CN104189901B

CN104189901B - 一种肺炎球菌缀合疫苗及其制备方法

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Publication number: CN104189901B
Application number: CN201410487165.6A
Authority: CN
Inventors: 吴克; 刘昊智; 程超; 王文灏
Original assignee: BRAVOVAX Co Ltd
Current assignee: Bravovax Co ltd; SHANGHAI BOWO BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2034-09-23
Also published as: CN106668853A; CN104189901A; CN107412764A; CN107412764B

Abstract

本发明公开了一种肺炎球菌缀合疫苗，该结合疫苗为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的结合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球。该肺炎球菌缀合疫苗的制备方法将多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白分别与纳米微球经偶联而成。本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗制备工艺简单，采用纳米微球为连接物的肺炎球菌缀合疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性，此外还可诱导小鼠产生轮状病毒抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔的应用前景。

Description

一种肺炎球菌缀合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗，具体说，是涉及一种肺炎球菌缀合疫苗疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

一、微生物对人体的危害及应对措施

微生物通常是指那些个体体积直径一般小于1mm的生物群体，它们结构简单，大多是单细胞，还有些甚至连细胞结构也没有，我们身边无时无刻不存在着微生物，通常会借助显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构；其中，致病微生物是指能够引起人类、动物和植物的病害，具有致病性的微生物。一种病原体的致病性有赖于它的侵袭宿主并在体内繁殖和抵御宿主抵抗力而不被其消灭的能力。微生物致病性有种属特征，致病能力强弱的程度称为毒力。感染性疾病的成立并非由微生物的毒力单方面决定，还要视宿主的健康情况与免疫功能状态。一般而言，毒力强的微生物感染未曾免疫过的机体，能引起病理损害出现显性感染等，而正常机体却能抵抗许多低毒微生物(如条件致病菌)的损害，但当宿主抵抗力降低时则可对这些微生物易感而致病。病原体的毒力与宿主抵抗力两者之间的较量，引出感染性疾病的发生、发展、转归和预后，由于病原体和宿主之间适应程度不同，双方抗衡的结局各异，产生各种不同的感染谱，即感染过程的不同表现。致病性是对特定宿主而言，有的只对人类有致病性，有的只对某些动物，而有的则属人畜共患性微生物。而此时宿主通常只能通过自身的免疫系统来对抗微生物的感染，死亡率非常高，致使各研究学者研究出了疫苗来对抗致病性微生物对人体的侵害。

而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫苗保护人体不受致病性微生物的侵害。通过接种预防性疫苗来预防疾病是人类在一个多世纪的临床实践中，证明是行之有效的手段。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。今天，用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。用基因重组蛋白技术开发出来的疫苗，如乙肝表面抗原(预防乙型肝炎)、人类乳头状类病毒颗粒病毒(预防子宫颈癌)等。用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白结合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗。由此可见，医学生物技术的发展，是疫苗产品不断发展的原动力，通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类健康的挑战。

二、结合疫苗概述

多糖是病原菌中的一种重要免疫有效成分，有菌体多糖(OPS)和荚膜多糖(CPS)之分。当病原体侵入机体后，它们作为免疫原，能刺激机体产生保护性免疫应答。但是，多糖分子属于T细胞不依赖性抗原(Ti-Ag)，免疫原性较弱，接种婴幼儿后免疫效果尤其不理想，而目前许多危害严重的疾病如流感嗜血杆菌(Hib)引起的脑膜炎、E.Coli O 157:H7引起的小儿出血性腹泻脱水等在婴幼儿中高发且临床无有效的治疗办法，病死率高(王燕等，结合疫苗概述[J],微生物学免疫学进展，2000,28(1):60-63)。为了提高多糖疫苗的免疫原性，国外于本世纪20年代初兴起了多糖和蛋白的化学结合疫苗，即缀合疫苗，结合(以蛋白为载体的细菌多糖类)疫苗采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上制备成多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等，短短几十年其发展相当迅速，已取得显著成果。

三、肺炎球菌的危害及其流行病学研究

由肺炎球菌(肺链)所引起的感染是全世界发病率和死亡率的主要起因。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常见表现形式，而呼吸道内的细菌扩散可导致中耳感染、窦炎或复发性支气管炎。与侵入性疾病相比，非侵入性的表现形式通常不那么严重，但更多见。由于抗生素耐药性传染病的扩散，以及肺炎球菌肺炎经常在流感感染之后出现，肺炎球菌疾病在流感期间发作的可能性进一步增加。

由肺炎链球菌引发的疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎球菌已成为全球儿童的头号杀手。我国肺炎的病死率为16.4％，其中50岁以上中老年人及1岁以下婴幼儿分别高达28.6％和22.0％。我国肺炎球菌在健康儿童中的携带率较高，资料统计显示，在北方地区健康儿童中的携带率为24.2％，南方地区为31.3％。而所述病是导致5岁以下儿童死亡的重要原因。主要原因在于婴幼儿免疫系统的发育尚不完善，免疫力较弱。并且年龄越小的婴儿，免疫力越弱。肺炎球菌大约有90种血清型(菌株)，我国的统计资料显示肺炎球菌感染菌株前几个血清型依次为：5、6、19、23、14、2、4型。据一项收集了860株肺炎球菌分离株的研究显示，有109株(12.7％)表现为血清群6，在中国肺炎球菌血清型6的红霉素耐药性达100％，其中的6A、6B和6C型分别为62株(56.9％)、38株(34.9％)和9株(8.2％)。

从化学结构上来看，以上病原体拥有一个细胞表面荚膜多糖(Capsularpolysaccharide，CPS)或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)壳，或者两者兼有，其功能是帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够防止细菌被杀灭。大多数病原菌中，不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多种不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一部分菌株感染所导致的。

由此可见，大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖以提高致病菌株覆盖率，优化和选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病学问题。一旦明确何种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗。

中国生物技术集团成都生物制品研究所生产的23价肺炎球菌疫苗是选取了23种最常见的致病菌(1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F，33F)，分别发酵培养并分离提纯肺炎球菌荚膜上的各型多糖，按等比例混合制成疫苗。细菌的多糖是一种胸腺非依赖性抗原，这种抗原与胸腺依赖性抗原的主要区别在于前者不需要T淋巴细胞的辅助来产生抗体。临床使用证明，荚膜多糖制作的疫苗明确有效，并在多个国家广泛使用。但是这类多糖疫苗存在以下问题：(1)在幼小动物或婴幼儿体内只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强；(2)产生低亲和力的抗体；(3)只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强效应；(4)容易产生免疫耐受；(5)普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用，23价多糖疫苗对于侵入型肺链感染的保护率为50-70％，而且只能用于2岁以上的人群接种，而肺炎的高峰发病年龄为6-12月龄；(6)具有重复结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫原，没有T细胞的参与，它们是无法诱导免疫记忆效应，刺激机体产生的抗体主要是IgM和IgG2，不能够有效地激活补体系统。

