CN104151435A

CN104151435A - 一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品

Info

Publication number: CN104151435A
Application number: CN201410411940.XA
Authority: CN
Inventors: 潘兴; 祝洁; 周永君; 高礼珍
Original assignee: SICHUAN VACCINE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SICHUAN VACCINE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明公开了一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品。所述多靶点重组基因包括具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽、具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的编码多靶点融合多肽的多靶点重组基因、以及上述多靶点重组基因或上述多靶点融合多肽或上述多靶点融合多肽的特异性抗体作为生物制品在预防和治疗幽门螺杆菌感染中的应用。本发明通过在重组幽门螺杆菌多靶点融合多肽（rIB）的N段添加了一段去除信号肽的分子内佐剂CTB，进一步提高了对幽门螺杆菌感染的防治效果。

Description

一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品

技术领域

本发明涉及疫苗和抗体制药方面的生物技术领域，具体地说，涉及一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是1982年发现的一种重要的致病菌，目前研究表明该细菌除引起胃炎、胃溃疡外，其与MALT淋巴瘤和胃癌的关系非常密切，是目前唯一被WHO公布的与人肿瘤发生相关的细菌性病原。最近研究还发现Hp与人冠心病等心血管疾病也有高度的相关性。Hp可感染老人、小孩和青壮年，但不同国家和地区，因经济水平和生活习惯不同感染率差异很大。我国的普通人群的感染率约50-80%，且每年以1-2%的速度增加。

1989年Hp的尿素酶基因被克隆出，1997年Hp的全基因序列测定完成。Agnes等利用shutte克隆技术对尿素酶进行分析，证实编码尿素酶一组基因位于4.2 kb DNA片段中，并确定这组基因中有4个开放性阅读框架(ORF)，分别称为ureA、ureB、ureC、ureD。进一步研究发现在ureA、ureB下段的ureC、ureD阅读框架分别是ureI、ureE、ureF、ureG、ureH，整个尿素酶基因长度约为8 kb。1998法国巴士德研究所Stéphane研究认为ureI基因对Hp的尿素酶的合成无关系，但与Hp的胃内定植非常密切，是Hp在胃定植所必需的基因。2000年Rektorschek用基因突变技术比较研究指出，ure I 编码 Hp的尿素膜通道蛋白。ureI基因体外转录翻译成6个片段的跨膜蛋白UreI，该蛋白独立于Hp的细胞膜上，保护尿素酶在pH低于4时的胃酸性环境的酶活性，实验发现在pH值大于4时,胞内尿素酶可以不依赖UreI蛋白而维持尿素酶活性,但在pH低于4时ureI是维护尿素酶活性必需基因。2001年David L. Weeks研究认为UreI是Hp联系尿素酶和在胃内定植的重要通道蛋白，UreI对Hp在胃定植起关键作用。有研究用非洲爪蛙卵细胞（Xenopus oocytes）作为转基因细胞模型，观察表达的UreI能在酸性条件下促进尿素吸收，而细胞周质第123位组氨酸（histidine123）缺失的ureI突变体无促进尿素吸收作用，同时UreI介导的尿素转运是尿素特异的、被动的、非饱和的、非极性的和非温度依赖性的。Weeks指出UreI是Hp的H+控尿素通道，调控细胞内尿素酶代谢，对Hp在胃的定植和生存非常必要。David R.Scott研究认为在有尿素的情况下，UreI在pH ≤5时刺激胞内氨产生，但用乙酰胺代替尿素却无此现象。

尿素酶是螺杆菌属富含的一种金属酶，能够水解代谢尿素，释放氨中和胃酸，使细菌增强抵抗胃部强酸，穿过胃黏液层到达黏膜表面；能够激活单核吞噬细胞和刺激炎性细胞因子的产生，在体外实验中对人胃上皮细胞仍具有毒性作用。Hp尿素酶既是定植因子又是毒力因子，分布在Hp的表面，占全菌蛋白的5％-10％，它由A、B两个亚单位组成，呈六聚体，由尿素酶A(UreA)、尿素酶B(UreB)两亚单位组成，几乎所有Hp菌株均能产生。通过不同菌株的比较，其Ure B氨基酸同源性达到97.9％以上，表明Hp菌株间Ure B的抗原变异性极小，保守性好，实验证实，通过黏膜免疫途径给予UreB蛋白疫苗，能够诱导并激发机体的保护性免疫应答，因此是Hp重要的保护性候选抗原。

UreI蛋白是一种pH 依赖的尿素通道，是Hp定植于胃粘膜所必须。胃液中的尿素通过该通道进入Hp胞内，再通过Hp细胞质中的尿素酶使其分解成NH₃和CO₂，NH₃和CO₂扩散至细胞外，NH₃中和胃酸，CO₂和HCO3^-缓冲液维持Hp细胞外周质的pH至6.1。Mollenhauer等研究结果显示, 如能采取有效的手段抑制ureI的活性, 则能清除胃内的Hp的定植。Scott等通过基因表达微点阵分析证实, 在沙鼠感染Hp后, ureI的表达出现了上调（>2倍）。

霍乱弧菌肠毒素（cholerae enterotoxin，CT）已被证实是强有力的粘膜免疫佐剂，但因其毒性而在应用上受到限制。CT的结构为一个A亚单位、五个B亚单位。CTB分子量大小为11.6 kD，五分子的CTB通过盐键和氢建聚集成56 kD的大亚基，呈圆筒状，与真核细胞表面的神经节苷脂G_M1结合，可使连接的抗原与粘膜作用，进而引起一系列的生化反应，产生更强的免疫效果。CTB可促进抗原通过粘膜屏障，加强抗原被树突状细胞和其他抗原提呈细胞的提呈作用，增强抑制性T细胞分泌TGF-β。重组CTB去除了CTA的毒性，保留了霍乱毒素的免疫佐剂性，将所述去除信号肽的霍乱毒素B亚单位的基因命名为CTB。

