CN102178941A - 一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由幽门螺旋杆菌尿素酶A、B双亚基的Th和B细胞抗原表位的多拷贝体以及黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基构成。本发明主要通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含有尿素酶A、B双亚基的Th和B细胞抗原表位多拷贝体的基因序列，然后将该人工基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌原核表达系统表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得幽门螺旋杆菌多表位疫苗。该幽门螺旋杆菌多表位疫苗能够诱发机体产生针对尿素酶A、B双亚基的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

Description

一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌多表位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡的重要致病因子，与胃癌密切相关，世界卫生组织(WHO)已将Hp列为I类致癌因子。幽门螺旋杆菌的感染率很高，世界人群Hp感染率超过50％，我国人群Hp感染率为58.07％，呈现家庭聚集性，形势更加严峻。目前治疗Hp感染的方法，主要基于“三联”药物疗法，其主要成分为质子泵抑制剂、抗生素和铋剂。“三联”药物疗法存在诸多弊端：(1)抗生素广泛使用，导致Hp耐药菌株日益增多，药物疗效每况日下，临床上同时使用2种或3种抗生素仍难以将其彻底根治。(2)治疗药物存在毒副作用。(3)药物治疗难以避免“反复治疗，反复感染”的尴尬局面。(4)药物价格昂贵，治疗周期长，病人依从性较差。因此，“三联”药物疗法不宜在Hp感染人群中大规模推广使用。实验研究表明，免疫接种可预防甚至治疗Hp感染，使人群获得持久性的免疫力。研制有效的预防性和治疗性Hp疫苗是控制Hp感染性疾病的一种切实有效的方法，逐渐成为国内外学者竞相研究的一个热点。

抗原表位是刺激机体产生免疫应答的基本功能单位，包括B细胞抗原表位、Th细胞抗原表位、CTL细胞抗原表位和一些不利于免疫保护作用的抗原表位。表位疫苗基于抗原表位而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。表位疫苗与全菌疫苗、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗相比，具有以下优点：(1)表位疫苗一般稳定、无毒，具有更高的安全性。(2)抗原表位肽的分子结构小而简单，不会引起免疫抑制或者自身免疫性疾病。(3)表位疫苗可对抗原表位进行精确定位，具有更高的免疫针对性和特异性。(4)表位疫苗具有十分灵活的设计性，可组合不同Th、B细胞抗原表位，制成针对多种病原体的疫苗。(5)表位疫苗选用高保守性的抗原表位肽，可有效防止病原体快速基因突变所形成的免疫逃避机制。在Hp疫苗研究领域，表位疫苗与其他疫苗相比，同样具有很大优势，既可激发更高特异性的抗Hp抗体，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫针对性和安全性。

幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶(Urease)，约占全菌体蛋白的5％～10％，在Hp内部和表面广泛表达。一般细菌难以在胃部的高酸环境中存活，但尿素酶能水解尿素产生氨来中和 胃酸，并可对胃黏膜造成病理性损伤。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。尿素酶由A和B两个亚单位(UreA和UreB)组成，其中尿素酶B亚基是尿素酶活性亚单位，在各Hp菌株中具有很好的保守性，被公认为是Hp疫苗的理想候选抗原。最新实验研究表明，尿素酶A亚基同样具有较强的抗原性，针对尿素酶A亚基的Hp疫苗同样能够取得良好的保护作用。因此，尿素酶A、B双亚基都是Hp疫苗设计的理想抗原。从理论上讲，研制一种针对尿素酶A、B双亚基的Hp表位疫苗，比只针对尿素酶单亚基的Hp表位疫苗，具有更好免疫预防和治疗效果。另外，实验研究也证明天然Hp尿素酶激发的抗尿素酶抗体，不能有效抑制尿素酶活性。究其原因，Hp尿素酶抗原表位可分为两类，一类表位激发机体产生的抗尿素酶抗体，可明显抑制尿素酶活性，为中和抗体；而另一类表位激发机体产生的抗尿素酶抗体，却有助于Hp的胃部定植和病理性进程。因此，选择可激发中和抗体的尿素酶抗原表位来构建表位疫苗，可避免交叉反应产生的免疫病理性伤害，激发有效抑制尿素酶活性的抗体，有助于Hp感染性疾病的有效治疗。

