CN108619505A

CN108619505A - 抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗

Info

Publication number: CN108619505A
Application number: CN201810242449.7A
Authority: CN
Inventors: 吴克; 闫利明; 刘昊智; 孙晓东
Original assignee: BRAVOVAX Co Ltd
Current assignee: BRAVOVAX Co Ltd
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2018-03-22
Publication date: 2018-10-09
Also published as: CN108619501A; CN108619502A; CN108619507A; CN108619508A; CN108619506A

Abstract

本发明公开了一种抗Hib‑RSV‑脑膜炎球菌联合疫苗，所述联合疫苗包括：Hib‑脑膜炎球菌中间体和RSV免疫中间体，所述脑膜炎球菌免疫中间体包括改性ΔfHbp蛋白、柔性连接肽段和NadA蛋白，所述重组ΔfHbp蛋白包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域，Hib荚膜多糖活化后缀合于ΔfHbp蛋白和/或NadA蛋白上；所述RSV免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；上述组分的免疫中间体分别制备，临用混合。

Description

抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗

技术领域

本发明涉及一种抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，属于生物制药领域。

背景技术

一、流感嗜血杆菌及其流行病学

流感嗜血杆菌中b型流感嗜血杆菌侵袭力最强的一个血清型，是引起小儿严重感染的重要致病菌，其感染对象主要是5岁以下儿童，尤其是2岁以下的婴幼儿。Hib通过易感者呼吸道传播，定植于鼻咽部，可表现为无症状携带，持续数月，少部分人群则发生Hib侵袭性疾病。Hib感染最常见的疾病为脑膜炎与肺炎，另外还包括骨髓炎、脓毒性关节炎，会厌炎及败血症等。Hib最重要的致病因子是其荚膜多糖PRP，能在Hib感染和克隆过程中提供生存优势，抵抗补体介导的吞噬作用，抑制血清杀菌活性，逃脱鼻粘膜免疫，促进细菌在人群中的传播。

Hib结合疫苗根据PRP长度、载体蛋白不同常见的有四种，其免疫原性各有特点：(1)以白喉类毒素蛋白为载体的结合疫苗(PRP-diphthena toxoid，PRP-D)：与Hib多糖疫苗免疫原性相似，具有一定的年龄特点，成人初次接种后就可产生较高水平的抗体，而>15月的儿童虽可以产生较高水平抗体，但加强接种后无长期保持作用。(2)以B组脑膜炎双球菌胞膜蛋白为载体的结合疫苗(PRP-OMP):PRP-OMP对所有年龄组人群均有较好的免疫原性。第1剂接种后，大多数人均能产生高水平的抗体。再次接种后的抗体效价亦大于PRP-D，Hb-OC，PRP-T，但PRP-OMP的抗体维持的时间短，且抗体峰值水平较Hb-OC，PRP-T低。(3)以减毒的白喉类毒素CRM197为载体的结合疫苗(Hb-OC，PRP-CRM197)：2月龄婴儿第1剂接种产生的抗体水平较低，但4和6月龄分别再次注射后可诱导出高水平的抗体，1年后抗体仍可维持一定的水平。(4)以破伤风类毒素为载体的结合疫苗(PRP-T)：与Hb-OC类似，在较大儿童及成人，第1剂接种即可显示较好的免疫原性。小婴儿对第1剂接种免疫反应较弱，第2剂及第3剂再次接种后即能产生较高水平的抗体，且抗体水平维持时间较长。目前，国内及国际上主要使用的是PRP-CRM197，PRP-T两种，PRP-T适用于大多数年龄段人群的Hib疫苗接种。

二、呼吸道合胞病毒及其流行病学

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，尚无有效的疫苗可用。RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和因肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院率达70％，2周岁以内的儿童感染率甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。

RSV隶属于副粘病毒科肺病毒属，是单股负链RNA病毒。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，包括三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusion protein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白高度差异，根据G蛋白抗原性差异RSV可分为A和B两个亚型；RSV的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSV F和G糖蛋白的中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSVF和G蛋白已被公认为RSV的毒力致病分子和保护性抗原。

对于RSV而言，20世纪60年代，FμLginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半敏感感染/复制模型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防止婴幼儿感染，在之后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。

近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV疫苗有望用于新生儿。载体疫苗主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vacciniavirus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。

三、脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)及其流行病学

流行性脑脊髓膜炎(epidemic cerebrospinal meningitis)是由脑膜炎奈瑟氏菌，通过呼吸道传播引起的急性化脓性脑膜炎，在世界各地均有不同程度的流行。脑膜炎奈瑟菌也称为脑膜炎球菌，是一类革兰染色阴性双球菌，通常定植在人的鼻咽部。人类是其唯一宿主，因而Nm表现出对人类鼻咽部高度的适应性，10％-40％的健康人群都是Nm的无临床症状携带者，在脑膜炎爆发性流行时期，无症状携带者比例更可高达70％。少数情况下，Nm可经血侵入脑脊髓膜，引起化脓性炎症，出现脑膜刺激症和化脓性脑膜炎的脑脊液变化。疫苗预防是防治脑膜炎球菌病的重要手段，因为即使采用抗生素干涉，这种疾病仍有高发病率和死亡率。

具有致病性的Nm菌株一般都具有荚膜结构，健康人群正常携带的菌株往往会缺失荚膜，成为不能分群的菌株。根据Nm荚膜多糖的化学组成可将其分成A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和w135 13个血清群(Serogroup)，而根据其外膜蛋白(OMP)、PorB(2或3类OMp)和PorA(1类OMP)的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。全球每年约发生120万的Nm感染病例，多数病例是由A、B、C、W135、Y群菌株引起。而在发达国家中由B群Nm引起的流行性脑脊髓膜炎病例更是高达总病例的80％。在我国的流行主要以A群为主，近年来由于疫苗的广泛接种，A群引起的感染得到有效控制，而由B群引起的病例也相对增多。单一血清群、血清型和血清亚型的流脑菌苗在整体上很难预防流行性脑脊髓膜炎的发生。随着对Nm表面抗原结构更加深入的研究，流脑菌苗正朝着多元化方向发展。

流脑多糖-蛋白缀合菌苗已有研制，Chiron和Wyem使用脱毒白喉类毒素(CRM197)作为蛋白载体，Baxter用破伤风类毒素作为载体，开发了A/C群脑膜炎球菌缀合疫苗，于1999年11月引入了英国。此后Sanofi-Pasteur开发了A/C/Y/W135群多糖共价结合白喉类毒素(MCV4)的四价缀合疫苗，我国已有几种A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白TT的缀合疫苗批准上市。由于脑膜炎球菌多糖及缀合疫苗应用，有效的预防了A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的感染。与A、C、W135、Y群菌株荚膜多糖不同，B群Nm菌株的荚膜多糖免疫原性较低，并且MenB荚膜多糖的结构与正在发育的神经组织及少数成熟组织中的神经细胞黏附分子同源，免疫接种易产生自身免疫。因此，B群Nm的荚膜多糖不能用作疫苗的抗原成份。B群疫苗的研究目前主要集中在非荚膜抗原，如蛋白、脂多糖(1ipopolysaccharide，LOS)等。筛选非荚膜表面抗原的主要挑战是其安全性、抗原保守性及能引发广泛有效的杀菌力反应。能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点：在大多数菌株中都表达且结构保守；可诱生杀菌抗体或保护性抗体。目前在蛋白质疫苗的研究方面取得了一定进展，诺华公司应用反向疫苗学研制的4CMenB疫苗已通过Ⅲ期临床实验。在研热点候选抗原有PorA，NhhA、GNA2132、NadA和fHBP等，其中fHBP是最有前途的候选蛋白质之一。

