CN101538550A - 幽门螺杆菌活菌载体疫苗及其专用重组菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌活菌载体疫苗及其专用重组菌。该专用重组菌为重组福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)，是将含有幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白的编码基因导入福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)疫苗株得到的重组菌。本发明的幽门螺杆菌活菌载体疫苗的活性成分即为重组后的福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)。动物实验表明，本发明提供的幽门螺杆菌疫苗菌株的免疫原性和免疫保护性良好。

Description

幽门螺杆菌活菌载体疫苗及其专用重组菌

技术领域

本发明涉及一种幽门螺杆菌活菌载体疫苗及其专用重组菌。

背景技术

胃炎和消化性溃疡是人类的常见病和多发病，胃癌也是发病率和死亡率比较高的恶性肿瘤之一。多年来人们一直都认为这类病是普通的内科病，并没有与病原体的感染联系在一起，医学界曾经一度认为：在胃内的酸性环境下，微生物是很难定居和繁殖致病的，胃酸是形成溃疡的关键因素，临床上也通常采用中和胃酸或抑制胃酸分泌的方法来治疗这类疾病。然而，1982年，两位澳大利亚学者Robin Warren和Barry Marshall从人胃组织中分离到了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)。其后，许多学者对幽门螺杆菌的感染状况与致病性进行了一系列的调查与研究，研究证实：幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的最主要病因，同时与胃腺癌和胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将该菌列为I级致癌因子。2005年，诺贝尔生理学或医学奖授予了澳大利亚的这两位科学家。

大量的流行病学研究资料表明，H.pylori感染呈全球分布，感染率之高仅次于龋齿，居第二位。在发达国家，H.pylori的成人感染率为30-50％，在发展中国家感染率相对更高，可达60％以上，且婴幼儿和儿童的感染也很普遍；在中国，据报道成人感染率约在60％，感染主要发生在儿童期，感染一经获得，便在人胃内持续数年、数十年乃至一生。在感染者中，大约有20％的人口发病，其中包括胃炎、胃腺萎缩、胃和十二指肠溃疡、胃腺癌及胃淋巴瘤等。儿童期感染上H.pylori已被认为是成年期胃癌发生的一个重要因素。

目前，临床上主要采用抗生素疗法来清除H.pylori，但是体内单一抗生素对H.pylori的根治率不足20％，三联疗法即铋剂加两种抗生素治疗后，H.pylori的根治率也仅达55-95％，且存在下列问题：所需的费用昂贵、根除率低、耐药菌株的不断增加、药物的副作用、停药后的复发与再感染、病人的依从性差、不能用于预防H.pylori感染等问题。历史经验告诉我们：要想从大量人群中根除某种感染性疾病，开发研制该种疾病的有效疫苗应该是优先要考虑的问题，也是最具价值效益关系的。成功的幽门螺杆菌疫苗适用人群巨大。单从我国来看，据流行病学调查表明，我国人群中该菌的感染率在60％以上，感染者中大约有20％的人发病，因此，在我国需要进行幽门螺杆菌疫苗根除治疗的人群大约有1亿5千多万人。另外，在我国幽门螺杆菌的感染主要发生在儿童期，而我国大约每年有1500余万左右的新生儿出生，因此，在我国，需要进行幽门螺杆菌疫苗预防的人群也非常巨大。

H.pylori的保护性抗原成分主要有：尿素酶、热休克蛋白、过氧化物酶、空泡毒素和毒素相关蛋白等。研究表明，在每一种保护性抗原单独使用时，其效果并不理想，因而构建多价组合保护性抗原疫苗是研制H.pylori疫苗的重要目标。减毒载体活菌苗具有不必纯化抗原、本身有一定的佐剂作用、易于大量生产、服用方便、避免抗原在胃内降解与变性，能够诱导细胞、体液和黏膜免疫反应等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)。

本发明所提供的重组福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)，是将含有幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白的编码基因导入福氏志贺氏菌(Sh.fiexneri)得到的重组菌。

本发明所提供的福氏志贺氏菌可为2aT32，也可为其它许可在人体使用的亚型。

本发明所提供的福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)疫苗株是一株经一系列传代后发生的自发突变减毒株，来源是中国医学细菌保存中心。

本发明所提供的重组福氏志贺氏菌中，幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(AAD07143.1)和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(AAD07081.1)的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

