CN104844712B - 肺炎链球菌蛋白抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

肺炎链球菌蛋白抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肺炎链球菌蛋白抗原，以及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及肺炎链球菌表面粘附素A与肺炎链球菌表面蛋白A的融合蛋白及其制备方法。本发明还涉及编码其的核酸及用于表达其的载体和细胞。本发明还涉及包含其的疫苗组合物以及包含其和其他蛋白抗原的组合物及其用途。

Description

肺炎链球菌蛋白抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及肺炎链球菌蛋白抗原，以及其制备方法、包含其的组合物及其用途。
背景技术
1.肺炎链球菌
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种有荚膜的革兰氏阳性菌。它是一种常见的致病菌，也是社区获得性肺炎最主要的致病原，同时还能够引起鼻窦炎、中耳炎和脑膜炎等。在发展中国家，肺炎链球菌所引起的肺炎是老人与儿童的主要致死病因之一；而在发达国家，由肺炎链球菌导致的中耳炎也是儿科中最常见的疾病之一。据估计，2000年全世界有100万左右5岁以下的儿童死于肺炎链球菌疾病。Christa L Fischer Walker等估计，2010年全世界有1400万左右5岁以下儿童发展为严重肺炎。其中肺炎链球菌是最主要的严重肺炎的致病原，世界范围内至少18％的严重病例和33％肺炎致死病例都是由肺炎链球菌导致的。
2.肺炎链球菌疫苗研究现状
目前，市售的疫苗主要为多糖疫苗和多糖结合疫苗，它们都是基于肺炎链球菌的荚膜多糖的型特异性的疫苗。根据肺炎链球菌荚膜多糖的不同，已经鉴定出90多个不同的血清型。因此多糖疫苗很难将所有的血清型覆盖。23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗对2岁以下免疫系统发育不完全的儿童无效，而广泛应用的7价肺炎结合疫苗仅覆盖占亚洲地区的致病血清型的55％的7个血清型。并且由于多糖疫苗和多糖结合疫苗的应用，已经开始出现血清型的替代现象，导致疫苗的有效性逐年下降。同时由于多糖结合疫苗的价格昂贵，而很难在发展中国家实施。尽管2007年WHO就建议发展中国家将肺炎链球菌结合疫苗纳入国家免疫计划，但是至今仍未实现。
肺炎链球菌蛋白疫苗则因为具有不依赖血清型、相对廉价、免疫原性好等特点，成为了目前肺炎链球菌疫苗研发的热点。
3.肺炎链球菌表面粘附素A
肺炎链球菌表面粘附素A(pneumococcal surface adhesin A，简称PsaA)是所有肺炎链球菌菌株共同表达的一种高度保守的、种特异性的表面结合脂蛋白，分子量为37KD，具有较好的免疫原性，在锰转运和肺炎链球菌粘附呼吸道粘膜过程中发挥关键作用，是肺炎链球菌入侵的一种重要的毒力因子。据报道，PsaA突变株影响了肺炎链球菌很多重要的功能，包括粘附和毒力。PsaA具有良好的免疫原性。文献报道PsaA免疫后或肺炎链球菌鼻咽部定植后均可诱导出高效价的PsaA抗体；并且评价了PsaA的免疫保护效能。因此，PsaA蛋白以其种特异性、序列保守性、较好的免疫原性和免疫保护性成为肺炎链球菌蛋白疫苗的研究热点之一。
4.肺炎链球菌表面蛋白A
肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，简称PspA)是胆碱结合家族的一种细菌表面蛋白，是肺炎链球菌重要的毒力因子。PspA的主要功能是其与乳铁蛋白结合使之丧失抑菌活性；抑制补体在肺炎链球菌表面沉积从而干扰补体介导的调理吞噬作用。研究已经证明PspA-菌株毒力低，感染机体后很快被机体清除。主动免疫重组的PspA蛋白后可以对各种攻毒模型进行保护。
目前，在所有临床分离的肺炎链球菌株中均发现PspA的存在。但PspA分子结构并不保守，分子量为67-100KD不等。PspA分子包括5个区域：信号肽区、一个α螺旋区、脯氨酸富集区、胆碱结合区和C端17个氨基酸尾。胆碱结合区是PspA结合细胞表面的区域。
尽管PspA的结构和抗原性具有多变性，但是针对PspA产生的抗体具有高度的交叉反应性与交叉保护性。基因和蛋白图谱研究显示，主要的交叉保护性抗原表位位于α螺旋中靠近脯氨酸富集区的大约100个氨基酸左右的序列，被称为亚类决定区(clade definingregion，简称CDR)。根据CDR区的不同，PspA被分为3个家族(Fam1、Fam2、Fam3)、6个亚类(Clade1、Clade2、Clade3、Clade4、Clade5、Clade6)，6个亚类分别属于3个家族，其中Clade1、Clade2属于Fam1家族，Clade3、Clade4、Clade5属于Fam2家族，Clade6属于Fam3家族。每个家族内亚类间CDR区基因序列相似度大于80％；各家族间CDR区基因序列间相似度大于50％。在三个家族中，家族1与家族2流行率大于98％。
现有技术中应用的蛋白疫苗多是使用单一蛋白，而只针对某一类型的肺炎链球菌，因此不具有广谱性。本发明使用PsaA与PspA的融合蛋白以及使用该融合蛋白与其他蛋白抗原联合或作为蛋白载体，而增加疫苗的广谱性和保护性。
发明内容
发明人发现，与对照组(PBS)相比，PsaA-PspA融合蛋白免疫动物后能够诱导出高效价的抗体，并且对家族1和家族2的菌株的攻毒都有很好的保护性作用；与对照组(PBS)相比，PsaA-PspA与PspA家族2亚类4(PspA4)的联合使用也对家族1和家族2的攻毒菌株也都有很好的保护作用。
