。 

以幽门螺旋杆菌相关疫苗的制备为例，发明人优先选择了幽门螺旋杆菌尿素酶、幽门螺旋杆菌CagA蛋白和幽门螺旋杆菌中性白细胞激活蛋白作为用于幽门螺旋杆菌的有效抗原。 

尿素酶B亚单位(UreaseB，UreB)是H.pylori主要的外膜抗原成分，由569个氨基酸残基编码产生，是H.pylori抗原性最强的保护性蛋白，具有无毒性、抗原性强且相对保守等特点，其在H.pylori的致病过程中起关键作用。实验证实，通过黏膜免疫途径给予UreB蛋白疫苗，能够诱导并激发机体的保护性免疫应答，因此是H.pylori重要的保护性候选抗原之一，也是基因工程疫苗的首选抗原。尿素酶基因是所有Hp菌株共同拥有的编码的蛋白，具有很强的尿素酶活性。尿素酶占Hp总蛋白量的6％。它是含有镍离子的金属酶能够分解尿素为NH₃和CO₂，使Hp周围pH值增高有利于Hp在低的pH值环境下生存。目前发现尿素酶基因大小约为7.5kb，共有9个读码框(ORF)，分别为UreA、UreB、UreC、UreD、UreE、UreF、UreG、UreH和UreI。其中UreA、UreB为尿素酶的两个结构亚单位，具有高度的保守性， 是PCR检测Hp感染常选择的目的基因以及基因疫苗的候选基因。实验证明剔除尿素酶基因表达的Hp在无菌乳猪感染模型中Hp感染后不能定植于胃内，这充分证明尿素酶的致病作用；而且能激活单核吞噬细胞和刺激炎性细胞因子的产生，介导胃黏膜上皮炎症反应和空泡形成。也导致胃黏膜上皮的增生与凋亡，失衡增生指数(LI)/凋亡指数(AI)明显增高导致癌前病变的发生。同时，在体外仍然对胃上皮细胞有毒力作用。另外铵离子会干扰胃黏膜的正常H+反渗，导致组织损伤细菌过度的生长硝酸盐降解为亚硝酸盐及亚硝胺而致癌。因此尿素酶既是定植因子又是毒力因子。虽然尿素酶对Hp的定植和致病起着重要的作用，但由于其主要活性部分位于菌体表面含量丰富，广泛表达，高度保守，其大分子量和颗粒状结构有利于黏膜免疫接种。因此尿素酶分子是作为疫苗抗原的合理选择。同时在体内Hp表面具有黏附胞质蛋白的特性，能够将自溶释放的尿素酶黏附到活菌表面。这给Hp疫苗的研究又提供了一重要的理论依据。大量的文献报道用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)口服免疫预先感染了Hf小鼠结果发现免疫的小鼠不仅彻底清除了Hf感染，而且能够预防小鼠再次感染；Kleanthous et al用重组的尿素酶亚单位B(rUreB)加上大肠杆菌热不稳定毒素(LT)作为黏膜佐剂免疫小鼠，与对照组相比结果发现：免疫组胃内Ure活性显著降低且胃黏膜组织Hp定量培养显示Hp减少97％以上；Michetti et al对口服不同剂量(180mg、60mg、20mg，4次/d)的尿素酶与LT(5μg)安全性和免疫原性进行了研究结果发现：所有的志愿者都能够耐受，且能够减少胃内Hp的定植从而减轻了胃炎的程度。Saldinger et al采用rUreB结合霍乱毒素(CT)免疫感染了Hf BALB/c小鼠，结果发现免疫BALB/c小鼠全部清除了Hf。进一步研究表明脾脏CD4+T细胞增生血清中lgG1增加同时伴随IL-4的增高，以及干扰素的减少，从而推测rUreB可能诱导了Th-2CD⁴⁺T细胞增生，从而有助于Hp的根除。有学者对Hp感染志愿者进行了I期临床实验，用Ure结合LT免疫后，同样发现Hp感染的密度显著减少；Lee et al对非人灵长类进行的类似研究也表明，通过减少胃内Hp的密度有助于减轻胃炎的程度。然而Solnick et al报 道，用尿素酶口服和肌肉注射免疫类人猿而后进行Hp攻击，结果发现：虽然能够诱导体液免疫，但是所有给与Hp攻击的类人猿都感染了Hp，而且细菌密度在实验组和对照组中没有统计学差异。上述结果显示Hp疫苗有待于进一步研究，为了获得较好的免疫效果，因而建议多种抗原成分联合起来制作疫苗。 

