CN102816246B - 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白，它包括鞭毛蛋白，以及人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段；本发明公开了编码前述融合蛋白的DNA分子，以及包含该DNA分子的重组质粒和重组表达载体；本发明公开了该融合蛋白的制备方法和用途；本发明还公开了一种人巨细胞病毒疫苗。本发明融合蛋白的免疫原性强，可刺激机体产生大量抗巨细胞病毒抗体，用于制备疫苗以预防巨细胞病毒感染引起的疾病，具有良好的临床应用前景。

Description

一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法。
背景技术
人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）属于β-疱疹病毒亚科双链DNA病毒，是最常见的机会性感染病毒，其感染具有种属特异性。HCMV感染率因地方不同、年龄不同表现出明显差别。发达国家HCMV抗体阳性率在50％～80％；而发展中国家，80％的小儿在3岁前感染HCMV，至成人期，HCMV感染率甚至可达100％。我国人群感染率高达86%-96%。健康人多呈亚临床型感染或者潜伏感染，无明显临床症状，部分患者可有与传染性单核细胞增多症相似的表现。但是HCMV感染确是引起器官移植受者术后并发症、HIV感染者死亡以及新生儿先天缺陷的重要病因。
目前对HCMV感染和HCMV相关疾病的预防和治疗方法是使用抗病毒药物（如更昔洛韦(ganciclovir)，缬更昔洛韦(Valganciclovir)，膦甲酸(Foscarnet)等）以及人巨细胞病毒特异性免疫球蛋白（HCMV-IVIG）。长时间的药物治疗会对患者产生药物毒性和以及造成病毒产生耐药性，HCMV-IVIG尽管有一定效果，但是治疗费用相对昂贵，接种疫苗是一种比较好的的预防/治疗方式。
现有的人巨细胞病毒疫苗有减毒活疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗、基因工程亚单位疫苗和合成肽疫苗等种类。减毒活疫苗因存在回复突变的可能性以及潜在的致癌性，且保护效力也不强；病毒载体疫苗和DNA疫苗也存在安全性和保护力相对较弱的问题；现有报道的基因工程亚单位疫苗和合成肽疫苗的有效性较差，如，Pass,R.F.et al.“A subunit cytomegalovirus vaccine based on recombinantenvelope glycoprotein B and a new adjuvant.”,J.Infect.Dis.1999，180,970975报道了一种添加佐剂MF59（一种角鲨烯类乳剂）的重组包膜蛋白B亚单位疫苗，其I期临床研究显示，新佐剂MF59与30μg重组gB配伍免疫效果和安全性均优于传统铝佐剂与100μg重组gB。三次免疫后，受试者体内的gB抗体和中和抗体水平高于血清阳性对照，但免疫后体内产生的抗体水平明显下降，尽管第四次免疫可以加强机体应答并产生高水平抗体，但是12个月后抗体中水平又下降到基线水平。并且，文中作者明确阐明“该疫苗有可能降低CMV的胎儿感染率，但不能防止育龄妇女感染”。基于MF59的作用以及Pass的分析，MF59/gB随后进行了II期临床试验。如“Vaccine Prevention of Maternal Cytomegalovirus Infection”，N EnglJ Med.2009，360:1191-1199报道，II期临床试验以检测到CMV感染为主要判定终点，三次接种后，其预防CMV感染效果仅为50%，这一结果进一步说明该疫苗的局限性。为了满足更广泛的临床需求，需要开发新的免疫原或者疫苗。
鞭毛是沙门菌运动性的基础结构，鞭毛蛋白是鞭毛丝状部组成元件。研究发现，鞭毛蛋白作为天然免疫应答的诱导剂，诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答，从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。
发明内容
为了解决现有人巨细胞病毒疫苗有效性差的问题，本发明提供了一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白。
