CN108619508A

CN108619508A - 一种基于重组载体蛋白的季节流感-rsv-流脑-肺炎球菌联合疫苗

Info

Publication number: CN108619508A
Application number: CN201810242447.8A
Authority: CN
Inventors: 吴克; 闫利明; 史晋; 孙晓东
Original assignee: BRAVOVAX Co Ltd
Current assignee: BRAVOVAX Co Ltd
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2018-10-09
Also published as: CN108619507A; CN108619501A; CN108619505A; CN108619506A; CN108619502A

Abstract

本发明公开了一种基于重组载体蛋白的季节流感‑RSV‑流脑‑肺炎球菌联合疫苗，所述联合疫苗包括：多糖，流脑荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖和多价肺炎球菌荚膜多糖；蛋白，RSV免疫原性蛋白和流脑改性载体蛋白；多糖与蛋白经连接体连接而成的联合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球。本发明采用以磁性纳米微球作为连接体，将四种免疫组合物连接起来协同产生免疫反应，产生了良好的免疫效果，制备工艺简单，具有良好的推广价值。

Description

一种基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗

技术领域

本发明涉及一种基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，属于生物制药领域。

背景技术

一、流感嗜血杆菌及其流行病学

流感嗜血杆菌中b型流感嗜血杆菌侵袭力最强的一个血清型，是引起小儿严重感染的重要致病菌，其感染对象主要是5岁以下儿童，尤其是2岁以下的婴幼儿。Hib通过易感者呼吸道传播，定植于鼻咽部，可表现为无症状携带，持续数月，少部分人群则发生Hib侵袭性疾病。Hib感染最常见的疾病为脑膜炎与肺炎，另外还包括骨髓炎、脓毒性关节炎，会厌炎及败血症等。Hib最重要的致病因子是其荚膜荚膜多糖PRP，能在Hib感染和克隆过程中提供生存优势，抵抗补体介导的吞噬作用，抑制血清杀菌活性，逃脱鼻粘膜免疫，促进细菌在人群中的传播。

Hib结合疫苗根据PRP长度、载体蛋白不同常见的有四种，其免疫原性各有特点：(1)以白喉类毒素蛋白为载体的结合疫苗(PRP-diphthena toxoid，PRP-D)：与Hib荚膜多糖疫苗免疫原性相似，具有一定的年龄特点，成人初次接种后就可产生较高水平的抗体，而>15月的儿童虽可以产生较高水平抗体，但加强接种后无长期保持作用。(2)以B组脑膜炎双球菌胞膜蛋白为载体的结合疫苗(PRP-OMP):PRP-OMP对所有年龄组人群均有较好的免疫原性。第1剂接种后，大多数人均能产生高水平的抗体。再次接种后的抗体效价亦大于PRP-D，Hb-OC，PRP-T，但PRP-OMP的抗体维持的时间短，且抗体峰值水平较Hb-OC，PRP-T低。(3)以减毒的白喉类毒素CRM197为载体的结合疫苗(Hb-OC，PRP-CRM197)：2月龄婴儿第1剂接种产生的抗体水平较低，但4和6月龄分别再次注射后可诱导出高水平的抗体，1年后抗体仍可维持一定的水平。(4)以破伤风类毒素为载体的结合疫苗(PRP-T)：与Hb-OC类似，在较大儿童及成人，第1剂接种即可显示较好的免疫原性。小婴儿对第1剂接种免疫反应较弱，第2剂及第3剂再次接种后即能产生较高水平的抗体，且抗体水平维持时间较长。目前，国内及国际上主要使用的是PRP-CRM197，PRP-T两种，PRP-T适用于大多数年龄段人群的Hib疫苗接种。

二、呼吸道合胞病毒及其流行病学

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，尚无有效的疫苗可用。RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和因肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院率达70％，2周岁以内的儿童感染率甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。

RSV隶属于副粘病毒科肺病毒属，是单股负链RNA病毒。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，包括三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusion protein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白高度差异，根据G蛋白抗原性差异RSV可分为A和B两个亚型；RSV的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSV F和G糖蛋白的中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSVF和G蛋白已被公认为RSV的毒力致病分子和保护性抗原。

对于RSV而言，20世纪60年代，FμLginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半敏感感染/复制模型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防止婴幼儿感染，在之后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。

近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV疫苗有望用于新生儿。载体疫苗主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vacciniavirus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。

三、脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)及其流行病学

流行性脑脊髓膜炎(epidemic cerebrospinal meningitis)是由脑膜炎奈瑟氏菌，通过呼吸道传播引起的急性化脓性脑膜炎，在世界各地均有不同程度的流行。脑膜炎奈瑟菌也称为脑膜炎球菌，是一类革兰染色阴性双球菌，通常定植在人的鼻咽部。人类是其唯一宿主，因而Nm表现出对人类鼻咽部高度的适应性，10％-40％的健康人群都是Nm的无临床症状携带者，在脑膜炎爆发性流行时期，无症状携带者比例更可高达70％。少数情况下，Nm可经血侵入脑脊髓膜，引起化脓性炎症，出现脑膜刺激症和化脓性脑膜炎的脑脊液变化。疫苗预防是防治脑膜炎球菌病的重要手段，因为即使采用抗生素干涉，这种疾病仍有高发病率和死亡率。

具有致病性的Nm菌株一般都具有荚膜结构，健康人群正常携带的菌株往往会缺失荚膜，成为不能分群的菌株。根据Nm荚膜荚膜多糖的化学组成可将其分成A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和w135 13个血清群(Serogroup)，而根据其外膜蛋白(OMP)、PorB(2或3类OMp)和PorA(1类OMP)的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。全球每年约发生120万的Nm感染病例，多数病例是由A、B、C、W135、Y群菌株引起。而在发达国家中由B群Nm引起的流行性脑脊髓膜炎病例更是高达总病例的80％。在我国的流行主要以A群为主，近年来由于疫苗的广泛接种，A群引起的感染得到有效控制，而由B群引起的病例也相对增多。单一血清群、血清型和血清亚型的流脑菌苗在整体上很难预防流行性脑脊髓膜炎的发生。随着对Nm表面抗原结构更加深入的研究，流脑菌苗正朝着多元化方向发展。

