CN108619501A - 抗rsv和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法及缀合疫苗，所述方法用于制备包括RSV免疫原性蛋白、脑膜炎球菌多糖和脑膜炎球菌载体蛋白的缀合疫苗，所述缀合疫苗先将活化的脑膜炎球菌多糖活化后与RSV免疫原性蛋白相连，缀合后再与脑膜炎球菌载体蛋白相连；该方法制备获得的缀合疫苗以RSV免疫原性蛋白和脑膜炎球菌多糖作为抗原，脑膜炎球菌重组蛋白为多糖载体蛋白，所述重组蛋白包括重组ΔfHbp、柔性连接肽段和NadA，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域。

Description

抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法，属于生物技术领域，尤其是生物医药领域。
背景技术
一、呼吸道合胞病毒及其流行病学
呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，尚无有效的疫苗可用。RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和因肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院率达70％，2周岁以内的儿童感染率甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。
RSV隶属于副粘病毒科肺病毒属，是单股负链RNA病毒。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，包括三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusion protein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白高度差异，根据G蛋白抗原性差异RSV可分为A和B两个亚型；RSV的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSV F和G糖蛋白的中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSVF和G蛋白已被公认为RSV的毒力致病分子和保护性抗原。
对于RSV而言，20世纪60年代，FμLginiti VA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半敏感感染/复制模型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防止婴幼儿感染，在之后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。
近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV疫苗有望用于新生儿。载体疫苗主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vacciniavirus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。
二、脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)及其流行病学
流行性脑脊髓膜炎(epidemic cerebrospinal meningitis)是由脑膜炎奈瑟氏菌，通过呼吸道传播引起的急性化脓性脑膜炎，在世界各地均有不同程度的流行。脑膜炎奈瑟菌也称为脑膜炎球菌，是一类革兰染色阴性双球菌，通常定植在人的鼻咽部。人类是其唯一宿主，因而Nm表现出对人类鼻咽部高度的适应性，10％-40％的健康人群都是Nm的无临床症状携带者，在脑膜炎爆发性流行时期，无症状携带者比例更可高达70％。少数情况下，Nm可经血侵入脑脊髓膜，引起化脓性炎症，出现脑膜刺激症和化脓性脑膜炎的脑脊液变化。疫苗预防是防治脑膜炎球菌病的重要手段，因为即使采用抗生素干涉，这种疾病仍有高发病率和死亡率。
具有致病性的Nm菌株一般都具有荚膜结构，健康人群正常携带的菌株往往会缺失荚膜，成为不能分群的菌株。根据Nm荚膜多糖的化学组成可将其分成A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和w135 13个血清群(Serogroup)，而根据其外膜蛋白(OMP)、PorB(2或3类OMp)和PorA(1类OMP)的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。全球每年约发生120万的Nm感染病例，多数病例是由A、B、C、W135、Y群菌株引起。而在发达国家中由B群Nm引起的流行性脑脊髓膜炎病例更是高达总病例的80％。在我国的流行主要以A群为主，近年来由于疫苗的广泛接种，A群引起的感染得到有效控制，而由B群引起的病例也相对增多。单一血清群、血清型和血清亚型的流脑菌苗在整体上很难预防流行性脑脊髓膜炎的发生。随着对Nm表面抗原结构更加深入的研究，流脑菌苗正朝着多元化方向发展。
流脑多糖-蛋白缀合菌苗已有研制，Chiron和Wyem使用脱毒白喉类毒素(CRM197)作为蛋白载体，Baxter用破伤风类毒素作为载体，开发了A/C群脑膜炎球菌缀合疫苗，于1999年11月引入了英国。此后Sanofi-Pasteur开发了A/C/Y/W135群多糖共价结合白喉类毒素(MCV4)的四价缀合疫苗，我国已有几种A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白TT的缀合疫苗批准上市。由于脑膜炎球菌多糖及缀合疫苗应用，有效的预防了A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的感染。与A、C、W135、Y群菌株荚膜多糖不同，B群Nm菌株的荚膜多糖免疫原性较低，并且MenB荚膜多糖的结构与正在发育的神经组织及少数成熟组织中的神经细胞黏附分子同源，免疫接种易产生自身免疫。因此，B群Nm的荚膜多糖不能用作疫苗的抗原成份。B群疫苗的研究目前主要集中在非荚膜抗原，如蛋白、脂多糖(1ipopolysaccharide，LOS)等。筛选非荚膜表面抗原的主要挑战是其安全性、抗原保守性及能引发广泛有效的杀菌力反应。能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点：在大多数菌株中都表达且结构保守；可诱生杀菌抗体或保护性抗体。目前在蛋白质疫苗的研究方面取得了一定进展，诺华公司应用反向疫苗学研制的4CMenB疫苗已通过Ⅲ期临床实验。在研热点候选抗原有PorA，NhhA、GNA2132、NadA和fHBP等，其中fHBP是最有前途的候选蛋白质之一。
fHBP为因子H结合蛋白(Factor H-binding Protein，fHBP)，又称为脂蛋白2086，几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面，由255个氨基酸残基组成，分子量29000。因子H是补体替代途径的关键调节子，它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径c3转化酶C3bBb的衰变。fHBP和因子H结合可下调替代途径，从而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。fHBP对于脑膜炎球菌在人类的血液、血清和抗菌性多肽存在的情况下的生存是极为重要的。其氨基酸序列较保守，变种内91.6％-100％氨基酸相同。重组fHBP抗体可引起针对同一类变种的补体介导的杀菌作用和诱导感染乳鼠模型的被动保护。由完整fHBP获得的抗体不仅滴度高，且对顺序变异不敏感，即使有少量氨基酸改变，只要决定空间构象的关键氨基酸不变，抗体杀菌活性变化不大。所有这些特点使fHBP成为脑膜炎奈瑟菌最有效的抗原之一和最有希望的候选通用疫苗。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3个抗原变体组。通常，针对变体V1的fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表达fHbp的菌株，反之亦然。在每个变体组中也存在fHbp的亚变体。最近，fHbp的分子结构已显示为“模块化”，fHbp变体含有五个可变结构域的不同组合(VA～VE)，每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。因此，通过基因工程手段自由组合五个结构域可以得到覆盖A、B两个亚族三种变体的抗原的重组ΔfHbp蛋白，成为广谱的疫苗抗原及蛋白载体。