fHBP为因子H结合蛋白(Factor H-binding Protein，fHBP)，又称为脂蛋白2086，几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面，由255个氨基酸残基组成，分子量29000。因子H是补体替代途径的关键调节子，它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径c3转化酶C3bBb的衰变。fHBP和因子H结合可下调替代途径，从而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。fHBP对于脑膜炎球菌在人类的血液、血清和抗菌性多肽存在的情况下的生存是极为重要的。其氨基酸序列较保守，变种内91.6％-100％氨基酸相同。重组fHBP抗体可引起针对同一类变种的补体介导的杀菌作用和诱导感染乳鼠模型的被动保护。由完整fHBP获得的抗体不仅滴度高，且对顺序变异不敏感，即使有少量氨基酸改变，只要决定空间构象的关键氨基酸不变，抗体杀菌活性变化不大。所有这些特点使fHBP成为脑膜炎奈瑟菌最有效的抗原之一和最有希望的候选通用疫苗。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3个抗原变体组。通常，针对变体V1的fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表达fHbp的菌株，反之亦然。在每个变体组中也存在fHbp的亚变体。最近，fHbp的分子结构已显示为“模块化”，fHbp变体含有五个可变结构域的不同组合(VA～VE)，每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。因此，通过基因工程手段自由组合五个结构域可以得到覆盖A、B两个亚族三种变体的抗原的重组ΔfHbp蛋白，成为广谱的疫苗抗原及蛋白载体。

但是，单独使用fHbp蛋白也有一定的缺陷，因为在有些MenB菌株中fHbp蛋白表达水平较低，只有fHbp的抗原的疫苗不可能足以用于广泛的免疫脑膜炎球菌的感染，融合表达多种抗原不失为一个良好的选择。在研的一种纯蛋白疫苗(LP2086)中含有三种组分，其中两个组分是融合蛋白(GNA 2091与fHbp融合，GNA 2132与GNA 1030融合)，第三个组分是重组NadA。5种抗原负染应用可以引起小鼠中的大多数血清杀菌应答，起到良好的保护。其中，GNA 2091、GNA 2132和GNA 1030均为未知功能蛋白组分，而NadA为奈瑟氏菌粘附素A，在体外结合上皮细胞的粘附素/侵袭素。该抗原在MenB菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，但是不存在于某些遗传谱系的菌株中，仅有50％的MenB致病菌株表达NadA蛋白，但这50％都是高致病菌。融合表达ΔfHbp蛋白和NadA蛋白，无疑能提高其抗原性，并以此抗原为蛋白载体，结合A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖，理论上该多价缀合疫苗可预防A、B、C、Y和W135五个亚群致病菌的感染，从而预防绝大部分Nm感染导致的流行性脑脊髓膜炎。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的获得一种抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗。

为实现上述发明目的，本发明采用的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗的技术方案如下：

所述联合疫苗包括：

a.Hib-脑膜炎球菌中间体，所述脑膜炎球菌免疫中间体包括改性ΔfHbp蛋白、柔性连接肽段和NadA蛋白，所述重组ΔfHbp蛋白包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域，Hib荚膜多糖活化后缀合于ΔfHbp蛋白和/或NadA蛋白上；

b.RSV免疫中间体，所述RSV免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；

上述组分的免疫中间体分别制备，临用混合。

优选的，所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

优选的，所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：8所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：9所示。

优选的，RSV蛋白为F蛋白，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

优选的，重组的RSV蛋白抗原为pcDNA3.1-F。

优选的，减毒胞内细菌载体选自：L3261、SL7207或ty21a。

作为一种优选的实施方式，转染至细菌载体内的RSV抗原为SL7207/pcDNA3.1-F。

优选的，Hib-脑膜炎球菌中间体和RSV免疫中间体均为冻干粉剂。

优选的，冻干保护剂的为蔗糖。

更优选地，蔗糖在冻干原液中的初始浓度不大于20％；蔗糖的初始浓度不小于60％，优选为大于70％。

优选地，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为不大于20％；较佳地，为4～20％；作为一种较佳的实施方式，根据所需制备的疫苗的不同为7～10％、8～10％、10～15％或12～15％；最佳为7％、8％、10％或12％。

优选地，蔗糖选用工业级分析纯或药用级。

与现有技术相比，本发明突破了市售无产品的局限，将已成功研发的呼吸道合胞病毒中间体与Hib-脑膜炎球菌免疫中间体联用，两种免疫中间体临用混合作为联合疫苗，同时免疫Hib、RSV和脑膜炎球菌等多种感染源，可进行广谱保护，减少接种次数和接种后反应，对于接种者具有积极意义。

其中：呼吸道合胞病毒中间体以载体为基础构建的RSV活载体疫苗可在机体细胞形成的蛋白质构象与其天然构象完全相同，减毒沙门氏菌既可携带原核表达质粒也可携带真核表达质粒，不会导致抗原表位的丧失或变化，形成的免疫力更利于抵抗随后的自然感染；免疫效力高、成本低及安全性好；避免了RSV存在的体外繁殖滴度低和稳定性差的问题，重组减毒沙门氏菌疫苗生产工艺简单，疫苗易于储存和运输，因此疫苗的成本相对较低，有利于疫苗的大规模制备；重组减毒菌疫苗可经口服免疫、鼻内免疫和直肠免疫等多种途径免疫，抗原被直接递呈到APC细胞，有效激发细胞免疫和体液免疫，且经黏膜途径免疫不会产生疾病增强作用，且能突破母传抗体的干扰；脑膜炎球菌免疫中间体针对B群脑膜炎球菌荚膜多糖成份不适合用作疫苗，利用反向遗传学的技术，表达B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白重组蛋白与奈瑟氏菌粘附素A蛋白的融合产物ΔfHbp-NadA，可作为Hib、A、C、Y、W135型多糖的载体。经疫苗效价实验可知，本发明提供的三联疫苗，虽免疫效果略下降，但与阳性对照无极显著差异，可通过多次免疫保证免疫效果。