CagA基因也称为细胞毒素相关基因，其表达产物为CagA蛋白。作为细菌分泌的一种毒素，它由IV型分泌系统Cag致病岛从细菌转运到宿主细胞中，在宿主细胞中被磷酸化，参与宿主细胞的信号转导及引起细胞骨架结构的重排。研究表明CagA阳性幽门螺杆菌为毒力菌株，与萎缩性胃炎、胃癌与消化道溃疡等常见的消化道疾病密切相关，90％以上的幽门螺杆菌临床分离菌株cagA呈阳性表达。具有CagA基因的Hp几乎都表达CagA蛋白并产生可测的抗体反应。据文献报道CagA阳性菌株能够直接或间接(通过NF-γB)诱导胃上皮细胞IL-8的分泌，而IL-8在中性粒细胞趋化和激活过程中起重要作用，导致胃黏膜的损伤。动物实验发现CagA基因和CagA蛋白与胃炎消化性溃疡尤其胃癌的发生有良好的相关性。在CagA阳性的Hp菌株中，还发现某些Hp染色体上存在特定的DNA区域与致病相关，具有致病岛特征，称之为Cag致病岛(pathogenecity island PAI)。Cag PAI约4万bp的DNA片段，含有30多个基因，依次命名为CagA、CagB、CagC、CagT等。Cag PAI部分基因序列与一些已知致病毒力基因序列有高度同源性，所以提示Cag PAI是Hp主要毒力因子。关于Cag PAI多态性致病性与其疫苗正在探讨中。 

Evans等在Hp的水溶性抽提物中发现一种中性粒细胞激活蛋白(NAP)，它能够募集并活化嗜中性粒细胞，促进中性粒细胞对胃上皮细胞的黏附，激活中性粒细胞释放反应性氧代谢物而引起胃黏膜炎症病变。Satin等研究证实，重组NAP能阻止Hp在胃内的定植，在小鼠体内免疫保护率达80％，多数Hp感染者血清存在抗NAP特异抗体，因此，NAP是Hp感染的重要毒力因子和疫苗候选抗原之一。NAP是一种铁蛋白，编码它的NAP基因几乎在 所有Hp中检测到，但是在体外表达的NAP其活性存在很大差异。它能够通过CD11a/CD18和CD11b/CD18与ICAM-1相互作用，而使白细胞黏附内皮细胞；选择性地与中性白细胞的酸性糖鞘脂相结合而调节白细胞的功能，与粘蛋白相结合为Hp定植于胃黏膜上皮细胞埋下了伏笔。因此NAP在其黏附和致病过程中起重要作用。进一步研究发现，NAP也是一种Hp疫苗的候选抗原，rNAP免疫小鼠能够使小鼠获得免疫力。Satin et al采用Hp NAP接种小鼠能够诱导体液免疫，使小鼠对Hp具有免疫力，但同时发现Hp NAP对淋巴细胞等具有化学趋化作用，导致炎症细胞在Hp感染部位聚集，同时激活NADPH氧化酶，产生一些氧自由基导致机体的损害。 

鉴于上述理由，本发明的发明人选择了上述抗原进行组合。另外，由于CTB能够形成五聚体并与CTA2结合(参见图1和图2中CTB五聚体的立体结构图，和二者结合的立体结构图，进一步增大了抗原的体积，从而增加了其免疫原性。 