本发明人巨细胞病毒免疫原融合蛋白包括鞭毛蛋白，以及人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段。
所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段代替鞭毛蛋白的高变区。
所述鞭毛蛋白为肠炎沙门菌亚属（Salmonella enterica）鞭毛蛋白2型。
所述鞭毛蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID NO:1所示。
所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白为包膜糖蛋白B或者包膜糖蛋白H。
所述人巨细胞病毒包膜糖蛋白多肽片段的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或者SEQ ID NO：10所示。
优选地，人巨细胞病毒免疫原融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或者SEQ ID NO：20所示。其核苷酸编码序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：17或者SEQ ID NO：19所示。
本发明还提供了SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：17或者SEQ ID NO：19所示核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组质粒，其包括SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或者SEQ ID NO：19所示核苷酸序列，如，重组pET42b质粒。
本发明还提供了一种重组表达载体，其包括前述重组质粒，如，重组大肠杆菌Rossetta。
本发明还提供了前述融合蛋白的制备方法，它包括如下步骤：
（1）取前述的重组表达载体，用IPTG诱导表达；
（2）离心，得沉淀，分离纯化，即得融合蛋白。
本发明还提供了前述融合蛋白在制备人巨细胞病毒疫苗中的用途。
本发明最后提供了一种人巨细胞病毒疫苗，它包含前述任意一项融合蛋白。
本发明制备得到了鞭毛蛋白与人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段的融合蛋白，该融合蛋白的免疫原性强，用于制备疫苗的免疫效果好，临床应用前景良好。
人巨细胞病毒由内向外分为衣壳、被膜和包膜三个主要结构，含有的抗原众多，如，即刻早期蛋白1（immidiate early protein1，IE1）、磷蛋白65（phosphoprotein65，pp65）磷蛋白150（phosphoprotein150，pp150）、磷蛋白28（phosphoprotein28，pp28）、包膜蛋白pUL128、包膜蛋白pUL130、包膜蛋白pUL131A、包膜糖蛋白B、（glycoprotein B，gB）、包膜糖蛋白H（glycoprotein H，gH）、包膜糖蛋白M（glycoprotein M，gM）等。研究发现，不是所有人巨细胞病毒抗原与鞭毛蛋白形成的融合蛋白均可得到免疫原性较强的免疫原，本发明在大量抗原中选择人巨细胞包膜糖蛋白与鞭毛蛋白结合，制备得到了免疫原性较强的免疫原。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1pET42b/FljB酶切鉴定结果，泳道1为pET42b/FljB NdeI/BamHI酶切产物，泳道2为100bp DNA ladder；箭头所指FljB片段
图2pET42b/FljB-AD1酶切鉴定结果图，泳道1为100bp DNA ladder；泳道2为pET42b/FljB-AD1NdeI/BamHI酶切产物；箭头所指FljB-AD1片段
图3FljB-AD1表达鉴定，泳道1为重组菌株诱导前菌体裂解液，泳道2为蛋白分子量标准，泳道3为重组菌株诱导后菌体裂解液
图4FljB-AD1表达鉴定，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为诱导后菌体裂解液沉淀，泳道3为诱导后菌体裂解液上清，箭头所指处为FljB-AD1蛋白
图5FljB-AD1纯化产物鉴定，泳道1为Superdex-200凝胶过滤层析洗脱物，泳道2为蛋白分子量标准，箭头所指FljB-AD1蛋白