序列表中的序列1由702氨基酸组成，自序列1的氨基末端第1-569位为幽门螺杆菌尿素酶B亚单位，自序列1的氨基末端第570-584位为连接肽(G₄S)₃，自序列1的氨基末端第585-702位为幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位。

所述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白编码基因〔ureB(GI：231353)-hspA(GI：2313085)〕的核苷酸序列具体可如序列表中序列2所示。

所述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白编码基因可通过重组质粒pTA-ureB-hspA导入福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)疫苗株。所述pTA-ureB-hspA是将所述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白编码基因插入pTA的多克隆位点得到的重组质粒；所述pTA为表达载体pET22b+(购自Novegen公司)去掉抗性基因，加入asd基因制备，asd基因序列号为GI：153560。

本发明的另一个目的是提供一种幽门螺杆菌活菌载体疫苗。

本发明所提供的幽门螺杆菌活菌载体疫苗，它的活性成分为上述重组福氏志贺氏菌。

本发明还提供了一种融合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的融合蛋白(UreB-HspA)是含有幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白，它的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

上述蛋白的编码基因(ureB-hspA)的核苷酸序列，具体可如序列表中序列2所示。

含有上述融合蛋白编码基因的重组菌或重组质粒也属于本发明的保护范围。

本发明是利用基因重组的方法，将H.pylori尿素酶B亚单位和热休克蛋白A亚单位进行融合，并转化福氏志贺氏菌疫苗株构建的幽门螺杆菌活菌载体疫苗。试验证明本发明的幽门螺杆菌活菌载体疫苗具有较高的免疫原性和免疫保护性：在幽门螺杆菌活菌载体疫苗的免疫原性试验中，实验组(免疫本发明的幽门螺杆菌活菌载体疫苗)小鼠血清经200倍稀释后，血清的IgG效价OD₄₉₂平均值(0.563±0.162)要远高于对照组(经100倍稀释的对照组小鼠血清)小鼠血清测定的OD₄₉₂平均值(0.083±0.016)，实验组小鼠肠液中抗幽门螺杆菌sIgA抗体测定的OD₄₉₂值(0.387±0.147)也远高于对照组₄₉₂(0.114±0.035)；在免疫保护性试验中，对照组20只小鼠胃内均有幽门螺杆菌定植，实验组20只小鼠中有5只小鼠没有定植，获得了完全保护，实验组小鼠比对照组小鼠胃内H.pylori平均定植密度低近1个数量级，二者之间具有显著差异。

附图说明

图1为H.pylori ureB基因PCR扩增结果。

其中，泳道1为Gibco 1kb Marker，泳道2为PCR扩增的ureB基因

图2为H.pylori hspA基因PCR扩增结果电泳图谱。

其中，泳道1为Gibco 100bp Marker，泳道2为PCR扩增的hspA基因

图3为pET-ureB-hspA电泳图。

其中，泳道1为Gibco 1kb marker，泳道2为用NcoI和NotI双酶切的融合基因片段，泳道3为用NcoI和NotI双酶切的pET22b+，泳道4为ureB-hspA基因扩增产物，泳道5为ureB基因扩增产物，泳道6为hspA基因扩增产物，泳道7为Gibco100bp marker。

图4为H.pylori UreB-HspA重组蛋白SDS-PAGE电泳图谱。

其中，泳道1为marker(从上至下分别为97.4kD，66.2kD，43kD，31kD)，泳道2为福氏2a志贺氏菌疫苗株对照，泳道3为HP-BA疫苗菌株全菌表达样品。

图5为一抗为兔抗UreB抗体的重组蛋白Western blot检测试验结果。

其中，泳道1为预染蛋白marker(从上至下分别为175kD，83kD，62kD，48kD，33kD，25kD，17kD，7kD)，泳道2为兔抗UreB疫苗菌株表达抗原蛋白。

图6为一抗为兔抗hspA抗体的重组蛋白Western blot检测试验结果。

其中，泳道1为预染蛋白marker(从上至下分别为175kD，83kD，62kD，48kD，33kD，25kD，17kD，7kD)，泳道2为兔抗hspA疫苗菌株表达抗原蛋白。

具体实施方式

下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、重组福氏志贺氏菌及幽门螺杆菌活菌载体疫苗的制备及其效果