附图说明

图1为fHbp V1～V3可变体结构域及重组ΔfHbp结构域；

图2为ΔfHbp扩增电泳图谱与pET-ΔfHbp鉴定电泳图谱；

图3为NadA扩增电泳图谱与pET-Δfhbp-NadA鉴定电泳图谱；

图4为IPTG诱导重组菌表达ΔfHbp和ΔfHbp-NadA蛋白；

图5为Western-Blot鉴定ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白；

图6为SDS-PAGE鉴定纯化后的ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白；

图7为SDS-PAGE鉴定大规模纯化后的ΔfHbp-NadA重组蛋白；

图8是本发明实施例提供的F蛋白PCR扩增产物电泳图；

图9是本发明实施例提供的阳性质粒构建插入位点图；

图10是本发明实施例提供的小鼠体内感染的F蛋白PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

1、制备Hib-脑膜炎联合免疫中间体

1.1.ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的克隆和原核表达

fHbp是一种膜表面脂蛋白，许多脑膜炎球菌的菌株都带有其基因，也发现不携带该基因的菌株。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3个抗原变体组V1～V3。通常，针对变体V1的fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表达fHbp的菌株，反之亦然。fHbp的蛋白分子含有五个可变结构域的不同组合(V_A～V_E)，每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。我们根据其结构域特点，设计了ΔfHbp的结构(如图1所示)，其包含V1的A、B结构域(B结构域上含有V1的抗原表位)，以及V3的C、D、E结构域(C、D、E结构域含有V2和V3的抗原表位，且其174-216位氨基酸高度保守，只有个别氨基酸的差异)，理论上，重组的ΔfHbp能覆盖所有野生型fHbp 3个变体的抗原位点，具有广谱抗菌的潜力。

根据GeneBank登录的fHbp V1和fHbp V3全长CDS序列，设计如下2对引物：引物在P1和P4位置分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。

P1：GGATTCATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCC

P2：GCCGGGCAGTTGGTTGAAGGCGGTA

P3：ACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCA

P4：AAGCTTTTACTGCTTGGCGGCAAGACCGATA

分别以表达fHbp V1和V3的两株MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，进行PCR扩增。其中P1，P2可扩增fHbp V1的A、B结构域基因片段，P3和P4可扩增V3的C、D、E结构域基因片段。再以这两段基因片段为模板，P1，P4为引物，进行搭桥PCR，可扩增得到重组的ΔfHbp全长片段。用BamH I和HindⅢ双酶切目的基因(PCR产物)和原核表达载体pET32a(+)，凝胶回收盒回收Δfhbp基因片段和线性pET32a载体。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和HindⅢ双酶切鉴定的约800bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒pET-ΔfHbp，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图2所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，其ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ IDNO：2(826bp)所示。

SEQ ID NO：2(826bp)：

ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA

其氨基酸序列为SEQ ID NO：1：

MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ

但单独使用ΔfHbp蛋白也有一定的缺陷，因为在有些MenB菌株中fHbp蛋白表达水平较低，只有ΔfHbp抗原的疫苗不可能足以用于广泛的免疫脑膜炎球菌的感染。奈瑟氏菌粘附素A(NadA)，在体外结合上皮细胞的粘附素/侵袭素。该抗原在MenB菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，不存在于某些遗传谱系的菌株中，仅有50％的MenB致病菌株表达NadA蛋白，但这50％都是高致病菌。融合表达ΔfHbp蛋白和NadA蛋白，无疑能提高其抗原性，但两个蛋白之间要加上柔性的链接肽段，最为经典的即为Huston设计合成的(GGGGS)3序列，有利于两个蛋白能够正确折叠，从而不影响其各自的免疫原型。根据GeneBank登录的NadA全长CDS序列，设计引物：引物P5和P6分别引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，同时P5的酶切位点后设计表达(GGGGS)3连接蛋白的序列。

P5：AAGCTT GGCGGCGGCGGCAGT GGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTATGAAACACTTTCCATCCAAAGTAC(SEQ ID NO：3)

P6：CTCGAGTTACCACTCGTAATTGACGCCGACA

以表达NadA的MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，P5，P6为引物，扩增得到NadA蛋白的全长CDS序列，用HindⅢ和XhoⅠ双酶切目的基因(NadA产物)和重组质粒pET-ΔfHbp，凝胶回收盒回收NadA基因片段和线性pET-ΔfHbp载体。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和XhoⅠ双酶切鉴定的约1900bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒pET-ΔfHbp-NadA，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图3所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5(1089bp)所示。

SEQ ID NO：5(1089bp)：

ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAAGGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTATGAAACACTTTCCATCCAAAGTACTGACCACAGCCATCCTTGCCACTTTCTGTAGCGGCGCACTGGCAGCCACAAGCGACGACGATGTTAAAAAAGCTGCCACTGTGGCCATTGTTGCTGCCTACAACAATGGCCAAGAAATCAACGGTTTCAAAGCTGGAGAGACCATCTACGACATTGGTGAAGACGGCACAATTACCCAAAAAGACGCAACTGCAGCCGATGTTGAAGCCGACGACTTTAAAGGTCTGGGTCTGAAAAAAGTCGTGACTAACCTGACCAAAACCGTCAATGAAAACAAACAAAACGTCGATGCCAAAGTAAAAGCTGCAGAATCTGAAATAGAAAAGTTAACAACCAAGTTAGCAGACACTGATGCCGCTTTAGCAGATACTGATGCCGCTCTGGATGAAACCACCAACGCCTTGAATAAATTGGGAGAAAATATAACGACATTTGCTGAAGAGACTAAGACAAATATCGTAAAAATTGATGAAAAATTAGAAGCCGTGGCTGATACCGTCGACAAGCATGCCGAAGCATTCAACGATATCGCCGATTCATTGGATGAAACCAACACTAAGGCAGACGAAGCCGTCAAAACCGCCAATGAAGCCAAACAGACGGCCGAAGAAACCAAACAAAACGTCGATGCCAAAGTAAAAGCTGCAGAAACTGCAGCAGGCAAAGCCGAAGCTGCCGCTGGCACAGCTAATACTGCAGCCGACAAGGCCGAAGCTGTCGCTGCAAAAGTTACCGACATCAAAGCTGATATCGCTACGAACAAAGCTGATATTGCTAAAAACTCAGCACGCATCGACAGCTTGGACAAAAACGTAGCTAATCTGCGCAAAGAAACCCGCCAAGGCCTTGCAGAACAAGCCGCGCTCTCCGGCCTGTTCCAACCTTACAACGTGGGTCGGTTCAATGTAACGGCTGCAGTCGGCGGCTACAAATCCGAATCGGCAGTCGCCATCGGTACCGGCTTCCGCTTTACCGAAAACTTTGCCGCCAAAGCAGGCGTGGCAGTCGGCACTTCGTCCGGTTCTTCCGCAGCCTACCATGTCGGCGTCAATTACGAGTGGTAA

其氨基酸序列为SEQ ID NO：4：

MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQGGGGSGGGGSGGGGSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW

将重组质粒pET-ΔfHbp和pET-ΔfHbp-NadA转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含50μg/ml卡纳青霉素)，得到ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD600约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图4显示，ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量分别为30kD和72kD。经Western-Blot鉴定为ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白，如图5所示：1，3泳道为ΔfHbp/BL21(DE3)诱导表达物，2，4泳道为ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)诱导表达物，1，2用fHbp单抗检测，分别有30kD和72kD的预期条带，3，4用NadA单抗检测，只有4泳道有72kD条带，结果符合预期。最后两个重组蛋白经质谱鉴定，确定为ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白。