流脑荚膜多糖-蛋白联合菌苗已有研制，Chiron和Wyem使用脱毒白喉类毒素(CRM197)作为蛋白载体，Baxter用破伤风类毒素作为载体，开发了A/C群脑膜炎球菌联合疫苗，于1999年11月引入了英国。此后Sanofi-Pasteur开发了A/C/Y/W135群荚膜多糖共价结合白喉类毒素(MCV4)的四价联合疫苗，我国已有几种A、C群脑膜炎球菌荚膜荚膜多糖与载体蛋白TT的联合疫苗批准上市。由于脑膜炎球菌荚膜多糖及联合疫苗应用，有效的预防了A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的感染。与A、C、W135、Y群菌株荚膜荚膜多糖不同，B群Nm菌株的荚膜荚膜多糖免疫原性较低，并且MenB荚膜荚膜多糖的结构与正在发育的神经组织及少数成熟组织中的神经细胞黏附分子同源，免疫接种易产生自身免疫。因此，B群Nm的荚膜荚膜多糖不能用作疫苗的抗原成份。B群疫苗的研究目前主要集中在非荚膜抗原，如蛋白、脂荚膜多糖(1ipopolysaccharide，LOS)等。筛选非荚膜表面抗原的主要挑战是其安全性、抗原保守性及能引发广泛有效的杀菌力反应。能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点：在大多数菌株中都表达且结构保守；可诱生杀菌抗体或保护性抗体。目前在蛋白质疫苗的研究方面取得了一定进展，诺华公司应用反向疫苗学研制的4CMenB疫苗已通过Ⅲ期临床实验。在研热点候选抗原有PorA，NhhA、GNA2132、NadA和fHBP等，其中fHBP是最有前途的候选蛋白质之一。

fHBP为因子H结合蛋白(Factor H-binding Protein，fHBP)，又称为脂蛋白2086，几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面，由255个氨基酸残基组成，分子量29000。因子H是补体替代途径的关键调节子，它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径c3转化酶C3bBb的衰变。fHBP和因子H结合可下调替代途径，从而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。fHBP对于脑膜炎球菌在人类的血液、血清和抗菌性多肽存在的情况下的生存是极为重要的。其氨基酸序列较保守，变种内91.6％-100％氨基酸相同。重组fHBP抗体可引起针对同一类变种的补体介导的杀菌作用和诱导感染乳鼠模型的被动保护。由完整fHBP获得的抗体不仅滴度高，且对顺序变异不敏感，即使有少量氨基酸改变，只要决定空间构象的关键氨基酸不变，抗体杀菌活性变化不大。所有这些特点使fHBP成为脑膜炎奈瑟菌最有效的抗原之一和最有希望的候选通用疫苗。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3个抗原变体组。通常，针对变体V1的fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表达fHbp的菌株，反之亦然。在每个变体组中也存在fHbp的亚变体。最近，fHbp的分子结构已显示为“模块化”，fHbp变体含有五个可变结构域的不同组合(VA～VE)，每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。因此，通过基因工程手段自由组合五个结构域可以得到覆盖A、B两个亚族三种变体的抗原的重组ΔfHbp蛋白，成为广谱的疫苗抗原及蛋白载体。

但是，单独使用fHbp蛋白也有一定的缺陷，因为在有些MenB菌株中fHbp蛋白表达水平较低，只有fHbp的抗原的疫苗不可能足以用于广泛的免疫脑膜炎球菌的感染，融合表达多种抗原不失为一个良好的选择。在研的一种纯蛋白疫苗(LP2086)中含有三种组分，其中两个组分是融合蛋白(GNA 2091与fHbp融合，GNA 2132与GNA 1030融合)，第三个组分是重组NadA。5种抗原负染应用可以引起小鼠中的大多数血清杀菌应答，起到良好的保护。其中，GNA 2091、GNA 2132和GNA 1030均为未知功能蛋白组分，而NadA为奈瑟氏菌粘附素A，在体外结合上皮细胞的粘附素/侵袭素。该抗原在MenB菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，但是不存在于某些遗传谱系的菌株中，仅有50％的MenB致病菌株表达NadA蛋白，但这50％都是高致病菌。融合表达ΔfHbp蛋白和NadA蛋白，无疑能提高其抗原性，并以此抗原为蛋白载体，结合A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜荚膜多糖，理论上该多价联合疫苗可预防A、B、C、Y和W135五个亚群致病菌的感染，从而预防绝大部分Nm感染导致的流行性脑脊髓膜炎。

由于呼吸系统疾病之间的相互关联性较高，且对于易感人群来说容易因一种呼吸系统疾病而引起其他的并发症，因此，设计一种针对主要的呼吸系统疾病均有免疫效果的疫苗具有十分重要的临床意义。

四、肺炎球菌及其流行病学

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)简称肺炎球菌(Pneumococcus)，寄居于正常人的鼻咽腔中，是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、肺炎、支气管炎的主要病原菌。肺炎球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎球菌荚膜糖疫苗和荚膜糖蛋白质结合疫苗，其设计都基于肺炎球菌荚膜糖，涵盖了导致肺炎球菌性疾病的最常见血清型。但肺炎球菌荚膜糖为胸腺非依赖性抗原(Thymus independent antigen，TI-Ag)，抗体反应主要依赖于其重复单位组成的线性表位，在无T淋巴细胞辅助的情况下直接与B淋巴细胞表面的IgM受体交联，所诱导的抗体主要为IgM和IgG2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护。荚膜糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎球菌结合疫苗包括血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方法相异。对荚膜糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证荚膜糖特异基团不丢失、抗原性和免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求，对荚膜糖及结合物分子的大小应当有一定控制。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。结合疫苗在初次免疫后活的抗体浓度仅能维持几个月，随后就会下降到免疫前水平；并且结合疫苗的整个工艺过程中需要加入多种化学试剂参与反应，并且荚膜糖蛋白结合疫苗的血清型覆盖率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者开始关注其他方向的肺炎球菌疫苗开发。

五、纳米微球在生物技术中的应用及前景

纳米材料是指晶粒尺寸小于100纳米的单晶体或多晶体，独特的小尺寸效应和表面或界面等效应，使其具备了许多优异的或全新的性能，它正日益受到人们的重视。例如纳米材料对药物研究领域的不断渗透和影响，已经引发了药物领域一场深远的革命。药物是人类用于抵御和预防疾病的重要物质，长期以来，药物的研究开发已经为临床提供了许多的治疗手段，为患者带来了许多益处。但是，现有药物仍存在着许多问题，如药物无法在循环系统内滞留并达到有效浓度、无法到达特定的治疗目标、无法通过血脑屏障、无法在某个局部形成较高浓度而同时又不产生毒副作用等(吴新荣.载药纳米微粒的应用及研究进展[J].中国医院药物学杂志，2001,21(3):171-173.)。磁性纳米微球药物载体是纳米技术与现代医药学结合的产物，由于它具有小尺寸效应、良好的靶向性、生物相容性、生物降解性和功能基团等优点，因此有望克服传统药物所带来的这些缺陷。磁性纳米微粒也可用于蛋白质和酶的纯化、回收以及酶的固定化，操作简单，且提高酶的稳定性。利用磁性纳米微粒进行免疫分析，具有特异性好、分离快、重现性好的特点。使用磁性微球载体进行介入治疗，在磁控血管内进行栓塞，则具有磁控导向、靶位栓塞等优点。