一、重组福氏志贺氏菌及幽门螺杆菌活菌载体疫苗的制备

1、克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)基因

根据幽门螺杆菌26695的ureB基因序列，用PCR引物设计和分析软件设计了引物(P1：5’-TGCGAGCTCAAAAAGATTAGCAGAAAA-3’；P2：5’-GGCTGCAGGAAAATGCTAAAGAGTTG-3’)，以幽门螺杆菌26695(购自中国疾病预防控制中心)的基因组DNA为模板，采用高保真Pyrobest DNA聚合酶(购自Takala公司)进行了PCR扩增，获得了H.pylori ureB基因，如图1所示。

PCR扩增的ureB基因片段经纯化后，经SacI和PstI(购自NEB公司)酶切连接到载体pQE30(购自QIAGEN公司)中。连接产物转化大肠杆菌M15后挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后进行全自动序列分析，将含有幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)基因(GI：231353)的重组质粒命名为pQE-ureB。

2、克隆幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(hspA)基因

根据幽门螺杆菌26695hspA基因序列，用PCR引物设计和分析软件设计了一对引物(P3：5’-GGAGAATTCAAGTTTCAGCCATTAGGAG-3’；P4：5’GTTCTGCAGTTTAGTGTTTTTTGTGATC-3’)，以幽门螺杆菌26695(购自中国疾病预防控制中心)的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得约360bp的H.pylori hspA扩增带，如图2所示。

扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后用EcoRI和PstI双酶切，与此同时将质粒载体pUC19也用EcoRI和PstI进行双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳回收，在T₄DNA连接酶的作用下12℃过夜连接，转化大肠杆菌JM109后挑选阳性克隆，经质粒酶切鉴定后进行全自动序列分析，将含有幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(hspA)基因(GI：2313085)的重组质粒命名为pUC-hspA。

3、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(hspA)融合蛋白编码基因的制备

以含有尿素酶B亚单位和热休克蛋白A亚单位全长序列的重组质粒载体pQE-ureB和pUC-hspA为模板，采用如下PCR的方法将ureB和hspA两基因融合起来：合成引物为P5：5’-TGCCCATGGATAAAAAGATTAGCAGAAAA-3’；

P6：5’-GTTGCGGCCGCTTTAGTGTTTTTTGTGATC-3’；

P7：5’-CCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCGAAAATGCTAAAGAGTTG-3’；

P8：5’-GGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTAAGTTTCAGCCATTAGGAG-3’。

用引物P1和P7扩增pQE-ureB，用引物P4和P8扩增pUC-hspA，将二者扩增产物混合，再以二者混合物为模板再用引物P5和P6进行PCR反应得到ureB-hspA融合片段。PCR反应的条件为：95℃变性5min，一循环为(94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min)，共做30循环，最后72℃延伸10min。融合基因片段经纯化后，用NcoI和NotI(购自NEB公司)进行双酶切，并将其连接到表达载体pET22b+(购自Novegen公司)中，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)后挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后，采用373A DNA自动分析仪进行全自动序列分析，将含有幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB，GI：2313153)和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(hspA，GI2313085)的融合蛋白编码基因ureB-hspA的重组质粒命名为pET-ureB-hspA。pET-ureB-hspA的鉴定结果如图3所示。

4、构建疫苗候选株

以重组质粒pET-ureB-hspA为模板，用引物P5和P6进行PCR扩增ureB-hspA。PCR扩增产物经纯化后，用NcoI和NotI(购自NEB公司)酶切并连接到质粒pTA(pTA为表达载体pET22b+(购自Novegen公司)去掉抗性基因，加入asd基因制备，asd基因序列号为GI：153560)中，连接产物用电击转化法将其导入福氏2a志贺氏菌疫苗株(购自中国疾病预防控制中心)中，挑选重组转化子获得重组福氏志贺氏菌(疫苗株)HP-BA。在LB试管中37℃过夜培养HP-BA菌株。按1％将过夜培养种子液接种到新的一支LB试管中，37℃振荡培养2-3h，使其OD600至0.4-0.5。加入1M IPTG使其终浓度为1mM，继续37℃振荡培养4-5h。离心收集1ml液体培养物中的细菌，将其重悬于0.1ml裂解缓冲液中，100℃加热5min。取20μl样品进行10％的SDS-PAGE电泳。经考马斯亮兰染色后，疫苗候选株HP-BA可见表达与预期蛋白大小一致的相对分子质量约为77kD的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)融合蛋白(UreB-HspA)，其结果见图4。