半化学结合技术(也称结合技术)开发疫苗的方法是从20世纪80年代出现的开发细菌疫苗的技术。John Robbins通过将流行性嗜血杆菌b型(Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)荚膜多糖(Polyribosylribitolphosphate，PRP)，用共价键的形式连接到蛋白载体(破伤风类毒素)合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖PRP-破伤风类毒素结合疫苗(PRP-TT)，在免疫动物后，能够产生杀菌的保护性抗体，从而开创了新一代细菌疫苗开发技术。特别有意义的是，对于年龄小于2岁的婴幼儿来说，由于免疫系统发育不完善，多糖对于婴幼儿是属于一种非T细胞依赖性抗原，不能够刺激机体如成人一样产生长效的针对于所述多糖来源的细菌特异性保护IgG抗体。因此，多糖对于小于2岁的婴幼儿是一种半抗原，不能够作为疫苗来接种小于2岁的儿童。当将细菌多糖以共价键的形式连接到蛋白载体，如破伤风类毒素(Tetanus Toxoid，TT)，由于蛋白质是一种T细胞依赖性抗原，能够将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机体产生针对于所述多糖的特异性IgG抗体，保护机体不受细菌的感染。流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素(PRP-TT)结合疫苗开发的成功，开创了一个开发细菌疫苗的技术平台，即将细菌多糖，如荚膜多糖、O-特异性多糖(O-specificpolysaccharide)、或寡聚糖(Oligosaccharide)，以共价键连接到蛋白载体上而制成的结合疫苗。基于这一概念的成功，医学生物研究界通过采用同一种化学合成方法开发出了不同细菌的结合疫苗；同样也用不同的合成技术开发出同一种细菌的结合疫苗。

荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面的蛋白激活和免疫细胞吞噬。如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也能够避免细菌被杀灭。荚膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作为疫苗对较大的儿童有一定的保护力。然而，荚膜多糖对2岁以下婴幼儿、老年人以及B细胞免疫缺陷的人群免疫效果差，接种剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。所述多糖疫苗与其它多糖疫苗一样，属T细胞非依赖性抗原，具有年龄相关的免疫原性，且不诱生T细胞依赖性的加强应答。通过将多糖与某种蛋白质共价结合，可使多糖转化成T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例。这种多糖结合疫苗不仅能够保护婴幼儿(2岁以下儿童)，还能够大大地增强抵抗力差的病人对细菌感染的抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景。1980年，JohnRobbins用溴化氰来随机活化Hib荚膜多糖，然后，将己二酰二肼(Adipic Dihydrazide，ADH)作为连接物(linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法将衍化后的多糖共价键地连接到载体蛋白破伤风类毒素上，合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素结合疫苗(PRP-TT)。由于在每个多糖链上有多个活化点，蛋白载体上同样的有多个连接点，形成的结合物是一种多糖和蛋白交叉连接的大分子，平均分子量约为5×106Da。1980年，Harold Jennings在美国专利4356170里，陈述了用牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)为载体，将脑膜炎球菌的A，C群多糖通过还原胺法共价键地连接到BSA上，合成出了流行性脑膜炎多糖-BAS结合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分别在美国专利4673574和4902506里，描述了用变异无毒株白喉毒素197(Cross reaction material sub197，CRM197)作为载体蛋白，以还原胺法合成了流行性嗜血杆菌b型寡聚糖-变异无毒株白喉毒素197(HbOC-CRM197)结合疫苗。具体的方法是用高碘酸钠氧化Hib荚膜多糖，产生在两末端为醛基的寡聚糖，通过还原剂氰基硼氢化钠(sodiumcyanoborohydride)，将寡聚糖共价键连接到蛋白载体上。形成分子量约为90kDa的脂多糖结合物，制成了含有30％的多糖和每一个蛋白上带有6个糖分子的结合疫苗。随后，美国默克(Merck，Sharpe and Dohme)以巯基化学方法，用纯化的奈瑟氏脑膜炎B群菌株(Neisseria meningitidis groups B)细菌表面蛋白复合物(outer membraneprotein complex，OMP)作为蛋白载体，合成出流行性嗜血杆菌b型多糖-细菌表面蛋白复合物(PRP-OMP)结合疫苗。运用这些合成技术，先后开发出了三种现已广泛用于临床接种的流行性嗜血杆菌b型结合疫苗，即PRP-TT、PRP-HbOC和PRP-OMP。Hib结合疫苗的成功为开发其它细菌结合疫苗提供了理论和技术基础，随后的开发进入了技术更为复杂的多价结合疫苗阶段，其原因是某些传染病，如肺炎球菌导致的肺炎、流行性脑膜炎球菌所致的脑膜炎等，可由多种不同的血清型或菌株感染所致，并且各血清型或菌株间由于细菌表面多糖的化学结构的不同，其抗体没有交叉免疫反应，因此，接种单一的血清型或菌株结合疫苗，无法保护被接种人体免于其它血清型或菌株的感染。由于这个原因，合成和配制多价结合疫苗来扩大疫苗的保护覆盖率成为开发的主要目标。

通过多年的努力，用结合技术开发出了多种覆盖率广的多价结合疫苗。细菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世纪30年代，Goebel和Avery将3型肺炎球菌多糖连接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗体，同时提供相应的免疫保护。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗，B型流感嗜血杆菌(HiB)多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗被美国FDA批准进入市场。默克公司、辉瑞公司和诺华公司相继开发了HiB多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性脑膜炎多糖-破伤风类毒素结合疫苗，并成功上市。2000年，美国惠氏(Wyeth)公司成功开发并上市了7价肺炎球菌多糖-CRM197结合疫苗，是由7个不同的肺炎球菌血清型多糖分别共价键连接到CRM197蛋白载体上，混合配制而成的一种多价疫苗，用以预防小儿肺炎，所述7个血清型肺炎球菌涵盖了北美和欧洲90％以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株。2006年，Sanofi Pasteur开发出了4价脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗，用于预防4种流行性脑膜炎球菌群，即A，C，Y，W135，所致的脑膜炎。2009年，GlaxoSmithKline(GSK)也开发出了一种10价肺炎球菌多糖-蛋白质结合疫苗，用以预防10种肺炎球菌血清型所导致的肺炎。所述疫苗运用了三种蛋白质作为蛋白载体，其中最主要的载体是蛋白-D(Protein D，PD)，有8个血清型多糖是用这个蛋白作为载体。蛋白-D是用非可分型的流行性嗜血杆菌的基因重组方法表达出来的无酯化表面蛋白，能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型的流行性嗜血杆菌感染所致的急性中耳炎，其他还有破伤风类毒素和白喉内毒素作为作为载体，被分别用作血清型18C和19F的结合疫苗的蛋白载体。从以上结合疫苗产品的设计，可以看出，结合疫苗的开发从单价疫苗过渡到技术上更为复杂的多价疫苗，提高了细菌疫苗的覆盖率。

多糖蛋白缀合疫苗(结合疫苗)是目前最先进的疫苗技术，在特异抗原上加上蛋白质载体，可增加其免疫原性。蛋白质载体具有T细胞依赖特性，多糖蛋白缀合疫苗可将非T细胞依赖性质的多糖抗原转变为T细胞依赖性质的抗原，激发机体的T辅助细胞产生一系列的免疫增强效应。荚膜多糖结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，增加其免疫原性。结合疫苗接种后产生的抗体在质量和数量上是一代疫苗的400-1000倍，产生免疫保护更广更强，保护时间更长久，达到高效保护。2000年，美国辉瑞公司第一个7价肺炎球菌结合疫苗上市；美国辉瑞公司开发婴幼儿更有针对性的7(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)价肺炎球菌蛋白疫苗，对5岁以下儿童也有效。荚膜多糖蛋白结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，可增加其免疫原性，可用于6周龄以上的儿童。目前辉瑞公司正在中国注册13价结合疫苗，增加了6个血清型(1，3，5，7F，6A，19A)。但是我国的资料显示肺炎球菌感染菌株血清型依次为：5、6、1、19、23、14、2、4，辉瑞7价肺炎球菌结合疫苗对我国常见致病菌型覆盖率只有50％左右，而13价结合疫苗的覆盖率也仅有70％。惠氏7价肺炎球菌结合疫苗需要接种4针剂，每针860元，价格昂贵，不利于推广。13价疫苗估计其价格将更为昂贵。因此美国辉瑞公司的7和13价结合疫苗不太适合我国大范围的儿童肺炎预防。