但是，单独使用fHbp蛋白也有一定的缺陷，因为在有些MenB菌株中fHbp蛋白表达水平较低，只有fHbp的抗原的疫苗不可能足以用于广泛的免疫脑膜炎球菌的感染，融合表达多种抗原不失为一个良好的选择。在研的一种纯蛋白疫苗(LP2086)中含有三种组分，其中两个组分是融合蛋白(GNA 2091与fHbp融合，GNA 2132与GNA 1030融合)，第三个组分是重组NadA。5种抗原负染应用可以引起小鼠中的大多数血清杀菌应答，起到良好的保护。其中，GNA 2091、GNA 2132和GNA 1030均为未知功能蛋白组分，而NadA为奈瑟氏菌粘附素A，在体外结合上皮细胞的粘附素/侵袭素。该抗原在MenB菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，但是不存在于某些遗传谱系的菌株中，仅有50％的MenB致病菌株表达NadA蛋白，但这50％都是高致病菌。融合表达ΔfHbp蛋白和NadA蛋白，无疑能提高其抗原性，并以此抗原为蛋白载体，结合A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖，理论上该多价缀合疫苗可预防A、B、C、Y和W135五个亚群致病菌的感染，从而预防绝大部分Nm感染导致的流行性脑脊髓膜炎。
三、细菌载体疫苗概述
细菌载体疫苗是将异源抗原基因插入活细菌的染色体或质粒载体中，激发免疫系统提呈异源抗原并产生免疫保护，从而达到预防一种或多种疾病的新型疫苗。减毒细菌疫苗载体因具有：生产相对低廉；操作方法简便易行；可以携带较大的基因片段，易于构建多价疫苗；以及免疫佐剂活性等优点，被广泛用于疫苗研究。沙门氏菌是目前的细菌载体方面的研究热点，沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，可用其作为疫苗载体携带原核表达质粒和真核表达质粒，重组减毒沙门氏菌疫苗制备简单，免疫方便，有较强的免疫原性，能诱导持久的免疫反应，尤其可诱导较强的黏膜免疫反应。但沙门氏菌是一种非常重要的人兽共患细菌病，主要引起人和动物的肠炎、败血症等。因此以沙门氏菌作为细菌载体，需要对其进行减毒处理，减毒沙门氏菌是通过物理、化学或基因工程等方法，使沙门氏菌某些特定的基因发生不可逆的突变，使其毒力大大降低，感染宿主细胞后可在体内生长繁殖。研究表明减毒沙门氏菌在肠道的侵入机制主要包括上皮细胞途径和非上皮细胞途径两种。携带质粒DNA的减毒沙门氏菌被巨噬细胞、树突状细胞等细胞吞噬后，这些吞噬细胞被激活活化，开始分化并向脾脏和淋巴结等组织迁移，在此期间减毒沙门氏菌死亡，裂解释放其携带的真核质粒，真核质粒经过“特定转运”和“渗漏”进入吞噬细胞的细胞质，再进入细胞核转录后于细胞质表达外源抗原。
由于沙门氏菌作为载体递呈疫苗具有很大的优点，且易于保证体内的免疫平衡，RSV病毒疫苗又具有上述缺陷，因此取长补短，将目光集中在新型载体与RSV病毒的结合上，是本领域研究人员对于RSV疫苗的研究新方向。
由于呼吸道合胞病毒与流脑病毒均是通常定植在人的鼻咽部的病毒，婴幼儿等易感人群极易同时发生两种病毒感染，因此，设计研发一种可以同时免疫上述两种病毒的新型疫苗是十分必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以蛋白改性技术为基础，获得一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗制备方法的技术方案如下：
抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，所述方法用于制备包括RSV免疫原性蛋白、脑膜炎球菌多糖和脑膜炎球菌载体蛋白的缀合疫苗，所述缀合疫苗先将活化的脑膜炎球菌多糖活化后与RSV免疫原性蛋白相连，缀合后再与脑膜炎球菌载体蛋白相连。
这种连接方式保证了RSV的免疫原性蛋白与脑膜炎球菌多糖的连接效率，先异源再同源连接，此时多糖不仅是该缀合疫苗的抗原之一，也是两个蛋白之间的桥梁，通过与蛋白质亲和力较高的多糖连接一种蛋白抗原与另一种载体蛋白，不仅可以起到双重免疫的作用，还保证了该缀合疫苗的生产效率和质量。如将两个蛋白的连接顺序颠倒或同时加入两种蛋白，则脑膜炎球菌载体蛋白会因为高亲和力而导致RSV蛋白处于游离状态，极少数可以被缀合在多糖周围。
优选的，所述方法包括如下步骤：
a)活化多糖：通过活化剂在多糖表面形成醛基或羟基；
b)RSV免疫原性蛋白缀合：向活化的多糖中加入RSV蛋白冻干粉，磁力搅拌均匀后加入氰基硼氢化钠溶解，反应后洗脱收集多糖-RSV蛋白缀合物；
c)脑膜炎球菌蛋白缀合：将步骤b)中收集的多糖-RSV蛋白缀合物超滤浓缩，加入脑膜炎球菌蛋白和氰基硼氢化钠，反应至少48h后加入硼氢化钠，反应后洗脱收集多糖-双蛋白缀合物。
优选的，所述活化多糖采用的方式具体为：加入高碘酸盐使多糖上相邻的双羟基氧化为醛基。
优选的，RSV免疫原性蛋白缀合和脑膜炎球菌蛋白缀合在洗脱前，加入硫酸铵溶液平衡层析柱。
更优选的，活化后的多糖活化度≥5。
优选的，单一种类的多糖与单一蛋白的质量比为0.8～2.5:1。
本发明的第二个目的在于提供一种通过上述抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法制备得到的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗，所述缀合疫苗以RSV免疫原性蛋白和脑膜炎球菌多糖作为抗原，脑膜炎球菌重组蛋白为多糖载体蛋白，所述重组蛋白包括重组ΔfHbp、柔性连接肽段和NadA，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域。
优选的，所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
优选的，RSV免疫原性蛋白选自RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G。
与现有技术相比，本发明采用先异源后同源的方法连接活化多糖、蛋白载体和蛋白抗原，构建了两联苗同时免疫两种疾病的作用，脑膜炎球菌免疫中间体针对B群脑膜炎球菌荚膜多糖成份不适合用作疫苗，利用反向遗传学的技术，表达B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白重组蛋白与奈瑟氏菌粘附素A蛋白的融合产物ΔfHbp-NadA。该融合蛋白的ΔfHbp含有fHbp A亚族和fHbp B亚族(V1～V3三种变体)的保守结构域，能够覆盖所有表达fHbp蛋白的Nm B群菌株，并且，ΔfHbp包含fHbp完整的VA～VE五个结构域，其结构、功能和抗原位点保持了完整性；同时，该融合蛋白的NadA在50％的Nm B群菌株中表达，且这些菌株基本为高致病菌。因此即使不表达fHbp但表达NadA的菌株也能被ΔfHbp-NadA蛋白覆盖，以此重组蛋白为抗原制成的蛋白疫苗能广谱保护几乎所有Nm B群致病菌的感染；两种抗原缀合作为疫苗，可进行广谱保护，减少接种次数和接种后反应，对于接种者具有积极意义。
附图说明
图1为fHbp V1～V3可变体结构域及重组ΔfHbp结构域；
图2为ΔfHbp扩增电泳图谱与pET-ΔfHbp鉴定电泳图谱；
图3为NadA扩增电泳图谱与pET-Δfhbp-NadA鉴定电泳图谱；
图4为IPTG诱导重组菌表达ΔfHbp和ΔfHbp-NadA蛋白；
图5为Western-Blot鉴定ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白；
图6为SDS-PAGE鉴定纯化后的ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白；
图7为SDS-PAGE鉴定大规模纯化后的ΔfHbp-NadA重组蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
1、ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的克隆和原核表达
1.1、Pet-ΔfHbp和Pet-ΔfHbp-NadA重组质粒的构建
