CN105126093B

CN105126093B - 一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗及其制备方法

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Publication number: CN105126093B
Application number: CN201510407694.5A
Authority: CN
Inventors: 郭乐; 刘昆梅; 汤锋; 贾伟; 李永红; 秦玉红
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2035-07-14
Also published as: CN105126093A

Abstract

本发明提供一种可针对幽门螺旋杆菌四种关键黏附因子的多表位疫苗，其活性是一条多肽，主要由尿素酶A和B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及霍乱毒素B亚基构成。本发明通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含尿素酶A和B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或区段，将该人工基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得四价黏附因子多表位疫苗。该疫苗能够诱发机体产生针对尿素酶A和B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，可用于防治幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

Description

一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)的感染呈全球分布，它与慢性胃炎、消化性胃溃疡、胃癌和胃黏膜相关组织淋巴瘤(MALT)等胃部疾病相关，被世界卫生组织归为I类致癌因子。在不同国家之间和同一国家不同地区之间，甚至不同民族之间，Hp感染率存在明显差异，在发达国家Hp感染率为30％-50％，我国属于世界上感染率较高的地区，感染率高达58.07％，且呈现明显的家庭聚集现象。目前Hp感染的治疗主要基于抗生素药物疗法，虽然在临床中已被证明是一种根除Hp感染的有效方法，但抗生素药物疗法存在诸多弊端：(1)服用药物剂量较大和治疗周期较长，病人的依从性较差。(2)抗生素药物疗法存在毒副作用。(3)抗生素药物疗法导致Hp耐药性增强。(4)抗生素药物疗法治疗后难以避免Hp的重复感染。(5)抗生素药物疗法主要是针对有症状的病人，而无症状的病人仍可能发展为严重的Hp感染性相关胃病。因此，研制有效的预防性或治疗性Hp疫苗，既可诱发特异性免疫应答预防或根除Hp感染，毒副作用少，又可避免Hp的重复感染，成为国内外学者竞相研究的一个热点。

幽门螺旋杆菌对胃粘膜屏障的破坏作用主要涉及二种关键因子：(1)黏附因子(黏附素)：主要指Hp表面的一类蛋白质。Hp可通过黏附因子附着在胃黏膜细胞上，对Hp的胃部定植起着重要作用。(2)毒力因子：主要指Hp可直接作用于胃黏膜细胞的毒力蛋白，对胃黏膜细胞起破坏作用。因此，Hp对人类胃部的感染，关键的第一步是通过黏附因子黏附胃黏膜细胞，而Hp表面的一些关键黏附因子蛋白，主要有Hp尿素酶、黏附素HpaA、外膜蛋白Lpp20、CagL等蛋白。幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶(Ure)，约占全菌体蛋白的5％～10％，在Hp内部和表面广泛表达，尿素酶由A和B两个亚单位(UreA和UreB)组成。一般细菌难以在胃部的高酸环境中存活，但Ure能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造成病理性损伤。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。幽门螺旋杆菌黏附素HpaA是Hp鞭毛鞘膜蛋白，几乎存在于所有临床分离的Hp菌株表面，是Hp主要的黏附因子之一，且氨基酸序列高度保守，动物实验已证明HpaA是定植的必要因子，是Hp疫苗研制的一种理想的保护性抗原。Lpp20是Hp的另一种外膜蛋白，有研究表明，Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性，天然Lpp20蛋白的分离纯化比较困难，给制备Lpp20亚单位疫苗带来了困难。CagL为幽门螺杆菌外膜伴侣蛋白的一种，由Hp的细胞毒素相关基因毒力岛(cagPAI)编码并表达于Hp IV型分泌系统(Type IV secretion system，TFSS)菌毛结构的表面蛋白，桥联TFSS与靶细胞的特异性黏附，不但能激活整合素依赖的细胞信号通路，还具有与纤维黏连蛋白相似的功能，能直接诱导鼠成纤维细胞形成黏着斑、刺激AGS细胞的扩散。

本发明的思路如下：根据机体对Hp的免疫保护性机制，合理预测和筛选Hp尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或表位区段和分子内黏膜佐剂CTB，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA、CagL)的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种可针对Hp四种关键黏附因子尿素酶、Lpp20、HpaA和CagL的Hp四价黏附因子多表位疫苗。