尽管13价肺炎球菌结合疫苗已经上市，但是其中有几个血清型的免疫效果相对其他血清型较低，如3型。且随着不同血清型的增加和同种载体蛋白的重复使用，使得载体蛋白用量增多，其免疫原性反而降低。GlaxoSmithKline在开发10价肺炎球菌多糖结合疫苗的设计中，选择了蛋白-D为载体，其原因是基于二个方面的考虑。其一，是为了避免重复使用已经作为百白破疫苗组分的破伤风类毒素和白喉类毒素作为载体。临床试验表明，当多价肺炎结合疫苗与其他含有与蛋白载体相同组分的单价疫苗或多联疫苗同时接种时，比如Hib-TT、百白破-Hib多糖结合疫苗-IPV(灭活脊髓灰质炎疫苗)-乙肝疫苗(简称6联疫苗)，多价肺炎球菌结合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性会受到抑制，特别是对用破伤风类毒素作为载体的血清型多糖免疫原性影响尤其明显。原因是多价肺炎球菌结合疫苗中作为载体的破伤风类毒素和白喉类毒素总浓度过高，在同时接种含有百白破组分的联合疫苗时，如6联疫苗，会造成所谓载体受体竞争性抑制效应，降低了结合疫苗多糖部分的免疫原性。SanofiPasteur的11价肺炎球菌多糖-TT和DT混合载体蛋白结合疫苗和Merck的7价肺炎球菌多糖-OMP结合疫苗(PCV-OMP)，都是临床试验结果不佳而导致产品开发失败的例子，原因就在与此。其二，是赋予蛋白载体以真正的保护性免疫原性功能。临床试验证明蛋白-D能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型流行性嗜血杆菌感染造成的急性中耳炎。GlaxoSmithKline的10价肺炎球菌多糖结合疫苗选择蛋白-D作为载体，使得蛋白载体产生的抗体具有临床意义的保护作用，是结合疫苗技术开发过程上的一大进步。

不过，非可分型的流行性嗜血杆菌实际临床意义受到所述类细菌感染率低下的限制，其感染导致的急性中耳炎发病率较低。但这些结合疫苗有一个共同点缺点，就是蛋白载体没有赋予免疫原性的保护功能，也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体，但是，疫苗的设计者并没有利用其抗体具有的保护性来预防传染病，同时，也没有确定其产生的抗体是否达到保护性滴度水平。破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉无毒变异株毒素等传统蛋白被选择作为载体的主要原因，并不是因为它们的产生的抗体具有保护性，而是从其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑。显而易见，破伤风类毒素和白喉类毒素已经是百白破三联疫苗的二个组分，被常规接种；所以，结合疫苗中的破伤风类毒素和白喉类毒素载体是否能够刺激机体产生达到保护性抗体滴度并不重要，相反的，结合疫苗中的多糖部分的抗体滴度才是疫苗设计者需要关注的主要问题。另外，一些正在开发中的结合疫苗产品所用的载体，如E.coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)，E.coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组霍乱毒素等也都是基于相同的考量。

新多糖结合疫苗的种类和型别在逐年增加，而可供选择的载体蛋白种类较少，不同疫苗重复使用载体蛋白较多。接种相同载体蛋白的不同结合疫苗可能会产生免疫抑制效应，导致不同疫苗之间免疫效果的相互影响。而且，多糖结合物的主要载体蛋白如TT等，其本身作为疫苗已大范围接种婴幼儿，人群体内原有的针对载体蛋白的高滴度特异性抗体可能会抑制机体对结合疫苗中多糖的特异性免疫反应。

中国专利(ZL02159032.X)公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，也是目前制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在所述技术中，以己二酸二酰肼(ADH)作为连接剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与ADH反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂，与ADH一端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼(AH)基团导入多糖分子，形成多糖-AH衍生物；多糖-AH衍生物在碳二亚胺(EDAC)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用。

然而，上述传统的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处：(1)多糖-AH衍生物会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的结合效率；(2)EDAC在介导ADH衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起多糖与载体蛋白的自身交联，从而降低多糖-蛋白的结合效率；(3)多糖和载体蛋白均为大型生物分子，中间靠仅有6个碳原子长度的ADH相连，多糖和蛋白质的结构势必会相互影响，使得多糖的一些重要抗原表位易被蛋白质所屏蔽，进而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。

四、纳米微球在生物技术中的应用及前景

纳米材料是指晶粒尺寸小于100纳米的单晶体或多晶体，独特的小尺寸效应和表面或界面等效应，使其具备了许多优异的或全新的性能，它正日益受到人们的重视。例如纳米材料对药物研究领域的不断渗透和影响，已经引发了药物领域一场深远的革命。药物是人类用于抵御和预防疾病的重要物质，长期以来，药物的研究开发已经为临床提供了许多的治疗手段，为患者带来了许多益处。但是，现有药物仍存在着许多问题，如药物无法在循环系统内滞留并达到有效浓度、无法到达特定的治疗目标、无法通过血脑屏障、无法在某个局部形成较高浓度而同时又不产生毒副作用等(吴新荣.载药纳米微粒的应用及研究进展[J].中国医院药物学杂志，2001,21(3):171-173.)。磁性纳米微球药物载体是纳米技术与现代医药学结合的产物，由于它具有小尺寸效应、良好的靶向性、生物相容性、生物降解性和功能基团等优点，因此有望克服传统药物所带来的这些缺陷。磁性纳米微粒也可用于蛋白质和酶的纯化、回收以及酶的固定化，操作简单，且提高酶的稳定性。利用磁性纳米微粒进行免疫分析，具有特异性好、分离快、重现性好的特点。使用磁性微球载体进行介入治疗，在磁控血管内进行栓塞，则具有磁控导向、靶位栓塞等优点。

磁性纳米微球在生物医学中的应用随研究的深入日渐广泛，具体有：

1、固定化酶

生物高分子例如酶分子等都具有很多官能团，可以通过物理吸附、交联、共价偶合等方式将他们固定在磁性微粒的表面。用磁性纳米微球固定化酶的优点是：易于将酶与底物和产物分离；提高酶的生物相容性和免疫活性；提高酶的稳定性，且操作简单可降低成本。Bendkiene等制备了壳聚糖磁性微球，用作固定化载体。酶被固定在这种载体上之后，可以很容易地用磁性装置从反应的混合液中分离回收。国内的研究者对这方面也作了探索，丁小斌等采用分散聚合法，合成出Fe3O4/(St-MPEO)(St-苯乙烯，MPEO-聚环氧乙烷大单体)微球，所述微球具有两亲结构，在大多数极性、非极性介质中都具有良好的溶胀性能，使得微球固载的化合物在多种介质中都具有较高的活性(Ding XB，Wei L,Zhao HZ.Synthesisand characterization of aliphatic polycarbonatediols[J].Applied PolymerScience，2001,79(3):1847-1851)。所述磁性纳米微球载体可望用于蛋白质和酶的纯化、回收以及酶的固定化、细胞分离等领域。