fHbp是一种膜表面脂蛋白，许多脑膜炎球菌的菌株都带有其基因，也发现不携带该基因的菌株。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3个抗原变体组V1～V3。通常，针对变体V1的fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表达fHbp的菌株，反之亦然。fHbp的蛋白分子含有五个可变结构域的不同组合(VA～VE)，每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。我们根据其结构域特点，设计了ΔfHbp的结构(如图1所示)，其包含V1的A、B结构域(B结构域上含有V1的抗原表位)，以及V3的C、D、E结构域(C、D、E结构域含有V2和V3的抗原表位，且其174-216位氨基酸高度保守，只有个别氨基酸的差异)，理论上，重组的ΔfHbp能覆盖所有野生型fHbp 3个变体的抗原位点，具有广谱抗菌的潜力。
根据GeneBank登录的fHbp V1和fHbp V3全长CDS序列，我们设计如下2对引物：引物在P1和P4位置分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。
P1：GGATTCATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCC
P2：GCCGGGCAGTTGGTTGAAGGCGGTA
P3：ACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCA
P4：AAGCTTTTACTGCTTGGCGGCAAGACCGATA
分别以表达fHbp V1和V3的两株MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，进行PCR扩增。其中P1，P2可扩增fHbp V1的A、B结构域基因片段，P3和P4可扩增V3的C、D、E结构域基因片段。再以这两段基因片段为模板，P1，P4为引物，进行搭桥PCR，可扩增得到重组的ΔfHbp全长片段。用BamH I和HindⅢ双酶切目的基因(PCR产物)和原核表达载体pET32a(+)，凝胶回收盒回收Δfhbp基因片段和线性pET32a载体。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和HindⅢ双酶切鉴定的约800bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒pET-ΔfHbp，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图2所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，其ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ IDNO：2(826bp)所示。
SEQ ID NO：2(826bp)：
ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA
其氨基酸序列为SEQ ID NO：1：
MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
但单独使用ΔfHbp蛋白也有一定的缺陷，因为在有些MenB菌株中fHbp蛋白表达水平较低，只有ΔfHbp抗原的疫苗不可能足以用于广泛的免疫脑膜炎球菌的感染。奈瑟氏菌粘附素A(NadA)，在体外结合上皮细胞的粘附素/侵袭素。该抗原在MenB菌株中是非常保守的(>96％氨基酸同一性)，不存在于某些遗传谱系的菌株中，仅有50％的MenB致病菌株表达NadA蛋白，但这50％都是高致病菌。融合表达ΔfHbp蛋白和NadA蛋白，无疑能提高其抗原性，但两个蛋白之间要加上柔性的链接肽段，最为经典的即为Huston设计合成的(GGGGS)3序列，有利于两个蛋白能够正确折叠，从而不影响其各自的免疫原型。根据GeneBank登录的NadA全长CDS序列，设计引物：引物P5和P6分别引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，同时P5的酶切位点后设计表达(GGGGS)3连接蛋白的序列。
P5：AAGCTT GGCGGCGGCGGCAGT GGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTATGAAACACTTTCCATCCAAAGTAC(SEQ ID NO：3)
P6：CTCGAGTTACCACTCGTAATTGACGCCGACA
以表达NadA的MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，P5，P6为引物，扩增得到NadA蛋白的全长CDS序列，用HindⅢ和XhoⅠ双酶切目的基因(NadA产物)和重组质粒pET-ΔfHbp，凝胶回收盒回收NadA基因片段和线性pET-ΔfHbp载体。胶回收后，用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和XhoⅠ双酶切鉴定的约1900bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒pET-ΔfHbp-NadA，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图3所示。将鉴定正确的重组质粒以15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5(1089bp)所示。
SEQ ID NO：5(1089bp)：
ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAAGGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTGGCGGCGGCGGCAGTATGAAACACTTTCCATCCAAAGTACTGACCACAGCCATCCTTGCCACTTTCTGTAGCGGCGCACTGGCAGCCACAAGCGACGACGATGTTAAAAAAGCTGCCACTGTGGCCATTGTTGCTGCCTACAACAATGGCCAAGAAATCAACGGTTTCAAAGCTGGAGAGACCATCTACGACATTGGTGAAGACGGCACAATTACCCAAAAAGACGCAACTGCAGCCGATGTTGAAGCCGACGACTTTAAAGGTCTGGGTCTGAAAAAAGTCGTGACTAACCTGACCAAAACCGTCAATGAAAACAAACAAAACGTCGATGCCAAAGTAAAAGCTGCAGAATCTGAAATAGAAAAGTTAACAACCAAGTTAGCAGACACTGATGCCGCTTTAGCAGATACTGATGCCGCTCTGGATGAAACCACCAACGCCTTGAATAAATTGGGAGAAAATATAACGACATTTGCTGAAGAGACTAAGACAAATATCGTAAAAATTGATGAAAAATTAGAAGCCGTGGCTGATACCGTCGACAAGCATGCCGAAGCATTCAACGATATCGCCGATTCATTGGATGAAACCAACACTAAGGCAGACGAAGCCGTCAAAACCGCCAATGAAGCCAAACAGACGGCCGAAGAAACCAAACAAAACGTCGATGCCAAAGTAAAAGCTGCAGAAACTGCAGCAGGCAAAGCCGAAGCTGCCGCTGGCACAGCTAATACTGCAGCCGACAAGGCCGAAGCTGTCGCTGCAAAAGTTACCGACATCAAAGCTGATATCGCTACGAACAAAGCTGATATTGCTAAAAACTCAGCACGCATCGACAGCTTGGACAAAAACGTAGCTAATCTGCGCAAAGAAACCCGCCAAGGCCTTGCAGAACAAGCCGCGCTCTCCGGCCTGTTCCAACCTTACAACGTGGGTCGGTTCAATGTAACGGCTGCAGTCGGCGGCTACAAATCCGAATCGGCAGTCGCCATCGGTACCGGCTTCCGCTTTACCGAAAACTTTGCCGCCAAAGCAGGCGTGGCAGTCGGCACTTCGTCCGGTTCTTCCGCAGCCTACCATGTCGGCGTCAATTACGAGTGGTAA