在第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含肺炎链球菌表面粘附素A(PsaA)与肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)，其中所述PsaA是PsaA蛋白全序列或截短序列，所述PspA是PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中任何一个亚类的全序列或截短序列或者PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中两个或两个以上亚类的全部或部分序列的融合蛋白。优选地，所述PsaA与所述PspA之间以接头连接。优选地，所述不同PspA部分序列之间以接头连接。优选地，所述PsaA的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。优选地，所述PspA为PspA亚类2的α螺旋区与PspA亚类3的CDR区氨基酸序列连接所得的序列，更优选通过接头连接所得的序列，进一步更优选所述PspA亚类2的N端序列为SEQ ID NO:2所示的序列，所述PspA亚类3的高变区为SEQ ID NO:3所示的序列，最优选地，所述PspA为SEQ ID NO:4所示的序列。最优选地，所述融合蛋白的序列为SEQ ID NO:5所示的序列。
在第二方面，本发明提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。优选地，所述核酸是经密码子优化设计的。更优选地，所述核酸是按照原核细胞偏爱的密码子优化设计的。更优选地，所述核酸是按照大肠杆菌(Escherichia coli)偏爱的密码子优化设计的。最优选地，所述核酸为SEQ ID NO:6所示的序列。
在第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，其包含第二方面的核酸，所述核酸可操作地与表达调控元件相连。优选地，所述表达载体是质粒。更优选地，所述表达载体是PET20b质粒。
在第四方面，本发明提供了一种重组细胞，其包含本发明第三方面的重组表达载体。优选地，所述细胞为原核细胞。更优选地，所述细胞为大肠杆菌。最优选地，所述细胞为大肠杆菌BL21。
在第五方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的PsaA-PspA融合蛋白的方法，其包括将编码所述PsaA-PspA的核酸插入表达载体；将所得的重组表达载体导入生物体，使所述核苷酸序列表达生成所述融合蛋白。优选地，所述方法还包括分离和纯化步骤。更优选地，使用亲和层析、离子交换层析和/或凝胶过滤层析对所述融合蛋白进行纯化。
在第六方面，本发明提供了一种组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的核酸、第三方面所述的载体、或第四方面所述的细胞，以及可药用载体。
在第七方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含第一方面所述的融合蛋白。优选地，所述疫苗组合物还包含佐剂。最优选地，所述佐剂是Al(OH)3佐剂。
在第八方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含第一方面的融合蛋白和至少一种其他肺炎链球菌蛋白抗原。优选地，所述其他蛋白抗原为表面暴露蛋白的全长或截短序列。更优选地，所述其他蛋白抗原为PspA的全长或截短序列。进一步更优选地，所述其他蛋白为PspA亚类4的全长或截短序列。最优选地，所述其他蛋白的序列为SEQ ID NO：8所示的序列。优选地，所述疫苗组合物还包含佐剂。更优选地，所述佐剂是Al(OH)3佐剂。
在第九方面，本发明提供了所述融合蛋白单独或与其他蛋白抗原联合用于制备预防肺炎链球菌感染的疫苗中的应用。
附图说明
图1.1示出了表达载体PET20b-PspA4质粒经Nde I和Xho I双酶切电泳图。1：1 kbDNA Ladder；2：PET20b-PspA4质粒经Nde I和Xho I双酶切后的条带。如图所示，PET20b-PspA4经双酶切验证后大小正确，约3700bp处条带为PET20b空载体线性片段，约1300bp处条带为PspA4目的片段。
图1.2示出了表达载体PET20b-PsaA-PspA质粒经Nde I和Xho I双酶切电泳图。1:1kb DNA Ladder；2：PET20b-PsaA-PspA质粒经Nde I和Xho I双酶切。如图所示，PET20b-PsaA-PspA双酶切后大小正确，约3700bp处条带为PET20b空载体线性片段，约2100bp处条带为PsaA-PspA目的片段。
图1.3示出了表达载体PET20b-PspA质粒经Nde I和Xho I双酶切电泳图。1:1kbDNA Ladder；2：PET20b-PspA质粒经Nde I和Xho I双酶切。如图所示，PET20b-PspA双酶切后大小正确，约3700bp处条带为PET20b空载体线性片段，约1150bp处条带为PspA目的片段。
图1.4示出了表达载体PET20b-PsaA质粒经Nde I和Xho I双酶切电泳图。1:1 kbDNA Ladder；2：PET20b-PsaA质粒经Nde I和Xho I双酶切。如图所示，PET20b-PsaA双酶切后大小正确，约3700bp处条带为PET20b空载体线性片段，约900bp处条带为PsaA目的片段。
图2.1示出了PsaA-PspA融合蛋白纯化后的SDS-PAGE图。1：真核蛋白marker条带；2：PsaA-PspA融合蛋白条带。如图所示，所述PsaA-PspA融合蛋白的大小为88.0kD，并且纯度约为82.0％。
