CN109602898B

CN109602898B - 一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法

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Publication number: CN109602898B
Application number: CN201811619231.5A
Authority: CN
Inventors: 魏后军; 王芳; 范志宇; 胡波; 宋艳华; 薛家宾; 仇汝龙
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: ZA201908569B; CN109602898A

Abstract

本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法。本发明的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺。本发明的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗采用自诱导分泌表达的去毒产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白制备，该疫苗具有安全、免疫效力好、工艺简单、成本低等优点，能有效避免现有技术疫苗的生产工艺较复杂、成本较高等问题。

Description

一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)也称魏氏梭菌，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一。该菌的致病因子是其分泌的外毒素，主要是α、β、ε和ι毒素，据此将该菌分为A、B、C、D、E等5个毒素型，ε毒素为B型和D型产气荚膜梭菌产生。产气荚膜梭菌可导致山羊、绵羊等动物的致死性肠道疾病，对畜牧业造成很大的经济损失。产气荚膜梭菌病发病急、病程短、死亡率高，免疫疫苗是本病的主要治疗手段，目前使用的商品化灭活疫苗，是将培养的产气荚膜梭菌菌液或外毒素灭活制备而成，存在稳定性差、副反应大以及灭活不彻底的安全隐患。

各型产气荚膜梭菌均产生α毒素，它是产气荚膜梭菌主要的毒力因子，其中A型产气荚膜梭菌分泌α毒素最多。α毒素基因位于染色体上，大小为1194bp，编码的产物由398个氨基酸残基组成，其中前28个氨基酸为信号肽，成熟肽为370个氨基酸。α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性，能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂，导致细胞裂解，因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。因此，研究者利用基因工程技术将毒素去毒性，作为抗原研制疫苗。

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程。相比之下，如果外源蛋白能以“胞外分泌”的形式表达，即目的蛋白分泌至细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，获得具有生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难；而且杂蛋白少，目的蛋白的回收相对简单。

美国Brookhaven实验室的Studier提出了外源基因表达自诱导(Auto-induction)的方法。即大肠杆菌首先以葡萄糖为碳源生长至饱和状态，待葡萄糖消耗殆尽，达到一定活力后，开始利用培养基中的乳糖。其主要机理是在lac Y与lac Z的基因产物乳糖渗透酶(1actose permease)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启了T7表达系统，此时乳糖的代谢产物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖)也可作为细菌生长的碳源。与传统IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)相比，乳糖无细胞毒性、价格较低，自诱导在培养基中含有诱导剂，无需在培养过程中检测重组菌的生长情况添加诱导剂。

目前，已有关于产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的报道，如牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用(申请号CN201710819084.5)、抑制产气荚膜梭菌感染的重组α蛋白及其制备方法与应用(申请号CN201610304595.9)、一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用(申请号CN201410117383.0)。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组菌的生长情况添加诱导剂；α毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的过程。

本发明制备的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，采用自诱导分泌表达的去毒产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白制备，该疫苗具有安全、免疫效力好、工艺简单、成本低等优点，能有效避免现有技术疫苗的生产工艺较复杂、成本较高等问题。

发明内容

本发明的目的在于制备产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，用于预防由A型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。

为此，本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个突变。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与成熟的野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生定点突变。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与成熟的野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生一个或多个定点突变。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位发生突变。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为组氨酸之外的氨基酸。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为选自以下氨基酸组成的组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白不具备α毒素蛋白的磷脂酶C活性。

另一方面，本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白通过自诱导体系表达。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白通过大肠杆菌自诱导体系表达。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白通过大肠杆菌BL21自诱导体系表达。

在一些实施方式中，其特征在于，所述大肠杆菌BL21的培养基包括自诱导培养基和消泡剂。

在一些实施方式中，其特征在于，所述大肠杆菌BL21的培养基包括自诱导培养基和0.01～0.02％消泡剂。

在一些实施方式中，其特征在于，所述大肠杆菌BL21的培养基包括发酵罐容积60～70％的自诱导培养基和0.01～0.02％消泡剂。

在一些实施方式中，其特征在于，大肠杆菌BL21的发酵培养参数设置为：温度28℃，pH值7.0，通气量15升/分钟，28℃培养20～24小时。

在一些实施方式中，其特征在于，产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素相比，其氨基酸序列发生了定点突变。