其氨基酸序列为SEQ ID NO：4：
MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQGGGGSGGGGSGGGGSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW
1.2、ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的原核表达及鉴定
将重组质粒pET-ΔfHbp和pET-ΔfHbp-NadA转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含50μg/ml卡纳青霉素)，得到ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD600约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图4显示，ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量分别为30kD和72kD。经Western-Blot鉴定为ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白，如图5所示：1，3泳道为ΔfHbp/BL21(DE3)诱导表达物，2，4泳道为ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)诱导表达物，1，2用fHbp单抗检测，分别有30kD和72kD的预期条带，3，4用NadA单抗检测，只有4泳道有72kD条带，结果符合预期。最后两个重组蛋白经质谱鉴定，确定为ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白。
2、ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白的小规模纯化及其免疫效果评价
将ΔfHbp/BL21(DE3)和ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)接种LB(含50μg/ml卡纳霉素)液体培养基，37℃、200rpm培养12小时，以1％接种比例扩大培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。离心机离心收集菌体。超声破菌，之前的SDS-PAGE显示，重组蛋白表达以包涵体的形式(图3)。先后用TE+300mM Nacl，TE+1％Triton-100洗涤包涵体后，8000rpm离心20min获得包涵体，洗涤后，溶解于3mol/L urea，20mmol/LTris-Cl，1mmol/L EDTA，pH4.0溶液中，经CM柱离子交换层析纯化，可得到与目标蛋白大小相符的两个目的蛋白。最后待重组蛋白稀释复性至24h后，超滤器低温快速浓缩至原体积的1.2倍，过阴离子交换柱Q SepharoseF.F，收集目的蛋白峰，检测方法同图4与图5，凝胶检测蛋白含量达到95.3％以上，纯化效果如图6所示，WB检测确为目的蛋白。用PBS(pH7.4)透析除盐后，BCA法测蛋白浓度含量约0.5mg/mL。
小鼠免疫：分别用纯化后的ΔfHbp和ΔfHbp-NadA重组蛋白皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次纯化后的ΔfHbp或ΔfHbp-NadA重组蛋白50ug/只(溶解于0.2ml生理盐水中)，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，具体方法如下：采用纯化后的ΔfHbp或ΔfHbp-NadA重组蛋白，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价(表1)。两种重组蛋白免疫小鼠后均产生了高低度的血清抗体。
表1.各组抗原三次免疫小鼠后血清抗体的滴度测定(几何平均值)
免疫抗原 血清IgG抗体滴度(GMT)
ΔfHbp 1:25489
ΔfHbp-NadA 1:29346
阴性对照(生理盐水) 0
两种重组蛋白免疫效果的评价，采取两种方法，一为全菌体包被测定全细胞ELISA，另一为流行株的杀菌力实验。全菌体包被选择MenB群菌株MC58(高表达fHbp V1可变体)、8047(高表达fHbp V2可变体)、M1239高表达fHbp V3可变体)，961-5945(中量表达fHbp蛋白)和67/00(低量表达fHbp蛋白)，将这些菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生理盐水溶解，甲醛杀菌后，稀释为2×108个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜，洗板后，进行检测，结果见表2。同样，培养MenB群菌株MC58(高表达fHbp V1可变体)、8047(高表达fHbp V2可变体)、M1239高表达fHbp V3可变体)，961-5945(中量表达fHbp蛋白)和67/00(低量表达fHbp蛋白)后用相应血清抗体进行杀菌检测，测定并计算杀菌抗体滴度(与补体阴性对照孔相比，50％以上杀菌率的血清最高稀释度为血清抗体杀菌滴度)，结果见表3。
表2.各MenB菌株全细胞ELISA
菌株 ΔfHbp血清 ΔfHbp-NadA血清 生理盐水血清
MC58 979956 1204853 <200
8047 534678 1024568 <200
M1239 997854 1204674 <200
961-5945 328940 846780 <200
67/00 25679 597690 <200
表3.各MenB菌株杀菌力实验:BC50titer(1：)
菌株 ΔfHbp血清 ΔfHbp-NadA血清 生理盐水血清
MC58 1756 1923 1
8047 1023 1234 2
M1239 1872 2014 -2
961-5945 154 657 -1
67/00 6 456 1
备注：杀菌力实验以大于1：8为具有保护性。
由表2和表3的结果综合分析可得，ΔfHbp蛋白疫苗能够有效免疫所有表达fHbp(V1、V3和V2变体)的MenB菌株的侵染，但对低表达甚至不表达fHbp的MenB菌株失去保护能力；而ΔfHbp-NadA蛋白疫苗在免疫所有表达fHbp(V1、V3和V2变体)的MenB菌株的侵染的基础上，同时能对低表达甚至不表达fHbp的MenB菌株依然具有保护作用。同时，ΔfHbp-NadA蛋白疫苗能够产生更高的抗体效价并具有更强的杀菌能力，说明两种特异性蛋白的融合表达能够起到协同促进免疫反应的作用，并能提供更为广谱的疫苗保护功能。因此，我们的后续工艺选择ΔfHbp-NadA重组蛋白作为新型多价脑膜炎球菌及肺炎球菌缀合疫苗的蛋白载体。
3、工程菌的发酵培养、诱导表达及大规模抗原蛋白浓缩纯化
将上述鉴定正确的ΔfHbp-NadA/BL21(DE3)重组菌株按照药典的要求制成原始种子库和工作种子库。工艺流程如下：
3.1.取工程菌株工作种子库菌种，划种LB琼脂培养基(含卡纳霉素)，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至LB液体培养基(含50μg/ml卡纳霉素)中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到16-20时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，大容量离心机离心收集菌体。
3.2.取菌体加入破菌缓冲液(50mM PB，2mM EDTA，pH7.5)，高压(800-1000bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。采用30-60％硫酸铵分级沉淀，50mM PBPH7.5溶解，50kD超滤5次，并浓缩至原体积的1/5-1/3。
3.3.采用Sepharose QFF层析，平衡液：50mM PB PH7.2，洗脱液：50mM PB+1M NaClPH7.2。洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集10％的洗脱液。
3.4.取10％梯度洗脱液经50KD超滤膜包超滤浓缩，采用Sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集V0处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查即为ΔfHbp-NadA蛋白原液。