2、靶向药物

具有靶向性的药物载体微球是指载药微球能高选择地分布于作用对象，从而增强疗效、减少副作用。最初的靶向药物载体微球是根据临床需要，通过选用对机体各种组织或病变部位亲和力不同的载体制作载药微球，或将单克隆抗体与载体结合，以使药物能够输送到治疗期望达到的特定部位。随着人们对治疗的要求越来越高，靶向定位也因受基质的限制而不能完全令人满意，因此就出现了磁性纳米微球载药系统。这种系统在外加磁场的作用下，通过动(静)脉注人到病变组织，把载体定向到病变部位(靶位)，使所含药物得到定位释放，集中到病变部位发生作用(A Paul，Alivisatos.Ultrasensitive magneticbiosensor for homogeneous immunoassay[J].Science，2001,12(5):53-60)。德国的Lubbe等完成了世界上第一例应用磁性药物靶向治疗的临床实验。在对14个晚期实体瘤患者的磁靶向治疗中，发现患者对磁性靶向药物的耐受性很好。Lexion等也应用磁性微球作为药物载体治疗兔子的鳞癌(Lexion C，Amold W,Klein RJ,et al.Locotegional cancertreatment with magnetic drug targeting[J].Cancer Res，2000,60(23):6641-6648)，国内的陶凯雄等用阿霉素磁性蛋白微球治疗鼠种植性胃肿瘤(陶凯雄，孙宏武，陈道达，等.阿霉素磁性蛋白微球靶向治疗鼠种植性胃肿瘤[J].中华实验外科杂志，2000,17(1):63-64))，郭军等用平阳霉素磁性微球治疗口腔领面部海绵状血管瘤25例。此外，强磁场也具有抑癌作用(郭军，李澄，吴汉江.平阳霉素磁性微球靶向治疗口腔颌面部海绵状血管瘤25例临床报告[J].南京铁道医学院学报，2000,19(2):112-114))。徐慧显等用葡萄糖磁性微球固定化L-天冬酞胺酶来治疗急性淋巴白血病，也取得了良好的治疗效果。这些结果都表明，随磁场强度的提高磁性药物在肿瘤部位的聚集增多，利用外加磁场的磁导向作用，使药物定点于靶部位，发挥集中、高效的抗肿瘤作用。正是由于磁性纳米微球的靶向性和表面结合的特异性载体，使人们有望利用它来追踪和消灭正在转移的癌细胞，从而成为人体内消灭癌细胞的“生物导弹”。但是，目前应用磁性药物治疗的肿瘤多位于体表或离体表较近，因此外加磁场的强度可以较弱，且易于控制，若治疗深部器官或组织的肿瘤，则需要进一步优化磁场强度、定位和药物载体颗粒大小等。而要提高磁性微球的磁化强度则有一定的难度，因为磁性微粒表面的包覆层会大大降低其磁性能，另外，颗粒大小的可控也是有待解决的一个问题。

3、细胞分离和免疫分析

如果磁性微粒表面引接具有生物活性的专一性抗体，在外加磁场的作用下，利用抗体和细胞的特异性结合，就可以得到免疫磁性微球(Immunomagnetic microspheres,IMMS)或免疫磁性珠(Immunomagnetic beads,IMBS)，利用它们可快速有效地将细胞分离或进行免疫分析。尤其是采用IMBS对细胞、细胞器表面所特有的抗原物质进行分离时，具有简便快速、分离纯度高、保留靶物质活性等特点。Mccole等用IMBS分离被肝吸虫感染过的成年牛外周血中的T淋巴细胞，分出的细胞纯净，用于肝吸虫感染机制效果良好。John用连有单抗的IMMS检测沙门氏菌，整个检测过程只需2-3h，灵敏度为103-104菌体/ml，一定量血液和粪便的存在对分析无干扰，与凝集法和免疫荧光法相比，灵敏度提高103倍。Glenn用IMBS分离呼吸合包体病毒，结合酶联免疫分析，减低了传统管和微孔分析中的扩散和非特异性吸附，复合物的形成只需7min，而传统微孔法则需120min。细胞的分离技术还可用于癌症的治疗。康继超等用物理吸附结合化学键共价结合的方法，将抗人膀胧癌单克隆抗体连接到预先制备的聚苯乙烯磁性微球载体的表面，构建了能特异地与靶细胞结合并赋予其以磁响应性的免疫磁性微球。结果表明，所构建的IMMS可有效地和靶细胞结合，用IMMS从动物骨髓中分离癌细胞的初步实验表明，IMM可有效清除癌细胞，而骨髓细胞仅有很少量的损失。免疫分析在现代生物分析技术中是一种重要的方法，它对蛋白质、抗原、抗体及细胞的定量分析发挥着巨大的作用。利用磁性纳米微粒载体结合的抗原或抗体进行免疫分析，具有特异性高、分离快、重现性好等特点。景晓燕等采用无乳聚合法，在醇一水体系中，以过二硫酸钾为引发剂，在Fe3O4磁性流体粒子表面形成引发点，以丙烯酸(AA)为稳定剂，通过苯乙烯(ST)与丙烯酞胺共聚，制备出单分散的胺基磁性微球，所述微球可直接、快速与抗体(抗原)蛋白质交联，避免了其它功能团微球结合免疫试剂时需采用蛋白质为交联剂的缺点(景晓燕，王君，李茹民，等.磁性功能高分子微球的制备研究[J].应用科技，2000,27(1):16-17))。

4、磁控检塞

在通常的介人治疗过程中，会发生异位栓塞及梗死等现象，并引起严重的并发症，这是临床上急需解决的棘手问题，而使用磁性微球载体的介人治疗，在磁控血管内进行栓塞则具有磁控导向、靶位栓塞等优点，为解决以上难题提供了途径。学者们着重在磁球粒径、磁控时间、磁场强度、磁性微球包裹材料(粗糙、携带正电荷、具有疏水特性)等方面做了细致的研究。Minalnimura等运用热疗和动脉栓塞相结合的疗法用于鼠肝癌模型的研究。他们研制了DM-MS动脉导管局部给药，外加500kHz的磁场。治疗3d后，肿瘤增长率(栓塞-热疗组、单纯栓塞组和对照组)分别为28％、124％和385％(Minalnimura T，Sato H，Kasaoka S,et al.Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepaticembolization using dextran magnetite incorporated microspheres in rats[J].IntJ Oncol，2000,16(6):1153-1160)。此研究显示DM-MS热疗和栓塞相结合疗法是一种抗肿瘤可行性疗法，具有广阔的研究和应用前景。Goodwin等对阿霉素磁性微球肝动脉栓塞和药物靶向对抗肿瘤疗法的毒性做了研究(Goodwin SC,Bittner CA,Peterson CL,etal.Single-dose toxicity study of hepatic intra-arterial infusion ofdoxorubicin coupled to a novel magnetically targeted drug carrier[J].Toxical,2001,60(1):117-183)。他们建立的猪肝癌模型结果显示阿霉素磁性微球低剂量无毒副作用。只有当磁性微球的含量>＝75mg(含或不含阿霉素)靶区才有较好的效果，肝癌细胞的坏死程度与栓塞程度成正比，阿霉素不能在全身自由循环而成功地被控制在靶区。惠旭辉等用自制的聚甲基丙烯酸甲醋磁性微球对血管内栓塞进行了探讨，实验表明，30-50um的PMMA磁性微球具有磁响应能力强、磁控栓塞效果好、在高血流速情况下仍能实现靶位栓塞等优点，是一种较好的磁控血管内栓塞材料(惠旭辉，高立达，何能前.聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球血管内栓塞实验研究[J].四川医学,2001,22(10):928-929))。在磁控栓塞中，磁性微球载体的大小是影响靶区定位最重要的因素。如果粒径较小，则磁响应性弱，磁控度较差，不能用于高血流速或较大管径血管内的磁控栓塞。因此，与磁性微球在其他方面的应用有所不同，在磁控栓塞介人治疗中，一般采用粒径较大的磁性微球。

