CN108066755A

CN108066755A - 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108066755A
Application number: CN201711445590.9A
Authority: CN
Inventors: 袁于人; 殷波; 陆洲
Original assignee: Bio Technology (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Aidi Weixin Suzhou Biological Products Co ltd; Sihui Biotechnology (Jiangsu) Co.,Ltd.
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108066755B

Abstract

本发明公开了一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1：从NCBI搜索并下载细粒棘球绦虫的EG95基因序列如SEQ ID NO.2所示，EG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，然后进行氨基酸序列修饰，得到修饰后的EG95氨基酸序列；S2：将多个修饰后的EG95氨基酸序列的基因序列通过柔性linker进行串联表达，形成重组后的多EG95基因序列；S3：将重组后的多EG95基因序列克隆到pET28b质粒载体中，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，采用添加标签的融合表达方式进行诱导表达得到重组蛋白；S4：将重组蛋白进行蛋白纯化后即得抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液。本发明可以大幅度降低羊包虫抗原的生产成本，大大简化了生产工艺，具有安全、高效、成本低等诸多优点。

Description

一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

包虫病，又称棘球蚴病，是由棘球属(Genus echinococcus)虫种的幼虫所致的一种人兽共患病。棘球属虫种有细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,Eg)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)、福氏棘球绦虫(E.vogeli)和少节棘球绦虫(E.oligarthrus)等，其形态、宿主和分布地区略有不同，以细粒棘球绦虫最为常见。细粒棘球绦虫属于扁形动物门、绦虫纲、多节亚纲、圆叶目、带科、棘球属，它的幼虫称棘球蚴(hydatidcyst)，为圆型或不规则的囊状体，由囊壁、生发囊、原头蚴、囊砂和囊液组成，有的还有子囊和孙囊，囊壁外由宿主的纤维组织包绕。

绵羊细粒棘球绦虫俗称羊包虫，是细粒棘球绦虫的幼虫感染绵羊所引起一种人兽共患病。它是由Eg的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害健康的人畜共患寄生虫病，是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。包虫病严重危害人类的健康和农牧业经济的发展。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。

包虫病对人危害主要表现为在肝脏、肺、脑或肾等器官形成占位性包囊病变，以机械压迫与营养消耗等形式造成这些重要器官的严重损害，甚至导致个体死亡。由于细粒棘球蚴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布，是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其中以新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省(区)流行最为严重，高发区约占全国面积的44％，受威胁人口约5千万。而对于家畜而言，包虫病将会造成家畜的减产、品质下降等重大经济问题，并且作为寄生虫感染生活史的重要一个环节对人民生命财产安全带来巨大隐患。包虫病的防治已经作为衡量一个国家经济发展水平和文明程度的重要指标，我国目前的寄生虫感染情况不容乐观，与我国社会经济的发展速度大不相适应。

常用的防治手段有：

1、外科手术和药物治疗

目前，人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状，等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蚴或有手术禁忌的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。无论是手术治疗，还是药物治疗，对于包虫病治疗都有很大的不足，因此这就需要研究更有效的防治措施。

2、基因工程疫苗防治

近年来，分子生物学、蛋白组学、细胞学、免疫学等的研究突飞猛进，尤其是分子生物学的快速发展促进了寄生虫免疫应答和免疫诊断的研究，为研制理想疫苗提供了新方法。

Lightowlers等发现EG95是存在于Eg中的一种分子量为24.5kDa的天然六钩蚴抗原，其编码基因全长715bp，其中462bp基因可编码分子量为16.5kDa的含153个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析发现EG95蛋白含纤连蛋白III型结构域，与免疫球蛋白超家族、细胞粘附分子、细胞表面受体和糖结合蛋白有部分同源性，在Eg六钩蚴入侵小肠绒毛上皮的过程中起重要作用。

Eg疫苗相应的抗原主要有特异性诊断抗原和保护性抗原，其中与诊断有关的抗原主要有天然抗原和重组抗原及合成肽，与保护性相关的抗原主要有寄生虫免疫原和分子疫苗。用于疫苗防治的抗原主要有寄生虫免疫原、基因工程抗原和多肽抗原等。近年来，基因工程重组抗原疫苗的研发越来越备受关注。