下文中，以幽门螺旋杆菌相关抗原为例，通过示例性实施方式说明本发明，但是这些实施方式仅仅为举例性的描述，而不构成对本发明保护范围的限定。 

实施例1UreB-CTA2/5CTB的制备 

1.1重组工程菌PET-28a-UreB-CTA2/BL21-DE3的构建 

1.1.1融合基因UreB-CTA2的构建： 

UreB氨基酸序列来自幽门螺旋杆菌菌株MEL-HP27，CTA2氨基酸序列来自霍乱弧菌O395株，UreB-CTA2基因经密码子优化并合成。 

UreB-CTA2基因序列(SEQ ID NO.：1)为： 

ATGAAAAAAATCTCTAGGAAAGAGTACGTAAGCATGTACGGTCCGACCAC    50 

CGGTGACAAAGTTCGTCTGGGTGACACCGACCTGATCGCTGAAGTTGAAC    100 

ACGACTACACCATCTACGGTGAAGAACTGAAATTCGGTGGTGGTAAAACC    150 

CTGCGTGAAGGTATGTCTCAGTCTAACAACCCGTCTAAAGAAGAACTGGA    200 

CCTGATCATCACCAACGCTCTGATCGTTGACTACACCGGTATCTACAAAG    250 

CTGACATCGGTATCAAAGACGGTAAAATCGCTGGTATCGGTAAAGGTGGT    300 

AACAAAGACATGCAGGACGGTGTTAAAAACAACCTGTCTGTTGGTCCGGC    350 

TACCGAAGCTCTGGCTGGTGAAGGTCTGATCGTTACCGCTGGTGGTATCG    400 

ACACCCACATCCACTTCATCTCTCCGCAGCAGATCCCGACCGCTTTCGCT    450 

TCTGGTGTTACCACCATGATCGGTGGTGGTACCGGTCCGGCTGACGGTAC    500 

CAACGCTACCACCATCACCCCGGGTCGTCGTAACCTGAAATGGATGCTGC    550 

GTGCTGCTGAAGAATACTCTATGAACCTGGGTTTCCTGGCTAAAGGTAAC    600 

GCTTCTAACGACGCTTCTCTGGCTGACCAGATCGAAGCTGGTGCTATCGG    650 

TTTCAAAATCCACGAAGACTGGGGTACCACCCCGTCTGCTATCAACCACG    700 

CTCTGGACGTTGCTGACAAATACGACGTTCAGGTTGCTATCCACACCGAC    750 

ACCCTGAACGAAGCTGGTTGCGTTGAAGACACCATGGCTGCTATCGCTGG    800 

TCGTACCATGCACACCTTCCACACCGAAGGTGCTGGTGGTGGTCACGCTC    850 

CGGACATCATCAAAGTTGCTGGTGAACACAACATCCTGCCGGCTTCTACC    900 

AACCCGACCATCCCGTTCACCGTTAACACCGAAGCTGAACACATGGACAT    950 

GCTGATGGTTTGCCACCACCTGGACAAATCTATCAAAGAAGACGTTCAGT    1000 

TCGCTGACTCTCGTATCCGTCCGCAGACCATCGCTGCTGAAGACACCCTG    1050 

CACGACATGGGTATCTTCTCTATCACCTCTTCTGACTCTCAGGCTATGGG    1100 

TCGTGTTGGTGAAGTTATCACCCGTACCTGGCAGACCGCTGACAAAAACA    1150 

AAAAAGAATTCGGTCGTCTGAAAGAAGAAAAAGGTGACAACGACAACTTC    1200 

CGTATCAAACGTTACCTGTCTAAATACACCATCAACCCGGCTATCGCTCA    1250 

CGGTATCTCTGAATACGTTGGTTCTGTTGAAGTTGGTAAAGTTGCTGACC    1300 

TGGTTCTGTGGTCTCCGGCTTTCTTCGGTGTTAAACCGAACATGATCATA    1350 

AAGGGTGGCTTCATCGCTCTGTCGCAGATGGGTGACGCTAACGCTTCTAT    1400 

CCCGACCCCACAGCCGGTCTACTACAGGGAAATGTTCGCTCACCACGGTA    1450 

AAGCTAAATACGACGCTAACATCACCTTCGTTTCTAAAGCTGCTTACGAC    1500 

AAAGGTATCAAAGAAGAACTGGGTCTGGAACGTCAGGTTCTGCCGGTTAA    1550 

AAACTGCCGTAACATCACCAAAAAAGACATGCAGTTCAACGACACCACCG    1600 

CTCACATCGAAGTTAACCCGGAAACCTACCACGTTTTCGTTGACGGTAAA    1650 

GAAGTTACCTCTAAACCGGCTACCAAAGTTTCTCTGGCTCAGCTGTTCTC    1700 

TATCTTCGAATTCGAAGAACCGTGGATCCACCACGCTCCGCCGGGTTGCG    1750 

GTAACGCTCCGCGTTCTTCTATGTCTAACACCTGCGACGAAAAAACCCAG    1800 

TCTCTGGGTGTTAAATTCCTGGACGAATACCAGTCTAAAGTTAAACGTCA    1850 

GATCTTCTCTGGTTACCAGTCTGACATCGACACCCACAACCGTATCAAAG    1900 

ACGAACTGTAA 

表达载体PET-28a-UreB-CTA2的构建： 

表达载体PET-28a，幽门螺旋杆菌ureB基因和霍乱弧菌毒素CTA2融合基因，分别用NdeI和HindIII酶切消化。经琼脂糖电泳，凝胶中的目的DNA回收纯化。然后进行连接反应，根据目的片段和载体摩尔数比为1∶3-1∶10的原则，设计连接反应体系如下： 