用10％的SDS-PAGE对HP-BA菌株表达的抗原蛋白进行电泳，同时设预染蛋白Maker。表达样品及预染蛋白Marker用电转移的方法转移至硝酸纤维素膜，经封闭后分别用兔抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)抗体和兔抗幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)抗体，作一抗进行Western Blot。显色后两者在约77KD的位置均出现了特异性的棕色显色带(图5和图6)。其中，兔抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)抗体是以UreB作为免疫原免疫兔子得到的(Rokita，E etal.J.Chromatography B 2000，737：203-212)，兔抗幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)抗体是以HspA作为免疫原免疫兔子得到的(刘秀丽等，世界华人消化杂志，2005，13(5)：626-630)。

二、重组福氏志贺氏菌HP-BA的免疫效果

1、重组福氏志贺氏菌HP-BA外源表达抗原的免疫原性试验

用具有实验动物等级合格证的6-8周龄、体重18-20g的雌性SPF级BALB/c小鼠共20只进行试验。其中10只为实验组，10只为对照组。将按照上述步骤一中LB液体培养的经过1mM IPTG诱导的HP-BA菌株，离心收集菌体，用无菌生理盐水重悬洗涤两次后浓缩制成5×10⁹cfu/ml的细菌悬液。小鼠经禁食4h、禁水2h后，先以饱和NaHCO₃200μl/只灌胃，半小时后实验组小鼠用HP-BA菌株细菌悬液200μl/只灌胃免疫，对照组小鼠用200μl/只无菌生理盐水灌胃。按此方法隔周免疫，共免疫3次。最后一次免疫后10天取血、取肠液进行ELISA免疫效价测定。

用幽门螺杆菌标准株H.pylori 26695(购自中国疾病预防控制中心)超声粉碎物抗原(10μg/ml)包被酶联免疫反应板，将采集的对照组小鼠血清进行100倍稀释，实验组小鼠血清进行200倍稀释后进行免疫测定，结果对照组小鼠血清测定的OD₄₉₂值为0.083±0.016(平均值±标准差)，实验组小鼠血清OD₄₉₂值为0.563±0.162(平均值±标准差)。

用上述幽门螺杆菌标准株超声粉碎物抗原(10μg/ml)包被的酶联免疫反应板测定小鼠肠液中抗幽门螺杆菌sIgA抗体，结果10只对照组小鼠测定的OD₄₉₂值为0.114±0.035(平均值±标准差)，10只实验组小鼠OD₄₉₂值为0.387±0.147(平均值±标准差)。

2、重组福氏志贺氏菌HP-BA免疫保护性试验

用具有实验动物等级合格证的6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠40只进行实验。实验小鼠随机分为2组，每组20只。1组为实验组，另一组为对照组。按组分笼饲养，每笼5只。动物在免疫及攻毒实验期间由实验动物中心在SPF环境下饲养。

将按照上述步骤一中LB液体培养的经过1mM IPTG诱导的HP-BA菌株，离心收集菌体，用无菌生理盐水重悬洗涤两次后浓缩制成5×10⁹cfu/ml的细菌悬液。动物经禁食4h、禁水2h后，先以饱和NaHCO₃200μl/只灌胃，半小时后实验组小鼠用HP-BA菌株菌悬液200μl/只灌胃免疫；对照组小鼠用无菌生理盐水200μl/只灌胃。按此方法隔周免疫，共免疫3次。最后一次免疫两周以后，对小鼠以H.pyloriSS1(购自中国疾病预防控制中心)5×10⁸cfu/ml灌胃2次，每次每只小鼠200μl，隔天一次。攻毒后四周，处死小鼠，开腹取胃。将胃沿大弯纵切开，在生理盐水中漂洗去胃内残留的食物残渣，称重。再将胃沿小弯纵切一分为二，一半用10％的福尔马林缓冲液固定，一半加入适量布氏肉汤在玻璃研磨器中研磨至肉浆，制成1∶10倍稀释液，继续10×系列稀释，取稀释液涂布幽门螺杆菌血琼脂平板，每个稀释度三块，每块100μl。培养平板含5％脱纤羊血，10μg/ml万古霉素，5μg/ml两性霉素B，10U/ml多粘菌素B，20μg/ml杆菌肽。置于微需氧环境(5％O₂，10％CO₂，85％N₂)下37℃培养72-96小时，菌落计数，取同一稀释度菌数在30-300三块平板菌落数的平均值，换算成CFU/g胃组织。