图6pET42b/FljB-AD2酶切鉴定，泳道1为pET42b/FljB-AD2NdeI/BamHI酶切产物，泳道2为1kb DNA ladder，箭头所指FljB-AD2片段
图7FljB-AD2表达鉴定，泳道1为重组菌株诱导前菌体裂解液，泳道2为蛋白分子量标准，泳道3为重组菌株诱导表达后菌体裂解液
图8FljB-AD2纯化产物鉴定，泳道1为10倍稀释8M尿素溶解FljB-AD2，泳道2为蛋白分子量标准，箭头所指FljB-AD2
图9pET42b/FljB-4×AD2酶切图谱，泳道1为pET42b/FljB-4×AD2NdeI/BamHI酶切产物，泳道2为1Kb DNA ladder，箭头所指FljB-4×AD2片段
图10FljB-4×AD2表达产物鉴定，泳道1为重组菌株诱导前菌体裂解液，泳道2为重组菌株诱导表达后菌体裂解液，泳道3为蛋白分子量标准
图11FljB-4×AD2表达产物鉴定，泳道1蛋白分子量标准，泳道2为诱导后菌体裂解液上清，泳道3为诱导后菌体裂解液沉淀，箭头所指FljB-4×AD2蛋白
图12FljB-4×AD2纯化产物鉴定，泳道1、蛋白分子量标准，泳道2、Superdex-200凝胶过滤层析洗脱物，箭头所指FljB-4×AD2蛋白
图13pET42b/FljB-AD2-4×gH酶切鉴定结果，泳道1为pET42b/FljB-AD2-4×gH SpeI/KpnI酶切产物，泳道2为100bp DNA ladder，箭头所指AD2-4×gH片段
图14FljB-AD2-4×gH表达产物鉴定，泳道1为重组菌株诱导前菌体裂解液，泳道2为蛋白分子量标准，泳道3为重组菌株诱导后前菌体裂解液，箭头所指FljB-AD2-4×gH蛋白
图15FljB-AD2-4×gH纯化产物鉴定，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为Q Sepharose层析洗脱物，箭头所指FljB-AD2-4×gH蛋白
图16pET42b/FljB-4×gH-4×AD2PCR鉴定，泳道1、pET42b/FljB-4×gH-4×AD2PCR鉴定，泳道2为100bp DNA ladder;箭头所指4×gH-4×AD2PCR片段
图17pET42b/FljB-4×gH-4×AD2-DII酶切鉴定,泳道1为pET42b/FljB-4×gH-4×AD2-DIISpeI/KpnI酶切产物，泳道2为100bp DNA ladder;箭头所指从上到下依次为DII片段、4×AD2片段和4×gH片段
图18FljB-4gH-4AD2-DII诱导表达鉴定，泳道1、2为重组菌株诱导前菌体裂解液，泳道3为蛋白分子量标准，泳道4、5为重组菌株诱导后前菌体裂解液
图19FljB-4gH-4AD2-DII纯化产物鉴定，泳道1为FljB-4gH-4AD2-DII经Q Sepharose层析洗脱物；泳道2为蛋白分子量标准
图20FljB-AD1免疫血清抗体检测结果
图21FljB-AD2免疫血清抗体检测结果
图22FljB-4×AD2免疫血清抗体检测结果
图23FljB-AD2-4gH免疫血清抗体检测结果
图24FljB-4gH-4AD2-DII免疫血清抗体检测结果
图25pET42b/FljB载体
图26gB/ADl（也称为AD1）（SEQ ID NO:4）取代鞭毛蛋白高变区的融合蛋白表达载体
图27gB/AD2（也称为AD2）（SEQ ID NO:3）取代鞭毛蛋白高变区的融合蛋白表达载体
图28gB/4×AD2（也称为4×AD2）（SEQ ID NO:6）取代鞭毛蛋白高变区的融合蛋白表达载体
图294×gH-gB/4×AD2（也称为4×gH-4×AD2）（SEQ ID NO:9）代鞭毛蛋白高变区的融合蛋白表达载体
图304×gH-gB/4×AD2-DII（也称为4×gH-4×AD2-DII）（SEQ ID NO:10）代鞭毛蛋白高变区的融合蛋白表达载体。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实验材料：
pET42b购自Novagen(圣地亚哥，加州，美国)；
鞭毛蛋白FljB，编码FljB的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，合成；
gB，巨细胞病毒包膜糖蛋白B，其第121氨基酸-第619氨基酸序列如SEQID NO：2所示；
AD1是gB中能够与中和抗体结合的保守性抗原表位之一，编码AD1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，合成；