目的DNA15ul，PET-28a载体3ul，10倍连接缓冲液2.5ul，ddH₂O3.5ul， T4连接酶1ul，总体积25ul，16℃连接反应16小时。 

1.1.2大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl₂法) 

从-70℃保存的DH5a甘油菌中挑微量菌划板，挑取E.coli DH10B受体菌单菌落于装有5ml LB培养基的有盖试管中，37℃振荡(200rpm)培养10～12小时(前一天下午)，得到种子液，将5m1种子液接入100ml新鲜LB培养基中振荡(200rpm)培养，至菌液的OD₆₀₀为0.4～0.9时比较合适(1.5～2小时)，取新鲜培养液1.5ml转入eppendorf管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下4000rpm离心10分钟，小心弃上清，重复前两步一次，收集菌体。加入冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液300μl轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀加入100μl预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，即为感受态细胞，12～24小时后立即使用，如果感受态细胞需贮存以后再使用，则加入30μl预冷的含50％甘油与70μl的0.1mol/L的CaCl₂溶液(甘油终浓度为15％)，置-70℃保存(可保存半年)备用， 

1.1.3用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。 

-70℃冰箱中取出感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上，加入连接反应液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻弹匀，冰上放置30分钟，42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟，向管中加入800μl LB液体培养基，混匀后37℃150rpm振荡培养1.5小时，上述菌液4000rpm离心5min，倒掉上清，取沉淀涂布于含Kan的筛选平板，37℃培养过夜。 

1.1.4表达融合蛋白工程菌的构建及筛选： 

挑取大肠杆菌DH5a单菌落，提取质粒，双酶切鉴定。酶切鉴定结果如图3所示，酶切片段大小于设计一致，证明重组质粒构建成功。大肠杆菌BL21-DE3的感受态菌制备，转化及重组菌的质粒抽提、酶切鉴定同前。 

1.2重组工程菌PET-28a-UreB-CTA2/BL21-DE3的发酵 

培养温度为37℃，PH7.0，加入氨水使PH值保持恒定，OD600为20左右开始诱导，诱导3h后收菌体。 

发酵培养基：甘油4ml/L、Tryptone12g/L、YE24g/L、，KH2PO42.31g/L、K2HPO4 12.54g/L。 

1.3UreB-CTA2/5CTB纯化方案： 

1.3.1包涵体提取： 

(1)TE缓冲液：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，PH 8.0； 

(2)包涵体洗涤液A：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，1％Triton X-100PH8.0； 

(3)包涵体洗涤液B：20mmol/L Tris，2mol/L Urea，PH 8.0； 

(4)包涵体溶解液：20mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，8mol/L Urea，PH 8.0； 

包涵体提取：菌体以TE缓冲液1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后，高压匀浆破菌1000ba、3次，15000g离心30min，收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A和B各洗2次。洗涤条件为：4℃搅拌20min，15000g离心30min。包涵体用包涵体溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3小时，15000g离心30min。 

1.3.2层析纯化： 

UreB等电点为5.6，用Q Sepharose FF阴离子交换柱纯化。 

1.3.3加入相应摩尔数的五聚体CTB 

为了易于目的蛋白与CTB结合，目的蛋白摩尔数和单体CTB，比例为1∶5。 

1.3.4透析复性 

试剂配制：1)TE缓冲液：Tris-HCL 10mmol/L(pH 8.0)，EDTA 1mmol/L(pH 8.0)； 

2)复性液：(1)尿素4mol/L，Tris-HCL 2.0mmol/L(pH 8.0)； 

实验步骤：1)测定蛋白浓度；2)将蛋白放入处理好的透析袋中，两端 用细线系好，将透析袋放入装有1L复性液的烧杯中，4℃，搅拌透析4h；3)将透析袋取出，放入装有1L TE缓冲液的烧杯中，4℃，搅拌2h； 

电泳检测目的蛋白是否与CTB形成5聚体结构，参见图6的电泳结果可知，由于CTB五聚体在变性剂尿素和SDS中都极稳定，不会分开；采用变性电泳，电泳过程中变性不会导致形成的五聚体结构分开。电泳结果表明形成了稳定的UreB-CTA2-5CTB结构。 