1.2.ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的小规模纯化及其免疫效果评价

将ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)接种LB(含50μg/ml卡纳霉素)液体培养基，37℃、200rpm培养12小时，以1％接种比例扩大培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。离心机离心收集菌体。超声破菌，之前的SDS-PAGE显示，重组蛋白表达以包涵体的形式(图3)。先后用TE+300mM Nacl，TE+1％Triton-100洗涤包涵体后，8000rpm离心20min获得包涵体，洗涤后，溶解于3mol/L urea，20mmol/LTris-Cl，1mmol/L EDTA，pH4.0溶液中，经CM柱离子交换层析纯化，可得到与目标蛋白大小相符的两个目的蛋白。最后待重组蛋白稀释复性至24h后，超滤器低温快速浓缩至原体积的1.2倍，过阴离子交换柱Q SepharoseF.F，收集目的蛋白峰，检测方法同图4与图5，凝胶检测蛋白含量达到95.3％以上，纯化效果如图6所示，WB检测确为目的蛋白。用PBS(pH7.4)透析除盐后，BCA法测蛋白浓度含量约0.5mg/mL。

小鼠免疫：分别用纯化后的ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次纯化后的ΔfHbp或ΔfHbp-NadA重组蛋白50ug/只(溶解于0.2ml生理盐水中)，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，具体方法如下：采用纯化后的ΔfHbp或ΔfHbp-NadA重组蛋白，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价(表1)。两种重组蛋白免疫小鼠后均产生了高低度的血清抗体。

表1.各组抗原三次免疫小鼠后血清抗体的滴度测定(几何平均值)

免疫抗原	血清IgG抗体滴度(GMT)
		ΔfHbp	1:25489
ΔfHbp-NadA	1:29346
		阴性对照(生理盐水)	0

两种重组蛋白免疫效果的评价，采取两种方法，一为全菌体包被测定全细胞ELISA，另一为流行株的杀菌力实验。全菌体包被选择MenB群菌株MC58(高表达fHbp V1可变体)、8047(高表达fHbp V2可变体)、M1239高表达fHbp V3可变体)，961-5945(中量表达fHbp蛋白)和67/00(低量表达fHbp蛋白)，将这些菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生理盐水溶解，甲醛杀菌后，稀释为2×10⁸个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜，洗板后，进行检测，结果见表2。同样，培养MenB群菌株MC58(高表达fHbp V1可变体)、8047(高表达fHbp V2可变体)、M1239高表达fHbp V3可变体)，961-5945(中量表达fHbp蛋白)和67/00(低量表达fHbp蛋白)后用相应血清抗体进行杀菌检测，测定并计算杀菌抗体滴度(与补体阴性对照孔相比，50％以上杀菌率的血清最高稀释度为血清抗体杀菌滴度)，结果见表3。

表2.各MenB菌株全细胞ELISA

菌株	ΔfHbp血清	ΔfHbp-NadA血清	生理盐水血清
				MC58	979956	1204853	<200
8047	534678	1024568	<200
				M1239	997854	1204674	<200
961-5945	328940	846780	<200
				67/00	25679	597690	<200

表3.各MenB菌株杀菌力实验:BC50titer(1：)

菌株	ΔfHbp血清	ΔfHbp-NadA血清	生理盐水血清
				MC58	1756	1923	1
8047	1023	1234	2
				M1239	1872	2014	-2
961-5945	154	657	-1
				67/00	6	456	1

备注：杀菌力实验以大于1：8为具有保护性。

由表2和表3的结果综合分析可得，ΔfHbp蛋白疫苗能够有效免疫所有表达fHbp(V1、V3和V2变体)的MenB菌株的侵染，但对低表达甚至不表达fHbp的MenB菌株失去保护能力；而ΔfHbp-NadA蛋白疫苗在免疫所有表达fHbp(V1、V3和V2变体)的MenB菌株的侵染的基础上，同时能对低表达甚至不表达fHbp的MenB菌株依然具有保护作用。同时，ΔfHbp-NadA蛋白疫苗能够产生更高的抗体效价并具有更强的杀菌能力，说明两种特异性蛋白的融合表达能够起到协同促进免疫反应的作用，并能提供更为广谱的疫苗保护功能。因此，我们的后续工艺选择ΔfHbp-NadA重组蛋白作为新型多价脑膜炎球菌及肺炎球菌缀合疫苗的蛋白载体。

1.3.工程菌的发酵培养、诱导表达及大规模抗原蛋白浓缩纯化

将上述鉴定正确的ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)重组菌株按照药典的要求制成原始种子库和工作种子库。工艺流程如下：

1.取工程菌株工作种子库菌种，划种LB琼脂培养基(含卡纳霉素)，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至LB液体培养基(含50μg/ml卡纳霉素)中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到16-20时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，大容量离心机离心收集菌体。

2.取菌体加入破菌缓冲液(50mM PB，2mM EDTA，pH7.5)，高压(800-1000bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。采用30-60％硫酸铵分级沉淀，50mM PBPH7.5溶解，50kD超滤5次，并浓缩至原体积的1/5-1/3。

3.采用Sepharose QFF层析，平衡液：50mM PB PH7.2，洗脱液：50mM PB+1M NaClPH7.2。洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集10％的洗脱液。

4.取10％梯度洗脱液经50KD超滤膜包超滤浓缩，采用Sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查即为ΔfHbp-NadA蛋白原液。

技术要求为得到纯度大于95％的重组ΔfHbp-NadA蛋白原液。细菌内毒素不高于20EU/ml，本发明应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。分子量和纯度检查见图7，纯度为96.3％。蛋白特异性检测如图5所示，WB检测为目标蛋白。

1.4.制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖

a.采用CY培养基对Hib菌株1842在37℃下进行发酵，发酵液经甲醛灭活，离心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进行沉淀。然后用0.5～1M的NaCl对复合物沉淀进行解离，添加冰乙醇至终浓度25％(v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至终浓度75％(v/v)，沉淀得到粗多糖。

b.上述粗多糖用醋酸钠溶液溶解，冷酚抽提5-6次，最后超滤浓缩去除苯酚残留，经75％(v/v)乙醇沉淀得到精糖，置-20℃保存备用。

1.5.Hib-ΔfHbp-NadA免疫复合物的制备

将Hib多糖溶解至5-15mg/ml，调节pH值至10.8左右，在多糖溶液中加入1/10(g/g)的CDAP，室温、维持pH值10.8的碱性环境下活化多糖8min。按1：1(与活化多糖的体积比)的比例加入0.5mol/L的已二酰肼，室温反应50-70min。50KD膜包超滤去除溴化氰及已二酰肼，得到多糖衍生物。将多糖衍生物与载体蛋白ΔfHbp-NadA以1：1(g/g)的比例混合并搅拌，按碳二亚胺：多糖＝1:10的比例加入碳二亚胺，室温、酸性环境(pH5.6)下反应60min。经100KD超滤膜包超滤去除杂质，并浓缩。最后采用GE Sepharose 4FF进行凝胶层析纯化，收集V0附近的洗脱液。用0.22μm滤膜除菌过滤，得到Hib多糖-ΔfHbp-NadA免疫复合物原液。

将此原液采用磷酸铝佐剂搅拌吸附，以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至多价多糖蛋白结合物以多糖含量计终浓度分别为20μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.6mg/ml，搅拌均匀，以预填充注射器分装，0.5ml/支，制成Hib多糖-ΔfHbp-NadA免疫复合物制剂，2-8℃保存。也可在疫苗原液中加入80mg/ml蔗糖作为赋形剂，每支多糖含量20μg/ml冻干后制成蛋白疫苗制剂，2-8℃保存。