磁性纳米微球在生物医学中的应用随研究的深入日渐广泛，包括固定化酶、靶向药物、细胞分离和免疫分析、磁控检塞等，且纳米微球在DNA疫苗中的研究也备受关注，作为载体蛋白和佐剂的研究常有突破，但应用于预防性荚膜多糖和/或蛋白类疫苗未见报道。申请人将磁性纳米微球作为研究重点，在已有的研究基础上，继续深入研究磁性纳米微球的可塑性，希望能够发现更多更好的适应产品。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以重组载体蛋白为基础，获得一种基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗。

为实现上述发明目的，本发明采用的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗的技术方案如下：

所述联合疫苗包括：

多糖，流脑荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖和多价肺炎球菌荚膜多糖；

蛋白，RSV免疫原性蛋白和流脑改性载体蛋白；

多糖与蛋白经连接体连接而成的联合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球。

优选的，所述磁性纳米微球的磁性微粒位于磁性纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部。

作为进一步优选方案，磁性微粒为Fe₃O₄。

作为进一步优选方案，磁性纳米微球粒径为0.1-10μm，优选为0.1-5μm。

作为另一种优选方案，高分子材料为生物高分子材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)中的一种或以上的混合物；最佳为PLGA或PELA。

优选的，流脑荚膜多糖选自A群、C群、Y群和/或W135群荚膜荚膜多糖中的一种及以上。

优选的，RSV免疫原性蛋白选自以下蛋白中的至少一种：跨膜蛋白G、F、SH；基质蛋白M、M2；核衣壳蛋白N、P、L。

优选的，多价肺炎球菌多糖为多种肺炎球菌荚膜多糖，优选为分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，该血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。

作为进一步的优选方案，荚膜多糖与两种蛋白的质量比为(0.5～2)：1，优选为(0.5～1)：1，其中各载体蛋白间的质量比优选为1：1。

优选的，流脑改性载体蛋白包括改性ΔfHbp蛋白、柔性连接肽段和NadA蛋白，所述重组ΔfHbp蛋白包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域，Hib荚膜荚膜多糖活化后联合于ΔfHbp蛋白和/或NadA蛋白上。

其中所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：3所示。柔性肽段连接ΔfHbp蛋白和NadA蛋白。所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5所示。

本发明的结合疫苗制剂可采用水剂或冻干剂。为了增强其免疫原性，可加入佐剂，常用的佐剂有铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝，本发明优先选择磷酸铝。结合物的溶剂可为0.2氯化钠溶液、1×PBS缓冲液或其它能够稳定荚膜多糖或者结合物的缓冲液。本发明的肺炎球菌缀合疫苗各制剂的制备方法采用本技术领域的常规手段制备。其中，优选在糖(例如蔗糖或乳糖)存在下进行冻干。

本发明提供的肺炎球菌缀合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫，包括真皮层或皮肤给药、肌肉给药等形式。其中，所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。

与现有技术相比，本发明的联合疫苗具有如下技术效果：

1.填补了目前市场上无此类联合苗的空白；

2.为磁性纳米颗粒开发了一个新的使用方向，即同时连接两个不同的蛋白，一个作为载体，一个作为抗原，与多糖连接改性后免疫原性更强，引起的免疫应答更广泛。

3.纳米磁性颗粒的制备工艺简单，采用纳米微球为连接物的缀合疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性，此外还可诱导小鼠产生流感、脑膜炎和呼吸道合胞病毒抗体。

4.联合苗中，重组改性的融合蛋白ΔfHbp-NadA重组ΔfHbp-NadA是一种全新的可用于缀合疫苗的载体蛋白，不同于现有缀合疫苗工艺中常用蛋白载体(CRM197、TT、OMP、DT、HiD)，因而不会因同种蛋白载体接种过多导致缀合疫苗的免疫原性下降，且本身无毒性，从而在工业生产中不需要对该活性蛋白进行脱毒处理，不会改变其结构和抗原活性位点，从而获得更佳的免疫效果。

5.HIb、肺炎球菌荚膜多糖作为最常见的病毒抗原引入本联合疫苗中，大大增加了疫苗的免疫效果，流脑荚膜多糖与载体蛋白同源，因此在协同作用下具有良好的免疫效果，并且可以最大程度的降低抗原之间的竞争关系，使得五组抗原均可以稳定共存。

6.通过纳米磁珠作为荚膜多糖与载体蛋白之间的连接体，减少了载体剂量，避免了载体表位过载和各抗原之间的自身偶连；以纳米微球作为连接体，还可以简化制备工艺，适合疫苗的大规模推广。

附图说明

图1为fHbp V1～V3可变体结构域及重组ΔfHbp结构域；

图2为ΔfHbp扩增电泳图谱与pET-ΔfHbp鉴定电泳图谱；

图3为NadA扩增电泳图谱与pET-Δfhbp-NadA鉴定电泳图谱；

图4为IPTG诱导重组菌表达ΔfHbp和ΔfHbp-NadA蛋白；

图5为Western-Blot鉴定ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白；

图6为SDS-PAGE鉴定纯化后的ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白；

图7为SDS-PAGE鉴定大规模纯化后的ΔfHbp-NadA重组蛋白；

图8是本发明实施例提供的F蛋白PCR扩增产物电泳图；

图9是本发明实施例提供的阳性质粒构建插入位点图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

1.制备改性脑膜炎球菌蛋白载体

1.1.ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的克隆和原核表达

根据GeneBank登录的fHbp V1和fHbp V3全长CDS序列，我们设计如下2对引物：引物在P1和P4位置分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。

P1：GGATTCATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCC

P2：GCCGGGCAGTTGGTTGAAGGCGGTA

P3：ACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCA

P4：AAGCTTTTACTGCTTGGCGGCAAGACCGATA

分别以表达fHbp V1和V3的两株MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，进行PCR扩增。其中P1，P2可扩增fHbp V1的A、B结构域基因片段，P3和P4可扩增V3的C、D、E结构域基因片段。再以这两段基因片段为模板，P1，P4为引物，进行搭桥PCR，可扩增得到重组的ΔfHbp全长片段。用BamH I和HindⅢ双酶切目的基因(PCR产物)和原核表达载体pET32a(+)，凝胶回收盒回收Δfhbp基因片段和线性pET32a载体。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和HindⅢ双酶切鉴定的约800bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒pET-ΔfHbp，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图2所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，其ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ IDNO：2(826bp)所示。

SEQ ID NO：2(826bp)：

ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA

其氨基酸序列为SEQ ID NO：1：

MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ

融合表达ΔfHbp蛋白和NadA蛋白能提高其抗原性，但两个蛋白之间要加上柔性的链接肽段，最为经典的即为Huston设计合成的(GGGGS)3序列，有利于两个蛋白能够正确折叠，从而不影响其各自的免疫原型。根据GeneBank登录的NadA全长CDS序列，设计引物：引物P5和P6分别引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，同时P5的酶切位点后设计表达(GGGGS)3连接蛋白的序列。