实施例2CagA-CTA2/5CTB的制备方法 

采用与实施例1相同的步骤制备CagA-CTA2/5CTB，区别仅在于采用CagA基因代替UreB基因。 

相应的基因序列(SEQ ID NO.：2)为： 

ATGAAACTGTTCGGTAACTCTAACAACAACAACAACGGTCTGAAAAACGA    50 

ACCGATCTACGCTCAGGTTAACAAAAAAAAAGCTGGTCAGGCTACCTCTC    100 

CGGAAGAACCGATCTACGCTCAGGTTGCTAAAAAAGTTTCTGCTAAAATC    150 

GACCAGCTGAACGAAGCTACCTCTGCTATCAACCGTAAAATCGACCGTAT    200 

CAACAAAATCGCTTCTGCTGGTAAAGGTGTTGGTGGTTTCTCTGGTGCTG    250 

GTCGTTCTGCTTCTCCGGAACCGATCTACGCTACCATCGACTTCGACGAA    300 

GCTAACCAGGCTGGTTTCCCGCTGCGTCGTTCTACCGCTGTTAACGACCT    350 

GTCTAAAGTTGGTCTGTCTCGTGAACAGGAACTGACCCGTCGTATCGGTG    400 

ACCTCAACCAGGCTGTAAGCGAAGCTAAAACCGGTCACTTCGACAAACTG    450 

GAACAGAAAATGGACGAACTGAAAGACTCTACCAAAAAAAACGCTCTGAA    500 

ACTGTGGGCTGAATCTACCAAACAGGTTCCGACCGGTCTGCAGGCTAAAC    550 

TGGACAACTACGCTACCAACTCTCACACCCGTATCAACTCTAACGTTCAG    600 

AACGGTGCTGTTAACGAAAAAGTTACCGGTATGCTGACCCAGAAAAACCC    650 

GGAATGGCTGAAACTGGTTAACGACAAAATCGTTGCTCACAACGTTGGTT    700 

CTGCTCACCTGTCTGAATACGACAAAATCGGTTTCAACCAGAAAAACATG    750 

AAAGACTACTCTGACTCTTTCAAATTCTCTACCAAACTGAACAACGCTGT    800 

TAAAGACATCAAATCTTCTTTCGTTCAGTTCCTGACCAACACCTTCTCTA    850 

CCGGTTCTTACTCTCTGATGAAAGCTAACGCTGAACACGGTGTTAAAAAC    900 

ACCACCAAAGAATTCGAAGAACCGTGGATCCACCACGCTCCGCCGGGTTG    950 

CGGTAACGCTCCGCGTTCTTCTATGTCTAACACCTGCGACGAAAAAACCC    1000 

AGTCTCTGGGTGTTAAATTCCTGGACGAATACCAGTCTAAAGTTAAACGT    1050 

CAGATCTTCTCTGGTTACCAGTCTGACATCGACACCCACAACCGTATCAA    1100 

AGACGAACTGTAA 

电泳结果参见图5。电泳结果表明菌体中表达了稳定的CagA-CTA2。 

实施例3NAP-CTA2/5CTB的制备方法 

采用与实施例1相同的步骤制备NAP-CTA2/5CTB，区别仅在于采用NAP基因代替UreB基因。 

相应的基因序列(SEQ ID NO.：3)为： 

ATGAAAACCTTCGAAATCCTGAAACACCTGCAGGCTGACGCTATCGTTCT    50 

GTTCATGAAAGTTCACAACTTCCACTGGAACGTTAAAGGTACCGACTTCT    100 

TCAACGTTCACAAAGCTACCGAAGAAATCTACGAAGAATTCGCTGACATG    150 

TTCGACGACCTGGCTGAACGTATCGTTCAGCTGGGTCACCACCCGCTGGT    200 

TACCCTGTCTGAAGCTATCAAACTGACCCGTGTTAAAGAAGAAACCAAAA    250 

CCTCTTTCCACTCTAAAGACATCTTCAAAGAAATCCTGGAAGACTACAAA    300 

CACCTGGAAAAAGAATTCAAAGAACTGTCTAACACCGCTGAAAAAGAAGG    350 

TGACAAAGTTACCGTTACCTACGCTGACGACCAGCTGGCTAAACTGCAGA    400 

AATCTATCTGGATGCTGCAGGCTCACCTGGCTGAATTCGAAGAACCGTGG    450 

ATCCACCACGCTCCGCCGGGTTGCGGTAACGCTCCGCGTTCTTCTATGTC    500 

TAACACCTGCGACGAAAAAACCCAGTCTCTGGGTGTTAAATTCCTGGACG    550 

AATACCAGTCTAAAGTTAAACGTCAGATCTTCTCTGGTTACCAGTCTGAC    600 

ATCGACACCCACAACCGTATCAAAGACGAACTGTAA 

电泳结果参见图4。电泳结果表明诱导之后菌体中表达了NAP-CTA2。 

实施例4嵌合蛋白(UreB-CTA2/5CTB)免疫原性反应 

4只11至12周的Balb/C小鼠为一个实验组，100ugUreB-CTA2/5CTB嵌合蛋白溶解在0.5毫升的350mM碳酸氢钠，0.5毫升的350mM碳酸氢钠作为空白对照。每间隔10天胃口服一次，共3次。实验动物进食前2小时和进食后1小时，都要口服试验样品。 