2.制备呼吸道合胞病毒(RSV)免疫中间体

2.1.RSV蛋白的扩增表达

F蛋白为N-糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，全长575个氨基酸。F蛋白翻译后修饰包括糖基化、酶切、聚合和Cys-550位点的酰基化。F蛋白只有经过正确的加工才可以成为成熟的F蛋白，具有正常的生理功能和免疫原性。

本实施例选择RSV F蛋白的CDS区基因(GeneID：1489825)进行扩增，F蛋白的CDS区基因如序列表SEQ ID NO：6所示，根据F基因的特异性设计上下游引物，上游引物序列如序列表SEQ ID NO：7所示，下游引物如序列表SEQ ID NO：8所示，结合引物后的待扩增片段如序列表SEQ ID NO：9所示。

F蛋白CDS区序列具体如下：

ATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAG

取复苏并进行继代培养的Vero细胞，清洗后接入稀释的病毒，37℃吸附1h，每间隔15min摇动一次，使病毒充分感染细胞；倒掉接毒细胞瓶的病毒稀释液和未接毒细胞瓶的培养液，分别添加6～8mL含2％血清的DMEM维持液，37℃CO₂孵箱中培养，第二天起每天观察细胞病变情况。当细胞出现75％病变时收毒(约需要7d)，即将培养液于-80℃/37℃反复冻融3次后，10000r/min离心10min，无菌操作取上清，分装，于-80℃冰箱长期保存。

采用DEPC(焦炭酸二乙酯)对提取RNA需要的离心管、枪头及PCR管进行去RNA酶处理，并采用RNA/DNA试剂盒提取RSV RNA。本实施例中采用的提取试剂盒为TaKaRa小量病毒RNA/DNA提取试剂盒，按说明书操作即可。提取出的RNA需立即使用或置于-80℃冰箱保存备用。

逆转录体系采用25μL体系，加入RNA 12μL，通用引物Oligo(d)T18 1μL轻轻混匀，70℃孵育5min，冰浴2min。向离心管中加入AMV 1μL，AMV Buffer 5μL，dNTP 5μL，RNaseInhibitor 1μL轻轻混匀，42℃孵育60min。70℃10min灭活转录酶。得到的产物cDNA需立即使用或于-20℃长期保存备用。

根据RSV F蛋白CDS片段设计特异性引物，引物序列由5’端至3’端依次为保护碱基-酶切位点-连接引物，上游酶切位点为Hind III酶切位点，下游酶切位点为Xho I酶切位点，引物序列具体如下：

F:：5'-ccc-AAGCTT-CAGAAAACCGTGACCTATCAAG-3'

R：5'-cc-CTCGAG-ACATGAAGTTTTGCCTCACTAGTA-3'

PCR体系采用25μL体系，加入10×rTaq buffer 2.5μL，dNTP 2μL，rTaq 0.25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水17.25μL，RT-PCR产物cDNA 1μL；扩增F全长片段的反应条件：94℃5min，94℃50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min，25个循环，72℃延伸10min，4℃结束；扩增G全长片段的反应条件：94℃5min，94℃45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环，72℃延伸7min，4℃结束。

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳检测，检测后确认F基因片段大小约为2150bp的PCR扩增片段。扩增产物电泳图如图1所示，图中条带1位F基因，条带M1为标准DNA marker，条带清晰，符合预期理论值。

采用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。-20℃保存。

根据上述引物，采用表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-F，将F蛋白基因片段克隆入pcDNA3.1的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3.1-F。构建成功的部分连接片段如图2所示。

扩增F蛋白基因序列，限制性内切酶酶切PCR产物和pcDNA3.1，双酶切产物后连接，完成质粒构建。

引物连接后的待扩增片段具体如下：

CTTAGTTATTCAAAAACTACATCTTAGCAGAAAACCGTGACCTATCAAGCAAGAACGAAATTAAACCTGGGGCAAATAACCATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAGACAAAAAACCACCTGATCATGTTTCAACAACAGTCTGCTGATCACCAATCCCAAATCAACCCATAACAAACACTTCAACATCACAGTACAGGCTGAATCATTTCTTCACATCATGCTACCCACACAACTAAGCTAGATCCTTAACTCATAGTTACATAAAAACCTCAAGTATCACAATCAAACACTAAATCAACACATCATTCACAAAATTAACAGCTGGGGCAAATATGTCGCGAAGAAATCCTTGTAAATTTGAGATTAGAGGTCATTGCTTGAATGGTAGAAGATGTCACTACAGTCATAATTACTTTGAATGGCCTCCTCATGCCTTACTAGTGAGGCAAAACTTCATGTTAAACAAGATACTCAAGTCAATGGACAAAAGCATAGACACTTTGTCTGAAATAAGTGGAGCTGCTGAACTGGACAGAACAGAAGAATATGCTCTTGGTATAGTTGGAGTGCTAGAGAGTTACATAGGATCTATAAACAACATAACA

片段中下划线位置为F蛋白的启动子和终止子。

PCR质粒PCR产物F片段长约2150bp，与预期PCR产物一致。阳性质粒序列测定结果与原F基因序列完全一致。双酶切载体和目的片段位置也与预期一致。证明阳性质粒构建成功。

2.2重组真核表达质粒导入减毒沙门氏菌

在LB平板上划线培养鼠伤寒沙门氏菌SL7207；挑取单个菌落接种3ml LB液体培养基，37℃过夜振荡培养；每5ml LB液体培养基接种100μL过夜培养物，37℃，225prm振荡培养，至OD_600nm＝0.6；培养物冰浴30min，4000rpm离心10min；倾去所有营养液，用等体积、冰浴的WB溶液重悬细菌，4000prm，离心10min(WB＝10％甘油，90％双蒸水，过滤)；重复上一步2次：倾去大部分WB，使剩余体积为50μL(每10ml原始培养物制备感受态细胞50μL，即0.5％)，混匀即为感受态细胞。

每40μL感受态细胞中加入5μL质粒pcDNA3.1-F、pcDNA3.1以及荧光质粒pEGFP，混匀；吸取40μL加入冰预冷的电极杯中，进行电转化。参数设置为2.5Kv，200Ω，25μF，t≈4.5-5.0ms。另取不加质粒的感受态细胞电转化作对照：电击后，立即向电极杯中加入1mlLB，混匀，37℃振荡培养1h；取200μL铺带有Amp^R抗性的LB平板，37℃过夜培养。

挑取转化出的菌落在带有Amp^R的LB液体培养基中培养至OD_600nm＝1.0；提取质粒后电泳鉴定，证明与已知质粒大小相同。

2.3.携带RSV重组蛋白的沙门氏菌免疫学评价

2.3.1感染腹腔原代巨噬细胞预试验

取小鼠腹腔原代巨噬细胞，摘除眼球放血后，断颈处死小鼠，用75％的乙醇浸泡小鼠；将小鼠固定，无菌打开小鼠腹部的皮肤，暴露腹膜；将10ml 37℃水浴的无血清培养基RPMI1640沿耻骨前沿、腹中线一侧注射入小鼠的腹腔，不要拔出针头，然后用手指轻轻按摩腹部；无菌收集腹水，并分离巨噬细胞。