技术要求为得到纯度大于95％的重组ΔfHbp-NadA蛋白原液。细菌内毒素不高于20EU/ml，本发明应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。分子量和纯度检查见图7，纯度为96.3％。蛋白特异性检测如图5所示，WB检测为目标蛋白。
4、多糖蛋白缀合
4.1.ACYW135与RSV F蛋白和重组ΔfHbp-NadA蛋白缀合
A群脑膜炎球菌采用29201菌株，C群脑膜炎球菌采用29205菌株，Y群脑膜炎球菌采用29028菌株，W135群脑膜炎球菌采用29037菌株，脑膜炎球菌经发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100KD膜包超滤浓缩，采用25-80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用GE填料Capto adhere和Capto DEAE或其他厂家相同功能性质的离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采用GE Sephadex G25Coarse对流穿峰进行脱盐，乙醇沉淀或冻干回收多糖，置于-20℃保存备用。
将A/C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖溶解至5-15mg/ml，调节pH值至10.8左右，在多糖溶液中加入1/10(g/g)的CDAP，室温、维持pH值10.8的碱性环境下活化多糖8min。按1：1(与活化多糖的体积比)的比例加入0.5mol/L的已二酰肼，室温反应50-70min。50KD膜包超滤去除溴化氰及已二酰肼，得到多糖衍生物。将多糖衍生物与RSV F蛋白以1：1(g/g)的比例混合并搅拌，按碳二亚胺：多糖＝1：10的比例加入碳二亚胺，室温、酸性环境(pH5.6)下反应60min。经100KD超滤膜包超滤去除杂质，并浓缩。最后采用GE Sepharose 4FF进行凝胶层析纯化，收集V0附近的洗脱液。用0.22μm滤膜除菌过滤，得到A/C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖-F蛋白缀合物。
多糖-单蛋白缀合物超滤浓缩后加入重组ΔfHbp-NadA蛋白冻干粉，同样的连接条件缀合至少2h，缀合完成后过柱子层析收集到多糖-双蛋白缀合物。
将此原液采用磷酸铝佐剂搅拌吸附，以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至多价多糖蛋白结合物以多糖含量计终浓度分别为20μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.6mg/ml，搅拌均匀，以预填充注射器分装，0.5ml/支，制成抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗制剂，2-8℃保存。也可在疫苗原液中加入80mg/ml蔗糖作为赋形剂，每支多糖含量20μg/ml冻干后制成蛋白疫苗制剂，2-8℃保存。
4.2.A/C/Y/W135群多糖-ΔfHbp-NadA蛋白缀合疫苗效果评价
小鼠免疫：分别用A/C/Y/W135群多糖-ΔfHbp-NadA蛋白缀合疫苗蛋白原液、冻干制剂和佐剂吸附制剂皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，具体方法如下：采用纯化后的ΔfHbp-NadA重组蛋白，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价(表4)。缀合疫苗原液和两种剂型免疫小鼠后均产生了高低度的血清抗体。
表4.各组抗原三次免疫小鼠后血清抗体的滴度测定(几何平均值)
免疫物 血清IgG抗体滴度(GMT)
疫苗原液 1:22449
疫苗冻干制剂 1:25376
疫苗佐剂吸附制剂 1:24936
阴性对照(生理盐水) 0
缀合疫苗各剂型免疫效果的评价，同样采取两种方法，全菌体包被测定全细胞ELISA和流行株的杀菌力实验。全菌体包被选择A群脑膜炎球菌29201菌株，B群脑膜炎球菌MC58和67/00菌株，C群脑膜炎球菌29205菌株，Y群脑膜炎球菌29028菌株，W135群脑膜炎球菌29037菌株，将这些菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生理盐水溶解，甲醛杀菌后，稀释为2×108个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜，洗板后，用相应疫苗血清抗体进行ELISA检测，结果见表5。
表5.各群脑膜炎球菌菌株全细胞ELISA
菌株 疫苗原液 疫苗冻干制剂 疫苗佐剂吸附制剂 生理盐水
A群29201 1059456 1174856 1298936 <200
C群29205 996543 1025467 1145793 <200
Y群29028 998359 1104574 1221453 <200
W群29037 1032579 1124694 1308945 <200
B群MC58 1125690 1231245 1324760 <200
B群67/00 678947 797320 895680 <200
同样，A群脑膜炎球菌29201菌株，B群脑膜炎球菌MC58和67/00菌株，C群脑膜炎球菌29205菌株，Y群脑膜炎球菌29028菌株，W135群脑膜炎球菌29037菌株后用相应疫苗血清抗体进行杀菌检测，测定并计算杀菌抗体滴度(与补体阴性对照孔相比，50％以上杀菌率的血清最高稀释度为血清抗体杀菌滴度)，结果见表6。
表6.各群脑膜炎球菌菌株杀菌力实验:BC50titer(1：)
菌株 疫苗原液 疫苗冻干制剂 疫苗佐剂吸附制剂 生理盐水
A群29201 1572 1902 1953 1
C群29205 1465 1729 1793 2
Y群29028 1514 1852 1812 -1
W群29037 1439 1765 1832 -1
B群MC58 1599 1780 1832 2
B群67/00 883 932 978 1
备注：杀菌力实验以大于1：8为具有保护性。
由以上结果综合分析可得，以重组ΔfHbp-NadA为蛋白载体的新型多价脑膜炎球菌缀合疫苗具有广谱的免疫效果，其免疫小鼠血清能与A、B、C、Y和W135五个群的模式菌株产生交联反应，同时能够覆盖B群中表达fHbp(3种变体)以及不表达fHbp但表达NadA的高致病菌，并在杀菌检测中表现出广谱且极强的杀菌效果，从而保护人们(尤其是婴幼儿及年老体弱者)免受绝大部分Nm致病菌侵害导致的脊髓脑膜炎危害。
5、抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的免疫活性评价
经活化缀合的抗原复合物以冻干粉的形式储存运输，使用时以生理盐水溶解即可。以小鼠为活体实验对象，选择免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，检测结果如表7所示。
表7
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉博沃生物科技有限公司
<120> 抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val
20 25 30
Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu
35 40 45
Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile
50 55 60
Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr
65 70 75 80
Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu
85 90 95
Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala
100 105 110
Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly
115 120 125
Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu
195 200 205
Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His
210 215 220
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser
225 230 235 240
Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala
260 265 270
Leu Gly
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaccgaa ctgccttctg ctgccttttc ctgaccaccg ccctgattct gaccgcctgc 60
agcagcggag gcggcggaag cggaagcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacggggctt 120
gccgatgcac taactacgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc tctgacattg 180
gaagactcca ttccccaaaa cggaacacta accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240
ttcaaagccg gcgacaaaga caacagcctc aacacgggca aactgaagaa cgacaaaatc 300
agccgcttcg acttcgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360
ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480
ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccggca cggcattcgg ttcagacgat 540
gccagtggaa aactgaccta caccatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 600
gaacatttga aatcgccaga actcaatgtt gacctggccg cctccgatat caagccggat 660
aaaaaacgcc atgccgtcat cagcggttcc gtcctttaca accaagccga gaaaggcagt 720
tactctctag gcatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc agaagtggaa 780
accgcaaacg gcatacgcca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 825
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcttggcg gcggcggcag tggcggcggc ggcagtggcg gcggcggcag tatgaaacac 60
tttccatcca aagtac 76
<210> 4
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val
20 25 30
Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu
35 40 45
Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile
50 55 60
Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr
65 70 75 80
Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu
85 90 95
Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala
100 105 110
Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly
115 120 125
Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu
195 200 205
Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His
210 215 220
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser
225 230 235 240
Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala
260 265 270
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Met Leu His Pro Pro Ser Leu Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala
290 295 300
Thr Pro Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser Ala Ala Ala Val Leu
305 310 315 320
Leu Ala Ala Thr Val Ala Ile Val Ala Ala Thr Ala Ala Gly Gly Gly
325 330 335
Ile Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly Thr Ile Thr Ala Ile Gly Gly Ala
340 345 350
Gly Thr Ile Thr Gly Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Gly Ala Ala
355 360 365
Ala Pro Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Thr Ala Leu Thr Leu
370 375 380
Thr Val Ala Gly Ala Leu Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Leu Ala Ala
385 390 395 400
Gly Ser Gly Ile Gly Leu Leu Thr Thr Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ala
405 410 415
Ala Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ile Thr Thr Pro Ala Gly Gly Thr Leu Thr
435 440 445
Ala Ile Val Leu Ile Ala Gly Leu Leu Gly Ala Val Ala Ala Thr Val
450 455 460
Ala Leu His Ala Gly Ala Pro Ala Ala Ile Ala Ala Ser Leu Ala Gly
465 470 475 480
Thr Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ala Val Leu Thr Ala Ala Gly Ala Leu
485 490 495
Gly Thr Ala Gly Gly Thr Leu Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Leu Ala
500 505 510
Ala Gly Thr Ala Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala
515 520 525
Thr Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Val Thr Ala Ile