在小鼠免疫前1天(0天)和免疫后每周(8，18，28天)，从小鼠尾静脉抽血，得到血清。 

每间隔15分钟共4次，向小鼠胃注入0.5毫升的灌洗液(25mM的氯化钠，40mM硫酸钠，10mM氯化钾，20mM NaHCO₃和48.5mMpolyethyleneglycol)用于胃液提取物抗体制备，在最后一次灌洗30分钟后，向小鼠腹腔注射0.2ml匹罗卡品悬液(5mg/ml)，在注射后30分钟 后，提取小鼠胃液。 

在小鼠血清和胃液中提取IgG和IgA抗体，将UreB-CTA2/5CTB所产生的抗体进行定量用ELISA法检测，结果参见图7和图8。 

结果表明，UreB-CTA2/5CTB产生的抗体水平显著高于仅仅用UreB产生的抗体。而且无论是针对在血清中的抗体还是分泌型的抗体，都观察到UreB-CTA2/5CTB诱导产生了显著升高的抗体。这表明本发明的抗原组合物明显提高了原抗原的免疫原性水平，提高了抗原的效价，有助于更加有效的疫苗的制备。而且图8分泌型IgA检测的结果还表明，本发明的重组抗原构成的嵌合蛋白抗原穿透肠黏膜，并刺激黏膜产生分泌型IgA免疫。 

以上仅仅以幽门螺旋杆菌相关抗原为例，说明了本发明的CT-A2-5CTB系统在增强抗原的免疫原性方面的应用和效果，但是本领域技术人员均知，包括但不限于幽门螺旋杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原的其他抗原也可以使用本发明的CT-A2-5CTB系统，提高其免疫原性，并制备高效价疫苗。其相应的载体选择和制备、蛋白质的表达和纯化均为本领域公知技术，本领域普通技术人员在了解了本发明的发明点之后，均可以利用本发明的CT-A2-5CTB系统制备相应的融合蛋白和抗原组合物，并检测其相应的免疫原性的提高。 