本发明的第二个方面是提供了Hp四价黏附因子多表位疫苗的制备方法。

本发明的第三个方面是公布了Hp四价黏附因子多表位疫苗的用途。

本发明的第一个方面是提供了一种针对Hp关键黏附因子尿素酶、Lpp20、HpaA和CagL蛋白的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。该Hp多价表位疫苗主要由黏附因子多表位肽FAdE和霍乱毒素B亚基构成，黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列如(序列3)所示，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的整体氨基酸序列如(序列1)所示。

本发明的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE具有以下优点：(1)Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE将尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势抗原表位或区段和黏膜免疫佐剂CTB科学合理地整合在一起，可激发针对Hp尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。(2)Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL蛋白也存在一定的细胞生物学毒性，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有这4种Hp黏附因子的优势Th和B细胞抗原表位或区段，避免了其生物学毒性，且能够激发针对这4种Hp黏附因子的高特异性抗体，具有更高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。(3)以Hp尿素酶A和 B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL等制备Hp四价亚单位基因工程疫苗，存在重组蛋白过大，不易表达、提取、纯化等问题，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有这4种Hp黏附因子的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提取及纯化。(4)Hp黏附因子抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本发明的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE采取“偶联分子内免疫佐剂”和“抗原表位多重拷贝”两种设计思路来增强Hp黏附因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。

本发明的第二个方面是提供Hp四价黏附因子多表位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：

(1)Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的结构设计

根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，通过生物信息学软件合理筛选Hp尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位及分子内黏膜免疫佐剂CTB，并对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。

(2)重组表达质粒pCzn1-CFAdE(含有融合基因CFAdE)的构建

首先构建一个含有霍乱毒素B亚基(CTB)基因的重组表达载体pCzn1-C；然后通过基因合成技术合成一个黏附因子多表位肽FAdE(含有Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL的优势抗原表位或区段)的核苷酸序列，并将其插入重组表达载体pCzn1-C中，构建重组表达载体pCzn1-CFAdE。

(3)重组蛋白CFAdE的原核表达及纯化

将重组表达载体pCzn1-CFAdE转化进大肠杆菌Arctic Express中，构建重组基因工程菌株Arctic Express/pCzn1-CFAdE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和层析能够获得高纯度融合蛋白CFAdE，即为Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。

本发明的第三个方面是提供了Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的用途。Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

附图说明

图1：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的分子结构设计特点。

图2：重组表达载体pCzn1-CFAdE的双酶切鉴定。

泳道M：DNAMarker；泳道1：pCzn1-CFAdE/Nde I+Hind III；泳道2：酶切前质粒。

图3：重组蛋白CFAdE的原核表达。

泳道M：蛋白质Marker；泳道1：Arctic Express/pCzn1-CFAdE全菌蛋白(未经IPTG诱导)；泳道2：Arctic Express/pCzn1-CFAdE全菌蛋白(经IPTG诱导1h)；泳道3：ArcticExpress/pCzn1-CFAdE全菌蛋白(经IPTG诱导2h)；泳道4：Arctic Express/pCzn1-CFAdE包涵体蛋白(经IPTG诱导4h)；泳道5：Arctic Express/pCzn1-CFAdE可溶性蛋白(经IPTG诱导4h)。

图4：重组蛋白CFAdE的Ni-NTA亲和层析纯化。

泳道M：蛋白质Marker；泳道1：CFAdE包涵体蛋白(上样蛋白)；泳道2：杂蛋白；泳道3：纯化后的CFAdE蛋白样品。

图5：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗天然Hp尿素酶(Ure)抗体的检测。

Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和天然Hp尿素酶都能诱发较高滴度抗尿素酶抗体。

图6：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗UreA抗体的检测。

Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和Hp尿素酶都能诱发较高滴度的抗UreA抗体。

图7：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗UreB抗体的检测。

Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和Hp尿素酶都能诱发较高滴度的抗UreB抗体。

图8：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗外膜蛋白Lpp20抗体的检测。

只有Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE才能诱发较高滴度的抗外膜蛋白Lpp20抗体。

图9：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗外膜蛋白HpaA抗体的检测。

只有Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE才能诱发较高滴度的抗HpaA抗体。

图10：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE诱发抗外膜蛋白CagL抗体的检测。

只有Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE才能诱发较高滴度的抗外膜蛋白CagL抗体。

图11：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE致敏的小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。

Hp尿素酶A亚基、尿素酶B亚基、外膜蛋白(Lpp20、HpaA、CagL)和CFAdE刺激Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞均能发生明显的淋巴细胞增殖反应。