也有报告指出，纳米微球可作为DNA疫苗的载体蛋白和佐剂，但应用于预防性多糖和/或蛋白类疫苗未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种免疫原性更强的肺炎球菌缀合疫苗。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种肺炎球菌缀合疫苗，其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的肺炎球菌缀合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球。

作为一种优选方案，该磁性纳米微球的磁性微粒位于磁性纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部。

作为进一步优选方案，磁性微粒为Fe₃O₄。

作为进一步优选方案，磁性纳米微球粒径为0.1-10μm，优选为0.1-5μm。

作为另一种优选方案，高分子材料为生物高分子材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)中的一种或以上的混合物；最佳为PLGA或PELA。

作为另一种优选方案，多价肺炎球菌多糖为多种肺炎球菌荚膜多糖，优选为分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，该血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。

作为进一步优选方案，多价肺炎球菌多糖与两种载体蛋白的质量比为(0.5～2)：1，优选为(0.5～1)：1，其中各载体蛋白间的质量比优选为1：1。

作为一种优选优选方案，该载体蛋白选自重组人轮状病毒蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素、载体蛋白CRM197、嗜血流感杆菌表面蛋白HiD、百日咳Prn表面蛋白、百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)。

作为进一步优选方案，该载体蛋白中有一种为嗜血流感杆菌表面蛋白HiD或肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)。

作为进一步优选方案，重组人轮状病毒蛋白为P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列，优选为P基因型轮状病毒毒株P[8]、P[4]、P[6]或P[11]中的一种；其中，P基因型轮状病毒毒株选自P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5或P[6]G8中的一种。

作为更进一步优选方案，P基因型P[8]的轮状病毒毒株选自Wa、Ku、P、YO、MO、VA70、D、AU32、CH-32、CH-55、CHW2、CH927A、W161、F45、Ai-75、Hochi、Hosokawa、BR1054、WT78或WI79毒株中的一种。

作为更进一步优选方案，P基因型P[4]的轮状病毒毒株选自DS-1、RV-5、S2、L26、KUN、E210、CHW17、AU64、107E18、MW333或TB-Chen毒株中的一种。

作为更进一步优选方案，P基因型P[6]的轮状病毒毒株选自M37、1076、RV-3、ST3、SC2、BrB、McN13、US1205、MW023、US585或AU19毒株中的一种。

作为另一种进一步优选方案，重组人轮状病毒蛋白选自VP8、VP4、VP8多肽链片段、核VP8、VP4多肽链片段、VP8特异性抗原簇肽链或VP4特异性抗原簇肽链中的一种。

作为另一种进一步优选方案，重组轮状病毒蛋白是G血清型轮状病毒的VP7蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

作为更进一步优选方案，G血清型轮状病毒毒株选自G1、G2、G3、G4、G9、G5、G8、G10或G11血清型中的一种。

作为更进一步优选方案，所述G血清型轮状病毒毒株选自P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5或P[6]G8血清型中的一种。

本发明的另一目的是提供该肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，具体是将多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白分别与磁性纳米微球偶联而成。

作为一种优选方案，该肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：

a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；

b)分别制备并分离提纯所选用的载体蛋白；

c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微球偶联体；

d)再将多糖-磁性纳米微球偶联体分别与多种载体蛋白偶联结合；

e)分离纯化步骤d)所得偶联体成该肺炎球菌缀合疫苗原液。

作为进一步优选方案，该肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：

a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；

b)分别分离提纯所选用的多种载体蛋白；

c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微球偶联体，再经化学改性，从而将该多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性为-CHO；

e)分离纯化步骤d)所得偶联体成该肺炎球菌缀合疫苗原液。

作为进一步优选方案，该制备方法还包括制备磁性纳米微球，包括先制备纳米磁性粒子再制备磁性纳米微球的过程；其中纳米磁性粒子可通过化学共沉淀法、水热法或溶胶法热解法制备，磁性纳米微球可通过包埋法、单体聚合法或原位法制备，优选为采用化学共沉淀法制备纳米磁性粒子再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃取法和/或包埋法或单体聚合法制备磁性纳米微球；最优选为采用化学共沉淀法制备纳米磁性粒子再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃取法和/或包埋法制备粒径均一的磁性纳米微球；其中磁性微粒优选为Fe₃O₄。

作为更进一步优选方案，上述纳米磁性离子的制备方法可可参照现有技术中Fe₃O₄磁性纳米微球的方法制备，具体可参见下述具体实施方式，并不作为本发明是否可实现的关键因素。

作为更进一步优选方案，步骤a中多糖的分离纯化工艺可根据所需的多糖及蛋白种类根据现有技术进行操作。

作为更进一步优选方案，步骤b中的蛋白的制备及分离纯化工艺可根据所需的多糖及蛋白种类根据现有技术进行操作。

作为更进一步优选方案，步骤c的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，室温下、pH4.0-9.0下，将步骤a所得多糖与磁性纳米微球共反应6-24小时得多糖-磁性纳米微球偶联体，再通过25％戊二醛对其进行进一步改性，使得多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性为-CHO；其中偶联介质优选为PB、PBS或TBS，最佳为0.1M TBS溶液；反应缓冲液的最佳pH为6；最佳反应时间为12-16小时。

作为更进一步优选方案，步骤d的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，4℃、pH4.0-9.0下，将步骤c所得经化学改性的多糖-磁性纳米微球偶联体与载体蛋白共反应12-24小时；其中偶联介质优选为PB、PBS或TBS，最佳为0.1M TBS溶液；反应缓冲液的最佳pH为6；最佳反应时间为24小时。

作为更进一步优选方案，步骤e的分离纯化是将偶联结合物和未反应的多糖和载体蛋白分离纯化，纯化方法可用层析法或超滤法；可根据获得的肺炎球菌缀合疫苗的分子大小进行分离纯化，层析法优选采用Superdex200凝胶过滤柱、Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B进行；而超滤法是采用不同滞留分子量膜来分离结合物和未反应物。

该肺炎球菌缀合疫苗制剂可采用水剂或冻干剂。为了增强其免疫原性，可加入佐剂，常用的佐剂有铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝，本发明优先选择磷酸铝。结合物的溶剂可为0.2氯化钠溶液、1×PBS缓冲液或其它能够稳定多糖或者结合物的缓冲液。本发明的肺炎球菌缀合疫苗各制剂的制备方法采用本技术领域的常规手段制备。其中，优选在糖(例如蔗糖或乳糖)存在下进行冻干。

本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫，包括真皮层或皮肤给药、肌肉给药等形式。其中，所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。

术语定义

核VP8：是轮状病毒蛋白VP8中的一段具有和细胞表面含有唾液酸(sialic acid)粘合功能的多肽链，通常含有160氨基酸残基。

VP8多肽链片段：为任何分子量低于全长VP8的多肽链。

VP4多肽链片段：为任何分子量低于全长VP4的多肽链。

VP8特异性抗原簇链：全VP8多肽链含有多个抗原决定簇，通过基因重组的方法剪切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链，分子量通常小于全长VP8多肽链。

VP4特异性抗原簇链：全VP4多肽链含有多个抗原决定簇，通过基因重组的方法剪切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链，分子量通常小于全长VP4多肽链。