AD2是gB中能够与中和抗体结合的保守性抗原表位之一，编码AD2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，合成；
4×AD2，取上述AD2部分核苷酸序列，重复4段，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
gH是糖蛋白H中的线性中和表位之一，编码4×gH的核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示，合成；
DII是gB中的一个构象表位之一，编码DII的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，合成；
TP600热循环器(TaKaRA，日本)；
用Qiagen凝胶回收试剂盒（德国，货号28606）；
大肠杆菌Rosetta 2(DE3)(Novagen，圣地亚哥，加州，目录编号69053)；
Q Sepharose(GE)。
实施例1pET42b/FljB表达载体的构建
取pET42b质粒和编码鞭毛蛋白FljB的核苷酸，通过NdeI和BamHI内切酶，将编码鞭毛蛋白FljB的核苷酸酶切克隆至pET42b质粒上，即得pET42b/FljB载体。
连接转化：取回收目的片段与pMD19-T simple载体以3:1摩尔比16℃连接1小时，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞（CaCl2法制备）。连接物转化大肠杆菌感受态细胞的具体方法：将TOP10感受态细胞在冰上解冻；加入连接反应物(4μl)，温和地旋转，然后在冰上孵育5分钟；将试管在水浴中，以42℃热激30秒；将试管在冰上冷却至少2分钟；将SOC培养液(400μl)加到细胞中，并且在37℃震荡1小。
筛选：使用两个LB琼脂卡那霉素(50μg/ml)培养皿，以涂布100μl及10μl的转化细胞，并使其生长过夜；氨苄霉素抗性克隆株的筛选：提取单菌落在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液中小量培养；使用QIAprep微量制备质粒试剂盒提取质粒。
构建载体用限制酶酶切鉴定，结果见图1，说明成功构建得到pET42b/FljB载体，其结构如图25所示。
实施例2FljB-AD1融合蛋白表达载体构建及其表达和纯化
一、融合蛋白表达载体构建
取实施例1制备得到的pET42b/FljB及合成的AD1核苷酸序列分别进行SpeI/KpnI双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳，切取260bp AD1以及7.2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝胶回收试剂盒纯化，与pMD19-T simple载体以3:1摩尔比16℃连接1小时。连接产物经转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆（同实施例1），通过质粒提取，酶切质粒鉴定得到pET42b/FljB-AD1，结果如图2，说明成功构建得到pET426b/FljB-AD1载体，其结构如图26所示，FljB-AD1核苷酸序列如SEQ ID NO：13。
二、融合蛋白制备及纯化
pET42b/FljB-AD1转化大肠杆菌Rossetta 2(DE3)得到表达FljB-AD1阳性转化子，并用甘油保存。
将表达FljB-AD1阳性转化子在LB培养液中培养至OD600=0.4，在37℃以1mM IPTG诱导3小时，将转化子诱导前后菌体裂解液进行SDS-PAGE，如图3所示，比较诱导前后的电泳图谱，区别在于：诱导后裂解液在52kDa处出现一明显条带，结合计算的FljB-AD1的分子量大小，可以得知该52KDa大小的蛋白即为FljB-AD1。
放大至1升的规模；使细胞生长于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养液至OD600=0.4，并且在37℃以1mM IPTG诱导3小时；将细胞通过离心而回收(7000转/分钟×7分钟，于TOMY高速离心机)，并且再悬浮于2×PBS 1%TritonX-100、1毫克/毫升的溶菌酶；利用细胞超声破碎仪破碎细胞；将细胞裂解产物离心(20,000g离心1小时，Beckman冷冻高速离心机)，以将可溶性部分从包涵体中分开；可溶性部分和不可溶性部分均通过SDS-PAGE检测，检测结果如图4，可知绝大部分目的蛋白分布于沉淀。