本发明的思路如下：根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，合理选择尿素酶A、B双亚基的B、Th细胞优势抗原表位，通过生物信息学对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp多表位疫苗CTB-UE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp多表位疫苗CTB-UE能够激发BALB/c小鼠产生针对尿素酶A、B双亚基的T细胞免疫应答和有效抑制Hp尿素酶活性的高滴度表位特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种针对尿素酶A、B双亚基两者的Hp多表位疫苗。

本发明的第二个方面是提供了Hp多表位疫苗的制备方法。

本发明的第三个方面是公布了Hp多表位疫苗的用途。

本发明的第一个方面是提供了一种针对尿素酶A、B双亚基的Hp多表位疫苗CTB-UE。该Hp多表位疫苗主要由尿素酶多表位肽UE和霍乱毒素B亚基构成，尿素酶多表位肽UE的氨基酸序列如(序列1)所示，Hp多表位疫苗CTB-UE的整体氨基酸序列如(序列2)所示。本发明的新型Hp多表位疫苗CTB-UE具有以下优点：(1)尿素酶B亚基是尿素酶活性亚单位，被公认为是Hp疫苗的理想候选抗原；最新实验研究表明，尿素酶A亚基同样具有较强的抗原性，针对尿素酶A亚基的Hp疫苗同样能够取得良好的保护作用。Hp多表位疫苗CTB-UE将尿素酶A、B双亚基的抗原表位结合起来，可诱发针对尿素酶A、B双亚基两者的 T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答。(2)天然Hp尿素酶激发的抗尿素酶抗体，不能有效抑制尿素酶活性，本发明的Hp多表位疫苗CTB-UE由可激发中和抗体的尿素酶抗原表位构建而成，可避免交叉反应产生的免疫病理性伤害，激发有效抑制尿素酶活性的抗体。(3)尿素酶抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本发明的Hp多表位疫苗CTB-UE采取“偶联分子内免疫佐剂”和“抗原表位多重拷贝”两种设计思路来增强尿素酶抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的表位特异性抗体。

本发明的第二个方面是提供了Hp多表位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：

(1)新型Hp多表位疫苗抗原分子的结构设计

根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，合理选择尿素酶A、B双亚基的B、Th细胞优势抗原表位，通过生物信息学对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE。

(2)重组表达质粒pETCUE(含有融合基因CTB-UE)的构建

首先构建一个含有霍乱毒素B亚基(CTB)基因的重组表达载体pETC；然后通过基因合成技术合成一个尿素酶多表位肽UE(含有多个尿素酶细胞抗原表位)的核苷酸序列，并将其插入重组表达载体pETC中，构建重组表达载体pETCUE。

(3)融合蛋白CTB-UE的原核表达及纯化

将重组表达载体pETCUE转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株BL21(DE3)/pETCUE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和层析和DEAE SepharoseFF阴离子交换层析能够获得高纯度融合蛋白CTB-UE，即为Hp多表位疫苗。

本发明的第三个方面是提供了Hp多表位疫苗的用途。Hp多表位疫苗CTB-UE可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

附图说明

图1：新型Hp多表位疫苗的分子结构设计特点。

图2：重组表达载体pETCUE的双酶切鉴定。

泳道1：DNAMarker III；泳道2：pETCUE/Nco I+Xho I

图3：重组表达载体pETCUE质粒图谱。

Nco I和Xho I之间为插入的融合基因CTB-UE

图4：Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的原核表达。

泳道1：蛋白质Marker；泳道2、3：CTB-UE包涵体蛋白；泳道4-6：CTB-UE可溶蛋白；泳道7-9：CTB-UA包涵体蛋白(一个对照蛋白)；泳道10：BL21(DE3)/pET22b全菌蛋白。

图5：Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的Ni-NTA亲和层析纯化。

泳道1：蛋白质Marker；泳道2-4：杂蛋白；泳道5-8：纯化的CTB-UE蛋白样品；泳道9：杂蛋白；泳道10：纯化前的CTB-UE蛋白样品；

图6：Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的Sepharose FF阴离子交换层析纯化。

泳道1：蛋白质Marker；泳道2、3：纯化的CTB-UE蛋白样品；泳道4-6：杂蛋白和部分流失的目的蛋白；泳道7-8：杂蛋白；泳道9、10：纯化前的CTB-UE蛋白样品；