VP8融合蛋白：用基因重组方法，将VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽链融合表达，以提高VP8在水溶液中的可溶性；或增强VP8的免疫原性。

NSP4蛋白：是非结构性蛋白，具有肠毒素特性，分子量为28kDa，含有175个氨基酸。

VP8-NSP4融合蛋白：用基因重组的方法，将VP8和NSP4多肽链融合表达，以提高VP8在水溶液中的可溶性，同时使得融合蛋白具有刺激机体产生抗NSP4的保护性抗体。

荚膜多糖片段：通过物理(如超声波、微粒喷雾)、化学(如酸、碱、酶消化)等方法将由细菌培养液中纯化的多糖(称全多糖或原始多糖)降解(depolymerization)所获得的多糖片段，分子量通常低于原始多糖。荚膜寡聚糖：通过物理(如超声波、微粒喷雾)、化学(如酸、碱、酶消化)等方法将由细菌培养液中纯化的多糖(称全多糖或原始多糖)降解(depolymerization)所获得的多糖片段，分子结构中的单糖残基通常低于10。不过单糖残基数量的定义有差异，有些文献将多于10个少于20个单糖残基的多糖链也成为寡聚糖。

与现有技术相比本发明具有以下优势：

1.该肺炎球菌缀合疫苗是含两种或两种以上不同载体蛋白的免疫缀合物，与现有的肺炎球菌结合疫苗相比，其免疫原性更强，诱发的多糖抗体水平高于单载体结合物，可以在更广阔的人群中引起免疫应答，尤其是婴幼儿；可通过减少各载体剂量而避免载体表位过载；可通过两种载体增强辅助T细胞活性；

2.由于两种载体蛋白中具有保护性的蛋白抗原表位也会诱导比两种蛋白混合注射时更高的免疫反应，相互协同作用，进一步增进了载体蛋白的免疫原性，增加了机体对多糖的免疫反应；另一种为佐剂作用载体蛋白，还可进一步增强免疫原性，且具有一定的免疫记忆；

3.本发明首创的采用纳米微球作为多糖与多载体蛋白的连接体，有效地避免在制备过程中荚膜多糖和蛋白质的自身偶联，能够提高结合产物的收率，并且利于产品的质量控制；可有效延长荚膜多糖与载体蛋白之间的空间距离，减小了载体蛋白对荚膜多糖抗原表位的空间屏蔽效应，有利于提高荚膜多糖的免疫原性；

4.该肺炎球菌缀合疫苗的制备过程中首创的将纳米微球表面的-OH先与多糖进行偶联反应，再将偶联体经化学改性将未反应-OH改性为-CHO在与载体蛋白中的-NH₂进行偶联结合，较现有技术中的结合方法更为稳定；

5.其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要，未显著改变荚膜多糖和载体蛋白的结构特征。

综上述，本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗制备工艺简单，采用纳米微球为连接物的肺炎球菌缀合疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性，此外还可诱导小鼠产生轮状病毒抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的肺炎球菌缀合疫苗的¹H-NMR谱图；

图2为本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗的多糖特异性抗体的免疫应答实验结果示意图；

图3为本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗的多糖特异性抗体的免疫持效性实验结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。以下所用试剂或设备均为市售品种，如无特殊说明，均按照说明书操作，在此不做赘述。

以下为结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不应视为对本发明的限定。

实施例1

一、制备磁性纳米微球

1.取2.24gFeSO₄-7H₂O和3.24gFeCl₃-6H₂O分别溶于10mL和15mL过滤除氧的dddH₂O中，溶解后混合均勾，加入100mL过滤除氧的dddH₂O；

2.在N₂的保护下搅拌5min，一次性加入50mL1mol/LNaOH溶液，再调节溶液pH至9-10，加快搅拌速度至200-250r/min，连续搅拌30min；

3.将反应容器转移至65-70℃水浴中，继续在N₂的保护下搅拌陈化30min；

4.反应完毕定容至100mL，显微镜下观察磁性粒子合成情况；

5.将400mgPLGA溶于10mLEA溶剂中作为油相(O)，加入3mL上述磁性粒子溶液作为内水相(W₁)，采用超声细胞破碎仪(120W、60s)在冰水浴中进行初乳化化制备初乳，再将初乳倒入一定量含15g/LPVA和0.9％(ω)NaCl的水溶液(外水相，W₂)，磁力搅拌(300r/min、2min)制备预复乳液(W₁/0/W₂)，再将预复乳倒入快速膜乳化的储料罐中，以一定N₂压力将其反复压过SPG膜，得粒径均一的纳米微球复乳液滴。此外，未用完的纳米微球可制成冻干剂留用。

或通过取Fe₃O₄磁性粒子与50mL与无水乙醇按等体积加入，超声活化30min后，置60℃水浴中，缓慢的滴加10mLPELA对磁性纳米微球进行-NH₂末端改性且将PELA包裹在Fe₃O₄磁性粒子外，在氮气保护下搅拌反应l0h，制成磁性纳米微球；反应完毕后，用50mL无水乙醇洗漆3次，再用0.01MPBS洗漆三次后，定容至50mL，显微镜下观察磁珠改性情况，至磁性纳米微球表面-NH₂末端改为-OH末端。

二、肺炎球菌多糖的制备

1.选取24种血清型(1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)的肺炎球菌培养；

2.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖：肺炎球菌，灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70％的)预冷乙醇，离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1：2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清，补加乙醇(终浓度80％搅拌)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后即为多价精制荚膜多糖，置-20℃保存备用。三、轮状病毒载体蛋白的制备

轮状病毒载体蛋白的制备可参见现有技术中的多种重组蛋白的制备方法，本实施例采用CN 101972475中提及的方法制备，可简化为以下步骤，具体参数不做赘述：

1、建立轮状病毒的cDNA库

选用的为Wa毒株VP8蛋白的VP4基因，扩增引物设计如下：sense引物HWaVP4ρET28：

5’-TTACATATGGCTTCGCTCATTTATAG-3’，anti-sense引物AHWaVP4ρET28：

5’-CCGGATCCCTAGTCTTCATTAACTTGTGCT-3’。

2、构建pET28aWaVP8表达全长VP8质粒

3、表达重组VP8蛋白

1)将制得的pET28aWaVP8质粒转化入BL21(DE3)competent细胞中，接种细胞到50μg/mL卡那霉素LB培养皿，在37℃下于CO₂培养箱内过夜。

2)挑选出一个菌落，接种到10毫升含有50μg/mL的卡那霉素LB培养液(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.5)中扩增，在37℃培养过夜。

3)将培养液转接种到100毫升的50μg/mL卡那霉素LB培养液，继续培养。待吸光度600nm的OD到达1.0时，将培养液转接种到6升到50μg/mL卡那霉素LB培养液中，继续在37℃，摇速200rpm的摇床内培养，待吸光度600nm的OD到达0.6～0.8时，加入0.3mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导VP8表达。

4)在相同的培养条件下，诱导4小时后，以4000g下，在10℃离心20分钟后，收集菌体。

5)将细菌悬浮于20mL的1×PBS溶液，用法式压滤壶(Frenchpress)破碎细菌后，在10000g下，在10℃离心30分钟，丢弃上清液，收集沉淀的包涵体。在进一步纯化前，存储包涵体于-40℃。

3、从包涵体中纯化VP8蛋白

1)称取制备的VP8包涵体0.5克(湿重)，用清洗缓冲液(10mMTris，100mM磷酸盐缓冲液，2Murea，pH8.0)悬浮包涵体，在室温下孵育30分钟，以10,000g离心10分钟，收集包涵体。重复以上步骤三次除去污染的杂蛋白。