本申请的申请人在公告号为CN101955545 A的发明专利中公开了一种以幽门螺杆菌I亚单位表位和B亚单位表位串联融合的一种用于预防人幽门螺杆菌感染的重组幽门螺杆菌多靶点融合多肽（rIB），所述融合多肽具有较好的免疫原型和免疫反应性，在对幽门螺杆菌感染防治过程中具有较好的效果。

为了进一步提高重组幽门螺杆菌多靶点融合多肽（rIB）的免疫效果，在rIB的 N段添加了一段去除信号肽的分子内佐剂CTB，即构建了一个全新的幽门螺杆菌多靶点疫苗CTB-UreI-UreB（BIB），通过BABL/c小鼠动物实验证实，重组幽门螺杆菌多靶点疫苗BIB以及该多靶点抗原制备的特异抗体对幽门螺杆菌感染具有更好的防治效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽、具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的编码多靶点融合多肽的多靶点重组基因、包括上述重组基因或融合多肽的口服疫苗、以及上述多靶点重组基因或上述多靶点融合多肽或上述多靶点融合多肽的特异性抗体作为生物制品在预防和治疗幽门螺杆菌感染中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽或其衍生物。

上述多靶点融合多肽由幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及霍乱毒素B亚单位的B细胞及T细胞表位肽融合而成，该多靶点融合多肽可采用原核或真核表达或化学合成方法制备。该多靶点融合多肽是参考幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（UreI）、尿素酶B亚单位（UreB）和霍乱毒素B亚单位（CTB）氨基酸序列，生物信息学预测其B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，筛选优化拼接而成。所述SEQ ID NO :2所示氨基酸序列是在本申请人的另一篇中国专利申请号为CN201010274782.X的专利文献公开的UreI-B的基础上，添加一段霍乱毒素B亚单位（CTB）氨基酸序列，重组形成能够显著提高预防或治疗幽门螺杆菌感染的免疫应答的多靶点融合多肽。

人工合成基于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列或用PCR方法获得含有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或其衍生物，酶切连接该基因入原核表达载体或真核表达载体，如PET22b(+)或pIRES2-DsRed2或其他类型的表达载体中。转化重组表达载体进入宿主菌，如：Rosseta gami II 、BL21 、酵母等，构建基因表达工程菌。也可将含有SEQ ID NO :1所示的核酸序列克隆至植物表达载体，在植物中表达该含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽等。

编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列，为SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的多靶点重组基因。或者在SEQ ID NO :1所示序列的基础上有一个或多个碱基的缺失、替换和/或添加等变异且与SEQ ID NO :1具有相同编码产物的核苷酸序列。

上述SEQ ID NO :1所示核苷酸序列由幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及霍乱毒素B亚单位的B细胞及T细胞优势表位肽所对应的核苷酸序列重组而成，该重组序列采用PCR或人工合成的方法制备。所述SEQ ID NO :1所示核苷酸序列是在本申请人的另一篇中国专利申请号为CN201010274782.X的专利文献公开的ureI-B的基础上，添加一段霍乱毒素B亚单位（CTB）的核苷酸序列，重组形成能够显著提高预防或治疗幽门螺杆菌感染的免疫应答的多靶点重组基因。

本发明提供了一种用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的多靶点核酸疫苗，该多靶点核酸疫苗含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或该序列衍生的各种核酸制剂。该核酸疫苗的制备方法：人工合成或用PCR方法获得含有SEQ ID NO :1所示的核酸序列或其衍生物，酶切连接入真核表达载体，如pCDNA或各种病毒载体上，配制成各种核酸制剂。

包含上述核苷酸序列（即SEQ ID NO :1所示序列）的原核表达载体或真核表达载体。

一种多靶点核酸疫苗，为包含上述核苷酸序列（即SEQ ID NO :1所示序列）的真核表达载体，该真核表达载体在预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。

一种多靶点融合多肽疫苗，为包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽在预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。该多靶点融合多肽除了可以制备成疫苗之外，还可以制备成各种其他的生物制品，如诊断试剂或保健品等。

上述多靶点核酸疫苗或多靶点融合多肽疫苗能够制成以下剂型：如注射制剂、口服液、喷雾剂、片剂、胶囊剂等，更具体地可以优选微球口服制剂、肠溶胶囊口服制剂、肠溶片口服制剂或注射制剂。具体地，所述多靶点核酸疫苗或多靶点融合多肽疫苗各自独立地或与药学上可接受的辅料或载体制备成口服制剂或者是注射制剂。所述疫苗包含由可降解的缓释材料包裹重组融合蛋白rBIB制成的纳米微球。优选的疫苗是由纳米微球冻干制成的口服制剂。

具体地，制备微球口服制剂时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：海藻酸钠、壳聚糖等。

具体地，制备肠溶胶囊口服制剂时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：邻苯二甲酸醋酸纤维素、羟甲基淀粉钠、乳糖、微晶纤维素等。

具体地，制备肠溶片口服制剂时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：微晶纤维素、可压性淀粉、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、聚丙烯酸树脂II、柠檬酸三乙酯等。