在一些实施方式中，其特征在于，所述定点突变引物根据将产气荚膜梭菌α毒素蛋白的第176位氨基酸进行突变而设计。

在一些实施方式中，其特征在于，所述定点突变引物根据将产气荚膜梭菌α毒素蛋白的第176位氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺而设计。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白在制成疫苗前进行无菌检验。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与佐剂混匀制备所述产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因工程疫苗。

在一些实施方式中，其特征在于，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与氢氧化铝胶佐剂混匀制备所述产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因工程疫苗。

在一些实施方式中，其特征在于，对所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白进行毒性测定。

在一些实施方式中，其特征在于，对所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白进行毒性测定包括步骤：卵磷脂酶活性试验。

在一些实施方式中，其特征在于，对所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白进行毒性测定包括步骤：小鼠毒力试验。

在一些实施方式中，其特征在于，对所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白进行毒性测定包括步骤：卵磷脂酶活性试验和小鼠毒力试验。

另一方面，本发明提供一种分泌产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠杆菌菌株的构建方法，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据GeneBank上公布的α毒素基因序列AY823400.1设计引物，以A型产气荚膜梭菌DNA为模板，进行PCR扩增；

2)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段，回收的目的片段送公司测序，获得α毒素基因序列；

3)根据α毒素测序结果，将α毒素的第176位组氨酸(CAT)突变为天冬酰胺(AAT)，同时对信号肽序列进行密码子优化；将化学合成的该序列插入到载体pET32a(EcoR I和Xho I酶切位点之间)，获得重组质粒pET32a-αH176N

4)将重组质粒pET32a-αH176N转化BL21(DE3)感受态细胞并进行培养，PCR鉴定阳性的大肠杆菌菌株即为分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株。

进一步地，所述PCR扩增程序为94℃2min→(94℃30s→62.0℃1min→68℃1.5min)30个循环→68℃10min。

进一步地，所述A型产气荚膜梭菌DNA的扩增引物为：

上游引物：5-GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGTAAG-3(EcoR I)

下游引物：5-GCGCTCGAGTTATTTTATATTATAAGTTG-3(Xho I)。

另一方面，本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株；

2)对分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌进行自诱导发酵培养；

3)对发酵培养后的大肠杆菌进行离心，收集培养基，培养基经0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液；

4)将收集的滤液与佐剂混匀，制备产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗。

进一步地，在步骤4)之前对滤液进行无菌检验。

进一步地，所述无菌检验根据《中国兽药典》附录进行。

进一步地，在步骤4)之前测定所述滤液的毒性。

进一步地，在步骤4)之前测定所述滤液的毒性的步骤包括：卵磷脂酶活性试验。

进一步地，在步骤4)之前测定所述滤液的毒性的步骤包括：小鼠毒力试验。

进一步地，在步骤4)之前测定所述滤液的毒性的步骤包括：卵磷脂酶活性试验和小鼠毒力试验。

进一步地，所述佐剂为氢氧化铝胶，且所述滤液与所述氢氧化铝胶通过搅拌混匀。

本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

(1)菌种：制苗用菌种为大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株，该菌种表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白第176位组氨酸突变为天冬酰胺；

(2)一级种子繁殖及鉴定：用灭菌生理盐水将冻干菌种做适当稀释，划线接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37℃培养14～18小时，挑取单菌落，接种于LB液体培养基，置37℃培养12～16小时，与50％甘油等比例混合后分装，纯粹检验合格后，作为一级种子；

(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种于LB液体培养基，置37℃，200r/min，振荡培养14～18小时，取样进行纯粹检验，合格后作为二级种子；

(4)制苗用培养基：自诱导培养基；

(5)制苗用抗原制备：

菌液培养：取二级种子，按装入60～70％发酵罐容积的自诱导培养基及0.01～0.02％的消泡剂，培养基高压灭菌后，待温度降至室温，按培养基量的2％接种二级种子，参数设置为：温度28℃，pH值7.0，通气量15升/分钟(LPM)，28℃培养20～24小时；

收获蛋白：菌液离心收集培养基，培养基经0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液；

(6)蛋白含量测定：将蛋白和不同浓度的BSA(100、50、25μg/ml)进行SDS-PAGE电泳，通过QuantiyOne软件，计算蛋白含量，应不低于25μg/ml；