图2.2示出了PspA4蛋白纯化后的SDS-PAGE图。1：真核蛋白marker条带；2：PspA4蛋白条带。如图所示，所述PspA4蛋白的大小为63.8kD，并且纯度约为94.2％。
图2.3示出了PspA蛋白纯化后的SDS-PAGE图。1：原核蛋白marker条带；2：PspA蛋白条带。如图所示，所述PspA蛋白的大小为42.5kD，并且纯度约为88.0％。
图2.4示出了PsaA蛋白纯化后的SDS-PAGE图。1：原核蛋白marker条带；2：PsaA蛋白条带。如图所示，所述PsaA蛋白的大小为35.4kD，并且纯度约为86.0％。
图3.1的线形图示出了使用不同的抗原免疫小鼠后诱导出的PsaA-PspA抗体效价。菱形为使用单独的PsaA-PspA融合蛋白与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PsaA-PspA抗体的效价。正方形为使用PsaA-PspA融合蛋白和PspA4与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PsaA-PspA抗体的效价。三角形为使用对照PBS与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PsaA-PspA抗体的效价。与对照相比，单独的PsaA-PspA融合蛋白以及PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合都能诱导出高效价的PsaA-PspA抗体。
图3.2的线形图示出了使用不同的抗原免疫小鼠后诱导出的PspA4抗体效价。菱形为使用单独的PspA4与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PspA4抗体的效价。正方形为使用PsaA-PspA融合蛋白和PspA4与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PspA4抗体的效价。三角形为使用对照PBS与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PspA4抗体的效价。与对照相比，单独的PspA4以及PsaA-PspA与PspA4联合都能诱导出高效价的PspA4抗体。
图3.3的线形图示出了使用不同的抗原免疫小鼠后诱导出的PspA抗体效价。菱形为使用单独的PspA与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PspA抗体的效价。正方形为使用PsaA和PspA与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PspA抗体的效价。三角形为使用对照PBS与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PspA抗体的效价。与对照相比，单独的PspA以及PsaA和PspA联合都能诱导出高效价的PspA抗体。
图3.4的线形图示出了使用不同的抗原免疫小鼠后诱导出的PsaA抗体效价。菱形为使用单独的PsaA与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PsaA抗体的效价。正方形为使用PsaA和PspA与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PsaA抗体的效价。三角形为使用对照PBS与佐剂Al(OH)3的混合物皮下免疫小鼠后，诱导出的PsaA抗体的效价。与对照相比，单独的PsaA以及PsaA和PspA联合都能诱导出高效价的PsaA抗体。
图4.1的柱形图示出了使用不同的免疫原对小鼠进行免疫后，用肺炎链球菌ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)对小鼠进行腹腔攻毒14天后小鼠的存活率。图中从左至右的柱状图分别表示PBS(对照)、PsaA、PspA、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4、PsaA与PspA联合、PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合和23价多糖肺炎疫苗进行免疫的小鼠存活率。
图4.2的柱形图示出了使用不同的免疫原对小鼠进行免疫后，用肺炎链球菌ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)对小鼠进行鼻腔攻毒14天后小鼠的存活率。图中从左至右的柱状图分别表示PBS(对照)、PsaA、PspA、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4、PsaA与PspA联合、PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合和23价多糖肺炎疫苗进行免疫的小鼠存活率。
图4.3的柱形图示出了使用不同的免疫原对小鼠进行免疫后，用肺炎链球菌ATCC10813菌株(PspA家族1亚类2)对小鼠进行腹腔攻毒14天后小鼠的存活率。图中从左至右的柱状图分别表示PBS(对照)、PsaA、PspA、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4、PsaA与PspA联合、PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合和23价多糖肺炎疫苗进行免疫的小鼠存活率。