将不可溶性部分用8M尿素pH8.0溶解，10000×g离心15min，取上清，再用缓冲液：20mM Tris-C1，150mM NaCl，pH8.0以10倍稀释。最后利用Superdex-200凝胶过滤层析，柱子用50mM Tris、150mM NaCI及1%甘油加上1%脱氧胆酸钠冲洗；缓冲液交换是用含有50mM Tris.100mM NaCl及1%甘油的缓冲液过夜透析而进行。蛋白质浓度是通过MicroBCA蛋白质分析试剂盒(Pierce Biotechnology)而测定；纯化的FljB-AD 1制备物在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶鉴定，如图5所示，有约52kDa的明显条带，经考马斯亮蓝(Coommassie Blue)染色观察到的较单一条带且与小量诱导目的蛋白大小一致。
实施例3 FljB-AD2融合蛋白表达载体构建及其表达和纯化
一、融合蛋白表达载体构建
将实施例1构建好的pET42b/FljB及pUC57（含有合成的AD2序列SEQ IDNO:3）分别进行SpeI/KpnI双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳，切取318bp AD2以及7.2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝胶回收试剂盒纯化，连接反应同实施例1。连接产物经转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆（同实施例1），通过质粒提取，酶切质粒鉴定得到pET42b/FljB-AD2，结果如图6，说明成功构建得到pET42b/FljB-AD2载体，其结构如图27所示，FljB-AD2融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
二、融合蛋白制备及纯化
pET42b/FljB-AD2转化大肠杆菌Rossetta 2(DE3)得到表达FljB-AD2阳性转化子，并用甘油保存。
将表达FljB-AD2阳性转化子在LB培养液中培养至OD600=0.4，在37℃以1mM IPTG诱导3小时，转化子诱导前后菌体裂解液进行SDS-PAGE，如图7所示，比较诱导前后的电泳图谱，区别在于：诱导后裂解液在54kDa处出现一明显条带，结合计算的FljB-AD2的分子量大小，可以得知该54KDa大小的蛋白即为FljB-AD2。
随后放大至1升的规模；使细胞生长于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养液至OD.600=0.4，并且在37℃以1mM IPTG诱导3小时；将细胞通过离心而回收(7000转/分钟×7分钟，于TOMY高速离心机)，并且再悬浮于2×PBS1%TritonX-100、1毫克/毫升的溶菌酶；利用细胞超声破碎仪破碎细胞；将细胞裂解产物离心(20,000g离心1小时，Beckman冷冻高速离心机)，以将可溶性部分从包涵体中分开；弃去上清。
将沉淀部分用8M尿素pH8.0溶解，10000×g离心15min，取上清，再用缓冲液：20mM Tris-C1，150mM NaCl，pH8.0以10倍稀释。
蛋白质浓度是通过MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(Pierce Biotechnology)而测定；纯化的FljB-AD2制备物用在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶鉴定，如图8所示，有约54kDa的明显条带，经考马斯亮蓝(Coommassie Blue)染色观察到的较单一条带且与小量诱导目的蛋白大小一致。
实施例4 FljB-4AD2融合蛋白表达载体构建及其表达和纯化
一、融合蛋白表达载体构建