具体地，制备注射制剂时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：L-精氨酸等。

更优选将本发明所述的多靶点疫苗制成口服制剂型，本发明人通过多次试验发现，相对于注射疫苗来说，采用口服疫苗对幽门螺杆菌的免疫效果提高更明显。

本发明的重组幽门螺杆菌多靶点疫苗使用的可降解的缓释材料包括壳聚糖和海藻糖。优选的可降解的缓释材料由海藻酸钠、植物油、CaCl₂和壳聚糖组成。

本发明的重组幽门螺杆菌多靶点疫苗作为一种口服制剂，其赋形剂可以为甘露醇或者蔗糖，其加入量为总的口服制剂重量的2%-8%，稳定剂可以为0.05wt% 的EDTA-Na₂，最适pH为10。

本发明的另一方面提供了一种重组幽门螺杆菌多靶点疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）分别筛选和克隆去除信号肽的霍乱毒素B亚单位的基因CTB和幽门螺杆菌尿素酶I亚单位的表位基因ureI、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的表位基因ureB，将CTB、ureI、ureB连接成融合基因CTB-ureI-ureB；接着将融合基因构建到载体上，转化宿主，构建了疫苗工程菌；

（2）将疫苗工程菌进行高密度发酵；

（3）将步骤（2）中的菌体进行超声裂解；

（4）将步骤（3）中制得的菌体裂解液进行离心，取沉淀进行洗涤，得融合蛋白rBIB包涵体粗品；

（5）将步骤（4）中制得的rBIB蛋白包涵体粗品经阳离子交换层析进行纯化，稀释复性并脱盐，制得rBIB蛋白精品；

（6）将步骤（5）中的rBIB蛋白精品制成缓释微球冻干制剂。

其中步骤（6）的操作方法优选为取步骤（5）所得的rBIB蛋白与海藻酸钠溶液混匀，加入植物油，乳化后，反向滴入到CaCl₂溶液中，制成海藻酸钠包裹的rBIB蛋白微球剂，所得的微球固化后洗涤，离心，取沉淀物再重悬，将其加入到壳聚糖溶液中，再包裹，进而得到壳聚糖和海藻酸钠双包裹的蛋白微球，将所述双包裹的蛋白微球的混悬液倒入已灭菌的西林瓶中，液面高度为0.7 cm，放入-70℃冰箱预冻12 h，再将其放入已预冷至-70℃的真空干燥剂中进行干燥，待无气体生成时取出冻干品。

步骤（2）的发酵条件优选为：使用改良TB培养基，以5 mM的乳糖诱导表达，控制pH在 7.0，溶氧在30%以上进行发酵。

所述改良TB培养基是在TB培养基的基础上添加2 mg/L MgCl₂、2 mg/L ZnCl₂·4H₂O、2 mg/L CoCl₂·4H₂O、4 mg/L FeSO₄·16H₂O、2 mg/L MnCl₂·4H₂O、4 mg/L H₃BO₃、4 mg/L CuSO₄得到的。

步骤（3）的裂解条件优选为：采用超声破碎仪250 W，开2 s、关2 s，裂解40 min。

步骤（5）的阳离子交换层析条件优选为：使用SP Sephrose XL阳离子交换层析柱进行阳离子交换层析，结合缓冲液组成为20 mM磷酸缓冲液、8 M尿素，pH 7.0，洗脱缓冲液组成为20 mM磷酸缓冲液、0.5 M NaCl、8 M尿素，pH 7.0。

本发明所提供的重组幽门螺杆菌多靶点疫苗由于在制备过程中选用可被生物降解的缓释微球包裹重组蛋白rBIB，因此可以防止胃酸及胃部酶类对抗原产生的破坏作用，有利于保护抗原的生物活性。同时控制微球粒径大小及包被材料的应用可以定向的使其富集于靶器官，从而最大限度的发挥药效。

一种抗体制品，为包含抗SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽表位的特异性抗体，该特异性抗体在预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。该抗体含有抗基于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列多靶点融合多肽表位的单克隆或多克隆抗体。

该抗体制备方法可以用含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽免疫各种实验动物，如鸡、牛、小白鼠等制备单克隆或多克隆抗体。

该抗体可以用盐析或亲和层析等方法进行纯化，也可以不纯化直接制备成各种生物制品，如治疗性抗体、诊断试剂或保健品。

一种抗体制剂，是由上述的抗体制品单独地或与药学上可接受的辅料或载体制备成以下剂型：口服液、喷雾剂、片剂、胶囊、注射剂；更具体地可以为肠溶片、肠溶胶囊。

在一个优选的实施例中，制得一种抗体IgY，为使用含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽作为抗原免疫产蛋禽类，并从其卵的卵黄中提取的，能够与多靶点融合多肽特异性结合。

一种上述抗体IgY的口服制剂，是由上述抗体IgY与药学上可接受的辅料或载体制备而成。所述抗体IgY的口服制剂，包括：抗体IgY口服液、抗体IgY肠溶片、抗体IgY肠溶胶囊。

具体地，制备抗体IgY口服液时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：异麦芽低聚糖、果葡糖浆、葡萄糖酸锌、焦糖色素、苹果酸等。

具体地，制备抗体IgY肠溶片时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：微晶纤维素、聚维酮、乳糖、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁等。

具体地，制备抗体IgY肠溶胶囊时，可加入的药学上可接受的辅料或载体可以为：微晶纤维素、磷酸氢钙、羟丙甲纤维素等。

本发明人经过深入研究，在UreI-UreB的 N段添加了一段霍乱毒素B亚单位（CTB）的核苷酸序列，重组成一条具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的幽门螺杆菌多靶点疫苗CTB-UreI-UreB，该疫苗CTB-UreI-UreB相对于多靶点疫苗UreI-B能够显著地改善动物对幽门螺杆菌感染的免疫性能、提高保护率、降低感染率。

