发明内容
本发明要解决的第一个技术问题为提出一种细菌多糖-蛋白结合疫苗。
本发明要解决的第二个技术问题为提出一种编码本发明所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列。
本发明要解决的第三个技术问题为提出一种本发明所述重组轮状病毒蛋白表达系统。
本发明要解决的第四个技术问题为提出本发明重组蛋白表达系统所表达的蛋白,
本发明要解决的第五个技术问题为提出这种结合疫苗的制备方法。
本发明要解决的第六个技术问题为提出这种结合疫苗的制剂。
本发明要解决的第七个技术问题为提出这种结合疫苗的一种多价肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗。
为了完成本发明之目的,采用的技术方案为:
本发明涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗,所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗中的蛋白为具有免疫原性的重组轮状病毒蛋白。
本发明的第一优选方案为:所述的细菌多糖以共价键与重组轮状病毒蛋白相连接。
本发明的第二优选方案为:所述的作为结合疫苗载体的重组轮状病毒蛋白是P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
本发明的第三优选方案为:所述的作为结合疫苗载体的重组轮状病毒蛋白基因是选自P基因型轮状病毒毒株P[8],P[4],P[6]或P[11]中的至少一种;其中,P基因型轮状病毒毒株选自P[8]G1,P[4]G2,P[8]G3,P[8]G4,P[8]G9,P[8]G5或P[6]G8中的至少一种。
本发明的第四优选方案为:所述重组轮状病毒蛋白选自VP8,VP4,VP8多肽链片段,核VP8,VP4多肽链片段,VP8特异性抗原簇肽链,VP4特异性抗原簇肽链中的至少一种。
本发明的第五优选方案为:所述的P基因型P[8]的轮状病毒毒株选自Wa,Ku,P,YO,MO,VA70,D,AU32,CH-32,CH-55,CHW2,CH927A,W161,F45,Ai-75,Hochi,Hosokawa,BR1054,WT78或WI79毒株中的至少一种。
本发明的第六优选方案为:所述的P基因型P[4]的轮状病毒毒株选自DS-1,RV-5,S2,L26,KUN,E210,CHW17,AU64,107E18,MW333或TB-Chen毒株中的至少一种。
本发明的第七优选方案为:所述的P基因型P[6]的轮状病毒毒株选自M37,1076,RV-3,ST3,SC2,BrB,McN13,US1205,MW023,US585或AU19毒株中的至少一种。
本发明的第八优选方案为:所述的重组轮状病毒蛋白是G血清型轮状病毒的VP7蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
本发明的第九优选方案为:所述的G血清型轮状病毒毒株选自G1,G2,G3,G4,G9,G5,G8,G10或G11血清型中的至少一种。
本发明的第十优选方案为:所述G血清型轮状病毒毒株选自P[8]G1,P[4]G2,P[8]G3,P[8]G4,P[8]G9,P[8]G5或P[6]G8血清型中的至少一种。
本发明的第十一优选方案为:所述的细菌多糖选自革兰氏阳性菌荚膜多糖,革兰氏阴性菌O-特异性多糖,革兰氏阳性菌荚膜多糖片段,革兰氏阳性菌荚膜寡聚糖中的至少一种。
本发明的第十二优选方案为:所述的革兰氏阳性菌荚膜多糖选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F,流行性嗜血杆菌b型,脑膜炎球菌A、C、Y或W135群细菌中的至少一种。
本发明的第十三优选方案为:所述的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌O157、伤寒杆菌、副伤寒杆菌或霍乱弧菌细菌中的至少一种。
本发明还涉及一种编码本发明所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及一种重组表达系统,所述的重组蛋白表达系统中含有所述的重组轮状病毒蛋白核苷酸序列。
本发明的又一优选方案为:所述的重组蛋白表达系统选自大肠杆菌表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、CHO细胞表达系统或酵母表达系统。
本发明还涉及所述重组蛋白表达系统表达的蛋白,所表达的蛋白含有P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列或G基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
本发明的又一优选方案为,本发明重组蛋白表达系统所表达的蛋白为轮状病毒非结构性蛋白NSP4与P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列或G基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列所构成的融合蛋白。优先选择的是NSP4-VP8,或NSP4-VP7。
本发明还涉及细菌多糖-蛋白结合疫苗的制备方法,所述的细菌多糖和轮状病毒蛋白在水溶液或有机溶剂通过化学合成反应得到结合物。
本发明的又一优选方案为,所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
本发明的再一优选方案为,所述的化学合成反应选自还原胺法、己二酰二肼法或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。
本发明的制备方法还包括细菌多糖的前处理、重组轮状病毒蛋白的表达和纯化以及对结合物的纯化。
其中,所述的细菌多糖的前处理包括降解和活化,所述的降解方法选自酸水解法、碱水解法、超声法、酶消化法或微射流法,优选微射流法。
本发明还涉及所述的细菌多糖-蛋白结合疫苗的制剂,所述的具有免疫原性的结合疫苗为冻干剂或水剂,其中,所述的结合疫苗中含有佐剂。
本发明的又一优选方案为,所述的佐剂是氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝混合物中的至少一种。
本发明还涉及一种肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗,所述的重组轮状病毒蛋白选自P[8]毒株中的至少一种、P[4]毒株的至少一种或P[6]毒株中的至少一种,肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F中的至少一种;其中P[8]毒株选自Wa、Ku、P、YO、MO、VA70、D、AU32、CH-32、CH-55、CHW2、CH927A、W161、F45、Ai-75、Hochi,Hosokawa,BR1054,WT78或WI79;P[4]毒株选自DS-1、RV-5、S2、L26、KUN、E210、CHW17、AU64、107E18、MW333或TB-Chen;P[6]毒株选自M37、1076、RV-3、ST3、SC2、BrB、McN13、US1205、MW023、US585或AU19。