将构建好的pET42b/FljB及pUC57（含有合成的4×AD2核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）分别进行SpeI/KpnI双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳，切取180bp4×AD2以及7.2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝胶回收试剂盒纯化，连接反应如前述。连接产物经转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆（同步骤（一）），通过质粒提取，酶切质粒鉴定得到pET42b/FljB-4×AD2，结果如图9所示，说明成功构建得到pET42b/FljB-4×AD2载体，其结构如图28所示，FljB-4×AD2融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
2、融合蛋白表达及纯化
pET42b/FljB-4×AD2转化大肠杆菌Rosetta 2(DE3)得到表达FljB-4×AD2阳性转化子，并用甘油保存。
将表达FljB-4×AD2阳性转化子在LB培养液中培养至OD600=0.4，在37℃以1mM IPTG诱导3小时，，转化子诱导前后菌体裂解液进行SDS-PAGE，如图10所示，比较诱导前后的电泳图谱，区别在于：诱导后裂解液在50kDa处出现一明显条带，结合计算的FljB-4×AD2的分子量大小，可以得知该50KDa大小的蛋白即为FljB-4×AD2。
放大至1升的规模；使细胞生长于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养液至OD.600=0.4，并且在37℃以1mM IPTG诱导3小时；将细胞通过离心而回收(7000转/分钟×7分钟，于TOMY高速离心机)，并且再悬浮于2×PBS 1%TritonX-100、1毫克/毫升的溶菌酶；利用细胞超声破碎仪破碎细胞；将细胞裂解产物离心(20,000g离心1小时，Beckman冷冻高速离心机)，以将可溶性部分从包涵体中分开；将可溶性部分和不可溶性部分均通过SDS-PAGE检测（见图11）。可溶于不可溶部分都有目的蛋白。
将可溶性部分分批加到含有高盐的Sepharose Q树脂中，以减少DNA、内毒素及其它污染物；将含有目的蛋白的流穿液装载到10毫升的Q Sepharose；将结合的蛋白质利用从缓冲液A到B的线性梯度洗脱(缓冲液A：100mM Tris-C1，pH8.0。缓冲液B：100mM Tris-Cl，1M NaCI，pH8.0)。
将不可溶性部分用8M尿素pH8.0溶解，10000×g离心15min，取上清，再用缓冲液：20mM Tris-C1，150mM NaCl，pH8.0以10倍稀释。最后利用Superdex-200凝胶过滤层析，柱子用50mM Tris、150mM NaCI及1%甘油加上1%脱氧胆酸钠冲洗；缓冲液交换是用含有50mM Tris.100mM NaCl及1%甘油的缓冲液过夜透析而进行。
蛋白质浓度是通过MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(Pierce Biotechnology)而测定；纯化的FljB-4×AD2制备物在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，如图12所示，有约50kDa的明显条带，经考马斯亮蓝(Coommassie Blue)染色观察到的较单一条带且与小量诱导目的蛋白大小一致。
实施例5 FljB-AD2-4×gH融合蛋白表达载体构建及其表达和纯化
一、融合蛋白FljB-AD2-4×gH表达载体是以下述方式构建：
将实施例1构建好的pET42b/FljB及pUC57（含有合成的AD2-4×gH序列，SEQ ID NO:8）分别进行SpeI/KpnI双酶切。酶切产物进行琼脂糖电泳，切取270bpAD2-4×gH以及7.2kb左右pET42b/FljB片段，用Qiagen凝胶回收试剂盒纯化，连接反应同实施例1。连接产物经转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆（同实施例1），通过提取质粒pET42b/FljB-AD2-4×gH，再在经过酶切进行鉴定，结果如图13所示，说明成功构建得到pET42b/FljB    载体，其结构如图29所示，FljB-AD2-4×gH融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
二、融合蛋白FljB-AD2-4×gH的制备及纯化