本发明的有益效果是：重组CTB去除CTA的毒性，保留霍乱毒素的免疫佐剂性，在多靶点融合多肽UreI-B的N段添加该重组CTB，重组成能显著提高幽门螺杆菌感染的预防/或治疗效果的幽门螺杆菌多靶点融合多肽CTB-UreI-UreB（以下称BIB）。获得的多靶点融合多肽疫苗、核酸疫苗、抗体制品在BABL/c小鼠动物实验的免疫保护性实验中均显示了更好的防治幽门螺杆菌感染的特性。

附图说明

图1是多靶点融合多肽BIB疫苗构建示意图；

图2 是BL21(DE3)/BIB工程菌诱导表达、表达产物分布及纯化分析；

图3是BIB蛋白Western Blot鉴定；

图4是BIB抗原检测血清中抗体IgG的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图5是BIB抗原检测胃洗液中抗体IgG的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图6是BIB抗原检测肠洗液中抗体IgG的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图7是BIB 抗原检测血清中抗体IgA的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图8是BIB 抗原检测胃洗液中抗体IgA的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图9是BIB 抗原检测肠洗液中抗体IgA的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图10是血清中细胞因子IFN-γ的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB 3次、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图11是血清中细胞因子IL-4的吸光度值-免疫次数柱状图，口服给药BIB 3次、200 μg/次、每隔14天给药1次。免疫0次为阴性对照组，即正常小鼠；

图12是BALB/c小鼠胃组织病理变化图,图中，箭头A处表现为淋巴细胞浸润；箭头B处表现为胃组织坏死、脱落；箭头C处表现为腺体减少。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：多靶点融合多肽设计、构建

如图1所示为多靶点融合多肽BIB疫苗构建示意图：本发明中所述的BIB是在多靶点融合多肽IB的N段添加了一段去除信号肽的分子内佐剂CTB，形成如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。上述氨基酸序列对应的DNA序列，即SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。该BIB的蛋白序列长度为289aa，蛋白分子量为32.82 kDa，蛋白等电点为9.05 pI，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，CTB的蛋白序列长度为100aa，蛋白分子量为11.32 kDa，蛋白等电点为7.97 pI。

实施例2：rBIB工程菌的制备

BIB基因序列长度为876bp,由北京金威志合成；再将融合基因BIB构建到pET28a（+）载体上，限制性内切酶酶切位点为BamH I 和Hind III；之后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，构建疫苗工程菌BIB。

实施例3：rBIB蛋白的制备

3.1 BIB工程菌发酵

采用改良TB培养基作为发酵用培养基，高温高压灭菌后，以10%的接种量接种、37℃培养8-10 h，之后，添加终浓度为5 mM的乳糖诱导10 h，控制pH在7.2±0.3，调整转速以控制溶解氧在30%以上。最终，BIB菌体收率在30-45 g/L之间；蛋白表达量在25%-35%之间。

3.2 BIB包涵体制备

取发酵离心后收集的BIB工程菌菌体1 kg/次，超声裂解缓冲液1:10（W/V）比例重悬，采用磁力搅拌器搅拌使其混合均匀。将混合均匀的菌液的烧杯放置于冰块中，预冷至4℃，采用超声破碎仪250 W、开2 s、关2 s、40 min。取少量菌体超破液进行革兰染色镜检，在显微镜下观察细胞形态，确保细胞破碎完全。之后以10 000 g离心20 min，弃去上清收集沉淀。随后再以1:10（W/V）的比例分别用包涵体洗涤液Ⅰ和Ⅱ各洗涤1次，洗涤条件为：4℃搅拌混合均匀，10 000 g离心20 min，弃去上清，收集包涵体沉淀。最后将包涵体沉淀用包涵体溶解液以1:10（W/V）比例重悬，4℃搅拌混合均匀，10 000 g离心20 min，收集上清，弃去沉淀，收集上清。上清经0.22 μm滤膜过滤后，于-20℃保存。

3.3 重组蛋白BIB的纯化

采用阳离子交换层析一步纯化法，填料为SP Sephrose XL，纯化系统为AKTA purifier 100，柱形为XK50/30。上样量≤0.5 g/次，流速≤5 ml/min。经Sephrose XL阳离子交换层析纯化的重组蛋白纯度达到60%以上，再很据分子量的差异，选用中空纤维柱（UFP-5-E-4MA\5000NMWC）进行脱盐和去除尿素，并且使包涵体复性进而溶解在pH 10、200 mM的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中。

3.4 重组蛋白BIB的分装与冻干

将步骤3中的BIB蛋白溶液添加至终浓度为5%的甘露醇，蛋白浓度调整至8.0 mg/ml，分装至西林瓶中，4.0 ml/支。将装有分装好的西林瓶的托盘放置于预冻用物料架上,放入冷阱中，盖上冷阱盖板，预冻至-70℃。之后，再将预冻用物料架从冷阱腔中提出，将托盘置于冻干用物料架中；将硬质塑料盘（即冻干架支座）放置在冷阱腔上方，然后将冻干用物料架置于其上，再将有机玻璃筒罩好，开始冷冻干燥，至BIB蛋白水分≤3.0%。

实施例4：rBIB蛋白微球口服制剂的制备与冻干

在4℃条件下，将实施例3中制备的重组蛋白与2%的海藻酸钠溶液混匀，加入植物油（植物油：海藻酸钠的质量比为2:8）。8 000 rpm 乳化10 min后，逐滴滴入到CaCl₂溶液中，800 rpm搅拌30 min，形成O/W乳液，离心，取沉淀物洗涤后重悬。将悬液加入到1%浓度的壳聚糖溶液中，800 rpm搅拌30 min，从而制备出了壳聚糖-海藻酸钠包裹的BIB蛋白微球，离心洗涤3次。