图7：Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗尿素酶抗体的检测。

Hp多表位疫苗CTB-UE和重组尿素酶B亚基(rUreB)都能诱发较高滴度抗尿素酶抗体。

图8：Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗UreA抗体的检测。

Hp多表位疫苗CTB-UE能诱发较高滴度的抗尿素酶A亚基抗体。

图9：Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗UreB抗体的检测。

Hp多表位疫苗CTB-UE和重组尿素酶B亚基(rUreB)都能诱发较高滴度的抗尿素酶B亚基抗体。

图10：Hp多表位疫苗CTB-UE诱发UreA_183-203表位特异性抗体的检测。

Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高滴度的UreA_183-203表位特异性抗体。

图11：Hp多表位疫苗CTB-UE诱发UreB_327-334表位特异性抗体的检测。

Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高滴度的UreB_327-334表位特异性抗体。

图12：Hp多表位疫苗CTB-UE致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。

图13：Hp多表位疫苗CTB-UE免疫特异性的免疫印迹(Western Blot)鉴定。

图14：Hp多表位疫苗CTB-UE与神经节苷脂GM1的结合活性检测。

图15：Hp多表位疫苗CTB-UE多克隆抗体抑制尿素酶活性的检测。

鼠抗CTB-UE多克隆抗体可显著抑制Hp尿素酶活性。

具体实施方式

材料

1.IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2.氨苄青霉素(Amp)贮液(100mg/mL)：称取100mg氨苄青霉素(Amp)溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3.培养基：(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。(2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4.DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5.SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS 5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮蓝G-250100mg溶解在50ml 95％乙醇中，然后加入86％磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。(2)考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。(3)固定液：500ml乙醇、100ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(4)脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(5)保存液：25ml 87％甘油溶于225ml脱色液中。

7.RNase A溶液(10mg/ml)：10mg RNase A溶解于987μl水中，加入10μl 1M Tris-HCl(pH7.5)和3μl 5M NaCl，沸水浴15min后，缓慢冷却至室温，分成小份存于-20℃备用。

8.Lysozyme溶液(10mg/ml)：10mg Lysozyme溶于1ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)。

9.实验动物：(1)SD大鼠：清洁级，雄性，体重100～200g左右，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2007-0001。(2)BALB/c小鼠：为SPF级，雄性，8～10周龄，购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2007-0001。

10.Western blot试剂：(1)电转缓冲液：2.9g甘氨酸，5.8g Tirs，0.37g SDS，200ml甲醇，加双蒸水稀释至1L。(2)10×丽春红贮液：2g丽春红，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加水至1L；(3)5x PBS缓冲液：2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24g KH₂PO₄，8g NaCl，0.2g KCl溶于200ml ddH₂O中，用NaOH调PH值到7.4。(4)PBST缓冲液：PBS缓冲液中加入0.05％Tween-20。(5)封闭液：10％脱脂奶粉溶于PBST缓冲液，用前现配。(6)底物液反应液：增强型DAB显色试剂盒(天根)。

11.ELISA试剂：(1)包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。(2)洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH2O定容至1000ml(PBST)。(3)封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。(4)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml(1MH₂SO₄)。

12.淋巴细胞增殖实验主要试剂(1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公 司)(2)RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。(3)RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO₃，加去离子水至1000ml，pH 7.4，超滤除菌，分装。

13.快速尿素酶检测试剂：2％尿素，0.04％酚红，0.04％NaH₂PO₄.H₂O，0.1％Na₂HPO₄，pH为6.0，临用前配制。

14.BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93ml，1.5g琼脂粉，121℃灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7ml脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/ml)，万古霉素(终浓度10μg/ml)和甲氧苄氨嘧啶(终浓度5μg/ml)，分装至培养皿，冷却后备用。