P5：AAGCTT GGCGGCGGCGGCAGT GGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTATGAAACACTTTCCATCCAAAGTAC(SEQ ID NO：3)

P6：CTCGAGTTACCACTCGTAATTGACGCCGACA

以表达NadA的MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，P5，P6为引物，扩增得到NadA蛋白的全长CDS序列，用HindⅢ和XhoⅠ双酶切目的基因(NadA产物)和重组质粒pET-ΔfHbp，凝胶回收盒回收NadA基因片段和线性pET-ΔfHbp载体。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和XhoⅠ双酶切鉴定的约1900bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒pET-ΔfHbp-NadA，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图3所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5(1089bp)所示。

SEQ ID NO：5(1089bp)：

ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAAGGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGT GGCGGCGGCGGCAGTATGAAACACTTTCCATCCAAAGTACTGACCACAGCCATCCTTGCCACTTTCTGTAGCGGCGCACTGGCAGCCACAAGCGACGACGATGTTAAAAAAGCTGCCACTGTGGCCATTGTTGCTGCCTACAACAATGGCCAAGAAATCAACGGTTTCAAAGCTGGAGAGACCATCTACGACATTGGTGAAGACGGCACAATTACCCAAAAAGACGCAACTGCAGCCGATGTTGAAGCCGACGACTTTAAAGGTCTGGGTCTGAAAAAAGTCGTGACTAACCTGACCAAAACCGTCAATGAAAACAAACAAAACGTCGATGCCAAAGTAAAAGCTGCAGAATCTGAAATAGAAAAGTTAACAACCAAGTTAGCAGACACTGATGCCGCTTTAGCAGATACTGATGCCGCTCTGGATGAAACCACCAACGCCTTGAATAAATTGGGAGAAAATATAACGACATTTGCTGAAGAGACTAAGACAAATATCGTAAAAATTGATGAAAAATTAGAAGCCGTGGCTGATACCGTCGACAAGCATGCCGAAGCATTCAACGATATCGCCGATTCATTGGATGAAACCAACACTAAGGCAGACGAAGCCGTCAAAACCGCCAATGAAGCCAAACAGACGGCCGAAGAAACCAAACAAAACGTCGATGCCAAAGTAAAAGCTGCAGAAACTGCAGCAGGCAAAGCCGAAGCTGCCGCTGGCACAGCTAATACTGCAGCCGACAAGGCCGAAGCTGTCGCTGCAAAAGTTACCGACATCAAAGCTGATATCGCTACGAACAAAGCTGATATTGCTAAAAACTCAGCACGCATCGACAGCTTGGACAAAAACGTAGCTAATCTGCGCAAAGAAACCCGCCAAGGCCTTGCAGAACAAGCCGCGCTCTCCGGCCTGTTCCAACCTTACAACGTGGGTCGGTTCAATGTAACGGCTGCAGTCGGCGGCTACAAATCCGAATCGGCAGTCGCCATCGGTACCGGCTTCCGCTTTACCGAAAACTTTGCCGCCAAAGCAGGCGTGGCAGTCGGCACTTCGTCCGGTTCTTCCGCAGCCTACCATGTCGGCGTCAATTACGAGTGGTAA

其氨基酸序列为SEQ ID NO：4：

MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQGGGGS GGGGSGGGGSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW

将重组质粒pET-ΔfHbp和pET-ΔfHbp-NadA转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含50μg/ml卡纳青霉素)，得到ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD600约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图4显示，ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量分别为30kD和72kD。经Western-Blot鉴定为ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白，如图5所示：1，3泳道为ΔfHbp/BL21(DE3)诱导表达物，2，4泳道为ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)诱导表达物，1，2用fHbp单抗检测，分别有30kD和72kD的预期条带，3，4用NadA单抗检测，只有4泳道有72kD条带，结果符合预期。最后两个重组蛋白经质谱鉴定，确定为ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白。

1.2.ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的小规模纯化及其免疫效果评价

将ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)接种LB(含50μg/ml卡纳霉素)液体培养基，37℃、200rpm培养12小时，以1％接种比例扩大培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。离心机离心收集菌体。超声破菌，之前的SDS-PAGE显示，重组蛋白表达以包涵体的形式(图3)。先后用TE+300mM Nacl，TE+1％Triton-100洗涤包涵体后，8000rpm离心20min获得包涵体，洗涤后，溶解于3mol/L urea，20mmol/LTris-Cl，1mmol/L EDTA，pH4.0溶液中，经CM柱离子交换层析纯化，可得到与目标蛋白大小相符的两个目的蛋白。最后待重组蛋白稀释复性至24h后，超滤器低温快速浓缩至原体积的1.2倍，过阴离子交换柱Q SepharoseF.F，收集目的蛋白峰，检测方法同图4与图5，凝胶检测蛋白含量达到95.3％以上，纯化效果如图6所示，WB检测确为目的蛋白。用PBS(pH7.4)透析除盐后，BCA法测蛋白浓度含量约0.5mg/mL。

小鼠免疫：分别用纯化后的ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次纯化后的ΔfHbp或ΔfHbp-NadA重组蛋白50ug/只(溶解于0.2ml生理盐水中)，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，具体方法如下：采用纯化后的ΔfHbp或ΔfHbp-NadA重组蛋白，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价(表1)。两种重组蛋白免疫小鼠后均产生了高低度的血清抗体。

表1.各组抗原三次免疫小鼠后血清抗体的滴度测定(几何平均值)

免疫抗原	血清IgG抗体滴度(GMT)
		ΔfHbp	1:25489
ΔfHbp-NadA	1:29346
		阴性对照(生理盐水)	0

1.3.工程菌的发酵培养、诱导表达及大规模抗原蛋白浓缩纯化

将上述鉴定正确的ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)重组菌株按照药典的要求制成原始种子库和工作种子库。工艺流程如下：

1.取工程菌株工作种子库菌种，划种LB琼脂培养基(含卡纳霉素)，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至LB液体培养基(含50μg/ml卡纳霉素)中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到16-20时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，大容量离心机离心收集菌体。

2.取菌体加入破菌缓冲液(50mM PB，2mM EDTA，pH7.5)，高压(800-1000bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。采用30-60％硫酸铵分级沉淀，50mM PBPH7.5溶解，50kD超滤5次，并浓缩至原体积的1/5-1/3。

3.采用Sepharose QFF层析，平衡液：50mM PB PH7.2，洗脱液：50mM PB+1M NaClPH7.2。洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集10％的洗脱液。

4.取10％梯度洗脱液经50KD超滤膜包超滤浓缩，采用Sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查即为ΔfHbp-NadA蛋白原液。