图4.4的柱形图示出了使用不同的免疫原对小鼠进行免疫后，用肺炎链球菌ATCC6314菌株(PspA家族2亚类4)对小鼠进行腹腔攻毒14天后小鼠的存活率。图中从左至右的柱状图分别表示PBS(对照)、PsaA、PspA、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4、PsaA与PspA联合以及PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合进行免疫的小鼠存活率。
图4.5的柱形图示出了使用不同的免疫原对小鼠进行免疫后，用肺炎链球菌ATCC6303菌株(PspA家族2亚类5)对小鼠进行腹腔攻毒14天后小鼠的存活率。图中从左至右的柱状图分别表示PBS(对照)、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4以及PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合进行免疫的小鼠存活率。
图4.6的柱形图示出了使用不同的免疫原对小鼠进行免疫后，用肺炎链球菌ATCC6303菌株(PspA家族2亚类5)对小鼠进行鼻腔攻毒14天后小鼠的存活率。图中从左至右的柱状图分别表示PBS(对照)、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4以及PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合进行免疫的小鼠存活率。
具体实施方式
下文中结合具体实施例说明本发明的优势和技术效果。本发明的保护范围以权利要求书限定的为准，实施例仅是示例性地说明本发明的理念和原则，应理解，这些具体描述的实施方案不应构成对本发明范围的限制。
通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。应当理解的是，除非另有说明，下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备；所使用的培养基均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。
实施例
实施例1：编码目标蛋白的核酸序列的密码子优化及合成
1.PsaA-PspA融合蛋白氨基酸序列的选取，密码子优化及编码核苷酸序列的合成
选取肺炎链球菌D39菌株的PsaA(GenBank:P0A4G2.1)的20-309位氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示；肺炎链球菌RX1菌株PspA(家族1亚类2)(GenBank:M74122.1)的32-319位氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示；肺炎链球菌EF3296的PspA(家族2亚类3)(GenBank:AF071816.1)的346-420位氨基酸序列，如SEQ ID NO:3所示；PsaA-PspA融合蛋白中的PspA蛋白部分为上述肺炎链球菌RX1菌株PspA(家族1亚类2)的32-319位氨基酸序列与肺炎链球菌EF3296的PspA(家族2亚类3)的346-420位氨基酸序列中间通过接头连接，PspA蛋白部分的氨基酸序列如SED ID NO:4所示；PsaA-PspA融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEDID NO:4序列的融合，中间以接头连接，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码PsaA-PspA融合蛋白氨基酸序列的核苷酸序列进行优化。从而获得如SEQ ID NO:6所示的编码如SEQ ID NO:5所示的PsaA-PspA融合蛋白的核苷酸序列。为了便于酶切操作，而在核酸合成时5’端依次引入了NdeI酶切位点和6个组氨酸的标签，3’端引入了XhoI酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
人工合成如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所合成的序列保存在pGH质粒中。
2.PspA4蛋白氨基酸序列的选取，密码子优化及编码核苷酸序列的合成
选取肺炎链球菌EF5668菌株的PspA(家族2亚类4)(GenBank:U89711.1)的32-450位氨基酸序列，如SEQ ID NO:8所示。
选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码PspA4蛋白氨基酸序列的核苷酸序列进行优化。从而获得如SEQ ID NO:9所示的PspA4蛋白的核苷酸序列。为了便于酶切操作，在核酸合成时5’端引入了NdeI酶切位点，3’端引入了XhoI酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
人工合成如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，所合成的序列保存在pGH质粒中。
3.PsaA蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
选取肺炎链球菌D39菌株的PsaA(GenBank:P0A4G2.1)的20-309位氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。为了便于酶切操作，通过PCR技术在编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入XhoI酶切位点。
通过PCR技术，以人工合成的如SEQ ID NO:7所示的PsaA-PspA融合蛋白的核苷酸序列为模板，以如SEQ ID NO:13所示的序列为5’端引物，以如SEQ ID NO:14所示的序列为3’端引物，获得如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