15.尿素肉汤：称取葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾2g、氯化钠5g，加蒸馏水1000ml，矫正PH至7.2，再加入2ml 0.4％酚红溶液，高压灭菌(68.95kPa)20分钟，冷至60℃左右时加入已用滤菌器过滤的1ml 50％尿素溶液，混匀后备用。

实例1：幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE的分子结构设计

根据“机体对Hp的免疫保护性机制”和“尿素酶抗原表位的免疫学性质”，选择尿素酶Th和B细胞表位UreA_74-90、UreB_229--251、UreA_183-203和UreB_327-334用于新型Hp多表位疫苗的构建。在新型Hp多表位肽疫苗的设计中，本课题组将Th细胞表位放在B细胞表位的前端，有助于B细胞表位的有效递呈，再经过生物信息学DNAstar和RANKPEP软件的分析和评价，抗原表位顺序确定为UreAB_74-90-UreBB_229-251B-UreAB_183-203B-UreBB_327-334B；选择KK作为相邻尿素酶Th抗原表位的间隔序列，选择GS作为相邻尿素酶B抗原表位的间隔序列；将尿素酶抗原表位UreA_74-79、UreB_229-244、UreB_237-251和UreA_183-203分别拷贝两次，尿素酶抗原表位UreB_327-334拷贝三次；选择霍乱毒素B亚基(CTB)作为分子内免疫佐剂，融合在尿素酶多表位肽(UE)的N端，增强尿素酶多表位肽(UE)的免疫原性。

结果：幽门螺旋杆菌多表位疫苗CTB-UE的分子结构设计特点和思路如(图1)所示。

实例2：重组表达载体pETCUE(含有融合基因CTB-UE)的构建

(1)重组表达载体pETC(含有霍乱素素B亚基基因)的构建

以重组载体pETCtUBE(由吴梧桐教授惠赠)为模板，利用Primer Premier V5.0设计引物P1-CTB和P2-CTB。引物P1-CTB和P2-CTB的序列及特点如下：

引物P1-CTB：CATGUCCATGGUGCACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGC；

引物P2-CTB：

CCCUAAGCTT U CU GGTACC CGCGGATCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATC；

引物P1-CTB前端带有Nco I酶切位点(CCATGG)，用下划线标示；引物P2前端带有Hind III(AAGCTT)和KpnI(GGTACC)酶切位点和部分Linker，酶切位点用下划线标示， Linker用阴影标示。引物均由南京金思瑞生物科技公司合成。利用引物P1-CTB和P2-CTB从pETCtUBE扩增CTB基因的反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性45sec，54℃退火60sec，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸6min。

利用DNA片段凝胶回收纯化试剂盒(北京天根生物技术有限公司)回收纯化PCR扩增的CTB基因；将纯化后的CTB基因片段和pET22b表达质粒用Nco I/Hind III分别进行双酶切，双酶切反应体系如下：

37℃酶切反应2h，然后用1％琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒回收CTB基因和pET22b载体双酶切产物。将回收的pET22b空载体和CTB基因通过互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下(4℃过夜)连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒pETC。T4DNA连接酶连接体系如下：

(2)尿素酶多表位肽UE核苷酸序列的基因合成

将前期设计的多表位肽UE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托南京金丝瑞生物科技公司进行基因合成。

(3)尿素酶多表位肽UE基因与pETC表达载体的连接

通过质粒小量提取试剂盒(天根)提取重组质粒pUCUE和pETC(实验室前期构建)，用Kpn I/Xho I分别进行双酶切，双酶切反应体系如下：

37℃酶切反应2h，然后用1％琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒回收多表位肽UE基因和pETC表达载体双酶切产物。将回收的pETC线性化载体和UE基因通过互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下(4℃过夜)连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组表达质粒pETCUE。T4DNA连接酶连接体系如下：

结果：利用Nco I/Xho I双酶切待检重组质粒pETCUE，37℃反应2h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段为837bp，与融合基因CTB-UE的理论大小一致。再将pETCUE送交南京金思瑞生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pETCUE中融合基因CTB-UE的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体pETCUE的质粒图谱如(图3)所示。