本发明的又一优选方案为,所述肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗,其中,所述的重组轮状病毒蛋白选自P[8]毒株的至少一种、P[4]毒株中的至少一种或P[6]毒株中的至少一种;所述的肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F中的至少一种,其中,优选其中的8~15种,更优选10~15种。
本发明的又一优选方案为,所述的重组轮状病毒蛋白为由Wa毒株、DS-1毒株和M37毒株构成混合载体的多价疫苗。
本发明的再一优选方案为,所述的重组轮状病毒蛋白为Wa毒株和DS-1毒株构成的混合载体的多价疫苗。
本发明还提供了一个配制具有免疫原性的细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗的制剂和试验方法,用于小白鼠试验。
本发明最后提供了检测细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗在动物体上免疫效果的方法,包括ELISA抗体滴度和中和抗体滴度的检测。
为了更进一步解释和说明本发明,下面对本发明进行详述。
本发明提出一种将细菌多糖与重组轮状病毒蛋白以共价键形式连接而合成的结合疫苗,能够诱导机体同时产生两种保护性抗体,即针对于细菌多糖的抗体和针对于轮状病毒表面蛋白的抗体,达到接种一种疫苗预防两类疾病的临床效果。该发明不仅仅限于合成单价结合疫苗,同样适用于合成多价结合疫苗。目的是制备一种新颖的细菌多糖-蛋白结合疫苗,用于合成的多糖是纯化的细菌多糖,蛋白载体是基因重组的轮状病毒表面蛋白,将这两个生物大分子用化学合成反应以共价键连接后制成的具有免疫原性结合疫苗,在接种人体后,能够产生具有保护性的抗细菌同时也抗轮状病毒感染的抗体,达到接种一种结合疫苗能够预防同时两种传染病的结果。
本发明另外还设计制备了一种细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗,其轮状病毒蛋白载体是非全长的,经过剪切的VP8多肽链,称作核VP8,含有160个氨基酸序列,蛋白基因的来源可以是P血清型中的P1A[8]、P1B[4]或者P2A[6]中的任何一个毒株。
本发明提供了合成细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗的方法,用有机溶剂DMOS作为结合反应的溶剂,合成了肺炎球菌19F血清型多糖-轮状病毒VP8蛋白结合疫苗。
轮状病毒由一个11个分段式双股RNA基因、无囊膜,多层壳蛋白组成的病毒颗粒。这11个基因片段中,6个是为结构蛋白编码,5个是为非结构蛋白编码。这6个结构蛋白排列成3个包裹病毒基因的同心圆层。最外层是由2个蛋白组成,即能够分别刺激机体产生中和轮状病毒抗体的VP7和VP4。VP7是一个分子量为34kDa的糖蛋白,占总病毒蛋白的30%,组成了病毒光滑的外壳,是决定病毒特异性G血清型的蛋白。VP4构成了一些从VP7蛋白壳向外的突刺,其整个分子含有两个分离的末梢区域,一个中间体,和插入到VP7层的一个内球体区域的独特结构,组成了病毒外壳的小部分。VP4是一种非糖蛋白,分子量为88kDa,占病毒蛋白总量的1.5%,是决定病毒的P血清型的蛋白。研究表明,轮状病毒的VP4蛋白具有几个重要的功能,包括粘附细胞受体,进入宿主细胞,产生溶血,刺激机体产生中和抗体,致病性等。用胰蛋白酶消化后,VP4被切成2个连接于病毒体的多肽片段,一个是60-kDa的C-末端片段VP5,该片段含有帮助病毒穿透细胞膜区域,包含有VP4的中间体和内球体的结构区域;另一个是28-kDa的N-末端片段VP8,该片段含有溶血区域,位于VP4的突出末梢球形区域。蛋白酶切后能够稳定突刺结构,通过提高病毒穿透细胞的能力而大大地增强轮状病毒的感染性。
VP8亚单位在病毒的传染性和刺激机体产生中和抗体上具有重要的作用。研究动物和人类轮状病毒发现,在VP4上都有8个中和性抗原簇,其中5个在VP8片段上,而且轮状病毒特异性抗原簇,或有限混合型中和抗原簇坐落在VP4蛋白的VP8多肽片段上。这些发现表明,VP8亚单位具有轮状病毒的P血清型特异性抗原簇,也含有其它毒株VP8交叉反应的抗原决定簇。当用VP8单克隆抗体中和VP8时,不仅抑制了病毒粘附细胞的能力,也能够使得已经粘附于细胞表面的病毒脱落,在体外实验表明,VP8单克隆抗体能够中和病毒。由此可见,轮状病毒VP8蛋白在病毒免疫学上的重要性,能够刺激机体产生针对于轮状病毒的特异性中和抗体,具有免疫原性可作为疫苗来开发。
通过CD分析重组Wa毒株VP8二级结构表明,VP8有少量的α-螺旋(α-helix)结构,但有大量的β-折叠(β-sheet)结构;用病毒的VP8蛋白结构的研究证明,VP8是由11个被环结构(loop)分离的β-折叠结构,侧面链接着2个小的α-螺旋组成。以上的结构表明,重组表达的VP8蛋白的结构和病毒原始蛋白的结构相似。
由于缺乏区别不同VP4血清型分型血清或单克隆抗体,阻碍了VP4的血清型分型。作为替代,VP4主要是根据核酸序列来进行分类。目前已经证明至少有26个不同的VP4基因型。与VP7进行G型分类不同的是,其基因型和血清型的相关性已经确认,但是VP4的两者关联性不明确,尽管VP8区域氨基酸71-204的变异性已经用以决定P特异性型的抗原簇。从免疫学角度来说,用P基因型分类来作为免疫反应结果的判定标准是不正确的;也就是说,分类在同一基因型组的毒株,尽管基因序列相近,但是,可能没有明确的交叉免疫反应;同样的,分类在不同的基因型组内的毒株,尽管基因序列差异较大,但是,可能有明显的交叉免疫反应,这就给选择具有代表性用于疫苗开发的毒株带来了困难。本发明的目的是开发疫苗,需要选择的病毒蛋白具有的抗原簇产生的保护性抗体具有广泛的交叉反应的功能。现将主要的人类轮状病毒的毒株基因型分类列入表2。
表2:A型轮状病毒VP4[P]基因型和血清型表
表中可见,对人类致病的轮状病毒的P基因型毒株主要集中在P[8],其次是P[4],而P[6]较少。与已经明确了的P血清型共同来分类后,流行病学统计数据表明,P1A[8]株最常见,包括了Wa、KU、P、YO、MO、VA70、Hochi、Hosokawa、W161和F45毒株,这些毒株都具有P[8]基因型和P1A血清亚型(见表2),免疫学试验表明,其中的Wa或KU毒株基因重组VP8产生的抗体与该组内的其他毒株有明显的免疫交叉反应;其次常见的毒株是P1B[4]株,DS-1、S2、RV-5和L26属于该组,较少见的P2[6]。
以上分析得出结论,P血清型的P[8]组中的Wa,其基因型为P1A[8]的VP8的抗原簇,和P[4]中的DS-1,其基因型为P1B[4]的VP8的抗原簇产生的抗体覆盖率可达88.5%。本发明选择这两个VP8病毒蛋白作为多价细菌-蛋白结合疫苗载体,以达到一种疫苗可同时预防两种疾病,即细菌性感染(根据多糖来源的不同而定,比如肺炎球菌导致的肺炎和脑膜炎、流行性嗜血杆菌b型导致的脑膜炎、或脑膜炎球菌导致的脑膜炎等)和轮状病毒的感染。