PCR反应体系为：5’端引物1μL；3’端引物1μL；模板1μL；Taq酶0.5μL；10×PCR反应缓冲液5μL；dNTP(10mmol)1μL；MgSO4(50mmol)1.5μL；水39μL。
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃60s(共30个循环)；72℃10min。
将测序正确的PCR扩增的PsaA核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。连接体系：T-easy 1μL；PCR产物0.5μL；T4连接酶0.5μL；10×T4缓冲液5μL；水3μL。条件为：16℃过夜。次日转化到大肠杆菌Top 10(购于天根生化科技有限公司)中，涂板37℃培养过夜。选取单克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正确的质粒用于酶切操作。
4.PspA蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
选取肺炎链球菌RX1菌株PspA(家族1亚类2)(GenBank:M74122.1)的32-319位氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示；肺炎链球菌EF3296的PspA(家族2亚类3)(GenBank:AF071816.1)的346-420位氨基酸序列，如SEQ ID NO:3所示；PspA蛋白为上述氨基酸序列中间通过接头连接，氨基酸序列如SED ID NO:4所示。为了便于酶切操作，在编码如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列的5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入XhoI酶切位点。
通过PCR技术，以人工合成的如SEQ ID NO:7所示的PsaA-PspA融合蛋白的核苷酸序列为模板，以如SEQ ID NO:15所示的序列为5’端引物，以如SEQ ID NO:16所示的序列为3’端引物，获得如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
PCR反应体系为：5’端引物1μL；3’端引物1μL；模板1μL；Taq酶0.5μL；10×PCR缓冲液5μL；dNTP(10mmol)1μL；MgSO4(50mmol)1.5μL；水39μL。
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃90s(共30个循环)；72℃10min。
将测序正确的PCR扩增的PspA核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。连接体系：T-easy 1μL；PCR产物0.5μL；T4连接酶0.5μL；10×T4缓冲液5μL；水3μL。条件为：16℃过夜。次日转化到E.coli Top10(购于天根生化科技有限公司)，涂板37℃培养过夜。选取单克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正确的质粒用于酶切操作。
实施例2：蛋白的表达和纯化
1、表达载体的构建
将带有测序正确的Psa-PspA编码核酸(SEQ ID NO：7)的质粒以Nde I和Xho I双酶切后，与经同样双酶切的表达载体PET20b(购于Novagen公司)，用T4连接酶(购于PROMEGA公司)连接，然后转化E.coli Top10(购于天根生化科技有限公司)，加入含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板中培养过夜，次日挑克隆到加入含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，第二天提取质粒。用Nde I和Xho I双酶切后，将酶切鉴定结果正确的克隆测序，挑选与目的序列一致的克隆，从而获得表达质粒PET20b-PsaA-PspA。用同样的方法从带有测序正确的PspA4编码核酸(SEQ ID NO：10)的质粒获得PET20b-PspA4质粒。
将带有测序正确的PsaA编码核酸(SEQ ID NO：11)的T-easy载体以Nde I和Xho I双酶切后，与经同样双酶切的表达载体PET20b(购于Novagen公司)，用T4连接酶(购于PROMEGA公司)连接，然后转化E.coli Top10(购于天根生化科技有限公司)，在加入含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板中培养过夜，次日挑克隆到加入含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，第二天提取质粒。用Nde I和Xho I双酶切后，将酶切鉴定结果正确的克隆测序，挑选与目的序列一致的克隆，从而获得表达质粒PET20b-PsaA。以同样的方法从将带有测序正确的PspA编码核酸(SEQ ID NO：12)的T-easy载体获得表达质粒PET20b-PspA。
用Nde I和Xho I酶切鉴定表达质粒PET20b-PspA4、PET20b-PsaA-PspA、PET20b-PspA、PET20b-PsaA，片段大小正确。酶切结果分别如图1.1-1.4所示，对酶切鉴定正确的质粒进行测序，选取序列正确的表达质粒。
2.在宿主菌中表达目的蛋白PsaA-PspA融合蛋白、PspA4蛋白、PsaA蛋白和PspA蛋白：