将上述微球混悬液缓缓倒入玻璃平皿中，液面高度0.8 cm，-20℃预冻12 h后，放置于已预冷的真空冷冻干燥机内冷冻干燥，待气体压力显示器显示无气体生成时，取出冻干品进行质量检定。

分别取洗涤离心后的壳聚糖-海藻酸钠包裹的BIB蛋白微球、冻干微球、冻干微球复溶后样品，涂布于载玻片上，光学显微镜下观察微球冻干前后形态变化。并用粒径分布仪进行检测冻干前后粒径分布范围。

实施例5：rBIB蛋白肠溶胶囊口服制剂的制备

称取实施例3中制备的重组蛋白（5 g），邻苯二甲酸醋酸纤维素（40 g）及羟甲基淀粉钠（5 g），加入到适当浓度的乙醇水中搅拌混匀，抽真空旋转蒸发溶剂，制备固体分散体。将所制备固体分散体干燥，过100目筛，同时称取处方量的乳糖（60 g）和微晶纤维素（50 g）分别过100目筛。将按处方量已称取的原辅料按等量递进法投入多向运动混合机中，混合均匀后装入肠溶明胶空胶囊，用量1000粒。

实施例6：rBIB蛋白肠溶片口服制剂的制备

制备rBIB蛋白肠溶片片芯。将通过80目筛的rBIB蛋白、微晶纤维素（粘合剂、稀释剂：20%重量）、可压性淀粉（粘合剂、稀释剂：50%重量）、交联羧甲基纤维素钠（崩解剂：1.5%重量）和硬脂酸镁（润滑剂：0.1%重量），混合均匀，压片，制得片芯。第二步，rBIB蛋白肠溶片片芯薄膜包衣。肠溶包衣处方：聚丙烯酸树脂II 25 g、柠檬酸三乙酯 0.8 g、滑石粉 4.5 g、水 12 g。采用常规的薄膜包衣技术进行，包衣增重控制在6-8%左右。

实施例7：rBIB蛋白肠溶片口服制剂的制备

制备rBIB蛋白肠溶片片芯。将通过80目筛的rBIB蛋白、微晶纤维素（粘合剂、稀释剂：25%重量）、可压性淀粉（粘合剂、稀释剂：65%重量）、交联羧甲基纤维素钠（崩解剂：2. 5%重量）和硬脂酸镁（润滑剂：0.3%重量），混合均匀，压片，制得片芯。第二步，rBIB蛋白肠溶片片芯薄膜包衣。肠溶包衣处方：聚丙烯酸树脂II 25 g、柠檬酸三乙酯 0.8 g、滑石粉 4.5 g、水 12 g。采用常规的薄膜包衣技术进行，包衣增重控制在6%-8%左右。

实施例8：rBIB蛋白注射制剂的制备

将实施例3中步骤2制得的包涵体，经SP Sephrose XL阳离子交换层析和Sephacryl S-100HR分子筛层析两步纯化法进行纯化。将制得的纯度大于95%的BIB包涵体，经中空纤维柱（UFP-5-E-4MA\5000NMWC）进行脱盐和去除尿素，并且使包涵体复性进而溶解在pH 10、200 mM的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液中。用事先活化好的壳聚糖改性活性炭柱过滤，滤液经浓缩后，再一次通过改性活炭柱，加压下过0.2 μm微孔滤膜，滤液备用。再向滤液中加入终浓度为0.2 mg/ml的L-精氨酸，调整蛋白浓度至1.0 mg/ml，分装至西林瓶中，1.0 ml/支，冷冻干燥，临用时注射用水复溶即可。

实施例9：BIB IgY卵黄抗体的制备

9.1 产蛋母鸡的免疫程序及BIB IgY卵黄抗体的提取

肌肉注射BIB蛋白50 μg免疫产蛋母鸡，每隔14天追加免疫1次，共免疫3次。间接ELISA法监测抗体的变化情况，当抗体水平达到1:3200及以上时收集鸡蛋，采用水稀释硫酸铵盐析法提取卵黄抗体，提取得到的BIB IgY卵黄抗体纯度大于75%。再经脱盐柱进行缓冲液置换，使BIB IgY卵黄抗体溶解在0.9%的生理盐水中，0.2 μm滤膜过滤，调整浓度至8.0 mg/ml，分装至西林瓶中，4.0 ml/支，冷冻干燥，备用。

9.2 BIB IgY卵黄抗体口服液的制备

在双重蒸馏水中添加9wt%异麦芽低聚糖、10wt%果葡糖浆、0.007wt%葡萄糖酸锌、0.20wt%焦糖色素、0.04wt%苹果酸；并添加BIB IgY卵黄抗体终浓度至8 mg/ml，0.2 μm滤膜过滤，分装至西林瓶中，4.0 ml/支，灌装熔封，即可。

9.3 BIB IgY卵黄抗体肠溶片剂的制备

BIB IgY卵黄抗体肠溶片剂处方（100 000片）：

（1）片芯：BIB IgY卵黄抗体28 kg；MCC（微晶纤维素） KG802 4kg；聚维酮 S630 1kg、乳糖 1kg；交联CMC-Na（交联羧甲基纤维素钠） 0.6kg；硬脂酸镁 0.4kg。