所以，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。 

序列表 

<110>上海联合赛尔生物工程有限公司 

<120>重组抗原组合物、疫苗、制备该抗原组合物的载体和方法 

<130>DF10-110804 

<160>3 

<210>1 

<211>1911 

<212>DNA 

<213>合成序列 

<400>ATGAAAAAAATCTCTAGGAAAGAGTACGTAAGCATGTACGGTCCGACCAC    50 

CGGTGACAAAGTTCGTCTGGGTGACACCGACCTGATCGCTGAAGTTGAAC    100 

ACGACTACACCATCTACGGTGAAGAACTGAAATTCGGTGGTGGTAAAACC    150 

CTGCGTGAAGGTATGTCTCAGTCTAACAACCCGTCTAAAGAAGAACTGGA    200 

CCTGATCATCACCAACGCTCTGATCGTTGACTACACCGGTATCTACAAAG    250 

CTGACATCGGTATCAAAGACGGTAAAATCGCTGGTATCGGTAAAGGTGGT    300 

AACAAAGACATGCAGGACGGTGTTAAAAACAACCTGTCTGTTGGTCCGGC    350 

TACCGAAGCTCTGGCTGGTGAAGGTCTGATCGTTACCGCTGGTGGTATCG    400 

ACACCCACATCCACTTCATCTCTCCGCAGCAGATCCCGACCGCTTTCGCT    450 

TCTGGTGTTACCACCATGATCGGTGGTGGTACCGGTCCGGCTGACGGTAC    500 

CAACGCTACCACCATCACCCCGGGTCGTCGTAACCTGAAATGGATGCTGC    550 

GTGCTGCTGAAGAATACTCTATGAACCTGGGTTTCCTGGCTAAAGGTAAC    600 

GCTTCTAACGACGCTTCTCTGGCTGACCAGATCGAAGCTGGTGCTATCGG    650 

TTTCAAAATCCACGAAGACTGGGGTACCACCCCGTCTGCTATCAACCACG    700 

CTCTGGACGTTGCTGACAAATACGACGTTCAGGTTGCTATCCACACCGAC    750 

ACCCTGAACGAAGCTGGTTGCGTTGAAGACACCATGGCTGCTATCGCTGG    800 

TCGTACCATGCACACCTTCCACACCGAAGGTGCTGGTGGTGGTCACGCTC    850 

CGGACATCATCAAAGTTGCTGGTGAACACAACATCCTGCCGGCTTCTACC    900 

AACCCGACCATCCCGTTCACCGTTAACACCGAAGCTGAACACATGGACAT    950 

GCTGATGGTTTGCCACCACCTGGACAAATCTATCAAAGAAGACGTTCAGT    1000 

TCGCTGACTCTCGTATCCGTCCGCAGACCATCGCTGCTGAAGACACCCTG    1050 

CACGACATGGGTATCTTCTCTATCACCTCTTCTGACTCTCAGGCTATGGG    1100 

TCGTGTTGGTGAAGTTATCACCCGTACCTGGCAGACCGCTGACAAAAACA    1150 

AAAAAGAATTCGGTCGTCTGAAAGAAGAAAAAGGTGACAACGACAACTTC    1200 

CGTATCAAACGTTACCTGTCTAAATACACCATCAACCCGGCTATCGCTCA    1250 

CGGTATCTCTGAATACGTTGGTTCTGTTGAAGTTGGTAAAGTTGCTGACC    1300 

TGGTTCTGTGGTCTCCGGCTTTCTTCGGTGTTAAACCGAACATGATCATA    1350 

AAGGGTGGCTTCATCGCTCTGTCGCAGATGGGTGACGCTAACGCTTCTAT    1400 

CCCGACCCCACAGCCGGTCTACTACAGGGAAATGTTCGCTCACCACGGTA    1450 

AAGCTAAATACGACGCTAACATCACCTTCGTTTCTAAAGCTGCTTACGAC    1500 

AAAGGTATCAAAGAAGAACTGGGTCTGGAACGTCAGGTTCTGCCGGTTAA    1550 

AAACTGCCGTAACATCACCAAAAAAGACATGCAGTTCAACGACACCACCG    1600 

CTCACATCGAAGTTAACCCGGAAACCTACCACGTTTTCGTTGACGGTAAA    1650 

GAAGTTACCTCTAAACCGGCTACCAAAGTTTCTCTGGCTCAGCTGTTCTC    1700 

TATCTTCGAATTCGAAGAACCGTGGATCCACCACGCTCCGCCGGGTTGCG    1750 

GTAACGCTCCGCGTTCTTCTATGTCTAACACCTGCGACGAAAAAACCCAG    1800 

TCTCTGGGTGTTAAATTCCTGGACGAATACCAGTCTAAAGTTAAACGTCA    1850 

GATCTTCTCTGGTTACCAGTCTGACATCGACACCCACAACCGTATCAAAG    1900 

ACGAACTGTAA                                           1911 

<210>2 

<211>1113 

<212>DNA 

<213>合成序列 

<400>ATGAAACTGTTCGGTAACTCTAACAACAACAACAACGGTCTGAAAAACGA    50 

ACCGATCTACGCTCAGGTTAACAAAAAAAAAGCTGGTCAGGCTACCTCTC    100 

CGGAAGAACCGATCTACGCTCAGGTTGCTAAAAAAGTTTCTGCTAAAATC    150 

GACCAGCTGAACGAAGCTACCTCTGCTATCAACCGTAAAATCGACCGTAT    200 