分别将测序正确的重组表达质粒PET20b-PspA4、PET20b-PsaA-PspA、PET20b-PspA、PET20b-PsaA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购于TransGen Biotech)。用含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选。挑取新鲜单菌落接种于含50μg/ml氨苄青霉素的5mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜。次日取50μl过夜培养物接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中。37℃振荡培养约3小时，至OD600≈0.4-0.6时，添加终浓度1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，(对照组为不添加IPTG)，37℃诱导表达5-6小时，4℃下12000rpm离心5分钟收集细菌。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质免疫印迹(westernblotting)鉴定目的蛋白的表达。
3.培养和扩增表达宿主：将蛋白表达量高的克隆，扩增培养，将过夜培养物按1：50的比例接种于新鲜的含50μg/ml氨苄青霉素的500ml LB培养液中，37℃振荡培养约3小时，至OD600≈0.4-0.6时，添加终浓度1mM的IPTG，(对照组为不添加IPTG)，37℃诱导表达5-6小时，取大量表达的细菌培养液，4℃6000rpm离心30分钟，收集细胞沉淀，弃上清。
4.目的表达产物的分离纯化：将细胞沉淀重悬于细菌裂解液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0)中；冰浴下超声破碎15min；在4℃下以10000rpm离心30min；取上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，用Ni-NTA柱(GE公司)进行亲和层析。首先以50mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液平衡Ni-NTA柱，然后以1.5ml/min的速度将上清液滴注到柱子中，再使用洗脱缓冲液(依次用含有50、100、200和500mM的咪唑的50mM Tris-HCl(pH8.0))进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱液。对洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析纯化情况。PsaA-PspA融合蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果如图2.1，纯度可达到82.0％；PspA4蛋白的纯化后的SDS-PAGE电泳结果如图2.2，纯度可达到94.2％；PspA蛋白的纯化后的SDS-PAGE电泳结果如图2.3，纯度可达到88.0％；PsaA蛋白的纯化后的SDS-PAGE电泳结果如图2.4，纯度可达到86.0％。
也用离子交换层析和凝胶过滤层析法对所述目的蛋白进行了分离纯化，并获得了纯度较高的目的蛋白，结果未显示。
结论：通过该实施例的实验，可以获得大量纯度达到80％以上的目的蛋白。
实施例3：PsaA-PspA融合蛋白、PspA4蛋白、PspA蛋白与PsaA蛋白的免疫原性检测
分别将溶于PBS中的纯化得到的所述PsaA-PspA融合蛋白单独、PspA4蛋白单独、PspA蛋白单独、PsaA蛋白单独、PsaA-PspA融合蛋白和PspA4蛋白联合以及将PspA蛋白和PsaA蛋白联合与Al(OH)3佐剂混合均匀。作为对照，将等体积的PBS与Al(OH)3佐剂混合均匀。PsaA-PspA融合蛋白与PspA4蛋白无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量均为20μg每只小鼠；PspA蛋白与PsaA蛋白无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量均为10μg每只小鼠；Al(OH)3佐剂的使用剂量是100μg每只小鼠；总体积为100μL每只小鼠。取70只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，将其随机分配为7组，每组10只。用以上七组混合剂分别后背皮下三点免疫7组小鼠，共免疫3次，每次间隔14天。
免疫前与每次免疫后12天分别取血，用酶联免疫吸附试验ELISA检测血清中的抗体水平。首先用纯化的表1所示的ELISA检测用抗原包被ELISA反应板，4℃孵育过夜；次日用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭ELISA反应板孵育2小时；然后加入10倍系列稀释的免疫血清，37℃孵育45分钟；用PBS-T(PH7.4,0.5％Tween20)洗涤ELISA板后，加入100μL1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-标记的山羊抗小鼠二抗(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，37℃孵育45分钟；洗板后，加入四甲基联苯胺(TMB，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)显色15分钟；显色结束后加入2mol H2SO4终止反应，用酶标检测仪(BIO-RAD公司)在450nm波长下检测吸光度。抗体效价为血清抗体滴度的负对数。各免疫组的血清抗体效价如图3.1～图3.4所示。