本发明首选基因重组P[8]基因型毒株的全长(full-length)VP8病毒蛋白来作为蛋白载体合成多糖结合疫苗,VP8核酸序列的模板可为P血清型分类中的P1A[8]中任何一个毒株,包括Wa、KU、P、YO、MO、VA70、Hochi、Hosokawa、W161和F45毒株;也可选择P血清型分类中的P1B[4]中的任何一个毒株,包括DS-1、S2、RV-5和L26毒株;也可是P血清型分类中的P2A[6]中的任何一个毒株,如M37、1076、MeN、RV-3和ST3。本发明优先使用各个P血清型分类中代表性毒株的VP8蛋白作为重组蛋白载体,毒株包括P1A[8]的Wa、P1B[4]的DS-1和P2A[6]中的M37。这三个VP8重组蛋白可以通过结合反应分别连接到不同的细菌多糖(如流行性嗜血杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌、伤寒、副伤寒、霍乱或痢疾等)或者血清型多糖(如肺炎球菌)上来合成不同的单价多糖蛋白结合疫苗,然后根据流行病学资料,进行不同组份地混合,最终配制成不同制剂的多价多糖蛋白结合疫苗,比如,配制10价肺炎球菌多糖结合疫苗时,可用这三种蛋白作为载体,分别连接到不同的血清型多糖上,然后混合配制成含有三种轮状病毒VP8蛋白的多价肺炎结合疫苗。这种方法配制的优点是,控制了任何一种载体蛋白的总含量,以避免多价结合疫苗中一种载体蛋白含量过高造成的对多糖免疫原性的抑制效应;同时,也能够增加该疫苗预防轮状病毒感染的覆盖率。如果是合成单价多糖结合疫苗,优先选择的是用Wa毒株的VP8作为蛋白载体,因为从预防轮状病毒感染的角度来看,Wa或KU毒株P1A[8]的P血清型流行的范围更广泛。
不同毒株的基因重组VP8蛋白的核酸序列长短有差异,表达后的氨基酸序列长短在240~250之间,涵盖了VP8所有的抗原决定簇。VP8病毒蛋白是轮状病毒的壳蛋白,属于结构蛋白,全长VP8蛋白在水溶液中的可溶性差,造成在多糖蛋白结合疫苗的合成反应中结合物产量低;而且,不同毒株VP8在水溶液中的可溶性也有差别。通过选择性地克隆不同长度的VP8多肽链的片段,可以提高剪切后的VP8蛋白在水溶液中的可溶性。VP8的剪切点可以在蛋白的N-末端,或C-末端,也可以同时两个末端进行剪切。本发明优先选择的是在N-末端和C-末端同时剪切,即N-末端在64位前,和C-末端的223位以后进行剪切,得到的剪切后VP8蛋白有160氨基酸,试验证明,这一多肽片段是轮状病毒吸附于宿主细胞受体的区域,宿主细胞表面唾液酸(sialic acid)被认为是VP8蛋白吸附的受体成分,尽管唾液酸并不是必需不可少的成分。VP8蛋白这一多肽片段被称作核VP8(Core VP8)。
为了增强VP8蛋白或核VP8蛋白的免疫原性或水可溶性,可用基因重组VP8-蛋白质的融合蛋白来作为结合疫苗的蛋白载体,这种融合蛋白的功能有两方面,一方面增加蛋白的水溶性,便于进行结合反应;另一方面增加载体蛋白上有效保护性抗体的抗原簇的品种和数量。本发明优先考虑的是VP8-NSP4。轮状病毒的非结构性蛋白4(Non-structural protein 4,NSP4)是一种轮状病毒感染的宿主细胞分泌出来的一种肠毒素(enterotoxin)。这种融合蛋白载体刺激机体产生的抗体具有更广泛的保护作用,同时,也能够增强VP8蛋白的可溶性。另外,VP8-破伤风变异无毒类毒素、VP8-白喉变异无毒类毒素(如VP8-CRM197)或VP8-霍乱变异无毒类毒素制成的融合蛋白也能够增强VP8蛋白的可溶性。另外,VP8也可以和其它轮状病毒蛋白,如VP7、VP6或VP7的抗原簇多肽链片段形成重组融合蛋白来用作结合疫苗载体。
重组VP8蛋白的表达系统,本发明优先采用高表达质粒构建的E.coli表达系统,如用ρET28-BL21 DE3表达系统。但也可采用任何商业或自行构建的表达系统,包括哺乳动物细胞表达系统,如CHO细胞表达系统、杆状病毒-昆虫细胞表达系统;细菌表达系统,如E.coli细菌表达系统;酵母表达系统,如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统等。
轮状病毒VP4蛋白,其包含了VP8的所有抗原簇的多肽链,也可以通过基因重组方法进行制备,作为蛋白载体来合成结合疫苗。其基因克隆模板的来源和方式和上述的VP8相似,包括毒株的基因模板、融合蛋白的设计、表达系统的选择等。
本发明也可通过基因重组的方法来克隆、表达轮状病毒的G血清型决定蛋白VP7,作为多糖结合疫苗的载体使用,合成出的结合疫苗和含VP8载体蛋白的结合疫苗有相同的功效。由于VP7是一种糖蛋白,抗原决定簇的结构较为复杂,表达出来的蛋白的水溶性和免疫原性较差;为了克服这一困难,可以通过基因重组的方法来合成VP7多肽链上的抗原决定簇多肽链的融合蛋白,如VP8-VP7融合蛋白,来作为载体,以提够结合疫苗中蛋白载体的免疫覆盖率。
结合疫苗中的细菌多糖是纯化过的革兰氏性菌的荚膜多糖、革兰氏阴性菌的O-特异性多糖以及荚膜多糖的降解多糖片段。多糖来源的细菌是根据最终合成结合疫苗的品种来决定,如多价肺炎多糖结合疫苗可用纯化的肺炎球菌荚膜多糖,流行性嗜血杆菌b型多糖结合疫苗可用纯化的荚膜多糖PRP,脑膜炎球菌多糖结合疫苗可用纯化的其各群,如A、C、Y或W135荚膜多糖,伤寒多糖结合疫苗可用纯化的Vi多糖,E.coli O157、副伤寒多糖结合疫苗可用其O-特异性多糖。
将载体蛋白与细菌多糖共价键地连接的合成方法有多种。常用的方法有直接连接法、ADH法、还原胺法、巯基化学法等,具体的每个结合疫苗的合成需要根据蛋白载体和多糖的化学特性来选择。这些大分子在溶剂中的可溶性也是需要考虑到的问题,有些VP8蛋白,特别是全长VP8蛋白在水中无法溶解,而无法完成结合反应,需要在有机溶剂中来完成,常用的有机溶剂有DMSO(dimethylsulfoxide)、DMF。对于无法溶于水溶液的蛋白载体,本发明优先选择DMSO作为反应溶剂。
细菌多糖-重组轮状病毒结合疫苗的合成可分为四个阶段:
1、细菌多糖前处理:
细菌的不同,多糖的化学结构和特性有很大的差异,有些多糖在合成前需要进行前处理,处理的方法根据合成方法的不同有所不同,如果多糖的物理形状比较粘稠,直接用于合成后形成的结合物易于沉淀,需要进行适当的降解(depolymerization),来降低多糖的粘度。降解多糖的方法有酸水解法、碱水解法、超声法、酶消化法或微射流(microfluidization)法,本发明优先选择微射流法来进行物理降解多糖。如果是用还原胺法进行合成,多糖需要进行活化,本发明优先选择使用高碘酸钠,通过氧化多糖来引入醛基来活化多糖。如果用ADH法,则可用溴化氰或CDAP,将连接物ADH引入到多糖上来衍化多糖。
2、结合:
结合反应的溶剂需根据多糖和轮状病毒蛋白(全长VP8、核VP8、VP4或VP8融合蛋白)溶解特性进行选择,包括水溶液,缓冲溶液,有机溶剂DMSO、DMF等。如果用还原胺法进行合成,可加入还原剂氰基硼酸化钠。如果是用ADH法,可加入EDC,通过衍化的多糖上hydrazide基团和轮状病毒蛋白上的COOH基团反应形成共价键。或者通过加入EDC,通过多糖上的COOH基团与轮状病毒蛋白上的氨基反应形成共价键而将多糖和蛋白载体直接连接。其中,细菌多糖与轮状蛋白载体的物质的量的比为,1∶2~2∶1,其中优选为0.8∶1~1∶0.8,更优选为0.9∶1~1∶0.9。
3、结合物纯化:
制备结合疫苗需要将结合物和未反应的多糖和蛋白载体分离纯化,纯化方法可用层析法或超滤法。层析法优选采用Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B进行;而超滤法是采用不同滞留分子量膜来分离结合物和未反应物。
4、制剂:
结合疫苗制剂可采用水剂或冻干剂。为了增强其免疫原性,可加入佐剂,常用的佐剂有铝佐剂,如氢氧化铝、磷酸铝,本发明优先选择磷酸铝。结合物的溶剂可为0.2氯化钠溶液、1×PBS缓冲液或其它能够稳定多糖或者结合物的缓冲液。本发明的细菌多糖-蛋白结合疫苗的制备方法采用本技术领域的常规手段制备。其中,优选在糖(例如蔗糖或乳糖)存在下冻干。另外优选将其冻干,在林永前复原。冻干处理可是组合物疫苗更加稳定。
根据结合疫苗的用途的不同,可以配制成单价疫苗,如Hib多糖-轮状病毒VP8结合疫苗、伤寒Vi多糖-轮状病毒VP8结合疫苗。也可配置成多价肺炎球菌结合疫苗,如10价肺炎多糖-轮状病毒蛋白(WaVP8蛋白,DS-1蛋白和M37蛋白混合)载体结合疫苗。
本发明还提供疫苗盒,该疫苗包括装有本发明细菌多糖-蛋白结合疫苗(任选为冻干形式)的小瓶,还包括装有本发明所述佐剂的小瓶。在使用过程中,佐剂用来将冻干的疫苗复原成溶液的形式。
本发明的细菌多糖-蛋白结合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫,包括真皮层或皮肤给药、肌肉给药等形式。其中,所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。
本发明中的重组蛋白氨基酸序列为:
其中,SEQ ID NO:1为毒株Wa的VP8的氨基酸的序列;
SEQ ID NO:2为毒株Wa的核VP8的氨基酸的核序列;
SEQ ID NO:3为毒株DS1的VP8的氨基酸序列;
SEQ ID NO:4为毒株DS1的核VP8的氨基酸的核序列;
SEQ ID NO:5为毒株M37的VP8的氨基酸序列;
SEQ ID NO:6为毒株M37的核VP8的氨基酸的核序列;
SEQ ID NO:7为毒株Wa的VP4的氨基酸序列;
SEQ ID NO:8为毒株DS1的VP4的氨基酸序列;
SEQ ID NO:9为毒株M37的VP8的氨基酸序列;
SEQ ID NO:10为毒株Wa的VP7的氨基酸序列;
SEQ ID NO:11为毒株DS1的VP7的氨基酸序列;
SEQ ID NO:12为毒株M37的VP7的氨基酸序列;
SEQ ID NO:13为编码VP7基因型的核苷酸序列。
具体实施方式
术语定义
核VP8:是轮状病毒蛋白VP8中的一段具有和细胞表面含有唾液酸(sialic acid)粘合功能的多肽链,通常含有160氨基酸残基。
VP8多肽链片段:为任何分子量低于全长VP8的多肽链。
VP4多肽链片段:为任何分子量低于全长VP4的多肽链。
VP8特异性抗原簇链:全VP8多肽链含有多个抗原决定簇,通过基因重组的方法剪切去不含重要的氨基酸,而保留含有特异性抗原簇的多肽链,分子量通常小于全长VP8多肽链。
VP4特异性抗原簇链:全VP4多肽链含有多个抗原决定簇,通过基因重组的方法剪切去不含重要的氨基酸,而保留含有特异性抗原簇的多肽链,分子量通常小于全长VP4多肽链。
VP8融合蛋白:用基因重组方法,将VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽链融合表达,以提高VP8在水溶液中的可溶性;或增强VP8的免疫原性。
NSP4蛋白:是非结构性蛋白,具有肠毒素特性,分子量为28kDa,含有175个氨基酸。
VP8-NSP4融合蛋白:用基因重组的方法,将VP8和NSP4多肽链融合表达,以提高VP8在水溶液中的可溶性,同时使得融合蛋白具有刺激机体产生抗NSP4的保护性抗体。
荚膜多糖片段:通过物理(如超声波、微粒喷雾)、化学(如酸、碱、酶消化)等方法将由细菌培养液中纯化的多糖(称全多糖或原始多糖)降解(depolymerization)所获得的多糖片段,分子量通常低于原始多糖。荚膜寡聚糖:通过物理(如超声波、微粒喷雾)、化学(如酸、碱、酶消化)等方法将由细菌培养液中纯化的多糖(称全多糖或原始多糖)降解(depolymerization)所获得的多糖片段,分子结构中的单糖残基通常低于10。不过单糖残基数量的定义有差异,有些文献将多于10个少于20个单糖残基的多糖链也成为寡聚糖。
以下是一些举例本发明的实施方法,包括轮状病毒蛋白的克隆和纯化,细菌多糖-轮状病毒蛋白VP8结合物的合成和动物实验的检验。不过这并不表明本发明所包括的结合疫苗的合成和制备仅仅限制于这些方法,其它任何以重组轮状病毒蛋白为载体来合成细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备的方法都属于本发明保护的范围。
实施例1 建立轮状病毒的cDNA库
人类轮状病毒Wa毒株(2018-VR,ATCC)在加有1μg/ml胰蛋白酶的MA104细胞(猴胚胎肾细胞)中,温度36℃扩增1至2天。低速离心去除细胞碎片,加入羟磷灰石(hydroxyapatite,HA)至上清液中纯化病毒RNA。具体步骤为:600μl的6M异硫氰酸胍(GITC)溶液加入到400μl的培养上清液中,混匀。然后加入50μl(两滴)HA悬浮液,室温下上下颠倒混合试管或在震荡器上放置20分钟以便将核酸吸附到HA上。以13,000g离心1分钟,丢弃上清液。用1ml的10mM磷酸钾pH6.8洗RNA-HA两次。加入40μl的200mM磷酸钾pH6.8溶液从HA结晶上洗脱RNA,以13000g离心3分钟收集纯化的RNA。立即进行反转录-聚合酶链式反应,将样品溶液保存在-20℃。
为了扩增编码有Wa毒株VP8蛋白的VP4基因,引物设计如下:sense引物HWaVP4ρET28:5’-TTACATATGGCTTCGCTCATTTATAG-3’,anti-sense引物AHWaVP4ρET28:
5’-CCGGATCCCTAGTCTTCATTAACTTGTGCT-3’。
用Super Script One-Step RT-PCR系统,含有Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒进行RT-PCR扩增。
具体步骤如下:8μl纯化的RNA加入到加有4μl的DMSO,2μl的20mMHWaVP4ρET28和AHWaVP4ρET28引物的0.2-ml试管,在94℃加热2分钟,冰浴上退火。然后加入86μl的含有0.2mM各种dNTP,1.5mM的MgCl2和2μl的反转录酶和Taq酶反应混合溶液。在PCR仪上进行如下条件的反应:42℃孵化60分钟,然后进入35个周期的PCR反应,94℃30秒,42℃50秒,72℃70秒,最后72℃孵化7分钟。在GFX柱上纯化RT-PCR扩增产物。
用直接连接方法将PCR产物引入到pGEM-T Easy的载体。将构建的扩增质粒转化入到Competent细胞E.coli Top10里。用Wizard SV Mini prep DNA,选择阳性的转化菌落,在LB培养基中扩增细菌,收集细菌体,纯化系统重组DNA质粒。该含有VP8蛋白表达序列的质粒称为pGEM-TWaVP8,将质粒保存于-20℃。
实施例2构建pET28aWaVP8表达全长VP8质粒