pET42b/FljB-AD2-4×gH转化大肠杆菌Rossetta 2(DE3)得到表达FljB-AD2-4×gH阳性转化子，并用甘油保存。
将表达FljB-AD2-4×gH阳性转化子在LB培养液中培养至OD600=0.4，在37℃以1mM IPTG诱导3小时，，转化子诱导前后菌体裂解液进行SDS-PAGE，如图14所示，比较诱导前后的电泳图谱，区别在于：诱导后裂解液在50kDa处出现一明显条带，结合计算的FljB-AD2-4×gH的分子量大小，可以得知该50KDa大小的蛋白即为FljB-AD2-4×gH。
随后放大至1升的规模；使细胞生长于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养液至OD.600=0.4，并且在37℃以1mM IPTG诱导3小时；将细胞通过离心而回收(7000转/分钟×7分钟，于TOMY高速离心机)，并且再悬浮于2×PBS1%TritonX-100、1毫克/毫升的溶菌酶；利用细胞超声破碎仪破碎细胞；将细胞裂解产物离心(20,000g离心1小时，Beckman冷冻高速离心机)，以将可溶性部分从包涵体中分开；弃去可溶部分。
将不可溶性部分用8M尿素pH8.0溶解，10000×g离心15min，取上清，再用缓冲液：20mM Tris-C1，150mM NaCl，pH 8.0以10倍稀释。将含有目的蛋白的稀释液装载到10毫升的Q Sepharose(GE)；将结合的蛋白质利用从缓冲液A到B的线性梯度洗脱(缓冲液A：100mM Tris-C1，pH8.0。缓冲液B：100mMTris-Cl，1M NaCI，pH8.0)。
蛋白质浓度是通过MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(Pierce Biotechnology)而测定；纯化的FljB-AD2-4×gH制备物在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上鉴定，如图15所示。
实施例6 FljB-4×gH-4×AD2-DII融合蛋白表达载体构建及其表达和纯化
一、融合蛋白表达载体构建
将实施例1构建好的pET42b/FljB-4×AD2经SpeI酶切，4×gH基因经反应（引物5：ACTAGTAGCGAGGCATTAGACCC；引物6：ACTAGTCAGTAACAGGTGAAAGGC，DNA模板：合成的AD2-4×gH序列。反应体系同实施例1，延伸时间15s）克隆到T载体中，测序正确的质粒经SpeI酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳，切取150bp4×gH以及7.5kb左右pET42b/FljB-4×AD2片段，用Qiagen凝胶回收试剂盒纯化，连接反应同实施例1，连接产物经转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆（同前述），通过质粒提取，PCR鉴定得到的pET42b/FljB-4×gH-4×AD2(图16)，其结构如图30所示，FljB-4×gH-4×AD2核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
再以合成的DII序列为模板，以引物7：GGTACCactagtaccagcatgaagcc；引物8：GGTACCgctcttctgcttgatgcc进行DII扩增，克隆转化方法如前述。最后将pET42b/FljB-4×gH-4×AD2以及含有正确DII序列的T载体分别进行KpnI酶切电泳并分别回收7.7kb左右pET42b/FljB-4×gh-4×AD2片段和约410bp的DII片段。连接反应同实施例1连接产物经转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆（同前述），通过质粒提取，酶切质粒鉴定得到pET42b/FljB-4×gH-4×AD2-DII（图17），FljB-4×gH-4×AD2-DII核苷酸序列如SEQID NO.19所示。
二、融合蛋白制备及纯化
pET42b/FljB-4×gH-4×AD2-DII转化大肠杆菌Rossetta 2(DE3)得到表达FljB-4×gh-4×AD2-DII的阳性转化子，并用甘油保存。