表1.免疫原性检测中所用的免疫原和ELISA检测用抗原
ELISA组别 免疫原 ELISA检测用抗原
1 PsaA-PspA PsaA-PspA
2 PsaA-PspA+PspA4 PsaA-PspA
3 PspA4 PspA4
4 PsaA-PspA+PspA4 PspA4
5 PspA PspA
6 PsaA+PspA PspA
7 PspA PsaA
8 PsaA+PspA PsaA
结论：如图3.1～图3.4所示，与对照组(PBS)相比，PsaA-PspA融合蛋白、PspA4蛋白单独免疫或二者联合免疫，PspA蛋白与PsaA蛋白单独免疫或二者联合免疫都能诱导出高效价的血清抗体。
实施例4：目标蛋白的免疫保护作用
1.使用PspA家族1进行攻毒
分别将纯化得到的所述PsaA-PspA融合蛋白单独、PspA4蛋白单独、PspA蛋白单独、PsaA蛋白单独、PsaA-PspA融合蛋白和PspA4蛋白联合以及将PspA蛋白和PsaA蛋白联合与Al(OH)3佐剂混合均匀。作为阴性对照，将等体积的PBS与Al(OH)3佐剂混合均匀。PsaA-PspA融合蛋白与PspA4蛋白无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量均为20μg每只小鼠；PspA蛋白与PsaA蛋白无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量均为10μg每只小鼠；Al(OH)3佐剂的使用剂量是100μg每只小鼠，总体积为100μL每只小鼠。取70只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，将其随机分配为7组，每组10只。用以上七组混合剂分别后背皮下三点免疫7组小鼠，共免疫3次，每次间隔14天。作为阳性对照，选用市售23价多糖肺炎疫苗，免疫方式为后背皮下，按疫苗说明只免疫一次与蛋白组第一次免疫(简称“一免”)同时进行，免疫剂量为人免疫剂量的1/5，100μL每只小鼠。末次免疫后第14天，用肺炎链球菌ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)或ATCC10813菌株(PspA家族1亚类2)进行攻毒(菌株均购于美国菌种保藏中心)。攻毒方式为腹腔攻毒或鼻腔攻毒，攻毒剂量均为致死剂量。攻毒后14天为生存观察期。ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)腹腔攻毒(攻毒剂量为100CFU/只小鼠)和鼻腔攻毒(攻毒剂量为1.6×109CFU/只小鼠)，14天后观察小鼠生存率。ATCC10813菌株(PspA家族1亚类2)腹腔攻毒(攻毒剂量为20CFU/只小鼠)，14天后观察小鼠生存率。如图4.1～图4.3所示，结果如下：
(1)与对照组(PBS)相比，使用PsaA、PspA、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4、PsaA与PspA联合、PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合以及23价多糖肺炎疫苗进行免疫的小鼠的存活率都有所提高。
(2)与单独的PsaA和单独的PspA相比，PsaA-PspA融合蛋白对肺炎链球菌ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)或ATCC10813菌株(PspA家族1亚类2)的攻毒的保护性更强。
(3)与PsaA与PspA联合使用相比，PsaA-PspA融合蛋白对肺炎链球菌ATCC10813菌株(PspA家族1亚类2)的攻毒保护性相当，对肺炎链球菌ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)的攻毒的保护性更强。
(4)与23价肺炎多糖疫苗相比，PsaA-PspA融合蛋白和其与PspA4的联合使用的小鼠存活率更高，对肺炎链球菌ATCC6404菌株(PspA家族1亚类1)的攻毒保护性更强。
(5)单独的PsaA-PspA融合蛋白对家族1亚类1无论是鼻腔还是腹腔都有很好的保护作用，对家族1亚类2的腹腔攻毒也有很好的保护作用。其中该融合蛋白对亚类1和亚类2的腹腔攻毒的保护作用可以达到100％。
(6)与PspA4相比，PsaA-PspA融合蛋白对PspA家族1的亚类1和亚类2的攻毒的保护性作用更强，对家族1的毒株交叉保护性更好。
因此，对于PspA家族1亚类1和亚类2的攻毒，PsaA-PspA单独使用或其与PspA4联合使用都具有显著的保护作用。
2.使用PspA家族2进行攻毒
分别将纯化得到的所述PsaA-PspA融合蛋白单独、PspA4蛋白单独、PspA蛋白单独、PsaA蛋白单独、PsaA-PspA融合蛋白和PspA4蛋白联合以及将PspA蛋白和PsaA蛋白联合与Al(OH)3佐剂混合均匀。作为阴性对照，将等体积的PBS与Al(OH)3佐剂混合均匀。PsaA-PspA融合蛋白与PspA4蛋白无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量均为20μg每只小鼠；PspA蛋白与PsaA蛋白无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量均为10μg每只小鼠；Al(OH)3佐剂的使用剂量是100μg每只小鼠；总体积为100μL每只小鼠。后背皮下三点免疫6～8周龄BALB/c雌性小鼠，每组免疫10小鼠，共免疫3次，每次间隔14天。末次免疫后第14天，用肺炎链球菌ATCC6314菌株(PspA家族2亚类4)或ATCC6303菌株(PspA家族2亚类5)进行攻毒(均购于美国菌种保藏中心)。攻毒方式为腹腔攻毒或鼻腔攻毒，攻毒剂量为致死剂量。攻毒后14天为生存观察期。