2)将包涵体沉淀溶于溶解缓冲液(10mMTris-HCl，100mM磷酸盐缓冲液，8M尿素，pH8.0)中，在冰上搅拌孵育1小时。以16,000g离心30分钟，收集上清液，丢弃不溶沉淀物。

3)用固定金属离子亲和层析色谱法(IMAC)纯化His-tagged重组VP8蛋白。

4)收集含有VP8的洗脱液，转入透析袋中在含有20mMβ-巯基乙醇1和8M尿素的TBS(pH4.0)中透析，并逐渐降低尿素的浓度(即8，6，4，2，和1M)，在4℃中透析过夜。然后在含有2mMβ-巯基乙醇的TBSpH5.5溶液中透析两次，最后在TBS溶液中透析。根据重组VP8蛋白来源的毒株不同，来进行最后透析。

四、肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)的制备

将PspA蛋白克隆至大肠杆菌进行表达并分离纯化，具体包括：

1.目的基因的优化和重组表达质粒的构建

在GenBank中获取PspA基因序列(GI：193804931)并进行优化，加上His标签后进行全基因合成，将合成的序列经SacⅠ和NdeⅠ双酶切后，定向克隆至同样双酶切的表达载体pET-30a(+)中，转化感受态大肠杆菌BL21Star(DE3)，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆菌落，扩增培养后提取质粒，用NdeⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，并送测序，将测序正确的重组表达质粒命名为pET-30a-rPspA。

2.重组蛋白的诱导表达及纯化

复苏工程菌，以1：100的比例接种2×LB培养基，在37℃，237r/min下扩大培养，当菌体值约为12时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4h，取样进行SDS-PAGE分析离心收集诱导菌体，加入生理盐水重悬洗涤2次，以1:10(g/mL)的比例加入05mol/LNaCl5mmol/L咪唑20mmol/LPB(pH7.4)的缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，8000×g离心40min，收集上清，于镍离子层析柱中进行纯化，按说明书操作纯化产物的及分析将载体pET-30a(+)转化的大肠杆菌BL21Star(DE3)全菌体(对照)和将上步纯化样品经SDS-PAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉摇床轻微振荡封闭2h；加入His鼠源单抗(1∶800稀释)，4℃过夜；TBST清洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2000稀释)，室温孵育1h；洗涤3次，DAB显色。

五、肺炎球菌缀合疫苗的制备

1.多糖-磁性纳米微球偶联

0.1MTBS溶液缓冲液下，pH6.0加入上述步骤制得的任一或多种荚膜多糖和磁性纳米微球，本实施例中采用13价荚膜多糖(1、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)，荚膜多糖与磁性纳米微球的质量比为1:(0.5-1)，于室温下反应6-24小时；其中优化的质量比为1:1，于室温下缩醛反应16小时。反应结束后，用透析袋充分透析，除去未反应磁性纳米微球。

2.偶联体改性

取步骤1多糖-磁性纳米微球偶联体30mL，搅拌条件下缓慢滴加2mL25％戊二酸，200r/min搅拌反应6小时；反应完毕后，用0.01MPBS洗涤三次后，定容至30mL，显微镜下观察磁性纳米微球改性情况，使得多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性为-CHO；N₂、4℃保存备用。

3.与PspA载体蛋白和轮状病毒蛋白共偶联

0.1MTBS溶液缓冲液下，4℃、pH4.0-9.0下，将改性后的多糖-磁性纳米微球分别与轮状病毒蛋白和PspA蛋白共反应24小时(为保证足量的载体蛋白与磁性纳米微球，采用过量纳米载体蛋白加入量，如质量比采用多糖：磁性纳米微球：PspA：轮状病毒蛋白＝1：1：2：2)。

4.肺炎球菌缀合疫苗的分离纯化

用Superdex200凝胶过滤柱(2.6cm×60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)，流速为3mL/min。收集对应于多糖-磁性纳米微球-双载体蛋白的洗脱峰。

制得的肺炎球菌缀合疫苗的组成分析

用¹H-NMR进行检测所述肺炎球菌缀合疫苗，检测结果见图1。如图1所示，与荚膜多糖分子相比，缀合物在0.4-1.4ppm处出现了特征峰，对应于载体蛋白的脂肪链氨基酸残基。在7.2ppm处出现了对应于载体蛋白的芳香族氨基酸残基的特征峰。这表明荚膜多糖分子成功地偶联了轮状病毒蛋白和PspA载体蛋白两种载体蛋白。在6.2ppm处出现了对应于琥珀酰亚胺的特征峰，这表明多糖结合疫苗的连接桥中含有琥珀酰亚胺。此外，5.2、1.6、3.6出线了PELA的特征峰证明磁性纳米微球PELA作为连接物。因此，荚膜多糖在结合两种载体蛋白前后，其结构未发生明显改变。

通过CL-4B即SEC-MALLS方法检测多糖蛋白缀合物的分子量分布情况；通过免疫双扩的方法使用不同的抗体血清确定多糖蛋白缀合物中的蛋白和多糖种类；通过蒽酮法检测多糖蛋白缀合物的多糖含量；Lowry法蛋白含量检测多糖蛋白缀合物的总蛋白含量，再通过计算得到缀合物的多糖蛋白结合比(Ratio)；轮状病毒蛋白、PspA蛋白浓度通过酶联免疫法检测。结果表明：在所述肺炎球菌缀合疫苗原液中，各物质的浓度比约为：多糖：磁性纳米微球：PspA：轮状病毒蛋白＝1：1：1：1)。

对比例1

本对比例与实施例1的区别仅在于：制得的疫苗中无磁性纳米微粒作为连接体，而且通过现有技术中提及的方法将双载体蛋白与多糖缀合而得。

对比例2

本对比例与实施例1的区别仅在于：制得的疫苗中无PspA载体蛋白，仅采用多糖-磁性纳米微粒-轮状病毒载体蛋白为肺炎球菌缀合疫苗。

实施例2

本实施例与实施例1的区别仅在于所述肺炎球菌缀合疫苗的载体蛋白为破伤风类毒素载体蛋白和PspA。

制得的肺炎球菌缀合疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理论误差范围内的一致性。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于：所述肺炎球菌缀合疫苗的载体蛋白为轮状病毒载体蛋白和破伤风类毒素载体蛋白。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于：所述肺炎球菌缀合疫苗的载体蛋白为轮状病毒载体蛋白和嗜血流感杆菌表面蛋白HiD。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅在于：所述肺炎球菌缀合疫苗的载体蛋白为载体蛋白CRM197和PspA。

实施例6

本实施例与实施例1的区别仅在于：连接体为PLGA磁性纳米颗粒。

实施例7

本实施例与实施例1的区别仅在于：连接体为PEG磁性纳米颗粒。

疫苗评价

以下采用免疫原性等疫苗常规效价的评估实验评估实施例1～7及对比例1～2所得疫苗的免疫效果：

A.肺炎球菌缀合疫苗免疫原性实验

选取100只5周龄的雌性Blab/C小鼠，体重为15-22克。随机分为10组，即实施例1～7、对比例1～2和阳性对照组(Prevnar 13)，每组10只小鼠。腹腔注射，每只每次注射为5微克，每周注射1次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的IgG、IgG1和IgG2a。实验结果见表1