用核酸限制性内切酶NdeI和BamHI来消化实施例1制得的pGEM-TWaVP8,以获得VP8基因插入序列。同样用核酸限制性内切酶NdeI和BamHI来消化载体pET28a(+)。加入10μg的VP8基因插入序列,T4 DNA连接酶和切过的pET28a(+)于试管中,在16℃反应过夜。该构建完成的质粒称为pET28aWaVP8。该质粒表达出来的蛋白含有6-组氨酸标记(hexa-histidine tag,6×His-Tag),和在5′末端有凝血酶识别位点(thrombin recognition site)。
将pET28aWaVP8质粒转化入competent细胞E.coli TOP10中,该克隆在有50μg/ml的卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基皿筛选pET28aWaVP8阳性菌落。接种于LB培养液中进行扩增,保存表达菌种-20℃以下,同时从细菌中提取ρET28aWaVP8质粒,证实VP8的核酸序列(SEQ ID NO:1)。
实施例3表达重组VP8蛋白
1.将实施例2制得的pET28aWaVP8质粒转化入BL21(DE3)competent细胞中,接种细胞到50μg/ml卡那霉素LB培养皿,在37℃下于CO2培养箱内过夜。
2.挑选出一个菌落,接种到10毫升含有50μg/ml的卡那霉素LB培养液(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH 7.5)中扩增,在37℃培养过夜。
3.将培养液转接种到100毫升的50μg/ml卡那霉素LB培养液,继续培养。待吸光度600nm的OD到达1.0时,将培养液转接种到6升到50μg/ml卡那霉素LB培养液中,继续在37℃,摇速200rpm的摇床内培养,待吸光度600nm的OD到达0.6~0.8时,加入0.3mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导VP8表达。
4.在相同的培养条件下,诱导4小时后,以4000g下,在10℃离心20分钟后,收集菌体。
5.将细菌悬浮于20ml的1×PBS溶液,用法式压滤壶(French press)破碎细菌后,在10000g下,在10℃离心30分钟,丢弃上清液,收集沉淀的包涵体。在进一步纯化前,存储包涵体于-40℃。
实施例4从包涵体中纯化VP8蛋白
1.称取实施例3制备的VP8包涵体0.5克(湿重),用清洗缓冲液(10mM Tris,100mM磷酸盐缓冲液,2M urea,pH 8.0)悬浮包涵体,在室温下孵育30分钟,以10,000g离心10分钟,收集包涵体。重复以上步骤三次除去污染的杂蛋白。
2.将包涵体沉淀溶于溶解缓冲液(10mM Tris-HCl,100mM磷酸盐缓冲液,8M尿素,pH 8.0,简称缓冲液B)中,在冰上搅拌孵育1小时。以16,000g离心30分钟,收集上清液,丢弃不溶沉淀物。
3.用固定金属离子亲和层析色谱法(IMAC)纯化His-tagged重组VP8蛋白。
具体方法为:将螯合Sepharose FF胶预先在0.1M的NiSO4溶液中,在室温下混合平衡,摇动数次,使得Ni2+螯合在胶上后,用去离子水清洗Ni-Sepharose两次,除去未螯合的Ni2+离子。将胶悬浮于缓冲液B中,装柱制成IMAC柱。用缓冲液B预先平衡柱,然后将溶有VP8蛋白的缓冲液B上柱,室温下,待溶液在柱上平衡30分钟使得重组VP8蛋白中的His-tag与Ni离子吸附。用缓冲液B洗柱,以含有10mM的imidazole缓冲液B洗柱。进一步用缓冲液C(10mM Tris-HCl,100mM磷酸盐缓冲液,8M尿素,pH 6.3)洗柱。然后用洗脱缓冲液(含有100mM EDTA,2mM β-巯基乙醇和缓冲液B)洗脱VP8蛋白。
4.收集含有VP8的洗脱液,转入透析袋中在含有20mM β-巯基乙醇1和8M尿素的TBS(pH 4.0)中透析,并逐渐降低尿素的浓度(即8,6,4,2,和1M),在4℃中透析过夜。然后在含有2mM β-巯基乙醇的TBS pH 5.5溶液中透析两次,最后在TBS溶液中透析。根据重组VP8蛋白来源的毒株不同,来进行最后透析。
实施例5肺炎球菌血清型19F发酵和荚膜多糖纯化
1.从存放肺炎球菌血清型19F工作种子批的低温冰箱里取出一个工作种子批菌种管,在室温下解冻后接种到平皿培养基上,在36℃培养箱中过夜。
2.接种一个菌落与5毫升的新鲜培养液中,过夜至生长指数期,转接种于45毫升新鲜培养液,在摇床培养箱中,以300rpm,36℃培养18-20小时。
3.将处于指数生产期的培养液转入1升新鲜培养液中,在摇床培养箱中,以300rpm,36℃培养16-18小时。
4.将培养液转入装有20升培养液的150升发酵罐中,开始通入N2气(0.15vvm)。定时加入50%(w/v)葡萄糖溶液3.2升,46.2%(w/v)醋酸胺1.4升和培养液110升,控制pH至7.2。通入空气(0.15vvm),培养了14.5小时后收获多糖。加入福尔马林杀菌,最终浓度为0.5%,培养1小时。
5.用Millipore 0.45μm的微滤膜进行微滤除菌,设备可用Millipore公司的Pellicon Mini超滤系统,收集微滤溶液于20升储液罐。
6.用Millipore公司的0.22μm膜进行超滤,清除可能的颗粒,细胞碎片等,收集超滤液于20升储液罐。以100kDa膜进行超滤浓缩,将溶液浓缩到2升(10×浓缩),收集超滤液于10升储液罐中。
7.用磷酸盐缓冲液,以100kDa膜进行超滤清洗。加入等体积的十六烷基三甲基季铵溴化物(HB)的磷酸盐缓冲液来沉淀多糖,将溶液置于4~8℃环境过夜。
8.将得到的沉淀溶液滤过深层过滤器,使得多糖/HB沉淀截留在过滤器膜上,丢弃过滤液。清洗沉淀物,氯化钠溶液通入深层过滤器,溶解、洗脱过滤器收集溶液于储液罐。加入碘化钠溶液于储液罐中,置储液罐于4℃冷柜中过夜,沉淀溶液中的HB。将沉淀溶液滤过深层过滤器,使得HB/I沉淀截留在过滤器膜上,收集多糖滤液于储液罐中。
9.用0.22μm膜过滤多糖洗脱溶液。用30kDa膜超滤浓缩粗制多糖溶液到2升左右,然后以0.2M NaCl溶液超滤清洗。用磷酸盐缓冲液平衡HA柱。上柱粗制多糖溶液,然后用磷酸盐缓冲液进行洗脱。用0.22μm膜过滤多糖洗脱溶液,用30kDa膜超滤浓缩精制多糖溶液至体积约2升。用0.22μm膜过滤精制多糖溶液。真空冻干,多糖储存于-25±5℃低温冰箱备用。
实施例6合成肺炎球菌血清型19F-WaVP8结合疫苗
1、氧化:
称取实施例5制得的肺炎球菌血清型19F 20mg于反应瓶,加入3.3ml去离子水后,用磁力搅拌溶解,多糖浓度为5mg/ml,调节pH至6.0。加入等当量的高碘酸钠,在4℃下,氧化过夜。将氧化后的多糖溶液转移到透析袋(6~8000分子截留)中,在冷库中用去离子水透析。在更换三次去离子水后,将多糖溶液转入冻干瓶中,真空冻干。
2、合成
(1)还原胺法:称取5mg的氧化过的Pn19F多糖入反应瓶中,加入同等量的实施例4制得的载体蛋白VP8(液体或固体粉末),将反应物溶于0.5ml的去离子水,调节pH至7.0。搅拌混合均匀后,真空冻干。加入1ml的DMSO到反应瓶,搅拌1小时溶解反应物。加入8mM的氰基硼氢化钠入反应瓶。放置培养瓶于室温下反应2天。加入等当量的硼氢化钠于反应瓶,在室温下搅拌3小时终止反应。将反应混合物转入透析袋(6~8000分子截留)在0.2M的NaCl溶液中透析,换三次透析液。以10000rpm离心透析后的反应混合液,收集上清液。将上清液装柱(Sepharose CL-4B)进行纯化。分管收集过柱样品(每管32滴)。