实例3：尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE的原核表达

将验证正确的重组表达质粒pETCUE转化进E.coli BL21(DE3)菌株中。在预先制备好的含50μg/mL Amp的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pETCUE/BL21(DE3)，倒置于37℃培养箱，过夜培养12～16h后，挑取单个菌落，接种于含50μg/mL Amp的LB培养基中，37℃，180rpm，培养12～16h。以2％接种量分别接种重组菌于含50μg/mL Amp LB培养基中， 37℃，180rpm振荡过夜，次日晨再将该菌液以1％接种量接种于含50μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇瓶3h后，加入IPTG使终浓度达到1mmol/L，37℃，180rpm诱导表达，以空载体菌pET22b/BL21(DE3)作为阴性对照。

结果：将基因工程重组菌株pETCUE/BL21(DE3)在PH值为7、IPTG浓度为1mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为6h的情况下进行诱导表达。与对照菌株对比，基因工程重组菌株pETCUE/BL21(DE3)在约32KD处出现目的蛋白条带，与尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE的理论大小相符合(图4)。尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE在可溶性蛋白和包涵体蛋白中都有存在。

实例4：Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE的纯化

(1)Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化

将Ni-NTA填料充分混匀后加入层析柱中，溶液可通过重力作用缓慢流出，待完全加入后，将上层筛板平放入柱中；向装填好的柱中加入适量的去离子水将乙醇冲洗干净后，加入8倍柱体积的Binding buffer平衡，平衡结束后即可上样；收集菌体后，每100mg菌体加入1-5ml Binding Buffer，超声裂解菌体；12000rpm离心，弃上清，将沉淀重悬于提前加入1-5mMPMSF的Binding Buffer中，进行超声波处理，直至包涵体清洗干净(呈较洁净的乳白色状)；将沉淀重悬于含8M尿素的Binding Buffer中，冰浴1h，使包涵体溶解；将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；使用15倍柱体积的Wash buffer冲洗柱子，收集流穿峰；使用5倍柱体积的Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰；依次使用3倍柱体积的Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤后，用3倍柱体积的20％乙醇平衡，4℃保存。

结果：经Ni-NTA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在50mM咪唑和250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在50mM咪唑和250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度均在85％以上(图5)。

(2)阴离子交换层析(Sepharose FF)的纯化

Sepharose FF阴离子交换层析方法：用离子交换层析缓冲液A平衡DEAE Sepharose FF离子交换层析柱。将经过Ni-NTA亲和层析一级纯化后的蛋白样品以10ml/min流速上样DEAESepharose FF阴离子交换层析柱；用离子交换层析缓冲液B洗脱蛋白；洗脱方式：连续梯度洗脱40min，收集目的蛋白峰。

结果：经Sepharose FF阴离子交换层析纯化，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE主要集中在用0.5M NaCl的磷酸盐缓冲溶液洗脱下的蛋白峰中。经凝胶成像检测仪软件，尿素酶多表位肽融合蛋白CTB-UE的纯度在90％以上(图6)。

实施例5：Hp多表位疫苗CTB-UE的免疫原性和免疫特异性研究

(1)BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为4组，分别为新型Hp多表位融合蛋白CTB-UE免疫组、重组尿素酶B亚基(rUreB)免疫组、重组霍乱毒素B亚基(rCTB)免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共24只，详细分组如下图所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

免疫方式：用75％酒精对小鼠腹部消毒，然后腹部多点皮下注射幽门螺旋表位融合蛋白和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2周加弗氏不完全佐剂，第3周直接注射幽门螺旋杆菌表位融合蛋白溶液加强免疫。

抗血清的采集：在每次免疫前采取尾部静脉采血，检测血清特异性抗体水平的变化；在末次免疫后第三天，用玻璃采血管在眼眶后静脉丛采血，用琼脂糖免疫双扩散法检测特异性抗体的效价；如果特异性抗体效价较高，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，-70℃冻存备用。

(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原(天然Hp尿素酶、rUreA、rUreB、尿素酶抗原表位肽UreA_183-203和UreB_327-334)用包被液稀释成5μg/ml或者10μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清(鼠抗CTB-UE抗血清、鼠抗rCTB抗血清和鼠抗rUreB抗血清)和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10000)，100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。