技术要求为得到纯度大于95％的重组ΔfHbp-NadA蛋白原液。细菌内毒素不高于20EU/ml，本发明应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。分子量和纯度检查见图7，纯度为96.3％。蛋白特异性检测如图5所示，WB检测为目标蛋白。

2.制备b型流感嗜血杆菌荚膜荚膜多糖

2.1.采用CY培养基对Hib菌株1842在37℃下进行发酵，发酵液经甲醛灭活，离心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进行沉淀。然后用0.5～1M的NaCl对复合物沉淀进行解离，添加冰乙醇至终浓度25％(v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至终浓度75％(v/v)，沉淀得到粗荚膜多糖。

2.2.上述粗荚膜多糖用醋酸钠溶液溶解，冷酚抽提5-6次，最后超滤浓缩去除苯酚残留，经75％(v/v)乙醇沉淀得到精糖，置-20℃保存备用。

3.A群、C群、Y群和W135群Nm菌荚膜荚膜多糖的制备

A群脑膜炎球菌采用29201菌株，C群脑膜炎球菌采用29205菌株，Y群脑膜炎球菌采用29028菌株，W135群脑膜炎球菌采用29037菌株，脑膜炎球菌经发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100KD膜包超滤浓缩，采用25-80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制荚膜多糖；灭菌注射用水溶解荚膜多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用GE填料Captoadhere和Capto DEAE或其他厂家相同功能性质的离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采用GE Sephadex G25Coarse对流穿峰进行脱盐，乙醇沉淀或冻干回收荚膜多糖，置于-20℃保存备用。

4.制备多价肺炎球菌荚膜多糖

4.1.选取24种血清型(1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)的肺炎球菌培养；

4.2.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖：肺炎球菌，灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70％的)预冷乙醇，离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1：2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清，补加乙醇(终浓度80％搅拌)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后即为多价精制荚膜多糖，置-20℃保存备用。

5.制备磁性纳米微球

5.1.取2.24gFeSO₄-7H₂O和3.24gFeCl₃-6H₂O分别溶于10mL和15mL过滤除氧的dddH₂O中，溶解后混合均勾，加入100mL过滤除氧的dddH₂O；

5.2.在N₂的保护下搅拌5min，一次性加入50mL1mol/LNaOH溶液，再调节溶液pH至9-10，加快搅拌速度至200-250r/min，连续搅拌30min；

5.3.将反应容器转移至65-70℃水浴中，继续在N₂的保护下搅拌陈化30min；

5.4.反应完毕定容至100mL，显微镜下观察磁性粒子合成情况；

5.5.将400mgPELA溶于10mLEA溶剂中作为油相(O)，加入3mL上述磁性粒子溶液作为内水相(W₁)，采用超声细胞破碎仪(120W、60s)在冰水浴中进行初乳化化制备初乳，再将初乳倒入一定量含15g/LPVA和0.9％(ω)NaCl的水溶液(外水相，W₂)，磁力搅拌(300r/min、2min)制备预复乳液(W₁/0/W₂)，再将预复乳倒入快速膜乳化的储料罐中，以一定N₂压力将其反复压过SPG膜，得粒径均一的纳米微球复乳液滴。此外，未用完的纳米微球可制成冻干剂留用。

或通过取Fe₃O₄磁性粒子与50mL与无水乙醇按等体积加入，超声活化30min后，置60℃水浴中，缓慢的滴加10mLPELA对磁性纳米微球进行-NH₂末端改性且将PELA包裹在Fe₃O₄磁性粒子外，在氮气保护下搅拌反应l0h，制成磁性纳米微球；反应完毕后，用50mL无水乙醇洗漆3次，再用0.01MPBS洗漆三次后，定容至50mL，显微镜下观察磁珠改性情况，至磁性纳米微球表面-NH₂末端改为-OH末端。

6.制备呼吸道合胞病毒(RSV)

6.1.RSV蛋白的扩增表达

F蛋白为N-糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，全长575个氨基酸。F蛋白只有经过正确的加工才可以成为成熟的F蛋白，具有正常的生理功能和免疫原性。

本实施例选择RSV F蛋白的CDS区基因(GeneID：1489825)进行扩增，F蛋白的CDS区基因如序列表SEQ ID NO：6所示，根据F基因的特异性设计上下游引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO：7所示，下游引物如序列表SEQ ID NO：8所示，结合引物后的待扩增片段如序列表SEQ ID NO：9所示。

F蛋白CDS区序列具体如下：

ATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAG

取复苏并进行继代培养的Vero细胞，清洗后接入稀释的病毒，37℃吸附1h，每间隔15min摇动一次，使病毒充分感染细胞；倒掉接毒细胞瓶的病毒稀释液和未接毒细胞瓶的培养液，分别添加6～8mL含2％血清的DMEM维持液，37℃CO₂孵箱中培养，第二天起每天观察细胞病变情况。当细胞出现75％病变时收毒(约需要7d)，即将培养液于-80℃/37℃反复冻融3次后，10000r/min离心10min，无菌操作取上清，分装，于-80℃冰箱长期保存。

采用DEPC(焦炭酸二乙酯)对提取RNA需要的离心管、枪头及PCR管进行去RNA酶处理，并采用RNA/DNA试剂盒提取RSV RNA。本实施例中采用的提取试剂盒为TaKaRa小量病毒RNA/DNA提取试剂盒，按说明书操作即可。提取出的RNA需立即使用或置于-80℃冰箱保存备用。

逆转录体系采用25μL体系，加入RNA 12μL，通用引物Oligo(d)T18 1μL轻轻混匀，70℃孵育5min，冰浴2min。向离心管中加入AMV 1μL，AMV Buffer 5μL，dNTP 5μL，RNaseInhibitor 1μL轻轻混匀，42℃孵育60min。70℃10min灭活转录酶。得到的产物cDNA需立即使用或于-20℃长期保存备用。

根据RSV F蛋白CDS片段设计特异性引物，引物序列由5’端至3’端依次为保护碱基-酶切位点-连接引物，上游酶切位点为Hind III酶切位点，下游酶切位点为Xho I酶切位点，引物序列具体如下：

F:：5'-ccc-AAGCTT-CAGAAAACCGTGACCTATCAAG-3'

R：5'-cc-CTCGAG-ACATGAAGTTTTGCCTCACTAGTA-3'

PCR体系采用25μL体系，加入10×rTaq buffer 2.5μL，dNTP 2μL，rTaq 0.25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水17.25μL，RT-PCR产物cDNA1μL；扩增F全长片段的反应条件：94℃5min，94℃50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min，25个循环，72℃延伸10min，4℃结束；扩增G全长片段的反应条件：94℃5min，94℃45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环，72℃延伸7min，4℃结束。

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳检测，检测后确认F基因片段大小约为2150bp的PCR扩增片段。扩增产物电泳图如图8所示，图8中条带1位F基因，条带M1为标准DNA marker，条带清晰，符合预期理论值。