将分离的巨噬细胞进行细胞计数，铺板24孔细胞板，5×10⁵～1×10⁶个cell/孔，在含有RPMI培养基的细胞瓶中37℃吸附2h；用无抗生素的不完全培养基RPMI1640洗涤细胞2次，以除去未吸附的细胞；5000rpm离心收集菌体，用0.01mol/L PBS(pH7.4)重悬；将减毒沙门氏菌计数后与细胞数按1:1、5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、500:1和1000:1不同的比例加入到24孔细胞板中每个比例重复3孔，37℃孵育30min；用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗涤细胞3次，再用含有100mg/L的硫酸庆大霉素的RPMI1640培养液培养细胞2h，以杀死胞外菌；再向细胞培养物中加入10mg/L的四环素，37℃孵育2h，以阻断胞内菌的繁殖；再换用含有10mg/L的硫酸庆大霉素的RPMI1640(含有10％FCS)继续培养48-96h，每隔12h观察有无污染出现，以确定感染量。

将重组减毒沙门氏菌与巨噬细胞按MOI＝20作用，感染后48～72h用荧光显微镜观察细胞中有无绿色荧光表达。在感染后48h和72h都能够看见大约有34/的细胞中有绿色荧光表达，而对照中没有发现荧光。

2.3.2重组减毒沙门氏菌体内感染试验

本实施例采用小鼠进行体内感染试验，口服给药。

取6-8周龄雌性小鼠，分成4组，SL7207/pcDNA3.1-F一组，对照SL7207/pcDNA3.l一组，FI-RSV疫苗作为疫苗阳性对照一组，PBS组作为阴性对照。免疫前30min先用7.5％的NaHCO₃灌胃中和胃酸，100μL/只，然后口服免疫重组菌(10⁸cfu/只，200μL)。

分别在口服免疫后0h、24h、48h和72h，提取肠道粘膜的总RNA，每次2只。剪取小肠粘膜约100mg，剪碎后加入1.0mol TRIzol试剂，用组织捣碎机匀浆，在15～30℃温育5min；加入200μL的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡15s；15～30℃温育2-3mni；2-8℃12000g离心15min；转移水相到一新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，15i-30℃作用10min，2-8℃12000g离心10min；弃去上清液，加入75％乙醇l.0ml，振摇，2-8℃7500g离心5min；弃去上清，干燥沉淀物(室温约5min)；加入20μL DEPC水溶解，-20℃保存。

提取总RNA后，进行反转录cDNA合成及PCR扩增，扩增目的基因F的是否转录表达。扩增时用β-actin作为内参。

β-actin特异性引物：Pβl序列为5’-GTGGGCCGCTcTAGGCACCAA-3’；Pβ2序列为5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’；

F蛋白基因：94℃预变性3min，35个cycle，72℃延伸10min，产物置冰箱待测。

β-actin：取反转录产物2.0μL，加入PCR混合液48.0μL，包括Pβ1、Pβ2各40pmol，94℃预变性5min，35个cycle，72℃延伸5min，产物置冰箱待测。

PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检验，检验结果如图3所示。图中条带1为F蛋白基因，条带2为β-actin基因。检验结果显示条带位置正确清晰，说明目的基因F正确转录。

2.3.3间接免疫荧光试验(IFA)检测F蛋白在体内的表达

分别在口服免疫后24h、48h和72h采集小鼠的腹腔巨噬细胞，计数后，铺板96孔细胞板，5×10⁵～1×10⁶个cell/孔；在37℃、5％的二氧化碳温箱中温育2h后用PBS洗涤一次，然后弃去PBS；加入150μL4℃预冷丙酮到96孔细胞板中，4℃孵育30min；弃去丙酮，室温干燥；F蛋白的真核表达质粒免疫的小鼠血清1:80稀释，每个组重复两个孔；加入50μL稀释的血清，37℃温育30min；移去稀释血清，200μL PBS洗涤6次；加入50μL 1:100稀释的荧光标记羊抗鼠IgG，37℃温育30min；移去液体，在纸巾上使细胞板干燥，用PBS洗涤4次；于荧光显微镜下观察。

高压电转化至aroA突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207株构建成重组沙门氏菌SL7207/pcDNA3.1-F，制备小鼠腹腔巨噬细胞，感染SL7207/pcDNA3.1-F，经荧光显微镜可以检测到有荧光蛋白表达。将SL7207/pcDNA3.1-F口服免疫小鼠，2d后提取肠道粘膜总RNA，可以检测到目的基因的转录和表达；同时制备免疫小鼠的腹腔巨噬细胞，用FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验可以检测到特异性的黄绿色荧光。结果表明该减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给小鼠体细胞，而且，转运的目的基因可以获得转录和表达。

口服给药一周后，经小鼠眼眶取血，分离血清用PBS将各组小鼠血清从1：10000开始倍比稀释至1：5120000，间接ELISA检测抗体效价，即IgG滴度(几何平均值)。检测结果见表4。

表4 小鼠IgG抗体滴度表

	平行1	平行2	平行3	平行4
					SL7207/pcDNA3.1-F	10523	14962	13328	17385
SL7207/pcDNA3.1	0	0	0	0
					FI-RSV	29618	28619	21309	24661
PBS阴性对照	0	0	0	0

由上述实验可以看出，本发明中采用的呼吸道合胞病毒重组蛋白以细菌为载体，进入小鼠体内后，小鼠存活率正常，粪便检验正常；小鼠的正常免疫应答被激发，并且经过黏膜取样检验，在样品中检出一定量的IgA抗体，说明以本发明中得到的重组载体菌可以作为抗原对呼吸道合胞病毒进行免疫反应，并可进一步实验验证其有效性。

验证有效可行的呼吸道合胞病毒重组载体菌疫苗亚单位采用冻干剂型便于储存和运输，疫苗亚单位配有复苏液，临用前常温复苏菌体。

3.抗HIb-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗的免疫原性检测

将呼吸道合胞病毒重组载体菌SL7207/pcDNA3.1-F复苏后，与Hib-ΔfHbp-NadA免疫复合物冻干粉临用混合，进行Hib、A、C、Y和W135多糖含量检测及其它检测，符合中国药典三部(2015版)要求，结果如表5所示。

多糖	含量(μg/mL)
		Hib	35
A群	55
		C群	60
W135群	52
		Y群	50

选择免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，检测结果如表6所示。

表6

免疫物	GMT	GMT平行2
			Hib-RSV-多价流脑	1:26712	1:25487
阴性对照(生理盐水)	0	0

联合免疫后的抗体滴度实验与单独免疫无极显著差异(与上述单独免疫相比，P<0.001，统计学阳性对照数据见上述制备方法中各中间体数据。)，可有效进行Hib、RSV和流脑的多重免疫保护，但免疫效果相对降低，可考虑多次免疫已保证有效免疫。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val