结果：天然Hp尿素酶的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生与rUreB相近水平的抗尿素酶抗体，而PBS免疫组不能产生抗天然尿素酶抗体(图7)；重组尿素酶A亚基(rUreA)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高水平的抗rUreA抗体，而rCTB免疫组、rUreB免疫组和PBS免疫组不能产生抗rUreA特异性抗体(图8)；重组尿素酶B亚基(rUreB)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp多表位疫苗CTB-UE和rUreB免疫组能够产生较高水平的抗rUreB抗体，而rCTB免疫组 和PBS免疫组不能产生抗rUreB抗体(图9)；尿素酶抗原表位UreA_183-203和UreB_327-334的包被浓度为10μg/ml，通过ELISA检测，Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高水平的尿素酶表位(UreA_183-203和UreB_327-334)特异性抗体，而rUreB免疫组、rCTB免疫组和PBS免疫组不能产生尿素酶表位特异性抗体(图10和图11)。上述结果说明新型Hp多表位疫苗CTB-UE能够刺激机体产生针对尿素酶A、B双亚基的高滴度表位特异性抗尿素酶抗体，具有很好的免疫原性。

(3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75％酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏(暗红色)。在20ml的无菌小烧杯中放入4-5ml EZ-Sep^TM Mouse 1X淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200ul的1640培养基；800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液(5×10⁶/ml)。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入CTB-UE、Urease、rUreA、rUreB(20μg/ml)、尿素酶Th细胞抗原表位肽(UreA_74-90、UreB_229-251)和生理盐水各100μl，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃5％CO₂培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTT溶液(5mg/ml)30μl，继续培养4h后，轻轻吸出上清，每孔加入DMSO 100μl振荡混匀后用酶标仪读取OD₅₇₀值。刺激指数(SI)≥2时，判断为阳性；刺激指数计算公式如下：

结果：Hp多表位疫苗CTB-UE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经尿素酶Th表位肽UreA_74-90、UreB_229-251、重组尿素酶A亚基(rUreA)、重组尿素酶B亚基(rUreB)、天然尿素酶(Urease)和CTB-UE刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明Hp多表位疫苗CTB-UE中的尿素酶A、B双亚基的Th抗原表位(UreA_74-90、UreB_229-251)均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生针对各自Th抗原表位的细胞免疫应答(图12)。

(4)蛋白免疫印迹(Western blot)

取蛋白样品(CTB-UE、rCTB、rUreA和rUreB)进行15％SDS-PAGE电泳。用半干式电转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，恒流1mA/cm²，2h；将PVDF膜在丽春红中染色30s，用蒸馏水脱色至有清晰条带出现，将右上角剪去以区分蛋白面；将PVDF膜洗净后用10％脱脂牛奶封闭液28℃摇床封闭2h；PBST洗膜3次，每次10min。分别加入按1∶1000 倍数稀释好的抗血清(鼠抗CTB-UE血清、鼠抗rCTB血清、健康鼠血清)，28℃摇床震荡1小时后于4℃过夜；PBST洗膜3次，每次10min。加入按1∶10000倍数稀释好的二抗(HRP酶标羊抗鼠IgG)，28℃摇床孵育1h；用PBST洗膜3次，每次10min。在暗室(允许红色光源)中，将PVDF膜蛋白面朝上，放在保鲜膜上，吸水纸吸掉多余的PBST溶液，向膜上均匀滴加事先混合好的ECL发光液，反应1min；将PDVF膜包裹在保鲜膜中，剪下一块等大的X光胶片(胶片也作剪角处理以区分条带顺序)，放置夹片盒曝光0.5～30min；取出X光胶片，在显影剂中漂至条带出现，放到停影液(1.5％冰醋酸)中停影1min，用流水冲洗1min后在定影剂中漂至背景部分透明，最后流水冲洗20min固定影像。

结果：鼠抗CTB-UE血清能够与尿素酶A亚基(rUreA)和尿素酶B亚基(rUreB)发生结合反应，而健康鼠血清不能与CTB-UE、CTB-UA、CTB-UB、rUreA、rUreB发生任何结合反应，说明新型Hp多表位疫苗CTB-UE，能够激发机体产生针对尿素酶A、B双亚基的高特异性抗体，具有很好的免疫特异性和免疫反应性(图13)。