采用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。-20℃保存。

根据上述引物，采用表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-F，将F蛋白基因片段克隆入pcDNA3.1的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3.1-F。构建成功的部分连接片段如图9所示。

扩增F蛋白基因序列，限制性内切酶酶切PCR产物和pcDNA3.1，双酶切产物后连接，完成质粒构建。

引物连接后的待扩增片段具体如下：

CTTAGTTATTCAAAAACTACATCTTAGCAGAAAACCGTGACCTATCAAGCAAGAACGAAATTAAACCTGGGGCAAATAACCATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAGACAAAAAACCACCTGATCATGTTTCAACAACAGTCTGCTGATCACCAATCCCAAATCAACCCATAACAAACACTTCAACATCACAGTACAGGCTGAATCATTTCTTCACATCATGCTACCCACACAACTAAGCTAGATCCTTAACTCATAGTTACATAAAAACCTCAAGTATCACAATCAAACACTAAATCAACACATCATTCACAAAATTAACAGCTGGGGCAAATATGTCGCGAAGAAATCCTTGTAAATTTGAGATTAGAGGTCATTGCTTGAATGGTAGAAGATGTCACTACAGTCATAATTACTTTGAATGGCCTCCTCATGCCTTACTAGTGAGGCAAAACTTCATGTTAAACAAGATACTCAAGTCAATGGACAAAAGCATAGACACTTTGTCTGAAATAAGTGGAGCTGCTGAACTGGACAGAACAGAAGAATATGCTCTTGGTATAGTTGGAGTGCTAGAGAGTTACATAGGATCTATAAACAACATAACA

片段中下划线位置为F蛋白的启动子和终止子。

PCR质粒PCR产物F片段长约2150bp，与预期PCR产物一致。阳性质粒序列测定结果与原F基因序列完全一致。双酶切载体和目的片段位置也与预期一致。证明阳性质粒构建成功。

7.基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗的制备

7.1.荚膜多糖-磁性纳米微球偶联

0.1MTBS溶液缓冲液下，pH6.0加入上述步骤制得的任一或多种荚膜荚膜多糖和磁性纳米微球，本实施例中采用脑膜炎A群、C群、Y群、W135群荚膜荚膜多糖和Hib荚膜荚膜多糖，荚膜荚膜多糖与磁性纳米微球的质量比为1:(0.5-1)，于室温下反应6-24小时；其中优化的质量比为1:1，于室温下缩醛反应16小时。反应结束后，用透析袋充分透析，除去未反应磁性纳米微球。

7.2.偶联体改性

取步骤1荚膜多糖-磁性纳米微球偶联体30mL，搅拌条件下缓慢滴加2mL25％戊二酸，200r/min搅拌反应6小时；反应完毕后，用0.01MPBS洗涤三次后，定容至30mL，显微镜下观察磁性纳米微球改性情况，使得荚膜多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与荚膜多糖反应的-OH改性为-CHO；N₂、4℃保存备用。

7.3.改性ΔfHbp-NadA蛋白和RSV F蛋白共偶联

0.1MTBS溶液缓冲液下，4℃、pH4.0-9.0下，将改性后的多糖-磁性纳米微球分别与改性ΔfHbp-NadA蛋白和RSV F蛋白共反应24小时(为保证足量的载体蛋白与磁性纳米微球，采用过量纳米载体蛋白加入量，如质量比采用多糖：磁性纳米微球：改性ΔfHbp-NadA蛋白：RSV F蛋白＝1：1：2：2)。

7.4.联合疫苗的分离纯化

用Superdex200凝胶过滤柱(2.6cm×60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸缓冲液(pH7.4)，流速为3mL/min。收集对应于荚膜多糖-磁性纳米微球-双蛋白的洗脱峰。

洗脱后的联合疫苗冻干保存。

8.基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗的组成和免疫原性分析

用¹H-NMR进行检测所述基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，检测结果所示各组分均在对应的位置出现了特征峰。

将联合疫苗冻干粉复融后，进行Hib、A、C、Y、W135和肺炎球菌多糖含量检测及其它检测，符合中国药典三部(2015版)要求，结果如表2所示。

表2

免疫	GMT	生理盐水
			Hib	1507	0
RSV	957	0
			A群29201	1623	0
C群29205	1246	0
			Y群29028	1495	0
W群29037	1350	0
			B群MC58	1644	0
B群67/00	668	0
			肺炎球菌4型血清多糖	4486	0
肺炎球菌6B型血清多糖	4795	0
			肺炎球菌9V型血清多糖	6170	0
肺炎球菌14型血清多糖	3788	0
			肺炎球菌18型血清多糖	4721	0
肺炎球菌19型血清多糖	5534	0
			肺炎球菌23F型血清多糖	6012	0

由表2可知，联合免疫后的抗体滴度实验与单独免疫无极显著差异(与上述单独免疫相比，P<0.005，统计学阳性对照数据见上述制备方法中各中间体数据。)，可有效进行Hib、RSV、流脑和肺炎球菌的多重免疫保护，但免疫效果相对降低，可考虑多次免疫已保证有效免疫。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 一种基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val

20 25 30

Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu

35 40 45

Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile

50 55 60

Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala

100 105 110

Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro

130 135 140

Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro

165 170 175

Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu

195 200 205

Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His

210 215 220

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser

245 250 255

Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala

260 265 270

Leu Gly

<210> 2

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaccgaa ctgccttctg ctgccttttc ctgaccaccg ccctgattct gaccgcctgc 60

agcagcggag gcggcggaag cggaagcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacggggctt 120

gccgatgcac taactacgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc tctgacattg 180

gaagactcca ttccccaaaa cggaacacta accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240

ttcaaagccg gcgacaaaga caacagcctc aacacgggca aactgaagaa cgacaaaatc 300

agccgcttcg acttcgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccggca cggcattcgg ttcagacgat 540

gccagtggaa aactgaccta caccatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 600

gaacatttga aatcgccaga actcaatgtt gacctggccg cctccgatat caagccggat 660

aaaaaacgcc atgccgtcat cagcggttcc gtcctttaca accaagccga gaaaggcagt 720

tactctctag gcatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc agaagtggaa 780

accgcaaacg gcatacgcca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 825

<210> 3

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttggcg gcggcggcag tggcggcggc ggcagtggcg gcggcggcag tatgaaacac 60

tttccatcca aagtac 76

<210> 4

<211> 651

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val

20 25 30

Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu

35 40 45

Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile

50 55 60

Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala

100 105 110

Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro

130 135 140

Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro

165 170 175

Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu

195 200 205

Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His

210 215 220

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser

245 250 255

Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala

260 265 270

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Met Leu His Pro Pro Ser Leu Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala

290 295 300

Thr Pro Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser Ala Ala Ala Val Leu