ATCC6314菌株(PspA家族2亚类4)的腹腔攻毒(攻毒剂量为6×107CFU/只小鼠)14天后小鼠生存率和ATCC6303菌株(PspA家族2亚类5)的腹腔攻毒(攻毒剂量为20CFU/只小鼠)和鼻腔攻毒(攻毒剂量为2.2×106CFU/只小鼠)14天后小鼠生存率分别如图4.4、图4.5和图4.6所示，结果如下：
(1)与对照组(PBS)相比，使用PsaA、PspA、PsaA-PspA融合蛋白、PspA4、PsaA与PspA联合、PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合进行免疫的小鼠的存活率都有所提高。
(2)与单独的PsaA或单独的PspA相比，PsaA-PspA融合蛋白对肺炎链球菌ATCC6314菌株(PspA家族2亚类4)攻毒的保护性更强。
(3)与PsaA与PspA联合使用相比，PsaA-PspA融合蛋白对肺炎链球菌ATCC6314菌株(PspA家族2亚类4)攻毒的保护性更强。
(4)单独的PsaA-PspA融合蛋白对家族2亚类4与亚类5无论是鼻腔还是腹腔都有很好的保护作用。
(5)与PspA4相比，PsaA-PspA融合蛋白对PspA家族2的亚类4的腹腔攻毒与PspA家族2的亚类5的鼻腔攻毒保护性作用弱于PspA4，原因是融合蛋白中的PspA是PspA家族1亚类2菌株RX1的N端序列，而PspA4蛋白是家族2亚类4的序列，所以PspA4蛋白对家族2的毒株保护性较好；但是，PsaA-PspA融合蛋白比PspA4对PspA家族2的亚类5的腹腔攻毒保护性更好。
(6)与单独使用PsaA-PspA融合蛋白相比，PsaA-PspA与PspA4的联合免疫对家族2亚类5鼻腔攻毒保护性有显著的提高。
结论：
本实施例的实验说明，与对照组相比，PsaA-PspA融合蛋白对家族1与家族2的攻毒菌株的攻毒都有显著较好的保护作用。而单独使用PspA4蛋白时对家族1的保护作用较差。因此，本发明的PsaA-PspA融合蛋白可以用作免疫原，以及与佐剂结合用作疫苗。
PsaA-PspA融合蛋白与PspA4联合免疫组对家族1与家族2的攻毒菌株均具有很好的保护作用。本发明的PsaA-PspA融合蛋白还可以与其他表面蛋白联合使用，因此PsaA-PspA融合蛋白是肺炎链球菌疫苗的一个很好的候选免疫原，通过与其他蛋白的联合可以达到更优的保护效果。
本发明的PsaA-PspA融合蛋白还可以作为多糖疫苗的载体蛋白而增加多糖疫苗的广谱性和保护性。

Claims (24)

1.一种融合蛋白，其特征在于由PsaA和PspA以及PsaA和PspA之间的接头组成，其中所述PsaA与所述PspA之间以接头连接；所述PsaA的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列；所述PspA为PspA亚类2的N端序列SEQ ID NO:2与PspA亚类3的CDR区氨基酸序列SEQ ID NO:3通过接头连接所得的序列。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述PspA为SEQ ID NO:4所示的序列。
3.权利要求2的融合蛋白，所述融合蛋白的序列为SEQ ID NO:5所示的序列。
4.一种编码权利要求1-3中任一项的融合蛋白的核酸。
5.权利要求4的核酸，所述核酸是经密码子优化设计的。
6.权利要求5的核酸，所述核酸是按照大肠杆菌(Escherichia coli)偏爱的密码子优化设计的。
7.权利要求6的核酸，所述核酸的序列为SEQ ID NO:6所示的序列。
8.一种包含权利要求4-7中任一项的核酸的重组表达载体。
9.权利要求8的重组表达载体，所述重组表达载体为质粒。
10.权利要求9的重组表达载体，所述重组表达载体为pet20b质粒。
11.一种包含权利要求8-10中任一项的表达载体的细胞。
12.权利要求11的细胞，所述细胞为原核细胞。
13.权利要求12的细胞，所述细胞为大肠杆菌。
14.权利要求13的细胞，所述细胞为大肠杆菌BL21。
15.一种制备权利要求1-3中任一项的融合蛋白的方法，其包括将权利要求4-7中任一项的核酸插入表达载体，将所得的重组表达载体导入生物体，使所述核酸表达生成所述融合蛋白。
16.权利要求15的方法，所述方法还包括分离纯化所述融合蛋白。
17.权利要求16的方法，所述纯化方法为亲和层析、离子交换层析和/或凝胶过滤层析。
18.一种组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4-7中任一项所述的核酸、权利要求8-10中任一项所述的载体或权利要求11-14中任一项所述的细胞，以及可药用载体。
19.一种疫苗组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白和佐剂。
20.权利要求19的疫苗组合物，其中所述佐剂是Al(OH)3佐剂。
21.一种疫苗组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白和序列为SEQ IDNO：8所示的另一种肺炎链球菌蛋白抗原。
22.权利要求21的疫苗组合物，其还包含佐剂。
23.权利要求22的疫苗组合物，其中所述佐剂为Al(OH)3佐剂。
24.权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白单独或其与序列为SEQ IDNO：8所示的另一种肺炎链球菌蛋白抗原联合用于制备预防肺炎链球菌感染的疫苗中的用途。
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