(2)ADH法:该方法可以不用氧化多糖,直接进入合成阶段。称取10mg纯化的Pn19F多糖入反应瓶中,加1ml注射用水溶解多糖。加入CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼)溶液入反应瓶中活化多糖,搅拌溶液后,加入TEA,条件pH至8~9.5。加入1ml的ADH(己二酰肼)溶液,搅拌反应3小时。调节pH至8.0~8.5。将衍化后的多糖转入透析袋中,在水中透析过夜。过Sephadex G-50纯化,收集多糖溶液峰,转入透析袋中透析过夜。真空冻干。称取5毫克衍化后的多糖,加入无菌盐溶液(0.2M NaCl)溶解多糖,调节pH至5.0,加入VP8重组蛋白(粉末或浓溶液),加入适当的无菌盐溶液,最终体积为1ml,搅拌使得蛋白完全溶解和混合。加入EDAC(N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亚胺)试剂,在室温下反应3小时。将反应混合液转入到透析袋中,以0.2M NaCl溶液透析。上Sepharose CL-4B柱进行纯化,收集结合物峰,无菌过滤,4℃下保存。
3、结合物分析:
检测分析过柱后分管收集样品中多糖和VP8蛋白的分布情况。蛋白的测定方法为Lowry法(以牛血清蛋白为标准品),多糖的含量测定方法为酚-硫酸法(以葡萄糖为标准)。结合物在Sepharose CL-4B柱上的分布情况见附图1。根据多糖和蛋白分布结果,收集第一个峰值样品液(25~32管,共17毫升),分析蛋白(Lowry法)和多糖(酚-硫酸法)的总含量。同时分析过柱前离心沉淀物中多糖和蛋白含量,结果如表3:
表3:过柱前离心沉淀物中多糖和蛋白含量
|
过柱后结合物收集溶液 |
过柱前离心沉淀 |
蛋白(VP8) |
92μg/ml |
528μg/ml |
多糖(Pn19F荚膜) |
69μg/ml |
472μg/ml |
结合物溶液中多糖和蛋白的比率为0.76,多糖的回收率为23%,蛋白质的回收率为31%。
用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对结合物进行分析,可见结合物中蛋白VP8分子量变大,广泛的分布于每条样带的上部,这边表明多糖和蛋白载体直接进行了广泛的交叉连接。见图2,其中,从左向右依次为孔1~6,其中,孔1为蛋白分子标记,孔2为重组VP8参照标准,孔3为结合物一、孔4为结合物二,孔5为结合反应1沉淀,孔6为结合反应2沉淀。
用双向免疫扩散试验来验证结合物中VP8的抗原簇是否保存,见图3,其中,1和3为Pn19F荚膜多糖;2、4为多糖-蛋白结合物;5为兔抗Pn19F荚膜多糖抗体;琼脂凝胶浓度为在1×PBS中0.5%。图中可见结合物中的多糖能够与兔抗血清机体形成沉淀反应,荚膜多糖的沉淀线和结合物的沉淀线完全融合,表示经过化学合成反应,多糖的抗原性没有任何变化。
实施例7注射小白鼠检测结合疫苗的免疫原性
取6~8周的NIH/GP小白鼠50只,每支小鼠注射实施例6制备的结合疫苗5微克,注射容量为每支0.1毫升。注射的小鼠分两大组,一组注射液不含佐剂胶状磷酸铝;另一组注射液加入了佐剂胶状磷酸铝,浓度为每支小鼠0.2mg。具体的配制方法见表4,注射程序见表5:
表4:实验用疫苗配制方法
编号 |
组成 |
多糖浓度 |
VP8浓度 |
磷酸铝(佐剂) |
1 |
无佐剂对照组(Pn19F荚膜多糖) |
25μg/ml |
- |
- |
2 |
无佐剂疫苗组(结合疫苗) |
67μg/ml |
50μg/ml |
- |
3 |
含佐剂对照组(Pn19F荚膜多糖) |
25μg/ml |
- |
2mg/ml |
4 |
含佐剂疫苗组(结合疫苗) |
67μg/ml |
50μg/ml |
2mg/ml |
表5:程序注射
疫苗 小白鼠数量 第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周
无佐剂对照组 5 注射 - 注射 - 注射 采血
无佐剂疫苗组
10 注射 采血
(注射一次组)
无佐剂疫苗组
10 注射 注射 采血
(注射二次组)
无佐剂疫苗组
10 注射 注射 注射 采血
(注射三次组)
含佐剂对照组 5 注射 注射 注射 采血
含佐剂疫苗
10 注射 采血
(注射一次组)
含佐剂疫苗
10 注射 注射 采血
(注射二次组)
含佐剂疫苗
10 注射 注射 注射 采血
(注射三次组)
采血后,在室温放置1小时,以10000g离心10分钟,取血清,存储于4℃冰箱内。
实施例8ELISA测定抗体滴度
1、肺炎球菌血清型19F荚膜多糖IgG抗体滴度测定:
配制肺炎球菌血清型19F荚膜多糖储备液1mg/ml(1×PBS溶液中),存储于冰箱。稀释多糖存储液至包被缓冲液(Coating buffer,1%BSA+0.05%Brij35在1×PBS)2μg/ml,加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板(Nunc,96孔Maxisorp Nunc-Immuno板),在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl封闭缓冲液(Blocking buffer,1%BSA在1×PBS),在室温下孵育2小时,用洗板缓冲液洗4次,可在4℃下保存一周。
将实施例7制得的待测血清1∶10稀释成工作样品血清,稀释适当倍数,加入到ELISA板第一排孔内,总体积200μl,从第一排开始向下进行二倍系列稀释,在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1∶2000稀释),在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl磷酸-4-硝基苯酯二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate)底物溶液,在405nm读盘。
2、VP8重组蛋白IgG抗体滴度测定:
用WaVP8参照标准蛋白溶液配制包被缓冲液(Coating buffer)2μg/ml,加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板(Nunc,96孔MaxisorpNunc-Immuno板),在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl封闭缓冲液(Blocking buffer),在室温下孵育2小时,用洗板缓冲液洗4次,可在4℃下保存一周。将实施例7制得的待测血清1∶10稀释成工作样品血清,稀释适当倍数,加入到ELISA板第一排孔内,总体积200μl,从第一排开始向下进行二倍系列稀释,在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1∶2000稀释),在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl磷酸-4-硝基苯酯二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salthexahydrate,1mg/ml)底物溶液,在405nm读盘。