具体实施方式

材料

1.IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2.氨苄青霉素(Amp)贮液(100mg/mL)：称取100mg氨苄青霉素(Amp)溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3.培养基：(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。(2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4.DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5.SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS 5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮蓝G-250100mg溶解在50ml 95％乙醇中，然后加入86％磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。(2)考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。(3)固定液：500ml乙醇、100ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(4)脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(5)保存液：25ml 87％甘油溶于225ml脱色液中。

7.RNaseA溶液(10mg/ml)：10mg RNaseA溶解于987μl水中，加入10μl 1M Tris-HCl(pH7.5)和3μl 5MNaCl，沸水浴15min后，缓慢冷却至室温，分成小份存于-20℃备用。

8.Lysozyme溶液(10mg/ml)：10mg Lysozyme溶于1ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)。

9.实验动物：BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8～10周龄。

10.ELISA试剂：(1)包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。(2)洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1000ml(PBST)。(3)封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。(4)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml(1MH₂SO₄)。

11.淋巴细胞增殖实验主要试剂(1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司)(2)RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。(3)RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO₃，加去离子水至1000ml，pH 7.4，超滤除菌，分装。

13.BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93ml，1.5g琼脂粉，121℃灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7ml脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/ml)，万古霉素(终浓度 10μg/ml)和甲氧苄氨嘧啶(终浓度5μg/ml)，分装至培养皿，冷却后备用。

14.尿素肉汤：称取葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾2g、氯化钠5g，加蒸馏水1000ml，矫正PH至7.2，再加入2ml 0.4％酚红溶液，高压灭菌(68.95kPa)20分钟，冷至60℃左右时加入已用滤菌器过滤的1ml 50％尿素溶液，混匀后备用。

实例1：幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的分子结构设计

根据“机体对Hp的免疫保护性机制”和“Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL等关键黏附因子抗原表位或区段的免疫学性质”，通过生物信息学筛选UreA_27-90、UreA_183-225、UreB_327-385、Lpp20_58-97、Lpp20模拟表位(SWPLYSDASGLG)、HpaA_52-194、CagL_21-139等抗原表位或区段和分子内黏膜免疫佐剂CTB用于幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的构建。然后，通过表位疫苗的构建理论和生物信息学的分析，对所选择的抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和抗原表位拷贝数，加以分析和确定，最终设计出具有科学合理结构的幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。经DNAstar和MOE等生物信息学软件分析，CFAdE具有较好的等电点、抗原性和高级结构。从设计理论上讲，CFAdE能够激发机体产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，能够达到Hp感染性疾病的有效预防和治疗。

结果：幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的分子结构设计特点和思路如(图1)所示。

实例2：重组表达载体pCzn1-CFAdE(含有融合基因CFAdE)的构建

(1)黏附因子多表位肽FAdE核苷酸序列的基因合成

将前期设计的黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托钟鼎生物科技公司进行基因合成。

(3)黏附因子多表位肽FAdE基因与pCzn1-C表达载体的连接

将合成的黏附因子多表位肽FAdE基因和pCzn1-C(含有CTB基因)，用BamH I/Xbal分别进行双酶切，反应体系如下：

37℃酶切反应2h，然后用1％琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶 DNA回收纯化试剂盒回收黏附因子多表位肽FAdE基因和pCzn1-C双酶切产物。将回收的pCzn1-C线性化载体和FAdE基因通过互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下(4℃过夜)连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒pCzn1-CFAdE。

T4DNA连接酶连接体系如下：

结果：利用Nde I/Hind III双酶切待检重组质粒pCzn1-CFAdE，37℃反应2h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段为1848bp，为CFAdE基因除去CagL_21-139表位区段的的DNA片段，与预期结果大小一致。再将pCzn1-CFAdE送交钟鼎生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pCzn1-CFAdE中融合基因CFAdE的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体pCzn1-CFAdE双酶切图谱如(图2)所示。

实例3：重组蛋白CFAdE的原核表达

将验证正确的重组表达质粒pCzn1-CFAdE转化进Arctic Express菌株中。在预先制备好的含50μg/mL Amp的LB平板上，接种环划线基因工程菌株Arctic Express/pCzn1-CFAdE，倒置于37℃培养箱，过夜培养12～16h后，挑取单个菌落，接种于含50μg/mlAMP的3mlLB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1∶100接种于50μg/ml AMP的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)。取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4h，诱导CFAdE融合蛋白表达。取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。最后，进行10％SDS-PAGE分析。