大量的研究证明，源自于羊包虫的EG95基因是目前为止研发的最有效的防止绵羊包虫的抗原组分，然而EG95的表达产物在大肠杆菌中绝大部分仍以不可溶的包涵体形式存在。在制备疫苗时，仍需要用高浓度尿素溶解，由于重复的变性复性，不仅导致其抗原性降低而且也大大增加了抗原的生产成本。为了提高其免疫原性还需要用Quil-A作为佐剂，因此，每剂疫苗需要高达50μg的抗原量，导致生产成本居高不下，极大地限制了其推广应用(Lightowlers,Parasitology,2006,S27-S42)。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提出一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用，可以大幅度降低羊包虫抗原的生产成本，大大简化了生产工艺，具有安全、高效、成本低等诸多优点。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1：从NCBI搜索并下载细粒棘球绦虫的EG95基因序列如SEQ IDNO.2所示，EG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，然后进行氨基酸序列修饰，得到修饰后的EG95氨基酸序列；

S2：将多个修饰后的EG95氨基酸序列的基因序列通过柔性linker进行串联表达，形成重组后的多EG95基因序列；

S3：将重组后的多EG95基因序列克隆到pET28b质粒载体中，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，采用添加标签的融合表达方式进行诱导表达得到重组蛋白；

S4：将重组蛋白进行蛋白纯化后即得抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液。

进一步的，所述步骤S1中将EG95氨基酸序列的N-端截短2，4，6，8，10或12个氨基酸；优选地，将EG95氨基酸序列的N-端截短8个氨基酸，修饰后的EG95氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

进一步的，所述步骤S2中将修饰后的EG95氨基酸序列的2或3个重复基因序列串联表达；优选地，将修饰后的EG95氨基酸序列的2个EG95重复基因序列串联表达形成EG95-linker-EG95重组序列，重组后的EG95-linker-EG95基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述步骤S2中柔性linker具有11个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，所述步骤S3中采用添加标签的融合表达方式所采用的标签包括SUMO，GST，6*His，Flag或Trx中的任意一种。

进一步的，所述步骤S3中，将重组后的多EG95基因序列克隆到pET28b质粒载体中，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过单克隆筛选，得到优质高产菌株，然后将该高产菌株接种到500mL含氨苄霉素和氯霉素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至OD值为1.5～2.0左右时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到25～30左右时，添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12h～16h。

进一步的，所述步骤S4中，用含Ni-NTA亲和层析介质进行蛋白纯化。

进一步的，还包括将抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液低温保存，具体为将抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液溶于pH6.0～9.0的25mM～1000mM Tris-HCl和50mM～500mM NaCl的缓冲液中，并置于4℃～10℃条件下保存。

一种上述的制备方法得到的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗。

上述的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗在制备无佐剂注射剂型疫苗或佐剂注射型疫苗中的应用。

进一步的，所述佐剂注射剂型疫苗含4mg/4mL的佐剂和含3000μg/4mL的重组蛋白，所述佐剂为氢氧化铝。

本发明的突出效果为：

本发明的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用具有以下优点：

1、本发明通过对细粒棘球蚴绦虫病EG95基因编码的氨基酸序列进行修饰，并通过柔性Linker连接修饰后的EG95单体序列，然后与pET28b载体连接后得到pET28b-2EG95重组子，通过单克隆筛选后得到优势菌株，该优势菌株能够高效表达羊包虫病抗原蛋白，该抗原蛋白不但可溶性良好，免疫学实验证明其抗原性良好，单位菌量的大肠杆菌其表达量高达5～10mg，而且动物实验证明其具有良好的免疫保护性；

2、本发明的制备方法在大肠杆菌生物反应器中生产可溶性的羊包虫抗原，表达量是EG95原始序列的10～100倍，同时改进了融合抗原的基因结构，使得其抗原性得到了极大的提高，加之生产的抗原均为可溶性的，生产中不需要经过高浓度的尿素变性和随之的复性过程，佐剂也不需要用进口的专用佐剂Quil-A，抗原的生产和疫苗制备的加工成本得到了极大的降低；

3、本发明羊包虫2EG95亚单位疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组稍优于无佐剂组，而阴性对照组没有产生双重免疫应答；制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均能产生满意的双重免疫应答。同时其具有高水平的保护效果，免疫保护率在95％以上。该疫苗有望在羊包虫防治中发挥巨大的作用。

附图说明

图1为本发明实施例3经Ni-NTA纯化的2EG95蛋白SDS-PAGE检测结果电泳图；1：BSA，0.5mg/mL，1μL；2-4：上清液，沉淀，穿出，2μL；5-13：25％咪唑洗脱样品，5μL。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1、抗羊包虫病感染病亚单位疫苗pET28b-2EG95重组表达载体的构建