305 310 315 320

Leu Ala Ala Thr Val Ala Ile Val Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly

325 330 335

Ile Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly Thr Ile Thr Ala Ile Gly Gly Ala

340 345 350

Gly Thr Ile Thr Gly Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Gly Ala Ala

355 360 365

Ala Pro Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Thr Ala Leu Thr Leu

370 375 380

Thr Val Ala Gly Ala Leu Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Leu Ala Ala

385 390 395 400

Gly Ser Gly Ile Gly Leu Leu Thr Thr Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ala

405 410 415

Ala Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Thr Ala Ala Leu

420 425 430

Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ile Thr Thr Pro Ala Gly Gly Thr Leu Thr

435 440 445

Ala Ile Val Leu Ile Ala Gly Leu Leu Gly Ala Val Ala Ala Thr Val

450 455 460

Ala Leu His Ala Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ala Ala Ser Leu Ala Gly

465 470 475 480

Thr Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ala Val Leu Thr Ala Ala Gly Ala Leu

485 490 495

Gly Thr Ala Gly Gly Thr Leu Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Leu Ala

500 505 510

Ala Gly Thr Ala Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala

515 520 525

Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Thr Ala Ile

530 535 540

Leu Ala Ala Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Leu Ala Ser Ala

545 550 555 560

Ala Ile Ala Ser Leu Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Gly Thr

565 570 575

Ala Gly Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ser Gly Leu Pro Gly Pro

580 585 590

Thr Ala Val Gly Ala Pro Ala Val Thr Ala Ala Val Gly Gly Thr Leu

595 600 605

Ser Gly Ser Ala Val Ala Ile Gly Thr Gly Pro Ala Pro Thr Gly Ala

610 615 620

Pro Ala Ala Leu Ala Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser

625 630 635 640

Ala Ala Thr His Val Gly Val Ala Thr Gly Thr

645 650

<210> 5

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaccgaa ctgccttctg ctgccttttc ctgaccaccg ccctgattct gaccgcctgc 60

agcagcggag gcggcggaag cggaagcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacggggctt 120

gccgatgcac taactacgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc tctgacattg 180

gaagactcca ttccccaaaa cggaacacta accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240

ttcaaagccg gcgacaaaga caacagcctc aacacgggca aactgaagaa cgacaaaatc 300

agccgcttcg acttcgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccggca cggcattcgg ttcagacgat 540

gccagtggaa aactgaccta caccatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 600

gaacatttga aatcgccaga actcaatgtt gacctggccg cctccgatat caagccggat 660

aaaaaacgcc atgccgtcat cagcggttcc gtcctttaca accaagccga gaaaggcagt 720

tactctctag gcatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc agaagtggaa 780

accgcaaacg gcatacgcca tatcggtctt gccgccaagc agtaaggcgg cggcggcagt 840

ggcggcggcg gcagtggcgg cggcggcagt atgaaacact ttccatccaa agtactgacc 900

acagccatcc ttgccacttt ctgtagcggc gcactggcag ccacaagcga cgacgatgtt 960

aaaaaagctg ccactgtggc cattgttgct gcctacaaca atggccaaga aatcaacggt 1020

ttcaaagctg gagagaccat ctacgacatt ggtgaagacg gcacaattac ccaaaaagac 1080

gcaactgcag ccgatgttga agccgacgac tttaaaggtc tgggtctgaa aaaagtcgtg 1140

actaacctga ccaaaaccgt caatgaaaac aaacaaaacg tcgatgccaa agtaaaagct 1200

gcagaatctg aaatagaaaa gttaacaacc aagttagcag acactgatgc cgctttagca 1260

gatactgatg ccgctctgga tgaaaccacc aacgccttga ataaattggg agaaaatata 1320

acgacatttg ctgaagagac taagacaaat atcgtaaaaa ttgatgaaaa attagaagcc 1380

gtggctgata ccgtcgacaa gcatgccgaa gcattcaacg atatcgccga ttcattggat 1440

gaaaccaaca ctaaggcaga cgaagccgtc aaaaccgcca atgaagccaa acagacggcc 1500

gaagaaacca aacaaaacgt cgatgccaaa gtaaaagctg cagaaactgc agcaggcaaa 1560

gccgaagctg ccgctggcac agctaatact gcagccgaca aggccgaagc tgtcgctgca 1620

aaagttaccg acatcaaagc tgatatcgct acgaacaaag ctgatattgc taaaaactca 1680

gcacgcatcg acagcttgga caaaaacgta gctaatctgc gcaaagaaac ccgccaaggc 1740

cttgcagaac aagccgcgct ctccggcctg ttccaacctt acaacgtggg tcggttcaat 1800

gtaacggctg cagtcggcgg ctacaaatcc gaatcggcag tcgccatcgg taccggcttc 1860

cgctttaccg aaaactttgc cgccaaagca ggcgtggcag tcggcacttc gtccggttct 1920

tccgcagcct accatgtcgg cgtcaattac gagtggtaa 1959

<210> 6

<211> 1725

<212> DNA

<213> respiratory syncytial virus

<400> 6

atggagctgc tgatccacag gttaagtgca atcttcctaa ctcttgctat taatgcattg 60

tacctcacct caagtcagaa cataactgag gagttttacc aatcgacatg tagtgcagtt 120

agcagaggtt attttagtgc tttaagaaca ggttggtata ccagtgtcat aacaatagaa 180

ttaagtaata taaaagaaac caaatgcaat ggaactgaca ctaaagtaaa acttataaaa 240

caagaattag ataagtataa gaatgcagtg acagaattac agctacttat gcaaaacaca 300

ccagctgcca acaaccgggc cagaagagaa gcaccacagt atatgaacta tacaatcaat 360

accactaaaa acctaaatgt atcaataagc aagaagagga aacgaagatt tctgggcttc 420

ttgttaggtg taggatctgc aatagcaagt ggtatagctg tatccaaagt tctacacctt 480

gaaggagaag tgaacaagat caaaaatgct ttgttatcta caaacaaagc tgtagtcagt 540

ctatcaaatg gggtcagtgt tttaaccagc aaagtgttag atctcaagaa ttacataaat 600

aaccaattat tacccatagt aaatcaacag agctgtcgca tctccaacat tgaaacagtt 660

atagaattcc agcagaagaa cagcagattg ttggaaatca acagagaatt cagtgtcaat 720

gcaggtgtaa caacaccttt aagcacttac atgttaacaa acagtgagtt actatcattg 780

atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaaattaa tgtcaagcaa tgttcagata 840