结果：将基因工程重组菌株Arctic Express/pCzn1-CFAdE在PH值为7、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导温度37℃、诱导表达4h。与对照菌株对比，基因工程重组菌株ArcticExpress/pCzn1-CFAdE在约83KD处出现目的蛋白条带，与重组蛋白CFAdE的理论大小相符合(图3)。重组蛋白CFAdE主要以包涵体蛋白的形式存在。

实例4：重组蛋白CFAdE的纯化

利用低压层析系统，重组蛋白CFAdE包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱。用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜。最后，进行10％SDS-PAGE分析

结果：经Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析纯化后，可获得高纯度重组蛋白CFAdE，纯度为95.2％(图4)。

实施例5：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的免疫原性和免疫特异性研究

(1)BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为4组，分别为Hp尿素酶(Ure)免疫组、Hp四价黏附因子多表位疫苗(CFAdE)免疫组、重组霍乱毒素B亚基(rCTB)免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共24只，详细分组如下所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

免疫方式：用75％酒精对小鼠腹部消毒，然后腹腔注射重组蛋白和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2和3周加弗氏不完全佐剂，第4周直接注射重组蛋白溶液加强免疫。

抗血清的采集：在每次免疫前采取尾部静脉采血，检测血清特异性抗体水平的变化；在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，-70℃冻存备用。

(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原(天然Hp尿素酶、UreA、rUreB、Lpp20、HpaA、CagL)用包被液稀释成5μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清(鼠抗Ure抗血清、鼠抗CFAdE抗血清和鼠抗CTB抗血清)和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10000)，100μd/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

结果：天然Hp尿素酶的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够产生与Hp尿素酶(Ure)相近水平的抗尿素酶抗体，而霍乱毒素B亚基(CTB)不能产生抗天然Hp尿素酶抗体(图5)；Hp尿素酶A亚基(UreA)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和尿素酶(Ure)免疫组能够产生相近水平的抗UreA抗体(图6)；Hp尿素酶B亚基(UreB)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE和尿素酶(Ure)能够产生相近水平的抗UreB抗体，而霍乱毒素B亚基(CTB)不能产生抗UreB抗体(图7)；外膜蛋白Lpp20的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够产生较高水平的抗Lpp20抗体(图8)；外膜蛋白HpaA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE免疫组能够产生较高水平的抗HpaA抗体(图9)；外膜蛋白CagL的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够产生较高水平的抗CagL抗体(图10)。

上述结果说明Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够刺激机体产生针对Hp尿素酶、尿素酶A亚基、尿素酶B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA、CagL)的高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性。

(3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75％酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏(暗红色)。在20ml的无菌小烧杯中放入4～5ml EZ-Sep^TM Mouse 1X淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入到淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μl的1640培养基；800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液(5×10⁶/ml)。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入重组蛋白CFAdE、尿素酶A亚基(UreA)、尿素酶B亚基(UreB)、外膜蛋白Lpp20、HpaA、CagL和生理盐水各100μl，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃5％CO₂培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTT溶液(5mg/ml)30μl，继续培养4h后，轻轻吸出上清，每孔加入DMSO 100μl振荡混匀后用酶标仪读取OD₅₇₀值。刺激指数计算公式如下：

结果：Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经Hp尿素酶A亚基、Hp尿素酶B亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA、CagL和CFAdE刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE中关键黏附因子的Th表位或区段均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答(图11)。

Claims

1.一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B 亚基(CTB)和黏附因子多表位肽FAdE构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗，其特征在于：编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗，黏附因子多表位肽FAdE主要由幽门螺旋杆菌尿素酶A和B双亚基、幽门螺旋杆菌三种外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL的优势Th和B细胞抗原表位或区段构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求3所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗，其中编码黏附因子多表位肽FAdE的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.包含权利要求2所述的核苷酸序列的表达载体，转基因细胞系及宿主菌。

6.权利要求4所述的幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗的制备方法，通过基因合成技术合成黏附因子多表位肽FAdE的核苷酸序列，将其融合在霍乱毒素B亚基(CTB)基因的下游，构建含有融合基因CFAdE的重组表达载体pCzn1-CFAdE及其重组基因工程菌，重组基因工程菌株发酵后，经Ni-IDA镍离子交换层析纯化获得该疫苗的融合蛋白CFAdE。