表1

如表1所示，实施例1～7中所得的肺炎球菌缀合疫苗可显著提升抗体滴度(p<0.0001**)，如图2所示，且明显优于对比例1和对比例2以及阳性对照组；由此可见，采用双载体蛋白并以磁性纳米微球与肺炎多糖而得的肺炎球菌缀合疫苗可显著增强Th1型免疫应答，且免疫效果明显优于对比例1的无纳米磁性微球连接体和对比例2的单载体蛋白而得的肺炎球菌缀合疫苗；但根据实施例1～7所得的免疫应答结果也可知，由PspA或HiD为双载体蛋白之一的免疫应答效果较好，且磁性纳米载体中PELA和PLGA较PEG免疫应答效果好。

B.多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲合性实验

分别以实施例1、对比例1和2以及阳性对照所得肺炎球菌缀合疫苗进行一下实验。

1、免疫持效性

通过测定三针免疫后20周内多糖特异性抗体的滴度，以研究多糖特异性抗体的免疫持效性。图3为所述免疫持效性示意图，如图3所示，其多糖特异性IgG滴度较低，随着注射时间增加而逐渐降低，第4周后已无法检测到。对比例1和2产生的多糖特异性IgG滴度要低于实施例1组，而高于阳性对照组。多糖特异性IgG滴度在第2周达峰，在第4-20周内逐渐下降，其中阳性对照组的下降速度最快。第18周后，实施例1组、对比例1、对比例2和阳性对照组的多糖特异性IgG滴度分别是其峰值的20％、15％、12％和10％。因此，本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗能够增强多糖特异性抗体的免疫持效性。

2、特异性和亲和性

向200倍稀释的PS-TT组、PS-PLGA-TT组和PS-PELA-TT组小鼠血浆中加入不同量的荚膜多糖，用ELISA方法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的抗体水平，结果见表2。

表2

如表2所示，随着多糖加入量的增加，多糖特异性抗体结合96孔板中多糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到20μg时，抗体结合多糖的能力丧失。这表明由本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗诱导小鼠产生的抗荚膜多糖抗体能够特异性地结合荚膜多糖。

用硫氰酸铵法测定抗荚膜多糖的抗体亲合性。荚膜多糖组(阴性对照)的多糖特异性抗体亲和指数为1.18mol/L，而阳性对照组、对比例1组、对比例2组组和实施例1组的抗体亲和指数分别为2.65mol/L、2.80mol/L、3.02mol/L和3.21mol/L。这表明本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗能显著提高多糖特异性抗体的亲合性。

C、肺炎球菌缀合疫苗中单型肺炎球菌多糖的免疫原性比较实验

采用实施例1中所述的方法制备各单型肺炎球菌缀合疫苗共13类包被抗原型(即仅采用一种肺炎球菌多糖经磁性纳米颗粒与两种载体蛋白结合成缀合疫苗)，通过间接ELISA法分别检测抗体滴度，将各型肺炎多糖结合疫苗溶解于0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲溶液中，以20ug/ml浓度包被酶标板，2％的BSA液封闭。实验时将待测血清100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200、102400、204800、409600倍稀释后加入酶标板，置37℃反应40min，常规洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。同时加入不含血清的缓冲液作为阴性对照。用四氨基联苯胺显色，酶标仪450nm波长处读取A值。计算每孔中A值与阴性孔A值得比值，但比值大于2.1时代最大的稀释倍数为血清中的抗体滴度，对10只小鼠的滴度进行几何平均，并以10为底计算对数值，具体结果见表3。

表3各单型肺炎球菌缀合疫苗免疫原性评价

由表3可知：以本发明提供的磁性纳米颗粒为连接体的双载体蛋白所得的肺炎多糖结合疫苗可使小鼠对肺链多糖的免疫反应显著增强，其中1、3、5、和6A/B型尤其显著，具有更佳的免疫应答效果；此类更适合我国人群使用。

D、轮状病毒中和实验结果

采用实施例1中方法分别制得的小鼠血清各组(实施例1、对比例1组和对比例2组分别注射一针、两针和三针)的每个小鼠血清各取10μL混合，用于中和试验样品血清。

注射小白鼠产生的抗WaVP8抗体的中和试验在微板(microplate)上用BSC-1细胞进行。将加热灭活血清进行系列稀释后，与100TCID50的Wa轮状病毒毒株混合后，在4℃培养1小时。然后将BSC-1细胞接种到微板上，孵化1小时。加DMEM(不含血清)加入到每个孔，37℃孵化1小时。最后，稀释抗血清能够防止轮状病毒细胞病变效应(CPE)发生的浓度为中和滴度。多糖对照组血清用作阴性对照。实验结果见表4。

表4：肺炎球菌缀合疫苗注射小白鼠抗体中和轮状病毒Wa毒株试验结果

如表3所示，肺炎球菌缀合疫苗中和轮状病毒效果明显优于对比例1和对比例2，可显著诱导轮状病毒抗体产生。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种肺炎球菌缀合疫苗，其特征在于：所述肺炎球菌缀合疫苗为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的肺炎球菌缀合疫苗，其中：

连接体为磁性纳米微球，所述磁性纳米微球的磁性微粒位于磁性纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部；

所述多价肺炎球菌多糖为多种肺炎球菌荚膜多糖；

所述载体蛋白选自重组人轮状病毒蛋白和肺炎球菌表面蛋白A；

磁性微粒为Fe₃O₄，磁性纳米微球粒径为0.1-10μm；

高分子材料为聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)；

多价肺炎球菌多糖为分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F；

多价肺炎球菌多糖与两种载体蛋白的质量比为(0.5～2)：1。

2.根据权利要求1所述的肺炎球菌缀合疫苗，其特征在于：重组人轮状病毒蛋白为P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

3.权利要求1～2任一所述肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：将多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白分别与磁性纳米微球经偶联而成。

4.根据权利要求3所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；

b)分别制备并分离提纯所选用的多种载体蛋白；

e)分离纯化步骤d)所得偶联体成所述肺炎球菌缀合疫苗原液。

5.根据权利要求3所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；

b)分别分离提纯所选用的多种载体蛋白；

c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微球偶联体，再经化学改性，从而将所述多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性为-CHO；

e)分离纯化步骤d)所得偶联体成所述肺炎球菌缀合疫苗原液。

6.根据权利要求3所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：还包括制备磁性纳米微球，包括先制备磁性微粒再制备磁性纳米微球的过程；其中磁性微粒可通过化学共沉淀法、水热法或溶胶法热解法制备，磁性纳米微球可通过包埋法、单体聚合法或原位法制备。

7.根据权利要求3所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：采用化学共沉淀法制备磁性微粒再将磁性微粒与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃取法和/或包埋法或单体聚合法制备磁性纳米微球。

8.根据权利要求3所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：采用化学共沉淀法制备磁性微粒再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃取法和/或包埋法制备粒径均一的磁性纳米微球。

9.根据权利要求6所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：其中磁性微粒为Fe3O4。

10.根据权利要求4或5所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：步骤c的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，室温下、pH4.0-9.0下，将步骤a所得多糖与磁性纳米微球共反应6-24小时得多糖-磁性纳米微球偶联体，再通过25％戊二醛对其进行进一步改性，使得多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性为-CHO。

11.根据权利要求10所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：反应时间为12-16小时。

12.根据权利要求4或5所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：步骤d的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，4℃、pH4.0-9.0下，将步骤c所得经化学改性的多糖-磁性纳米微球偶联体与载体蛋白共反应12-24小时。

13.根据权利要求12所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：反应时间为24小时。

14.根据权利要求10或12所述的肺炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：偶联介质为PB、PBS或TBS。