(7)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长；

(8)疫苗制备：将检验合格的蛋白与氢氧化铝胶按9:1的比例加入氢氧化铝胶佐剂，50r/min搅拌20分钟，充分混匀；

(9)分装：定量分装，加盖密封，贴签。

本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的检验方法，其包括以下步骤：

(1)性状：本品为均匀混悬液，静置后上层为澄清液体，下层有少量沉淀；

(2)装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定；

(3)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长；

(4)安全检验：用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各颈部皮下注射疫苗2.0ml，观察10日，应全部健活；

(5)效力检验：下列方法任择其一；

血清中和法：用体重1.5～2.0kg健康易感家兔4只，各颈部皮下注射疫苗1.0ml；接种后14～21日，分别采血，分离血清；将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4ml分别与0.8mlA型产气荚膜梭菌毒素(含8个小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只；同时用同批小鼠2只，各注射1最小致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素；观察1日，判定结果；对照小鼠全部死亡，血清中和效价达到2(即0.1ml血清中和2MLD毒素)，即判为合格；

免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康易感家兔6只，4只颈部皮下注射疫苗1.0ml，另2只作为对照；接种后14～21日，每只兔各静脉注射1最小致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素，观察3～5日；对照兔应全部死亡，免疫兔应全部保护。

本发明所取得的有益效果为：

1.本发明所述产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其优势在于所述的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白，与野生型α毒素蛋白相比仅相差一个氨基酸残基，完整的保留其免疫原性。

2.本发明所述产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其优势在于所述的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白为无毒突变体。

3.本发明所述产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其优势在于所述的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白，在大肠杆菌BL21(DE3)中为分泌表达，蛋白在胞内表达后直接以可溶的形式分泌到胞外，在培养基中获得高纯度的重组α毒素蛋白，避免胞内蛋白繁琐的纯化、浓缩过程，减少了疫苗的生产成本。

4.本发明所述产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其优势在于所述的重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白，采用自诱导体系表达，与IPTG诱导体系相比，自诱导中的诱导剂乳糖无细胞毒性、价格低，且无需监测重组菌的生长情况来添加IPTG，降低了疫苗的生产成本，提高了生产效率。

5.本发明与传统的灭活苗相比，不存在灭活不彻底导致的安全性问题，生产过程中不存在散毒风险，抗原表达量高，免疫保护效果良好，成本低，不需要浓缩即可用于联苗的研制。

附图说明

图1：αH176N蛋白SDS-PAGE分析结果，1-3：100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的BSA，4：αH176N蛋白，M：Protein marker

图2：αH176N蛋白Western blot鉴定结果，1：空载体大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a经诱导的全菌液2：αH176N蛋白，M：Protein marker

图3：不同温度、不同乳糖含量的自诱导SDS-PAGE分析结果

具体实施方式

采用以下实施例对本发明做进一步说明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

实施例1大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株的构建

1、α毒素基因序列的测定

(1)根据GeneBank上公布的α毒素基因序列(GenBank:AY823400.1)设计引物如下：

上游引物：5-GCGGAATTCATGAAAAGAAAGATTTGTAAG-3(EcoR I)

下游引物：5-GCGCTCGAGTTATTTTATATTATAAGTTG-3(Xho I)

(2)以A型产气荚膜梭菌(苏84-A株)DNA为模板，PCR反应体系：模板1μL，高保真Taq酶0.2μL，10×Taq Buffer 5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.5μL，dNTPs(25mmol/L)4μL，MgSO₄(50mmol/L)2μL，ddH₂O 37μL。

94℃2min→(94℃30s→62.0℃1min→68℃1.5min)30个循环→68℃10min。

(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段。回收的目的片段送公司测序，获得α毒素基因序列(苏84-A株)。

2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株的构建

(1)根据α毒素测序结果，对α毒素的第176位组氨酸(CAT)突变为天冬酰胺(AAT)，同时对信号肽序列进行密码子优化；将化学合成的该序列插入到载体pET32a(EcoR I和XhoI酶切位点之间)，获得重组质粒pET32a-αH176N。