1.1溶液和培养基的配置

溶液I：25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％SDS(现配现用)。

溶液III：100mL体系，5mol/L醋酸钾80mL，冰乙酸12mL，ddH2O8mL。

TAE(50×)：242g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，无菌水定容至1000mL。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值到7.0(固体培养基含1.5％琼脂)。

蛋白上样缓冲液(2×)：100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4％SDS、0.2％溴酚蓝、10％甘油。

30％丙烯酰胺溶液29g：丙烯酰胺，1gN，N′-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100mL水，过滤。

考马斯亮蓝染液：0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)和10mL冰乙酸中。

脱色液：10％冰乙酸。

1.2重组2EG95基因人工合成

首先对EG95基因原始序列进行碱基突变，然后将突变后的EG95基因序列通过flexible linker进行连接，形成EG95-flexiblelinker-EG95重组序列，将重组的2EG95基因进行人工合成。

1.3pET-28b载体双酶切

酶切反应体系(50μL)

pET28b plasmid vector:43μL

NcoI/XhoI:2μL

FastDigest Buffer:3μL

反应条件：37℃,50min

1.4线性pET28b载体与2EG95基因重组反应

将双酶切后的线性pET28b载体与2EG95基因相连，获得pET28b-2EG95重组质粒。

反应体系(10μL)

2×Assembly Mix：5μL

linearized plasmid vector：4μL

Inserts：1μL

反应条件：37℃，1h

1.5将重组子转入大肠杆菌DH5α

将连接产物全部转入盛30μL DH5α感受态细胞的无菌Eppendorf管中，冰浴30min，42℃热击90s，然后再冰浴2min，接着向Eppendorf管中加入500μL无菌无抗的LB培养基，37℃/250rpm条件下振荡培养40min，取100μL菌液涂布于含氨苄霉素的LB平板上，做两个重复。然后将平板倒置于37℃的培养箱中正放10min，然后倒放过夜培养。

1.6菌落PCR及重组质粒的测序鉴定分析

挑取单克隆菌落，接种于含100μL含氨苄霉素的LB无菌Eppendorf管中，37℃/250rpm条件下振荡培养，直至出现浑浊。然后以菌液为模板，进行PCR扩增，取PCR结果为阳性的单克隆菌悬液，送金唯智(苏州)生物科技有限公司进行测序。测序结果用NCBI中的BLAST进行序列比对与分析。

PCR反应体系(50μL)

模板：菌液1μL

引物：(各1μL)

Forwardprimer:5’-GGTGGTGGTGCTCGAGATGGAAACAAGAACAACAGAAAC-3’

Reverseprimer:5’-GACGACAAGGCCATGGTTATACGAATAGGCTTCTGTTGA-3’

2×EasyTaq SuperMix:25μL

ddH₂O:22μL

实施例2、pET28b-2EG95重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达

将pET28b-2EG95重组质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌，涂布LB固体平板(方法同“1.5”)。通过单克隆筛选，得到优质高产菌株。然后将该高产菌株接种到500mL LB培养基(含氨苄霉素和氯霉素)中，在37℃条件下震荡培养至至OD值为1.5～2.0左右时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到25～30左右时开始降温至20℃，等温度稳定时添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～16h。

实施例3、羊包虫2EG95蛋白的纯化

BufferZ:25mM Tris-HCl(pH7.2),25mM Potassinm Phosphate(pH6.8),500mMNaCl,10％Glycerol,1mM DTT

Equilibrium buffer:10mM Tris-HCl(pH7.2),250mM NaCl,10％Glycerol

1M imidazole,pH 7.0

3.1发酵液离心及全细胞破碎

发酵结束后，将发酵液离心(10000rpm离心8min)后弃上清，沉淀用BufferZ重悬。重悬后的菌体采用高压均质机破碎(破碎压力为1000bar)，破碎结束后离心(23000rpm离心1h)，收集上清。

3.2目的蛋白纯化

将破碎后的上清液中加入3～5％的imidazole，先用100％Equilibrium buffer平衡Ni-NTA层析柱，然后挂样品，挂柱结束后直接用25％imidazole进行目的蛋白洗脱，最后将纯化获得的目的蛋白样液过夜透析以去除咪唑(如图1所示，2EG95蛋白经Ni-NTA纯化获得的纯品)。

实施例4、抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗注射剂型配制

BufferA:25mM Tris-HCl,200mM NaCl

4.1无佐剂型注射剂配置

将纯化的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液不加佐剂，用BufferA配制成2EG95浓度为3000μg/4mL的无佐剂型注射剂。

4.2有佐剂型注射剂配置

将纯化的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液加入氢氧化铝或其他佐剂，用BufferA配置成2EG95浓度为3000μg/4mL，氢氧化铝或其他佐剂为4mg/4mL的有佐剂型注射剂。