CAACAAAATCGCTTCTGCTGGTAAAGGTGTTGGTGGTTTCTCTGGTGCTG    250 

GTCGTTCTGCTTCTCCGGAACCGATCTACGCTACCATCGACTTCGACGAA    300 

GCTAACCAGGCTGGTTTCCCGCTGCGTCGTTCTACCGCTGTTAACGACCT    350 

GTCTAAAGTTGGTCTGTCTCGTGAACAGGAACTGACCCGTCGTATCGGTG    400 

ACCTCAACCAGGCTGTAAGCGAAGCTAAAACCGGTCACTTCGACAAACTG    450 

GAACAGAAAATGGACGAACTGAAAGACTCTACCAAAAAAAACGCTCTGAA    500 

ACTGTGGGCTGAATCTACCAAACAGGTTCCGACCGGTCTGCAGGCTAAAC    550 

TGGACAACTACGCTACCAACTCTCACACCCGTATCAACTCTAACGTTCAG    600 

AACGGTGCTGTTAACGAAAAAGTTACCGGTATGCTGACCCAGAAAAACCC    650 

GGAATGGCTGAAACTGGTTAACGACAAAATCGTTGCTCACAACGTTGGTT    700 

CTGCTCACCTGTCTGAATACGACAAAATCGGTTTCAACCAGAAAAACATG    750 

AAAGACTACTCTGACTCTTTCAAATTCTCTACCAAACTGAACAACGCTGT    800 

TAAAGACATCAAATCTTCTTTCGTTCAGTTCCTGACCAACACCTTCTCTA    850 

CCGGTTCTTACTCTCTGATGAAAGCTAACGCTGAACACGGTGTTAAAAAC    900 

ACCACCAAAGAATTCGAAGAACCGTGGATCCACCACGCTCCGCCGGGTTG    950 

CGGTAACGCTCCGCGTTCTTCTATGTCTAACACCTGCGACGAAAAAACCC    1000 

AGTCTCTGGGTGTTAAATTCCTGGACGAATACCAGTCTAAAGTTAAACGT    1050 

CAGATCTTCTCTGGTTACCAGTCTGACATCGACACCCACAACCGTATCAA    1100 

AGACGAACTGTAA                                         1113 

<210>3 

<211>636 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>ATGAAAACCTTCGAAATCCTGAAACACCTGCAGGCTGACGCTATCGTTCT    50 

GTTCATGAAAGTTCACAACTTCCACTGGAACGTTAAAGGTACCGACTTCT    100 

TCAACGTTCACAAAGCTACCGAAGAAATCTACGAAGAATTCGCTGACATG    150 

TTCGACGACCTGGCTGAACGTATCGTTCAGCTGGGTCACCACCCGCTGGT    200 

TACCCTGTCTGAAGCTATCAAACTGACCCGTGTTAAAGAAGAAACCAAAA    250 

CCTCTTTCCACTCTAAAGACATCTTCAAAGAAATCCTGGAAGACTACAAA    300 

CACCTGGAAAAAGAATTCAAAGAACTGTCTAACACCGCTGAAAAAGAAGG    350 

TGACAAAGTTACCGTTACCTACGCTGACGACCAGCTGGCTAAACTGCAGA    400 

AATCTATCTGGATGCTGCAGGCTCACCTGGCTGAATTCGAAGAACCGTGG    450 

ATCCACCACGCTCCGCCGGGTTGCGGTAACGCTCCGCGTTCTTCTATGTC    500 

TAACACCTGCGACGAAAAAACCCAGTCTCTGGGTGTTAAATTCCTGGACG    550 

AATACCAGTCTAAAGTTAAACGTCAGATCTTCTCTGGTTACCAGTCTGAC    600 

ATCGACACCCACAACCGTATCAAAGACGAACTGTAA                  636 

Claims (10)

1.一种抗原组合物，包括：

抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白；和

霍乱毒素CT-B蛋白。

2.如权利要求1所述的抗原组合物，其中所述抗原包括选自由幽门螺旋杆菌抗原、伤寒抗原、流感HA抗原等组成的组中的至少一种。

3.如权利要求2所述的抗原组合物，其中所述幽门螺旋杆菌抗原选自幽门螺旋杆菌尿素酶、幽门螺旋杆菌CagA蛋白和幽门螺旋杆菌中性白细胞激活蛋白中的至少一种。

4.如权利要求1至3中任一项所述的抗原组合物，其中所述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和所述霍乱毒素CT-B蛋白的摩尔比为1∶5。

5.一种疫苗，包括如权利要求1-4中任一项中所述的抗原组合物中的至少一种。

6.一种载体组合物，包括表达如权利要求1-4中任一项中所述的抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白的载体和表达霍乱毒素CT-B蛋白的载体。

7.一种表达宿主菌，所述宿主菌中转化或转染了如权利要求6所述的载体组合物所包含的载体中的至少一种。

8.一种制备疫苗的方法，包括用权利要求6所述的载体组合物中的载体分别表达所述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和霍乱毒素CT-B蛋白，然后将这两种蛋白混合，并复性使这两种蛋白结合形成嵌合蛋白。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗原与霍乱毒素CT-A2亚基的融合蛋白和霍乱毒素CT-B蛋白混合的摩尔比为1∶5。

10.如权利要求1-4中任一项所述的抗原组合物在制备用于治疗或预防所述抗原相关疾病的药物中的应用。

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