(2)将重组质粒pET32a-αH176N转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃静置培养过夜。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃振摇过夜，菌液经PCR鉴定阳性，该菌株命名为大肠埃希氏菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株(本发明又称大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株)，于2018年10月26日送至湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018717。

3、αH176N蛋白的表达

将大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1％接种于含氨苄青霉素抗性的自诱导培养基(10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L甘油，0.25g/L葡萄糖，25mM Na₂HPO₄，25mMKH₂PO₄，50mM NH₄CL，5mM Na₂SO₄，2mM Mg₂SO₄，1g/L乳糖)，28℃振摇培养24h后，6000r/min离心15min，收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤后，连同100、50、25μg/ml的BSA分别加入4×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5～8min，进行12％SDS-PAGE分析，由图1可见，目的蛋白分泌到培养基中，纯度较高，通过QuantiyOne软件，计算蛋白含量为50.1μg/ml。

4、αH176N蛋白的鉴定

以A型产气荚膜梭菌毒素的兔源多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，对αH176N蛋白进行Western blot鉴定。由图2可见，αH176N蛋白有约42.5KDa大小的目的条带，空载体大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a经诱导的全菌液无条带，表明目的蛋白已得到分泌表达。

实施例2自诱导条件的优化

1、含不同乳糖剂量的自诱导培养基的制备

培养基配制备：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L甘油，0.25g/L葡萄糖，25mMNa₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄CL，5mM Na₂SO₄，2mM Mg₂SO₄，与1g/L、2g/L、4g/L乳糖，经121℃15min灭菌，配成含1g/L、2g/L、4g/L乳糖的自诱导培养基。

2、自诱导条件的优化

将大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1％接种于含1g/L、2g/L、4g/L乳糖的自诱导培养基，每个乳糖浓度的培养基分别在16℃、28℃、37℃振摇培养24h后，6000r/min离心15min，收集上清，经0.22μm孔径滤膜过滤后，分别加入4×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5～8min，进行12％SDS-PAGE分析，由图3可见，在含1-2g/L乳糖的自诱导培养基及28℃诱导条件下，可以获得较多分泌表达的目的蛋白。

实施例3重组α毒素αH176N蛋白的毒性测定

1、卵磷脂酶活性试验

α毒素具有磷脂酶C活性，能将卵黄中的磷酸卵磷脂特异性的水解成磷酰胆碱和1,2-甘油二脂，产生白色混浊。将实施例1中的αH176N蛋白和野生型α毒素，分别滴加2μL到卵黄琼脂平板，37℃静置1h后，可见野生型α毒素滴加的位置出现白色混浊斑，而αH176N蛋白滴加的位置不出现白色混浊斑，说明αH176N蛋白已不具备α毒素的磷脂酶C活性。

2、小鼠毒力试验

10只16～20g小鼠，随机分成2组，每组5只。其中一组作为对照组，将空载体大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a自诱导的全菌液，离心后取上清，经0.22μm孔径滤膜的滤液，尾静脉注射小鼠0.3ml/只；另一组小鼠，尾静脉注射实施例1中的αH176N蛋白，0.3ml/只，连续观察7日。观察期内，尾静脉注射实施例1中的αH176N蛋白的全部小鼠均健活且无不良反应。说明重组α毒素蛋白αH176N是无毒的。

实施例4重组α毒素αH176N蛋白的免疫原性试验

1、产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备

(1)菌液培养：将大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株，发酵罐装入60～70％发酵罐容积的自诱导培养基及0.01～0.02％的消泡剂，培养基高压灭菌后，待温度降至室温，按培养基量的2％接种，参数设置为：温度28℃，pH值7.0，通气量15升/分钟(LPM)，28℃培养20～24小时。

(2)收获蛋白：菌液离心收集培养基，培养基经0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液。

(3)蛋白含量测定：将蛋白和不同浓度的BSA(100、50、25μg/mL)进行SDS-PAGE电泳，通过QuantiyOne软件，计算蛋白含量为62.4μg/mL。