530 535 540
Leu Ala Ala Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Leu Ala Ser Ala
545 550 555 560
Ala Ile Ala Ser Leu Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Gly Thr
565 570 575
Ala Gly Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ser Gly Leu Pro Gly Pro
580 585 590
Thr Ala Val Gly Ala Pro Ala Val Thr Ala Ala Val Gly Gly Thr Leu
595 600 605
Ser Gly Ser Ala Val Ala Ile Gly Thr Gly Pro Ala Pro Thr Gly Ala
610 615 620
Pro Ala Ala Leu Ala Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser
625 630 635 640
Ala Ala Thr His Val Gly Val Ala Thr Gly Thr
645 650
<210> 5
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgacatttg ctgaagagac taagacaaat atcgtaaaaa ttgatgaaaa attagaagcc 1380
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cttgcagaac aagccgcgct ctccggcctg ttccaacctt acaacgtggg tcggttcaat 1800
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tccgcagcct accatgtcgg cgtcaattac gagtggtaa 1959
<210> 6
<211> 1725
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<400> 6
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tacctcacct caagtcagaa cataactgag gagttttacc aatcgacatg tagtgcagtt 120
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ttaagtaata taaaagaaac caaatgcaat ggaactgaca ctaaagtaaa acttataaaa 240
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ccagctgcca acaaccgggc cagaagagaa gcaccacagt atatgaacta tacaatcaat 360
accactaaaa acctaaatgt atcaataagc aagaagagga aacgaagatt tctgggcttc 420
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gaaggagaag tgaacaagat caaaaatgct ttgttatcta caaacaaagc tgtagtcagt 540
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aaccaattat tacccatagt aaatcaacag agctgtcgca tctccaacat tgaaacagtt 660
atagaattcc agcagaagaa cagcagattg ttggaaatca acagagaatt cagtgtcaat 720
gcaggtgtaa caacaccttt aagcacttac atgttaacaa acagtgagtt actatcattg 780
atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaaattaa tgtcaagcaa tgttcagata 840
gtaaggcaac aaagttattc tatcatgtct ataataaagg aagaagtcct tgcatatgtt 900
gtacagctac ctatctatgg tgtaatagat acaccttgct ggaaattaca cacatcacct 960
ctatgcacca ccaacatcaa agaaggatca aatatttgtt taacaaggac tgatagagga 1020
tggtattgtg ataatgcagg atcagtatcc ttctttccac aggctgacac ttgtaaagta 1080
cagtccaatc gagtattttg tgacactatg aacagtttga cattaccaag tgaagtcagc 1140
ctttgtaaca ctgacatatt caattccaag tatgactgca aaattatgac atcaaaaaca 1200
gacataagca gctcagtaat tacttctctt ggagctatag tgtcatgcta tggtaaaact 1260
aaatgcactg catccaacaa aaatcgtggg attataaaga cattttctaa tggttgtgac 1320
tatgtgtcaa acaaaggagt agatactgtg tcagtgggca acactttata ctatgtaaac 1380
aagctggaag gcaagaacct ttatgtaaaa ggggaaccta taataaatta ctatgaccct 1440
ctagtgtttc cttctgatga gtttgatgca tcaatatctc aagtcaatga aaaaatcaat 1500
caaagtttag cttttattcg tagatctgat gaattactac ataatgtaaa tactggcaaa 1560
tctactacaa atattatgat aactacaatt attatagtaa tcattgtagt attgttatca 1620
ttaatagcta ttggtttgct gttgtattgc aaagccaaaa acacaccagt tacactaagc 1680
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<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagcttc agaaaaccgt gacctatcaa g 31
<210> 8
<211> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccctcgagac atgaagtttt gcctcactag ta 32
<210> 9
<211> 2306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttagttatt caaaaactac atcttagcag aaaaccgtga cctatcaagc aagaacgaaa 60
ttaaacctgg ggcaaataac catggagctg ctgatccaca ggttaagtgc aatcttccta 120
actcttgcta ttaatgcatt gtacctcacc tcaagtcaga acataactga ggagttttac 180
caatcgacat gtagtgcagt tagcagaggt tattttagtg ctttaagaac aggttggtat 240
accagtgtca taacaataga attaagtaat ataaaagaaa ccaaatgcaa tggaactgac 300
actaaagtaa aacttataaa acaagaatta gataagtata agaatgcagt gacagaatta 360