结果表明，对照组小鼠胃内均有幽门螺杆菌定植，实验组有5只小鼠没有定植，获得了完全保护；实验组小鼠的平均定植密度为3.1×10⁵cfu/g，而对照组为2.81×10⁶cfu/g；实验组小鼠比对照组小鼠胃内幽门螺杆菌定植密度低近1个数量级。统计分析表明，实验组小鼠胃内幽门螺杆菌定植密度与对照组之间具有非常显著的差异(p＜0.01)。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>幽门螺杆菌活菌载体疫苗及其专用重组菌

<160>1

<210>1

<211>702

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400>1

Met Asp Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro

1               5                   10                  15

Thr Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu

            20                  25                  30

Val Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly

        35                  40                  45

Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys

    50                  55                  60

Glu Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr

65                  70                  75                  80

Gly Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly

                85                  90                  95

Ile Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn

            100                 105                 110

Leu Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile

        115                 120                 125

Val Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln

    130                 135                 140

Gln Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly

145                 150                 155                 160

Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly

                165                 170                 175

Arg Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met

            180                 185                 190

Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu

        195                 200                 205

Ala Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp

    210                 215                 220

Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp

225                 230                 235                 240

Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala

                245                 250                 255

Gly Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His

            260                 265                 270

Thr Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile

        275                 280                 285

Lys Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr

    290                 295                 300

Ile Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met

305                 310                 315                 320

Val Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala

                325                 330                 335

Asp Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His

            340                 345                 350

Asp Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly

        355                 360                 365

Arg Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn

    370                 375                 380

Lys Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn

385                 390                 395                 400

Phe Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile

                405                 410                 415

Ala His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val

            420                 425                 430

Ala Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn

        435                 440                 445

Met Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala

    450                 455                 460

Asn Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe

465                 470                 475                 480

Ala His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser

                485                 490                 495

Gln Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg

            500                 505                 510

Gln Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met

        515                 520                 525

Gln Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr

    530                 535                 540

His Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys

545                 550                 555                 560

Val Ser Leu Ala Gln Leu Phe Ser Ile Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly

                565                 570                 575

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Phe Gln Pro Leu Gly Glu

            580                 585                 590

Arg Val Leu Val Glu Arg Leu Glu Glu Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly

        595                 600                 605

Ile Ile Ile Pro Asp Asn Ala Lys Glu Lys Pro Leu Met Gly Val Val

    610                 615                 620

Lys Ala Val Ser His Lys Ile Ser Glu Gly Cys Lys Cys Val Lys Glu

625                 630                 635                 640

Gly Asp Val Ile Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Gly Ala Glu Ile Val Leu