将以上注射疫苗溶液按5mL/瓶分装于西林瓶，于冷冻干燥设备冻干并封口包装，并存放于2～8℃备用。

实施例5、抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗反应原性检验

利用实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液进行ELISA检测，以检验其反应原性。

5.1包被蛋白：根据“羊包虫”疫苗免疫后血清检测待检蛋白的抗原-抗体反应原理，将待检蛋白经蛋白定量后，分别稀释至1μg/mL，用多道移液器在96孔酶标板中加入100μL/孔，4℃孵育过夜。

5.2弃板中液体，用PBST洗涤3次，每次3min。加入5％脱脂奶粉封闭缓冲液200μL/孔，37℃孵育1h后，弃板中液体，用PBST洗涤3次，每次3min，液体拍干待用。

5.3ELISA检测

(1)将“羊包虫”疫苗免疫前、后血清、阴性血清、阳性血清做1：200倍稀释；

(2)每孔加入100μL血清，平行对照两孔，轻轻混匀后，37℃恒温孵育45min；

(3)弃去孔中液体，用PBST洗涤3次，每次3min，洗板三次，最后一次将水拍干；

(4)加入(1:5000)酶标二抗100μL每孔，轻轻混匀后，37℃恒温孵育45min。重复(3)。

(5)加入OPD显色液100μL每孔,37避光5min；

(6)加入终止液50μL每孔后，10min内在波长492nm测出OD值。

结果判定：OD 492nm≤0.3 阴性

OD 492nm≥1.0 阳性

0.3<OD 492nm<1.0 可疑

结果显示：本发明抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液反应原性良好(表1所示)。

表1

实验例6、抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗对实验羊群体内的免疫应答效果实验

利用实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的注射剂型，并用等量PBS、铝盐为对照组，分别免疫3-4月龄羔羊。每次皮下免疫1mL，进行两次皮下免疫。两次免疫间隔28天，末次免疫后14天采集实验羊静脉血并分离血清，根据现行抗体检验规程进行抗体效价检测。

结果显示，本发明抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且试验组有佐剂组稍优于无佐剂组，而阴性对照组没有产生双重免疫应答；制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗不管是注射还是滴鼻、饮水剂型均能产生满意的双重免疫应答(表2所示)。

表2

实验例7抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗对实验羊群体内的免疫保护效果实验

利用实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的注射剂型为实验组，并用PBS、铝盐为对照组，分别免疫无免疫背景羊群，其免疫剂量按60μg/头份免疫两次(0，21天)，末次免疫后14天，各试验组、对照组用200个/头实验狗体内分离的虫卵喂食攻毒，观察保护效果。

结果显示，本发明羊包虫疫苗能产生高水平的保护效果，免疫保护率在95％以上，而其他各对照组保护率为0％。因此，本发明制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗在羊群体内具有高效的免疫保护效果。

实验例8、抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的安全性实验

(1)无菌、支原体试验：

将实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗分别接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养10d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为30℃。结果显示，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗都未见细菌生长。分别将抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养15天，次代培养15天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞培养5天，传代2次，用二苯甲酰胺荧光染料染色。

结果显示，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗均无支原体生长。

(2)溶血性试验：

选取体重为300g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血2mL，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释100倍。生理盐水稀释抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗(由实施例4制备)，分别为2倍、5倍、10倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，6h后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。

结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗均无溶血反应。

3)急性毒性试验：

取实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗1mL腹腔注射体重为10～15g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续3周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为10～15kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗肌肉注射10mL，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续3周观察行为、体重和存活率变化。

结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗均无急性毒性反应，使用是安全的。

(4)过敏试验研究：

取实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗皮下接种体重为250～300g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠10只，每只接种1mL，隔日一次，共4次。第4次注射后20天，耳静脉分别给予相同抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗1mL，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后1h及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗在动物体内均无过敏反应。

(5)兔热源质试验：

取预检合格的体重为1～3kg家兔5只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30min，要求2次温差不大于0.5℃，各家兔2次平均温度在38～40℃。将实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗预热至38℃，于第2次测温后15min内，自家兔耳边静脉分别缓缓注入1mL/只。注射后每隔30min测量体温1次，连测6次。结果显示：抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗给予家兔个体升温均未超过0.5℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗均无热源质。

实验例9、抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗稳定性实验

将实施例4制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，分别置于2～8℃、室温(20～25℃)、37℃1周，2周，1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、pH值、无菌、免疫动物观察安全性。