（2）包衣：优特奇L100 3kg；PEG6000 0.3kg；水 0.75kg；无水乙醇 45.95kg

制备工艺：按片芯处方采用干法制粒压片，350 mg/片，制得的片芯按包衣处方进行包肠溶衣，包衣增重8%。

9.4 BIB IgY卵黄抗体肠溶胶囊的制备

BIB IgY卵黄抗体（10 mg）研磨过100 目筛，微晶纤维素（180 mg）、磷酸氢钙(40 mg)混合均匀，以羟丙甲纤维素水溶液为粘合剂（4%）制成软材，挤出制粒，经滚圆、55℃干燥后，置气流包衣机中，用10%欧巴代YS-1-7006的50%乙醇液（含有10%钛白粉）包隔离衣，45℃干燥，再用5%的雅克宜包肠溶衣，干燥后加入滑石粉，灌装胶囊，包装。

实施例10：BIB疫苗的抗原性

10.1 BIB蛋白纯化效果及其免疫反应性

通过Sephrose XL阳离子交换层析纯化该多靶点融合多肽，纯化结果如图2所示，图中：

泳道1：Protein MARKER；

泳道2: BL21（DE3）空菌；

泳道3: BIB工程菌经5 mM乳糖诱导后；

泳道 4: BIB工程菌经5 mM乳糖诱导后的可溶蛋白；

泳道 5：BIB包涵体经包涵体洗液洗涤后；

泳道 6：BIB蛋白经阳离子交换层析纯化后；

结果表明， BIB蛋白通过Sephrose XL阳离子交换层析一步纯化法，BIB蛋白纯度为60%-75%之间，可以满足BIB口服疫苗的要求。

将纯化后的多靶点融合多肽电转至NC膜上，分别用抗Hp人血清及抗UreB单抗做一抗验证多靶点融合多肽的免疫特异性，结果如图3所示，图中：

（1）表示：一抗为鼠抗BIB血清，1:1000；二抗为羊抗鼠IgG，1:5000；

（2）表示：一抗为鼠抗CTB单抗，1:10 000；二抗为羊抗鼠IgG，1:5000；

（3）表示：一抗为正常小鼠血清，1:500；二抗为羊抗鼠IgG，1:5000。

结果显示，BIB蛋白可以刺激小鼠产生针对BIB的特异性抗体，且该抗体可以与UreB、UreI、UreI-UreB及CTB特性性结合，证实BIB蛋白具有UreB、UreI、UreI-UreB及CTB的抗原性。

10.2 BIB 抗原检测特异性抗体IgG、IgA 的效价变化

在每次免疫结束第9天时从每组中随机取4只小鼠（雌雄小鼠各2只），分别取血清、肠胃洗液用重组幽门螺杆菌多靶点疫苗（BIB）抗原检测血清、肠胃洗液中抗体IgG、IgA。

血清中抗体IgG、IgA的检测方法如下：

使用包被液将BIB抗原稀释至2.5 μg/ml，0.1 ml/孔，4℃过夜；用PBST洗涤液洗3次，5 min/次；在酶标孔内加入2% BSA溶液，0.2 ml/孔，37℃封闭2 h；用PBST洗涤液洗3次，5 min/次。使用PBST洗涤液将免疫鼠血清梯度稀释（如1:100、1:200、1:400梯度稀释），阴性血清直接上样，不做梯度稀释，0.1 ml/孔，37℃，1 h；用PBST洗涤液洗3次，5 min/次。用PBST洗涤液将辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗鼠IgG稀释至1:1 2000, 0.1 ml/孔，37℃，40 min；用PBST洗涤液洗3次，5 min/次。加入TMB显色液，0.05 ml/孔，37℃避光显色3-5 min。加入2 M硫酸，0.05 ml/孔。用酶标仪在波长450 nm处读数。得到如图4、7所示的吸光度值（OD）-免疫时间柱状图。

肠胃洗液中抗体IgG、IgA的检测方法同上，分别得到如图5-6、8-9所示的吸光度值-免疫时间柱状图。

结果显示，进行了一次以上BIB免疫的小鼠的血清、肠胃洗液中抗体IgG、IgA较阴性对照组明显升高，免疫一次，血清抗体IgG相对于阴性对照组升高1.07倍、胃液IgG相对于阴性对照组升高1.28倍、肠液IgG相对于阴性对照组升高2.07倍，血清抗体IgA相对于阴性对照组升高1.03倍、胃液IgA相对于阴性对照组升高2.53倍、肠液IgA相对于阴性对照组升高3.51倍；免疫两次，血清抗体IgG相对于阴性对照组升高2.23倍、胃液IgG相对于阴性对照组升高2.73倍、肠液IgG相对于阴性对照组升高3.41倍，血清抗体IgA相对于阴性对照组升高1.60倍、胃液IgA相对于阴性对照组升高4.22倍、肠液IgA相对于阴性对照组升高4.80倍；免疫三次，血清抗体IgG相对于阴性对照组升高6.96倍、胃液IgG相对于阴性对照组升高5.52倍、肠液IgG相对于阴性对照组升高11.60倍，血清抗体IgA相对于阴性对照组升高5.10倍、胃液IgA相对于阴性对照组升高6.64倍、肠液IgA相对于阴性对照组升高11.7倍，具体见图4、5、6、7、8、9。

10.3 血清中细胞因子IFN-γ、IL-4 的检测

在每次免疫结束第9天时从每组中随机取雌雄小鼠各1 只，分离血清，采用R&D小鼠白细胞介素-4酶联免疫试剂盒和小鼠γ干扰素酶联免疫试剂盒，进行血清中细胞因子IFN-γ、IL-4 的检测。