实施例6：GM1-ELISA检测Hp多表位疫苗中CTB组分的分子免疫佐剂活性

将神经节苷脂GM1或者牛血清白蛋白(BSA)用包被液稀释至10μg/ml，100μl/孔，包被ELISA板，4℃过夜。用PBST洗涤4次；每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h；用洗涤液PBST洗4次后，4℃保存。将Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE和重组霍乱毒素B亚基(rCTB)按照一定比例稀释(100μg/ml到0.78μg/ml)，加入100μl/孔，37℃放置60min。用洗涤液PBST洗4次，加入鼠抗CTB多克隆抗体(1∶1000)，100μl/孔，37℃温育60min。洗涤4次；加入HRP标记羊抗鼠IgG(1∶10000)，100μl/孔，37℃放置30min。洗涤4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应5min，100μl终止液终止反应。用酶标仪检测各孔OD₄₅₀值。

结果：通过GM1-ELISA检测Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE和rCTB是否具有形成五聚体和神经节苷脂GM1结合的活性。Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE和rCTB的OD₄₅₀都显著高于阴性对照组(包被BSA)，证明Hp多表位肽融合蛋白CTB-UE和rCTB均具有形成五聚体和神经节苷脂GM1结合的活性，也说明新型Hp多表位疫苗CTB-UE中CTB组分具有较好的分子免疫佐剂活性(图14)。

实施例7：幽门螺旋杆菌尿素酶活性抑制实验

将50μl纯化的Hp天然尿素酶(20μg/ml)(纯度＞95％；上海领潮生物科技有限公司)分别与50μl不同浓度的鼠抗CTB-UE多克隆抗体、鼠抗rUreB多克隆抗体、鼠抗rCTB多克隆抗体和阴性鼠血清混均，在96孔板4℃反应过夜。次日加入含有100mM尿素和0.005％酚红的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)100μl/孔，23℃共孵育4h后，以分光光度计550nm比色，颜色变化率以曲线的线性分布来表示。抑制百分比以如下公式计算：

结果：通过尿素酶活性抑制实验，检测鼠抗CTB-UE多克隆抗体、鼠抗rUreB多克隆抗体和鼠抗rCTB多克隆抗体，能否抑制天然Hp尿素酶的活性。实验结果表明：鼠抗CTB-UE多克隆抗体和重组尿素酶B亚基(rUreB)多克隆抗体均能有效抑制Hp尿素酶活性，而鼠抗CTB-UE多克隆抗体对Hp尿素酶活性的抑制效果更加显著，说明新型Hp多表位疫苗CTB-UE能够激发机体产生有效抑制尿素酶活性的中和抗体(图15)。

Claims (8)

1.一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基(CTB)和尿素酶多表位肽UE构成，其氨基酸序列如序列1所示。

2.如权利要求1所述，一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其核苷酸序列如序列2所示。

3.如权利要求1所述，尿素酶多表位肽UE主要由尿素酶A、B双亚基的Th和B细胞抗原表位的多拷贝体构成，其氨基酸序列如序列3所示。

4.如权利要求3所述，尿素酶多表位肽UE的核苷酸序列如序列4所示。

5.如权利要求1所述，霍乱毒素B亚基(CTB)和尿素酶多表位肽UE之间的间隔序列为DPRVPSS。

6.一种幽门螺旋杆菌多表位疫苗的制备方法，通过基因合成技术合成尿素酶多表位肽UE的核苷酸序列，将其融合在霍乱毒素B亚基(CTB)基因的下游，构建含有融合基因CTB-UE的重组表达载体pETCUE及其重组基因工程菌。重组基因工程菌株发酵后，经Ni-NTA镍离子交换层析和Sepharose FF阴离子交换层析，获得该疫苗的融合蛋白CTB-UE。

7.按照权利要求1和6所述的幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其特征在于能够激发机体产生针对Hp尿素酶A、B双亚基的T细胞免疫应答和有效抑制Hp尿素酶活性的高滴度表位特异性抗体。

8.按照权利要求1和7所述的幽门螺旋杆菌多表位疫苗，其特征是可以用作预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的药物组合。

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