20 25 30

Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu

35 40 45

Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile

50 55 60

Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala

100 105 110

Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro

130 135 140

Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro

165 170 175

Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu

195 200 205

Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His

210 215 220

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser

245 250 255

Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala

260 265 270

Leu Gly

<210> 2

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaccgaa ctgccttctg ctgccttttc ctgaccaccg ccctgattct gaccgcctgc 60

agcagcggag gcggcggaag cggaagcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacggggctt 120

gccgatgcac taactacgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc tctgacattg 180

gaagactcca ttccccaaaa cggaacacta accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240

ttcaaagccg gcgacaaaga caacagcctc aacacgggca aactgaagaa cgacaaaatc 300

agccgcttcg acttcgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccggca cggcattcgg ttcagacgat 540

gccagtggaa aactgaccta caccatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 600

gaacatttga aatcgccaga actcaatgtt gacctggccg cctccgatat caagccggat 660

aaaaaacgcc atgccgtcat cagcggttcc gtcctttaca accaagccga gaaaggcagt 720

tactctctag gcatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc agaagtggaa 780

accgcaaacg gcatacgcca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 825

<210> 3

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttggcg gcggcggcag tggcggcggc ggcagtggcg gcggcggcag tatgaaacac 60

tttccatcca aagtac 76

<210> 4

<211> 651

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val

20 25 30

Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu

35 40 45

Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile

50 55 60

Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala

100 105 110

Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro

130 135 140

Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro

165 170 175

Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu

195 200 205

Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His

210 215 220

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser

245 250 255

Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala

260 265 270

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Met Leu His Pro Pro Ser Leu Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala

290 295 300

Thr Pro Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser Ala Ala Ala Val Leu

305 310 315 320

Leu Ala Ala Thr Val Ala Ile Val Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly

325 330 335

Ile Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly Thr Ile Thr Ala Ile Gly Gly Ala

340 345 350

Gly Thr Ile Thr Gly Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Gly Ala Ala

355 360 365

Ala Pro Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Thr Ala Leu Thr Leu

370 375 380

Thr Val Ala Gly Ala Leu Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Leu Ala Ala

385 390 395 400

Gly Ser Gly Ile Gly Leu Leu Thr Thr Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ala

405 410 415

Ala Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Thr Ala Ala Leu

420 425 430

Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ile Thr Thr Pro Ala Gly Gly Thr Leu Thr

435 440 445

Ala Ile Val Leu Ile Ala Gly Leu Leu Gly Ala Val Ala Ala Thr Val

450 455 460

Ala Leu His Ala Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ala Ala Ser Leu Ala Gly

465 470 475 480

Thr Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ala Val Leu Thr Ala Ala Gly Ala Leu

485 490 495

Gly Thr Ala Gly Gly Thr Leu Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Leu Ala

500 505 510

Ala Gly Thr Ala Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala

515 520 525

Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Thr Ala Ile

530 535 540

Leu Ala Ala Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Leu Ala Ser Ala

545 550 555 560

Ala Ile Ala Ser Leu Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Gly Thr

565 570 575

Ala Gly Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ser Gly Leu Pro Gly Pro

580 585 590

Thr Ala Val Gly Ala Pro Ala Val Thr Ala Ala Val Gly Gly Thr Leu

595 600 605

Ser Gly Ser Ala Val Ala Ile Gly Thr Gly Pro Ala Pro Thr Gly Ala

610 615 620

Pro Ala Ala Leu Ala Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser

625 630 635 640

Ala Ala Thr His Val Gly Val Ala Thr Gly Thr

645 650

<210> 5

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaccgaa ctgccttctg ctgccttttc ctgaccaccg ccctgattct gaccgcctgc 60

agcagcggag gcggcggaag cggaagcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacggggctt 120

gccgatgcac taactacgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc tctgacattg 180

gaagactcca ttccccaaaa cggaacacta accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240

ttcaaagccg gcgacaaaga caacagcctc aacacgggca aactgaagaa cgacaaaatc 300

agccgcttcg acttcgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccggca cggcattcgg ttcagacgat 540

gccagtggaa aactgaccta caccatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 600

gaacatttga aatcgccaga actcaatgtt gacctggccg cctccgatat caagccggat 660

aaaaaacgcc atgccgtcat cagcggttcc gtcctttaca accaagccga gaaaggcagt 720

tactctctag gcatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc agaagtggaa 780

accgcaaacg gcatacgcca tatcggtctt gccgccaagc agtaaggcgg cggcggcagt 840

ggcggcggcg gcagtggcgg cggcggcagt atgaaacact ttccatccaa agtactgacc 900

acagccatcc ttgccacttt ctgtagcggc gcactggcag ccacaagcga cgacgatgtt 960

aaaaaagctg ccactgtggc cattgttgct gcctacaaca atggccaaga aatcaacggt 1020

ttcaaagctg gagagaccat ctacgacatt ggtgaagacg gcacaattac ccaaaaagac 1080

gcaactgcag ccgatgttga agccgacgac tttaaaggtc tgggtctgaa aaaagtcgtg 1140

actaacctga ccaaaaccgt caatgaaaac aaacaaaacg tcgatgccaa agtaaaagct 1200

gcagaatctg aaatagaaaa gttaacaacc aagttagcag acactgatgc cgctttagca 1260

gatactgatg ccgctctgga tgaaaccacc aacgccttga ataaattggg agaaaatata 1320

acgacatttg ctgaagagac taagacaaat atcgtaaaaa ttgatgaaaa attagaagcc 1380

gtggctgata ccgtcgacaa gcatgccgaa gcattcaacg atatcgccga ttcattggat 1440

gaaaccaaca ctaaggcaga cgaagccgtc aaaaccgcca atgaagccaa acagacggcc 1500

gaagaaacca aacaaaacgt cgatgccaaa gtaaaagctg cagaaactgc agcaggcaaa 1560

gccgaagctg ccgctggcac agctaatact gcagccgaca aggccgaagc tgtcgctgca 1620

aaagttaccg acatcaaagc tgatatcgct acgaacaaag ctgatattgc taaaaactca 1680

gcacgcatcg acagcttgga caaaaacgta gctaatctgc gcaaagaaac ccgccaaggc 1740

cttgcagaac aagccgcgct ctccggcctg ttccaacctt acaacgtggg tcggttcaat 1800

gtaacggctg cagtcggcgg ctacaaatcc gaatcggcag tcgccatcgg taccggcttc 1860

cgctttaccg aaaactttgc cgccaaagca ggcgtggcag tcggcacttc gtccggttct 1920

tccgcagcct accatgtcgg cgtcaattac gagtggtaa 1959

<210> 6

<211> 1725

<212> DNA

<213> respiratory syncytial virus

<400> 6

atggagctgc tgatccacag gttaagtgca atcttcctaa ctcttgctat taatgcattg 60

tacctcacct caagtcagaa cataactgag gagttttacc aatcgacatg tagtgcagtt 120

agcagaggtt attttagtgc tttaagaaca ggttggtata ccagtgtcat aacaatagaa 180

ttaagtaata taaaagaaac caaatgcaat ggaactgaca ctaaagtaaa acttataaaa 240

caagaattag ataagtataa gaatgcagtg acagaattac agctacttat gcaaaacaca 300

ccagctgcca acaaccgggc cagaagagaa gcaccacagt atatgaacta tacaatcaat 360

accactaaaa acctaaatgt atcaataagc aagaagagga aacgaagatt tctgggcttc 420

ttgttaggtg taggatctgc aatagcaagt ggtatagctg tatccaaagt tctacacctt 480

gaaggagaag tgaacaagat caaaaatgct ttgttatcta caaacaaagc tgtagtcagt 540

ctatcaaatg gggtcagtgt tttaaccagc aaagtgttag atctcaagaa ttacataaat 600

aaccaattat tacccatagt aaatcaacag agctgtcgca tctccaacat tgaaacagtt 660

atagaattcc agcagaagaa cagcagattg ttggaaatca acagagaatt cagtgtcaat 720

gcaggtgtaa caacaccttt aagcacttac atgttaacaa acagtgagtt actatcattg 780

atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaaattaa tgtcaagcaa tgttcagata 840