(4)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

(5)疫苗制备：将检验合格的蛋白稀释至25μg/mL，与氢氧化铝胶按9:1的比例加入氢氧化铝胶佐剂，50r/min搅拌20分钟，充分混匀。

(6)分装：定量分装，加盖密封，贴签。

2、疫苗的免疫原性试验

免疫攻毒：将1、0.5、0.25mL 3个剂量的疫苗，分别颈部皮下注射体重1.5～2.0kg健康易感家兔，在免疫后第7、14、21日，分别取每个剂量疫苗免疫兔6只，连同相同条件对照兔6只(即9个免疫组，3个对照组，共72只试验兔)，分别采血后，耳缘静脉注射1MLD的A型产气荚膜梭菌毒素，连续观察3～5日。

血清中和：将上述每只兔采血分离的血清，进行血清中和试验，测定其中和抗体效价。将每组6只试验兔的血清等量混合，取混合血清0.4mL分别与0.8mL A型产气荚膜梭菌毒素(含小鼠不同最小致死剂量的毒素)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只。同时用同批小鼠2只，各注射1MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。观察1日，判定结果。测定其中和抗体效价。

结果如下：

1mL疫苗免疫兔，在免疫后14、21日攻毒6/6健活，优于现行《中国兽药典》中兔产气荚膜梭菌(A型)灭活疫苗免疫后21日至少3/4攻毒保护的标准。

2组、3组、6组的免疫兔攻毒均6/6健活，血清中和效价分别为2、5、4(即0.1mL兔血清可中和2、5、4最小致死剂量的A型产气荚膜梭菌毒素)，而5组、8组、9组的免疫兔攻毒分别5/6健活、3/6健活、4/6健活，血清中和效价分别为1、0、1，说明免疫兔混合血清中和效价＝1时，并不能保证每只免疫兔攻毒后存活，而混合血清中和效价≥2时能保证免疫兔全保护。

因此，在制定疫苗效力检验标准时规定：

血清中和法：用体重1.5～2.0kg健康易感家兔4只，各颈部皮下注射疫苗1.0ml。接种后14～21日，分别采血，分离血清。将4只免疫家兔的血清等量混合，取混合血清0.4ml分别与0.8mlA型产气荚膜梭菌毒素(含8个小鼠最小致死剂量)，混合后置37℃作用40min，然后静脉注射16～20g小鼠2只，0.3ml/只。同时用同批小鼠2只，各注射1最小致死剂量的A型产气荚膜梭菌毒素。观察1日，判定结果。对照小鼠全部死亡，血清中和效价达到2(即0.1ml血清中和2MLD毒素)，即判为合格。

免疫攻毒法：用体重1.5～2.0kg健康易感家兔6只，4只颈部皮下注射疫苗1.0ml，另2只作为对照。接种后14～21日，每只兔各静脉注射1最小致死剂量的A型产气荚膜梭菌毒素，观察3～5日。对照兔全部死亡，免疫兔全部保护。

实施例5基因工程疫苗与灭活疫苗效力试验比较

1、A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备

(1)取冻干的A型产气荚膜梭菌(苏84-A株)，接种于肉肝胃膜消化汤中，置37℃培养20小时，作为一级种子；取一级种子按3％的量接种于肉肝胃膜消化汤中，置37℃培养6小时，作为二级种子。

(2)取二级种子，按3％的量接种于肉肝胃膜消化汤中，置37℃培养6小时；培养液4℃8000r/min离心20min，上清经0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液，即为A型产气荚膜梭菌毒素。

(3)毒素进行小鼠(16～20g)毒力试验，测定1MLD为0.02ml，将毒素按5％加入甲醛溶液，充分振摇后，置37℃灭活5日，期间每5～6小时振摇一次；将灭活脱毒的毒素腹腔注射小鼠(16～20g)4只，0.4mL/只，观察7日，均健活。

(4)将灭活脱毒的毒素，与氢氧化铝胶按9:1的比例加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀，即为自制的A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。

2、基因工程疫苗与灭活疫苗效力试验

将实施例4中制备的αH176N蛋白液(62.4μg/mL)，与氢氧化铝胶按9:1的比例加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀，作为本次试验用基因工程疫苗。

商品化疫苗购自市场上的兔产气荚膜梭菌病(A型)灭活疫苗，为全菌液灭活的A型产气荚膜梭菌苏84-A株及其类毒素，用量为每只2mL。

分别将基因工程疫苗(1、0.25、0.125mL)、类毒素疫苗(2、1mL)、商品化疫苗(2mL)免疫1.5～2.0kg健康易感家兔，每个剂量组各6只，21日后，连同6只对照组，耳缘静脉注射1MLD的A型产气荚膜梭菌毒素，连续观察3～5日。