gtaaggcaac aaagttattc tatcatgtct ataataaagg aagaagtcct tgcatatgtt 900

gtacagctac ctatctatgg tgtaatagat acaccttgct ggaaattaca cacatcacct 960

ctatgcacca ccaacatcaa agaaggatca aatatttgtt taacaaggac tgatagagga 1020

tggtattgtg ataatgcagg atcagtatcc ttctttccac aggctgacac ttgtaaagta 1080

cagtccaatc gagtattttg tgacactatg aacagtttga cattaccaag tgaagtcagc 1140

ctttgtaaca ctgacatatt caattccaag tatgactgca aaattatgac atcaaaaaca 1200

gacataagca gctcagtaat tacttctctt ggagctatag tgtcatgcta tggtaaaact 1260

aaatgcactg catccaacaa aaatcgtggg attataaaga cattttctaa tggttgtgac 1320

tatgtgtcaa acaaaggagt agatactgtg tcagtgggca acactttata ctatgtaaac 1380

aagctggaag gcaagaacct ttatgtaaaa ggggaaccta taataaatta ctatgaccct 1440

ctagtgtttc cttctgatga gtttgatgca tcaatatctc aagtcaatga aaaaatcaat 1500

caaagtttag cttttattcg tagatctgat gaattactac ataatgtaaa tactggcaaa 1560

tctactacaa atattatgat aactacaatt attatagtaa tcattgtagt attgttatca 1620

ttaatagcta ttggtttgct gttgtattgc aaagccaaaa acacaccagt tacactaagc 1680

aaagaccaac taagtggaat caataatatt gcattcagca aatag 1725

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccaagcttc agaaaaccgt gacctatcaa g 31

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccctcgagac atgaagtttt gcctcactag ta 32

<210> 9

<211> 2306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttagttatt caaaaactac atcttagcag aaaaccgtga cctatcaagc aagaacgaaa 60

ttaaacctgg ggcaaataac catggagctg ctgatccaca ggttaagtgc aatcttccta 120

actcttgcta ttaatgcatt gtacctcacc tcaagtcaga acataactga ggagttttac 180

caatcgacat gtagtgcagt tagcagaggt tattttagtg ctttaagaac aggttggtat 240

accagtgtca taacaataga attaagtaat ataaaagaaa ccaaatgcaa tggaactgac 300

actaaagtaa aacttataaa acaagaatta gataagtata agaatgcagt gacagaatta 360

cagctactta tgcaaaacac accagctgcc aacaaccggg ccagaagaga agcaccacag 420

tatatgaact atacaatcaa taccactaaa aacctaaatg tatcaataag caagaagagg 480

aaacgaagat ttctgggctt cttgttaggt gtaggatctg caatagcaag tggtatagct 540

gtatccaaag ttctacacct tgaaggagaa gtgaacaaga tcaaaaatgc tttgttatct 600

acaaacaaag ctgtagtcag tctatcaaat ggggtcagtg ttttaaccag caaagtgtta 660

gatctcaaga attacataaa taaccaatta ttacccatag taaatcaaca gagctgtcgc 720

atctccaaca ttgaaacagt tatagaattc cagcagaaga acagcagatt gttggaaatc 780

aacagagaat tcagtgtcaa tgcaggtgta acaacacctt taagcactta catgttaaca 840

aacagtgagt tactatcatt gatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaaatta 900

atgtcaagca atgttcagat agtaaggcaa caaagttatt ctatcatgtc tataataaag 960

gaagaagtcc ttgcatatgt tgtacagcta cctatctatg gtgtaataga tacaccttgc 1020

tggaaattac acacatcacc tctatgcacc accaacatca aagaaggatc aaatatttgt 1080

ttaacaagga ctgatagagg atggtattgt gataatgcag gatcagtatc cttctttcca 1140

caggctgaca cttgtaaagt acagtccaat cgagtatttt gtgacactat gaacagtttg 1200

acattaccaa gtgaagtcag cctttgtaac actgacatat tcaattccaa gtatgactgc 1260

aaaattatga catcaaaaac agacataagc agctcagtaa ttacttctct tggagctata 1320

gtgtcatgct atggtaaaac taaatgcact gcatccaaca aaaatcgtgg gattataaag 1380

acattttcta atggttgtga ctatgtgtca aacaaaggag tagatactgt gtcagtgggc 1440

aacactttat actatgtaaa caagctggaa ggcaagaacc tttatgtaaa aggggaacct 1500

ataataaatt actatgaccc tctagtgttt ccttctgatg agtttgatgc atcaatatct 1560

caagtcaatg aaaaaatcaa tcaaagttta gcttttattc gtagatctga tgaattacta 1620

cataatgtaa atactggcaa atctactaca aatattatga taactacaat tattatagta 1680

atcattgtag tattgttatc attaatagct attggtttgc tgttgtattg caaagccaaa 1740

aacacaccag ttacactaag caaagaccaa ctaagtggaa tcaataatat tgcattcagc 1800

aaatagacaa aaaaccacct gatcatgttt caacaacagt ctgctgatca ccaatcccaa 1860

atcaacccat aacaaacact tcaacatcac agtacaggct gaatcatttc ttcacatcat 1920

gctacccaca caactaagct agatccttaa ctcatagtta cataaaaacc tcaagtatca 1980

caatcaaaca ctaaatcaac acatcattca caaaattaac agctggggca aatatgtcgc 2040

gaagaaatcc ttgtaaattt gagattagag gtcattgctt gaatggtaga agatgtcact 2100

acagtcataa ttactttgaa tggcctcctc atgccttact agtgaggcaa aacttcatgt 2160

taaacaagat actcaagtca atggacaaaa gcatagacac tttgtctgaa ataagtggag 2220

ctgctgaact ggacagaaca gaagaatatg ctcttggtat agttggagtg ctagagagtt 2280

acataggatc tataaacaac ataaca 2306

Claims

1.一种基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：

蛋白，RSV免疫原性蛋白和流脑改性载体蛋白；

多糖与蛋白经连接体连接而成的联合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球；所述磁性纳米微球的磁性微粒位于磁性纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部，磁性微粒为Fe₃O₄。

2.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：荚膜多糖与两种蛋白的质量比为(0.5～2)：1。

3.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：高分子材料为生物高分子材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物中的一种或以上的混合物。

4.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：流脑荚膜多糖选自A群、C群、Y群和/或W135群荚膜荚膜多糖中的一种及以上。

5.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：多价肺炎球菌多糖为多种肺炎球菌荚膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。

6.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，RSV免疫原性蛋白选自以下蛋白中的至少一种：跨膜蛋白G、F、SH；基质蛋白M、M2；核衣壳蛋白N、P、L。

7.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：流脑改性载体蛋白包括改性ΔfHbp蛋白、柔性连接肽段和NadA蛋白，所述重组ΔfHbp蛋白包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域，Hib荚膜荚膜多糖活化后联合于ΔfHbp蛋白和/或NadA蛋白上。

8.根据权利要求7所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

9.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

10.根据权利要求1所属的基于重组载体蛋白的季节流感-RSV-流脑-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5所示。