gtaaggcaac aaagttattc tatcatgtct ataataaagg aagaagtcct tgcatatgtt 900

gtacagctac ctatctatgg tgtaatagat acaccttgct ggaaattaca cacatcacct 960

ctatgcacca ccaacatcaa agaaggatca aatatttgtt taacaaggac tgatagagga 1020

tggtattgtg ataatgcagg atcagtatcc ttctttccac aggctgacac ttgtaaagta 1080

cagtccaatc gagtattttg tgacactatg aacagtttga cattaccaag tgaagtcagc 1140

ctttgtaaca ctgacatatt caattccaag tatgactgca aaattatgac atcaaaaaca 1200

gacataagca gctcagtaat tacttctctt ggagctatag tgtcatgcta tggtaaaact 1260

aaatgcactg catccaacaa aaatcgtggg attataaaga cattttctaa tggttgtgac 1320

tatgtgtcaa acaaaggagt agatactgtg tcagtgggca acactttata ctatgtaaac 1380

aagctggaag gcaagaacct ttatgtaaaa ggggaaccta taataaatta ctatgaccct 1440

ctagtgtttc cttctgatga gtttgatgca tcaatatctc aagtcaatga aaaaatcaat 1500

caaagtttag cttttattcg tagatctgat gaattactac ataatgtaaa tactggcaaa 1560

tctactacaa atattatgat aactacaatt attatagtaa tcattgtagt attgttatca 1620

ttaatagcta ttggtttgct gttgtattgc aaagccaaaa acacaccagt tacactaagc 1680

aaagaccaac taagtggaat caataatatt gcattcagca aatag 1725

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccaagcttc agaaaaccgt gacctatcaa g 31

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccctcgagac atgaagtttt gcctcactag ta 32

<210> 9

<211> 2306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttagttatt caaaaactac atcttagcag aaaaccgtga cctatcaagc aagaacgaaa 60

ttaaacctgg ggcaaataac catggagctg ctgatccaca ggttaagtgc aatcttccta 120

actcttgcta ttaatgcatt gtacctcacc tcaagtcaga acataactga ggagttttac 180

caatcgacat gtagtgcagt tagcagaggt tattttagtg ctttaagaac aggttggtat 240

accagtgtca taacaataga attaagtaat ataaaagaaa ccaaatgcaa tggaactgac 300

actaaagtaa aacttataaa acaagaatta gataagtata agaatgcagt gacagaatta 360

cagctactta tgcaaaacac accagctgcc aacaaccggg ccagaagaga agcaccacag 420

tatatgaact atacaatcaa taccactaaa aacctaaatg tatcaataag caagaagagg 480

aaacgaagat ttctgggctt cttgttaggt gtaggatctg caatagcaag tggtatagct 540

gtatccaaag ttctacacct tgaaggagaa gtgaacaaga tcaaaaatgc tttgttatct 600

acaaacaaag ctgtagtcag tctatcaaat ggggtcagtg ttttaaccag caaagtgtta 660

gatctcaaga attacataaa taaccaatta ttacccatag taaatcaaca gagctgtcgc 720

atctccaaca ttgaaacagt tatagaattc cagcagaaga acagcagatt gttggaaatc 780

aacagagaat tcagtgtcaa tgcaggtgta acaacacctt taagcactta catgttaaca 840

aacagtgagt tactatcatt gatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaaatta 900

atgtcaagca atgttcagat agtaaggcaa caaagttatt ctatcatgtc tataataaag 960

gaagaagtcc ttgcatatgt tgtacagcta cctatctatg gtgtaataga tacaccttgc 1020

tggaaattac acacatcacc tctatgcacc accaacatca aagaaggatc aaatatttgt 1080

ttaacaagga ctgatagagg atggtattgt gataatgcag gatcagtatc cttctttcca 1140

caggctgaca cttgtaaagt acagtccaat cgagtatttt gtgacactat gaacagtttg 1200

acattaccaa gtgaagtcag cctttgtaac actgacatat tcaattccaa gtatgactgc 1260

aaaattatga catcaaaaac agacataagc agctcagtaa ttacttctct tggagctata 1320

gtgtcatgct atggtaaaac taaatgcact gcatccaaca aaaatcgtgg gattataaag 1380

acattttcta atggttgtga ctatgtgtca aacaaaggag tagatactgt gtcagtgggc 1440

aacactttat actatgtaaa caagctggaa ggcaagaacc tttatgtaaa aggggaacct 1500

ataataaatt actatgaccc tctagtgttt ccttctgatg agtttgatgc atcaatatct 1560

caagtcaatg aaaaaatcaa tcaaagttta gcttttattc gtagatctga tgaattacta 1620

cataatgtaa atactggcaa atctactaca aatattatga taactacaat tattatagta 1680

atcattgtag tattgttatc attaatagct attggtttgc tgttgtattg caaagccaaa 1740

aacacaccag ttacactaag caaagaccaa ctaagtggaa tcaataatat tgcattcagc 1800

aaatagacaa aaaaccacct gatcatgttt caacaacagt ctgctgatca ccaatcccaa 1860

atcaacccat aacaaacact tcaacatcac agtacaggct gaatcatttc ttcacatcat 1920

gctacccaca caactaagct agatccttaa ctcatagtta cataaaaacc tcaagtatca 1980

caatcaaaca ctaaatcaac acatcattca caaaattaac agctggggca aatatgtcgc 2040

gaagaaatcc ttgtaaattt gagattagag gtcattgctt gaatggtaga agatgtcact 2100

acagtcataa ttactttgaa tggcctcctc atgccttact agtgaggcaa aacttcatgt 2160

taaacaagat actcaagtca atggacaaaa gcatagacac tttgtctgaa ataagtggag 2220

ctgctgaact ggacagaaca gaagaatatg ctcttggtat agttggagtg ctagagagtt 2280

acataggatc tataaacaac ataaca 2306

Claims

1.一种抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：

上述组分的免疫中间体分别制备，临用混合。

2.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

3.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：7所示。

4.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：8所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：9所示。

5.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：RSV蛋白为F蛋白，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示。

6.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：重组的RSV蛋白抗原为pcDNA3.1-F。

7.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：减毒胞内细菌载体选自：L3261、SL7207或ty21a。

8.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：转染至细菌载体内的RSV抗原为SL7207/pcDNA3.1-F。

9.根据权利要求1所述抗Hib-RSV-脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于：Hib-脑膜炎球菌中间体和RSV免疫中间体均为冻干粉剂。