结果显示：抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗放置2～8℃24个月内均无变色分层等现象，pH值在7.5～8.5之间无变化，且注射或滴鼻给小鼠或实验猪，均表现正常；抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗放置室温25℃3个月内均有好的稳定性；抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗放置室温37℃1个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗放置2～8℃，理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 斯澳生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gaaacaagaa caacagaaac accactaaga aaacacttca acctaacacc agtaggaagc 60

caaggaataa gactaagctg ggaagtacaa cacctaagcg acctaaaagg agaaacaaca 120

gacataagcc taaaagcagt aaacccaagc gacccactag tatacaaaag acaaacagca 180

aaattcagcg acggacaact aacaatagga gaactaaaac caagcacact atacaaaatg 240

acagtagaag cagtaaaagc aaaaaaaaca atactaggat tcacagtaga catagaaaca 300

ccaagagcag gaaaaaaaga aagcacagta ctaatgttca acagaagcct attcgtagga 360

agcgaaacaa gaacaacaga aacaccacta agaaaacact tcaacctaac accagtagga 420

agccaaggaa taagactaag ctgggaagta caacacctaa gcgacctaaa aggagaaaca 480

acagacataa gcctaaaagc agtaaaccca agcgacccac tagtatacaa aagacaaaca 540

gcaaaattca gcgacggaca actaacaata ggagaactaa aaccaagcac actatacaaa 600

atgacagtag aagcagtaaa agcaaaaaaa acaatactag gattcacagt agacatagaa 660

acaccaagag caggaaaaaa agaaagcaca gtactaatgt tcaacagaag cctattcgta 720

<210> 2

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

caagaataca aaggaatggg agtagaaaca agaacaacag aaacaccact aagaaaacac 60

ttcaacctaa caccagtagg aagccaagga ataagactaa gctgggaagt acaacaccta 120

agcgacctaa aaggaacaga cataagccta aaagcagtaa acccaagcga cccactagta 180

tacaaaagac aaacagcaaa attcagcgac ggacaactaa caataggaga actaaaacca 240

agcacactat acaaaatgac agtagaagca gtaaaagcaa aaaaaacaat actaggattc 300

acagtagaca tagaaacacc aagagcagga aaaaaagaaa gcacagta 348

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro

1 5 10 15

Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg

20 25 30

Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile

35 40 45

Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln

50 55 60

Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro

65 70 75 80

Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr

85 90 95

Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys

100 105 110

Glu Ser Thr Val

115

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr

1 5 10 15

Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu

20 25 30

Ser Asp Leu Lys Gly Glu Thr Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn

35 40 45

Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp

50 55 60

Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met

65 70 75 80

Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val

85 90 95

Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val

100 105 110

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Leu Met Phe Asn Arg Ser Leu Phe Val Gly Ser

1 5 10

Claims

1.一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1：从NCBI搜索并下载细粒棘球绦虫的EG95基因序列如SEQ ID NO.2所示，EG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，然后进行氨基酸序列修饰，得到修饰后的EG95氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中将EG95氨基酸序列的N-端截短2，4，6，8，10或12个氨基酸；优选地，将EG95氨基酸序列的N-端截短8个氨基酸，修饰后的EG95氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中将修饰后的EG95氨基酸序列的2或3个重复基因序列串联表达；优选地，将修饰后的EG95氨基酸序列的2个EG95重复基因序列串联表达形成EG95-linker-EG95重组序列，重组后的EG95-linker-EG95基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述步骤S2中柔性linker具有11个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中采用添加标签的融合表达方式所采用的标签包括SUMO，GST，6*His，Flag或Trx中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，将重组后的多EG95基因序列克隆到pET28b质粒载体中，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过单克隆筛选，得到优质高产菌株，然后将该高产菌株接种到500mL含氨苄霉素和氯霉素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至OD值为1.5～2.0左右时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到25～30左右时，添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12h～16h。

6.根据权利要求1所述的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，用含Ni-NTA亲和层析介质进行蛋白纯化。

7.根据权利要求1所述的一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：还包括将抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液低温保存，具体为将抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗原液溶于pH6.0～9.0的25mM～1000mM Tris-HCl和50mM～500mM NaCl的缓冲液中，并置于4℃～10℃条件下保存。

8.根据权利要求1-7任意一种所述的制备方法得到的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗。

9.根据权利要求8所述的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗在制备无佐剂注射剂型疫苗或佐剂注射型疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述佐剂注射剂型疫苗含4mg/4mL的佐剂和含3000μg/4mL的重组蛋白，所述佐剂为氢氧化铝。