用纯化的小鼠IL-4（或IFN-γ）抗体包被96孔板，制成固相抗体；往包被抗体的微孔中依次加入不同浓度梯度的小鼠IL-4（或IFN-γ）；再与HRP标记的IL-4（或HRP标记的IFN-γ）抗体结合；经过彻底洗涤后加底物TMB显色。采用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算血清中小鼠IL-4、IFN-γ的含量，分别得到如图10所示的细胞因子IFN-γ的吸光度值-免疫次数柱状图、如图11所示的细胞因子IL-4的吸光度值-免疫次数柱状图。结果显示，进行了一次以上BIB免疫的小鼠血清中IL-4、IFN-γ较阴性对照组显著升高，免疫三次时其IL-4、IFN-γ水平均是正常小鼠的3倍以上，说明BIB疫苗能够刺激小鼠产生相应的体液免疫应答。

10.4 BIB蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性

BIB蛋白对小鼠免疫保护性实验的免疫程序分为口服免疫和肌肉注射免疫两种方式。口服免疫组（PBS组、BIB蛋白组、IB蛋白组、CTB蛋白组；每组小鼠数量n=30只）每只小鼠灌胃3次，间隔2周进行1次，200 μg/次；肌肉注射免疫组（PBS组、BIB蛋白组、IB蛋白组、CTB蛋白组；每组小鼠数量n=30只）每只小鼠肌肉注射3次，间隔2周进行1次，50 μg/次。

末次免疫一周后进行Hp攻击小鼠,取布氏琼脂培养的Hp，用0.02 mol/l pH 7.4 PBS迅速洗脱至无菌试管,调整菌浓度至10⁸CFU/ml，灌胃3次，间隔1天进行1次，0.2 ml/次。

末次灌胃后第四周处死小鼠，取出小鼠胃组织，沿胃大弯将其分为两半，1/2用于快速尿素酶实验，剩余进行涂片革兰染色镜检、培养及PCR鉴定。

BIB蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价标准为：三种检测方法（PCR 法、细菌涂片法及培养、尿素酶法）有两种及两种以上检测为幽门螺杆菌菌阳性，则判断该小鼠感染幽门螺杆菌。

保护率=（未感染数量/存活数量）× 100%

从上表中可以看出，BIB组小鼠的免疫保护率明显高于其他小组，尤其是口服BIB组的小鼠免疫保护率明显较口服IB组的小鼠免疫保护率高，达到83.3%，p<0.05；肌肉注射BIB组的小鼠免疫保护率明显较肌肉注射IB组的小鼠免疫保护率高，达到33.3%，p<0.05；而通过对比口服BIB组与肌肉注射BIB组的小鼠免疫保护率，可以看出，口服BIB组的小鼠免疫保护率明显较高，p<0.05。

多表位核酸疫苗在宿主细胞系统中转录并表达多个不同的保护性抗原表位,从多个方面诱导机体的免疫应答，是一种具有广谱免疫反应的通用疫苗。DNA疫苗在体内有长期持久的免疫原性，其表达蛋白的结构类似于正常真核细胞的表达结构。DNA编码的相关蛋白作为内源性抗原经由MHC-Ⅰ类途径加工处理后，表达于抗原提成细胞表面(antigen presenting cell, APC)，进一步刺激细胞毒性T细胞的活化。抗原肽也可作为分泌性蛋白，通过B细胞表面抗原受体直接识别结合进而摄取抗原，并经MHC-Ⅱ类途径加工处理后形成的抗原肽，以抗原肽-MHC-Ⅱ类分子复合物的形式转运到细胞表面，供CD4+ Th细胞识别，从而启动特异性免疫应答，同时产生记忆B细胞参与二次免疫，保护宿主免受相关微生物的攻击。因而在中国专利申请号为CN101955545 A的发明专利中用IB作为核酸疫苗肌肉注射小鼠时保护率较高，可以达到80%，说明IB的抗原性、免疫原型及免疫保护性较好。而IB蛋白是作为原核表达产物，免疫原性及抗原性虽然高，产生较高的血清IgG类抗体，这类抗体对Hp的杀灭作用很微弱。本申请发明人通过体内外试验研究显示，清除体内感染的Hp主要依靠特异的粘膜免疫特异性抗体，而肌肉注射IB蛋白的免疫途径主要是在血液中产生IgG类抗体，而在胃液、肠液特异抗体弱，因而肌肉注射IB蛋白分子的免疫保护率仅为10%，而口服途径可在胃、肠产生特异的粘膜抗体，对感染的Hp作用、杀灭，因而IB蛋白分子口服保护率为53.3%，而含分子内佐剂CTB的IB蛋白分子（BIB）能够激活小鼠体内清除Hp的粘膜免疫系统，口服免疫保护率达到83.3%，安全性及免疫保护性更好。

10.5 BALB/c小鼠胃组织病理变化（HE染色，显微镜放大倍数100倍）

上述实施例10.4中末次灌胃后第四周处死小鼠，取出实验组1-4组的小鼠胃组织，沿胃大弯将其分为两半。取1/2胃组织切块(5 mm×5 mm×2 mm)，40%甲醇固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明后，石蜡包埋，4 μm切片；再经脱蜡、HE染色，脱水透明后中性树胶封片。结果如图12。