表6:小白鼠抗Pn19F多糖-VP8结合疫苗中的多糖和蛋白IgG抗体滴度结果
实施例9轮状病毒中和试验结果
将实施例7制得的小鼠血清每组(空白多糖对照,结合疫苗注射一针,结合疫苗注射二针和结合疫苗注射三针)的每个小鼠血清各取10微升混合,用于中和试验样品血清。
注射小白鼠产生的抗WaVP8抗体的中和试验在微板(microplate)上用BSC-1细胞进行。将加热灭活血清进行系列稀释后,与100TCID50的Wa轮状病毒毒株混合后,在37℃培养1小时。然后将BSC-1细胞接种到微板上,孵化1小时。加DMEM(不含血清)加入到每个孔,37℃孵化1小时。最后,稀释抗血清能够防止轮状病毒细胞病变效应(CPE)发生的浓度为中和滴度。多糖对照组血清用作阴性对照。实验结果见表7.
表7:结合疫苗注射小白鼠抗体中和轮状病毒Wa毒株试验结果
核苷酸和氨基酸电子序列表
<110>一种细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法
<120>
<160>13
<170>patent version 2.1
<210>1
<211>244
<212>PRT
<213>轮状病毒Wa毒株的VP8
<220>
<400>1
MASIYRQLLT NSYSVDLHDE IEQIGSEKTQ NVTINPSPFA QTRYAPVNWG
HGEINDSTTV EPMLDGPYQP TTFTPPNDYW ILINSNTNGV VYESTNNSDF
WTAVVAIEPH VNPVDRQYTI FGESKQFNVS NDSNKWKFLE MFRSSSQNEF
YNRRTLTSDT RFVGILKYGG RVWTFHGETP RATTDSSSTA NLNNISITIH
SEFYIIPRSQ ESKCNEYINN GLPPIQNTRN VVPLPLSSRS IQYK
<210>2
<211>160
<212>PRT
<213>轮状病毒Wa毒株的核VP8
<220>
<400>2
MLDGPYQPTT FTPPNDYWIL INSNTNGVVY ESTNNSDFWT AVVAIEPHVN
PVDRQYTIFG ESKQFNVSND SNKWKFLEMF RSSSQNEFYN RRTLTSDTRL
VGILKYGGRV WTFHGETPRA TTDSSSTANL NNISITIHSE FYIIPRSQES
KCNEYINNGL
<210>3
<211>280
<212>PRT
<213>轮状病毒DS1毒株的VP8
<220>
<400>3
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GSWEINDSTT VEPVLDGPYQ PTTFKPPNDY WLLISSNTNG VVYESTNNND
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FSNRRTLTSS NRLVGMLKYG GRVWTFHGET PRATTDSSNT ADLNNISIII
HSEFYIIPRS QESKCNEYIN NGLPPIQNTR NVVPLSLSSR SIQYKRAQVN
EDITISKTSL WKEMQYNRDI IIRFKFGNSI
<210>4
<211>160
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<213>轮状病毒DS1毒株的核VP8
<220>
<400>4
VLDGPYQPTT FKPPNDYWLL ISSNTNGVVY ESTNNNDFWT AVSSVEPHVS
QTNRQYILFG ENKQFNVENN SDKWKFFETF TGSSQGNFSN RRTLTSSNRL
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<210>5
<211>289
<212>PRT
<213>轮状病毒M37毒株的VP8
<220>
<400>5
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HKRTLTSDTK LAGFLKHYNS VWTFHGETPH ATTDYSSTSN LSEVETTIHV
EFYIIPRSQE SKCVEYVNTG LPPMQNTRNI VPVALSSRSV TYQRAQVNKD
IIISKASLWK EMQYNRDIII RFKFNNSIVK LGGLGYKWS
<210>6
<211>211
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<213>轮状病毒M37毒株的核VP8
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<400>6
VLDGPYQPTS FKPPSDYWIL LNPTNQQVVL EGTNKIDIWV ALLLVEPNVT
NQSRQYTLFG ETKQITVENN TNKWKFFEMF RSNVSAEFQH KRTLTSDTKL
AGFLKHYNSV WTFHGETPHA TTDYSSTSNL SEVETTIHVE FYIIPRSQES
KCVEYVNTGL PPMQNTRNIV PVALSSRSVT YQRAQVNKDI IISKASLWKE
MQYNRDIIIR F
<210>7
<211>775
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<213>轮状病毒Wa毒株的VP4
<220>
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FWTAVVAIEP HVNPVDRQYT IFGESKQFNV SNDSNKWKFL EMFRSSSQNE
FYNRRTLTSD TRFVGILKYG GRVWTFHGET PRATTDSSST ANLNNISITI
HSEFYIIPRS QESKCNEYIN NGLPPIQNTR NVVPLPLSSR SIQYKRAQVN
EDIIVSKTSL WKEMQYNRDI IIRFKFGNSI VKMGGLGYKW
SEISYKAANY
QYNYLRDGEQ VTAHTTCSVN GVNNFSYNGG FLPTDFGISR YEVIKENSYV
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HSEFYIIPRS QESKCNEYIN NGLPPIQNTR NVVPLSLSSR SIQYKRAQVN
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QYSYSRDGEQ VTAHTTCSVN GVNNFSYNGG SLPTDFSISR YEVIKENSYV
YIDYWDDSKA FRNMVYVRSL AANLNSVKCT GGSYNFRLPV