cagctactta tgcaaaacac accagctgcc aacaaccggg ccagaagaga agcaccacag 420
tatatgaact atacaatcaa taccactaaa aacctaaatg tatcaataag caagaagagg 480
aaacgaagat ttctgggctt cttgttaggt gtaggatctg caatagcaag tggtatagct 540
gtatccaaag ttctacacct tgaaggagaa gtgaacaaga tcaaaaatgc tttgttatct 600
acaaacaaag ctgtagtcag tctatcaaat ggggtcagtg ttttaaccag caaagtgtta 660
gatctcaaga attacataaa taaccaatta ttacccatag taaatcaaca gagctgtcgc 720
atctccaaca ttgaaacagt tatagaattc cagcagaaga acagcagatt gttggaaatc 780
aacagagaat tcagtgtcaa tgcaggtgta acaacacctt taagcactta catgttaaca 840
aacagtgagt tactatcatt gatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaaatta 900
atgtcaagca atgttcagat agtaaggcaa caaagttatt ctatcatgtc tataataaag 960
gaagaagtcc ttgcatatgt tgtacagcta cctatctatg gtgtaataga tacaccttgc 1020
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ttaacaagga ctgatagagg atggtattgt gataatgcag gatcagtatc cttctttcca 1140
caggctgaca cttgtaaagt acagtccaat cgagtatttt gtgacactat gaacagtttg 1200
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acattttcta atggttgtga ctatgtgtca aacaaaggag tagatactgt gtcagtgggc 1440
aacactttat actatgtaaa caagctggaa ggcaagaacc tttatgtaaa aggggaacct 1500
ataataaatt actatgaccc tctagtgttt ccttctgatg agtttgatgc atcaatatct 1560
caagtcaatg aaaaaatcaa tcaaagttta gcttttattc gtagatctga tgaattacta 1620
cataatgtaa atactggcaa atctactaca aatattatga taactacaat tattatagta 1680
atcattgtag tattgttatc attaatagct attggtttgc tgttgtattg caaagccaaa 1740
aacacaccag ttacactaag caaagaccaa ctaagtggaa tcaataatat tgcattcagc 1800
aaatagacaa aaaaccacct gatcatgttt caacaacagt ctgctgatca ccaatcccaa 1860
atcaacccat aacaaacact tcaacatcac agtacaggct gaatcatttc ttcacatcat 1920
gctacccaca caactaagct agatccttaa ctcatagtta cataaaaacc tcaagtatca 1980
caatcaaaca ctaaatcaac acatcattca caaaattaac agctggggca aatatgtcgc 2040
gaagaaatcc ttgtaaattt gagattagag gtcattgctt gaatggtaga agatgtcact 2100
acagtcataa ttactttgaa tggcctcctc atgccttact agtgaggcaa aacttcatgt 2160
taaacaagat actcaagtca atggacaaaa gcatagacac tttgtctgaa ataagtggag 2220
ctgctgaact ggacagaaca gaagaatatg ctcttggtat agttggagtg ctagagagtt 2280
acataggatc tataaacaac ataaca 2306

Claims (11)

1.一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法用于制备包括RSV免疫原性蛋白、脑膜炎球菌多糖和脑膜炎球菌载体蛋白的缀合疫苗，所述缀合疫苗先将活化的脑膜炎球菌多糖活化后与RSV免疫原性蛋白相连，缀合后再与脑膜炎球菌载体蛋白相连。
2.根据权利要求1所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)活化多糖：通过活化剂在多糖表面形成醛基或羟基；
b)RSV免疫原性蛋白缀合：向活化的多糖中加入RSV蛋白冻干粉，磁力搅拌均匀后加入氰基硼氢化钠溶解，反应后洗脱收集多糖-RSV蛋白缀合物；
c)脑膜炎球菌蛋白缀合：将步骤b)中收集的多糖-RSV蛋白缀合物超滤浓缩，加入脑膜炎球菌蛋白和氰基硼氢化钠，反应至少48h后加入硼氢化钠，反应后洗脱收集多糖-双蛋白缀合物。
3.根据权利要求2所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述活化多糖采用的方式具体为：加入高碘酸盐使多糖上相邻的双羟基氧化为醛基。
4.根据权利要求2所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：RSV免疫原性蛋白缀合和脑膜炎球菌蛋白缀合在洗脱前，加入硫酸铵溶液平衡层析柱。
5.根据权利要求4所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：活化后的多糖活化度≥5。
6.根据权利要求2所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：单一种类的多糖与单一蛋白的质量比为0.8～2.5:1。
7.根据权利要求1～6任一所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法制备得到的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗，其特征在于：所述缀合疫苗以RSV免疫原性蛋白和脑膜炎球菌多糖作为抗原，脑膜炎球菌重组蛋白为多糖载体蛋白，所述重组蛋白包括重组ΔfHbp、柔性连接肽段和NadA，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域。
8.根据权利要求7所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
9.根据权利要求7所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗，其特征在于：所述柔性连接肽段的核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
10.根据权利要求7所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp-NadA融合蛋白载体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
11.根据权利要求7所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗，其特征在于：RSV免疫原性蛋白选自RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G。
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