结果如下：

结果显示,培养的重组蛋白液0.25mL免疫保护效果优于类毒素疫苗2mL及商品化疫苗2mL的免疫保护效果。本发明与传统的灭活苗相比，不存在灭活不彻底导致的安全性问题，生产过程中不存在散毒风险，抗原表达量高，免疫保护效果良好，成本低，不需要浓缩即可用于联苗的研制。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法

<141> 2018-12-27

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1194

<212> DNA

<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素全长基因

<400> 1

atgaaaagaa agatttgtaa ggcgcttatt tgtgctgcgc tagcaactag cctatgggct 60

ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaaaattg atggaacagg aactcatgct 120

atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtctaaaaa tgaaccagaa 180

agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 240

acttatccag attatgataa gaacgcctat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300

gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 360

acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420

aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 480

actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggaaatgt taagtttgag 540

acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 600

gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaagatttta atgcatggtc aaaagaatat 660

gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720

agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 780

gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 840

aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 900

gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960

gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 1020

gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080

gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta 1140

gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaa 1194

<210> 2

<211> 1194

<212> DNA

<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素无毒突变及密码子优化后序列

<400> 2

atgaaacgta aaatctgcaa agctctgatc tgcgctgctc tggctacctc tctgtgggct 60

ggtgcttcta ccaaagttta cgcttgggat ggaaaaattg atggaacagg aactcatgct 120

atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtctaaaaa tgaaccagaa 180

agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 240

acttatccag attatgataa gaacgcctat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300

gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 360

acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420

aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 480

actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggaaatgt taagtttgag 540

acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 600

gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaagatttta atgcatggtc aaaagaatat 660

gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720

agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 780

gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 840

aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 900

gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960

gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 1020

gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080

gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta 1140

gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaa 1194

<210> 3

<211> 398

<212> PRT

<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素的氨基酸序列（突变体）

<400> 3

Met Lys Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys

20 25 30

Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Val Ser

35 40 45

Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His

85 90 95

Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp

100 105 110

Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys

115 120 125

Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln

130 135 140

Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp

145 150 155 160

Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly Asn

165 170 175

Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile

180 185 190

Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr Ala Asp Ile Leu

195 200 205

Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe

210 215 220

Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His

225 230 235 240

Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser

245 250 255

Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser

260 265 270

Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala

275 280 285

Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met

290 295 300

Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met

305 310 315 320

Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr

325 330 335

Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met

340 345 350

Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro

355 360 365

Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp

370 375 380

Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys

385 390 395

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素基因上游引物

<400> 4

gcggaattca tgaaaagaaa gatttgtaag 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素基因下游引物

<400> 5

gcgctcgagt tattttatat tataagttg 29

Claims

1.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株的构建方法，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：

1）根据GeneBank上公布的α毒素基因序列AY823400.1设计引物，以A型产气荚膜梭菌DNA为模板，进行PCR扩增；

2）PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段，回收的目的片段送公司测序，获得α毒素基因序列；

3）根据α毒素测序结果，对α毒素的第176位组氨酸（CAT）突变为天冬酰胺（AAT），同时对信号肽序列进行密码子优化，优化得到的序列如SEQ ID NO:2所示；将化学合成的该序列插入到载体pET32a的EcoR I和 Xho I酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-αH176N；

4）将重组质粒pET32a-α H176N转化BL21（DE3）感受态细胞并进行培养，PCR鉴定阳性的大肠杆菌菌株即为分泌产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠杆菌菌株。

3.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：

1）根据权利要求2所述的方法构建分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株；

2）对分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌进行自诱导发酵培养；

3）对发酵培养后的大肠杆菌进行离心，收集培养基，培养基经0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液；

4）将收集的滤液与佐剂混匀，制备产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗。

4.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：发酵培养的培养基包括自诱导培养基和消泡剂。

5.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤4）之前对滤液进行无菌检验。

6.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤4）之前测定所述滤液的毒性，其包括步骤：卵磷脂酶活性试验和小鼠毒力试验。