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TRTINLYGLP AANPNNGNEY YEMSGRFSLI SLVQTNDDYQ TPIMNSVTVR
QDLERQLNDL REEFNSLSQE IAMSQLIDLA LLPLDMFSMF SGIKSTIDLT
KSMATSVMKK FRKSKLATSI SEMTNSLSDA ASSASRSASI RSNLSTISNW
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KTKIDMSTQI GKNTLPDIVT EASEKFIPKR SYRVLKDDEV MEINTEGKFF
AYKVDTLNEI PFDINKFAEL VTDSPVISAI IDFKTLKNLN DNYGITRIEA
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IWIALLLVEP NVTNQSRQYT LFGETKQITV ENNTNKWKFF EMFRKNVSAE
FQHKRTLTSD TKLAGFLKHY NSVWTFHGET PHATTDYSST SNLSEVETVI
HVEFYIIPRS QESKCVEYIN TGLPPMQNTR NIVPVALSSR SVTYQRAQVN
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<210>10
<211>326
<212>PRT
<213>轮状病毒Wa毒株的VP7
<220>
<400>10
MYGIEYTTIL IFLISIILLN YILKSVTRIM DYIIYRFLLI TVALFALTRA
QNYGLNLPIT GSMDAVYTNS TQEEVFLTST LCLYYPTEAS TQINDGDWKD
SLSQMFLTKG WPTGSVYFKE YSNIVDFSVD PQLYCDYNLV LMKYDQSLEL
DMSELADLIL NEWLCNPMDV TLYYYQQSGE SNKWISMGSS CTVKVCPLNT
QTLGIGCQTT NVDSFEMIAE NEKLAIVDVV DGINHKINLT TTTCTIRNCK
KLGPRENVAV IQVGGSNVLD ITADPTTNPQ TERMMRVNWK
KWWQVFYTIV DYINQIVQVM SKRSRSLNSA AFYYRV
<210>11
<211>326
<212>PRT
<213>轮状病毒DS1毒株的VP7
<220>
<400>11
MYGIEYTTIL TILISIILLN YILKTITNTM DYIIFRFLLL IALISPFVRT
QNYGMYLPIT GSLDAVYTNS TSGEPFLTST LCLYYPAEAK NEISDDEWEN
TLSQLFLTKG WPIGSVYFKD YNDINTFSVN PQLYCDYNVV LMRYDNTSEL
DASELADLIL NEWLCNPMDI SLYYYQQSSE SNKWISMGTD CTVKVCPLNT
QTLGIGCKTT DVNTFEIVAS SEKLVITDVV NGVNHKINIS INTCTIRNCN
KLGPRENVAI IQVGGPNALD ITADPTTVPQ VQRIMRINWK KWWQVFYTVV
DYINQVIQVM SKRSRSLDAA AFYYRI
<210>12
<211>326
<212>PRT
<213>轮状病毒M37毒株的VP7
<220>
<400>12
MYGIEYTTIL IFLISVILLN YILKSVTRIM DYIIYRSLLI TVALFALTRA
QNYGLNLPIT GSMDTIYANS TREGIFLTST LCLYYPTEAS TQISDGEWKD
SLSQMFLTKG WPTGSVYFKE YSSIVDFSVD PQLYCDYNLV LMKYDQNLEL
DMSELADLIL NEWLCNPMDI TLYYYQQSGE SNKWISMGSS CTVKVCPLNT
QTLGIGCRTT NVDSFEMVAE NEKLAIVDVV DGINHKINLT TTTCTIRNCK
KLGPRENVAV QVGGSNVLD ITADPTTNPQ TERMMRVNWK
RWWQVFYTIV DYINQIVQVM SKRSRSLNSA AFYYRV
<210>13
<211>1059
<212>DNA
<213>编码轮状病毒VP7的核苷酸
<220>
<400>13
GGCTTTAAAA GAGAGAATTT CCGTCTGGCT AACGGTTAGC
TCCTTTTAAT GTATGGTATT GAATATACCA CAATTCTAAT CTTTTTGATA
TCAATCATTC TACTCAACTA TATATTAAAA TCAGTGACTC
GAATAATGGA CTACATTATA TATAGATTTT TGTTGATTAC TGTAGCATTA
TTTGCTTTGA CAAGAGCTCA GAATTATGGA CTTAACTTAC
CAATAACAGG ATCAATGGAC GCTGTATATA CTAACTCTAC
TCAAGAAGAA GTGTTTCTAA CTTCTACGTT ATGTCTGTAT TATCCAACTG
AAGCAAGTAC TCAAATCAAT GATGGTGACT GGAAAGACTC
ATTGTCGCAA ATGTTTCTTA CAAAGGGTTG GCCAACAGGA
TCTGTTTACT TTAAAGAGTA CTCAAATATT GTTGATTTTT CTGTTGACCC
ACAGCTGTAT TGTGACTATA ATTTAGTACT TATGAAATAT
GACCAAAGTC TTAAATTAGA TATGTCAGAG TTAGCTGATT
TAATATTGAA TGAATGGTTA TGTAACCCAA TGGATGTAAC
ATTATACTAT TATCAACAAT CGGGAGAATC AAATAAGTGG
ATATCGATGG GATCATCATG TACCGTGAAA GTGTGTCCGC
TAAATACACA AACGTTAGGG ATAGGTTGTC AAACAACAAA
CGTAGACTCA TTTGAAATGA TTGCTGAGAA TGAGAAATTA
GCTATAGTGG ATGTCGTTGA TGGGATAAAT CATAAAATAA
ATTTAACAAC TACGACATGT ACTATTCGAA ATTGTAAGAA
ATTAGGTCCA AGAGAAAATG TAGCTGTAAT ACAAGTTGGT
GGTTCTAATG TGTTAGACAT AACAGCAGAT CCAACAACTA
ATCCACAAAC TGAGAGAATG ATGAGAGTGA ATTGGAAAAA
GTGGTGGCAA GTATTTTATA CTATAGTAGA TTATATTAAT
CAAATTGTAC AGGTAATGTC CAAAAGATCA AGATCATTAA
ATTCTGCAGC TTTTTATTAT AGAGTATAGT ATCTTAGATT
AGAATTGTTC GATGTGACC