                645                 650                 655

Asp Gly Thr Glu Tyr Met Val Leu Glu Leu Glu Asp Ile Leu Gly Ile

            660                 665                 670

Val Gly Ser Gly Ser Cys Cys His Thr Gly Asn His Asp His Lys His

        675                 680                 685

Ala Lys Glu His Glu Ala Cys Cys His Asp His Lys Lys His

    690                 695                 700

<210>2

<211>2109

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400>1

atggataaaa agattagcag aaaagaatat gtttctatgt atggccctac tacaggcgat    60

aaagtgagat tgggcgatac agacttgatc gctgaagtag aacatgacta caccatttat    120

ggcgaagagc ttaaattcgg tggcggtaaa accctgagag aaggcatgag ccaatccaac    180

aaccctagca aagaagaatt ggatctaatc atcactaacg ctttaatcgt ggattacacc    240

ggtatttata aagcggatat tggtattaaa gatggcaaaa tcgctggcat tggtaaaggc    300

ggtaacaaag acatgcaaga tggcgttaaa aacaatctta gcgtaggtcc tgctactgaa    360

gccttagccg gtgaaggttt gatcgtaact gctggtggta ttgacacaca catccacttc    420

atttcacccc aacaaatccc tacagctttt gcaagcggtg taacaaccat gattggtggc    480

ggaactggtc ctgctgatgg cactaatgcg actactatca ctccaggcag aagaaattta    540

aaatggatgc tcagagcggc tgaagaatat tctatgaact taggtttctt ggctaaaggt    600

aacgcttcta acgacgcgag cttagccgat caaattgaag ctggtgcgat tggctttaaa    660

atccacgaag actggggcac cactccttct gcaatcaatc atgcgttaga tgttgcagac    720

aaatacgatg tgcaagtcgc tatccacaca gacactttga atgaagccgg ttgcgtggaa    780

gacactatgg cagctattgc cggacgcact atgcacactt tccacactga aggtgctggc    840

ggcggacacg ctcctgatat tattaaagta gctggtgaac acaacattct tcccgcttcc    900

actaacccca ctatcccttt cactgtgaat acagaagcag aacacatgga catgcttatg    960

gtgtgccacc acttggataa aagcattaaa gaagatgttc agttcgctga ttcaaggatc    1020

cgccctcaaa ccattgcggc tgaagacact ttgcatgaca tggggatttt ctcaatcacc    1080

agctctgact ctcaagctat gggtcgtgtg ggtgaagtta tcactagaac ttggcaaaca    1140

gctgacaaaa acaaaaaaga atttggccgc ttgaaagaag aaaaaggcga taacgacaac    1200

ttcaggatca aacgctactt gtctaaatac accattaacc cagcgatcgc tcatgggatt    1260

agcgagtatg taggttctgt agaagtgggc aaagtggctg acttggtatt gtggagtccc    1320

gcattctttg gcgtaaaacc caacatgatc atcaaaggcg ggttcattgc gttgagtcaa    1380

atgggtgacg cgaacgcttc tatccctacc ccacaaccag tttattacag agaaatgttc    1440

gctcatcatg gtaaagccaa atacgatgca aacatcactt ttgtgtctca agcggcttat    1500

gacaaaggca ttaaagaaga attagggctt gaaagacaag tgttgccggt aaaaaattgc    1560

agaaacatca ctaaaaaaga catgcaattc aacgacacta ccgctcacat tgaagtcaat    1620

cctgaaactt accatgtgtt cgtggatggc aaagaagtaa cttctaaacc agccaataaa    1680

gtgagcttgg cgcaactctt tagcattttc ggcggcggcg gctctggcgg cggcggctct    1740

ggcggcggcg gctctaagtt tcagccatta ggagaaaggg tcttagtaga aagacttgaa    1800

gaagagaaca aaaccagttc aggcatcatc atccctgata acgctaagga aaagccttta    1860

atgggcgtag tcaaagcggt tagccataaa atcagtgagg gttgcaaatg cgttaaagaa    1920

ggcgatgtga tcgcttttgg caaatacaaa ggcgcagaaa tcgttttaga cggcactgaa    1980

tacatggtgc tagaactaga agacattcta ggcattgtgg gctcaggctc ttgttgtcat    2040

acaggtaatc atgaccataa acatgctaaa gagcatgaag cttgctgtca tgatcacaaa    2100

aaacactaa                                                            2109

Claims (10)

1、一种重组福氏志贺氏菌，是将含有幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白的编码基因导入福氏志贺氏菌得到的重组菌。

2、根据权利要求1所述的重组福氏志贺氏菌，其特征在于：所述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

3、根据权利要求2所述的重组福氏志贺氏菌，其特征在于：所述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

4、根据权利要求2或3所述的重组福氏志贺氏菌，其特征在于：所述福氏志贺氏菌疫苗株为福氏志贺氏菌2aT32。

5、根据权利要求4所述的重组福氏志贺氏菌，其特征在于：所述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白编码基因通过重组质粒导入福氏志贺氏菌疫苗株。

6、一种幽门螺杆菌活菌载体疫苗，它的活性成分为权利要求1-5中任一所述的重组福氏志贺氏菌。

7、一种蛋白，它的氨基酸序列为幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合蛋白的氨基酸序列。

8、权利要求7所述蛋白的编码基因。

9、根据权利要求8所述的基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的融合基因序列。

10、含有权利要求8或9所述基因的重组菌或重组质粒。

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