图12中，图12（1）为正常小鼠胃组织，无炎症细胞浸润，腺体排列整齐；图12（2）为BIB组小鼠胃组织，腺体排列整齐，胃粘膜表面无明显炎症细胞浸润；图12（4）为rIB组小鼠胃组织，胃粘膜固有层内见大量淋巴细胞浸润，浸润深度超过固有层的2/3，有淋巴滤泡形成，出现少量坏死、脱落组织；图12（5）为rCTB组小鼠胃组织，胃粘膜固有层内见大量淋巴细胞浸润，浸润深度超过固有层的2/3，有淋巴滤泡形成，减少腺体约为原有腺体的1/3；图12（6）为PBS组小鼠胃组织，胃粘膜出现大片坏死、脱落组织，腺体减少，减少腺体约为原有腺体的1/2。

BALB/c小鼠胃组织病理HE染色结果显示，小鼠口服BIB蛋白免疫后，Hp攻击，4周后BIB组小鼠胃组织腺体排列整齐，胃粘膜表面无明显炎症反应，与正常小鼠无明显差异；而其它组小鼠（rIB组小鼠、rCTB组小鼠、PBS组小鼠）胃组织均存在着较严重的炎症反应和腺体减少现象。因此，小鼠口服BIB蛋白免疫后，可以有效保护其胃粘膜免受Hp的损伤。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川万可泰生物技术有限责任公司

<120> 一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品

<130> 一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> Helicobacter pylori

<400> 1

atgggtaaca tcaccgacct gtgcgctgaa taccacaaca cccagatcta caccctgaac 60

gacaaaatct tctcttacac cgaatctctg gctggtaaac gtgaaatggc tatcatcacc 120

ttcaaaaacg gtgctatctt ccaggttgaa gttccgggtt ctcagcacat cgactctcag 180

aaaaaagcta tcgaacgtat gaaagacacc ctgcgtatcg cttacctgac cgaagctaaa 240

gttgaaaaac tgtgcgtttg gaacaacaaa accccgcacg ctatcgctgc tatctctatg 300

gctaacggtg gttctggtct gaccaaagtt gacccgaaat ctaccaaaaa aggtctggac 360

tggcgtccgt actcttggta caaaaaaatg tacggtccga ccaccggtga caaagttcgt 420

ctgaaaaaat ctgctatcaa ccacgctctg gacgttgctg acaaatacga cgttcaggtt 480

gctatccaca ccgacaccaa aaaatctatc aaagaagacg ttcagttcgc tgactctcgt 540

atccgtccgc agaccatcgc tgctgaagac accctgcacg acatgggtat cttctctatc 600

acctcttctg actctcaggc tatgggtcgt gttggtgaag ttatcacccg tacctggcag 660

accgctgaca aaaacaaaaa agaattcggt cgtctgaaag aagaaaaagg tgacaacgac 720

aacttcaaaa aaccggttaa aaactgccgt aacatcacca aaaaagacat gcagttcaac 780

gacaccaccg ctcacatcga agttaacccg gaaacctacc acgttttcgt tgacggtaaa 840

gaagttacct ctaaaccggc taacaaagtt tcttaa 876

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> Helicobacter pylori

<400> 2

Met Gly Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile

1 5 10 15

Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly

20 25 30

Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln

35 40 45

Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile

50 55 60

Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys

65 70 75 80

Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala

85 90 95

Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Gly Ser Gly Leu Thr Lys Val Asp Pro

100 105 110

Lys Ser Thr Lys Lys Gly Leu Asp Trp Arg Pro Tyr Ser Trp Tyr Lys

115 120 125

Lys Met Tyr Gly Pro Thr Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Lys Lys Ser

130 135 140

Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val

145 150 155 160

Ala Ile His Thr Asp Thr Lys Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe

165 170 175

Ala Asp Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu

180 185 190

His Asp Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met

195 200 205

Gly Arg Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys

210 215 220

Asn Lys Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp

225 230 235 240

Asn Phe Lys Lys Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp

245 250 255

Met Gln Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr

260 265 270

Tyr His Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn

275 280 285

Lys Val Ser

290

Claims

1.一种具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽或其衍生物。

2.根据权利要求1所述的具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽，其特征在于，所述多靶点融合多肽由幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及霍乱毒素B亚单位的B细胞及T细胞优势表位肽融合而成，该多靶点融合多肽采用原核或真核表达或化学合成方法制备。

3.编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列，其特征在于，为SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的多靶点重组基因，或者在SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中有一个或多个碱基的缺失、替换和/或添加且与SEQ ID NO :1具有相同编码产物的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的编码SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的核苷酸序列，其特征在于，SEQ ID NO :1所示核苷酸序列由幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及霍乱毒素B亚单位的B细胞及T细胞优势表位肽所对应的核苷酸序列重组而成，该重组序列采用PCR或人工合成的方法制备。

5.包含权利要求3所述核苷酸序列的原核表达载体或真核表达载体。

6.一种多靶点核酸疫苗，其特征在于，包含权利要求3所述核苷酸序列的真核表达载体，该真核表达载体在预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。

7.一种多靶点融合多肽疫苗，其特征在于，包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽在预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。

8.一种抗体制品，其特征在于，为包含抗SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多靶点融合多肽表位的特异性抗体，该特异性抗体在预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。

9.一种多靶点疫苗，其特征在于，为如权利要求6所述多靶点核酸疫苗单独地或与药学上可接受的辅料或载体制备而成，或为如权利要求7所述的多靶点融合多肽疫苗单独地或其与药学上可接受的辅料或载体制备而成，所述多靶点疫苗能够制成以下剂型：注射制剂、口服液、喷雾剂、片剂、胶囊剂。

10.一种抗体制剂，其特征在于，是由如权利要求8所述的抗体制品单独地或与药学上可接受的辅料或载体制备成以下剂型：口服液、喷雾剂、片剂、胶囊、注射剂。