将表达FljB-4×gH-4×AD2-DII阳性转化子在LB培养液中培养至OD600=0.4，在37℃以1mM IPTG诱导3小时，，转化子诱导前后菌体裂解液进行SDS-PAGE，如图18所示，比较诱导前后的电泳图谱，区别在于：诱导后裂解液在72kDa处出现一明显条带，结合计算的FljB-4×gH-4×AD2-DII的分子量大小，可以得知该72KDa大小的蛋白即为FljB-4×gH-4×AD2-DII。
放大至1升的规模；使细胞生长于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养液至OD.600=0.4，并且在37℃以1mM IPTG诱导3小时；将细胞通过离心而回收(7000转/分钟×7分钟，于TOMY高速离心机)，并且再悬浮于2×PBS 1%TritonX-100、1毫克/毫升的溶菌酶；利用细胞超声破碎仪破碎细胞；将细胞裂解产物离心(20,000g离心1小时，Beckman冷冻高速离心机)，以将可溶性部分从包涵体中分开；弃去可溶部分。
将不可溶性部分用8M尿素pH8.0溶解，10000×g离心15min，取上清，再用缓冲液：20mM Tris-C1，150mM NaCl，pH 8.0以10倍稀释。将含有目的蛋白的稀释液装载到10毫升的Q Sepharose(GE)；将结合的蛋白质利用从缓冲液A到B的线性梯度洗脱(缓冲液A：100mM Tris-C1，pH8.0。缓冲液B：100mMTris-Cl，1M NaCI，pH8.0)。
蛋白质浓度是通过MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(Pierce Biotechnology)而测定；纯化的FljB-4×gH-4×AD2-DII制备物在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上鉴定，条带位置与小量培养物诱导产生蛋白位置一致（见图19）。
实验例1小鼠免疫原性
1、实验方法
使用大约18-22g的雌性BALB/c小鼠。将小鼠分成3到5只小鼠的组，并于0天与21天，于颈部皮下分别使用指示浓度（抗原50μg/只，Al(OH)3100μg/只，佐剂Abisco25μl/只）的FljB-AD1，FljB-AD2以及FljB-4×AD2融合蛋白致免疫。于第28天时，以眼窝后穿刺对个体进行采血。通过凝血并离心以不含肝素的样本而收集血清。
FljB-AD2-4gH和FljB-4×gH-4×AD2-DII融合蛋白免疫试验使用18-22g的雌性BALB/c小鼠，免疫小鼠分组为2-4只，于颈部皮下分别使用指示浓度（抗原1μg/只，佐剂Abisco（也可拼写为Iscom）25μl/只），其中FljB-AD2-4gH进行2次免疫和3次免疫效果比较。
2、小鼠血清抗体测定
HCMV特异性的IgG是通过ELISA而测定。将96孔的酶连接免疫吸附分析板，以100微升/孔的10微克/ml的AD1，AD2合成肽或者DII蛋白（AD1对应FljB-AD1，AD2对应FljB-AD2、FljB-4×AD2、FljB-AD2-4gH和FljB-4×gH-4×AD2-DII，DII对应FljB-4×gH-4×AD2-DII）于包被稀释液，4℃包被过夜。将培养板以包含0.05%Tween-20的PBS（PBS-T）清洗二次。将培养板以250微升/孔的封闭液于37°封闭1小时后用PBS-T清洗二次。加入血清于稀释液中（100微升/孔），并将培养板于37°孵箱中培养1小时。将培养板以PBS-T清洗五次。加入稀释于稀释液中的辣根过氧化酶标记的山羊抗-小鼠IgG抗体（sigma,100微升/孔），并将培养板于37℃孵箱培养1小时。将培养板以PBS-T洗板五次。再加入显色液后放入37℃孵箱培养15分钟。加入2M硫酸溶液作为终止液后将培养板放到微量分光光度计上测量OD450。
3、实验结果
检测结果如表1~6（表1~5中，Yn指某一注射剂量组中第几只小鼠），结果如图20-24所示：
表1FljB-AD1免疫血清抗体检测结果
由表1和图20可知，参照PBS对照免疫结果，FljB-AD1的平均免疫血清抗体水平不高，稀释200倍时ELISA结果为0.015；与免疫佐剂Al(OH)3或Abisco联合使用时，抗AD1抗体水平显著提高。
表2FljB-AD2免疫血清抗体检测结果
由表2和图21可知，参照PBS对照免疫结果，FljB-AD2免疫血清中存在一定量抗AD2抗体，与免疫佐剂Al(OH)3或Abisco联合使用时，Al(OH)3不能增加抗AD2抗体水平，而Abisco的影响效果显著。
表3FljB-4×AD2免疫血清抗体检测结果
由表3和图22可知，参照PBS对照免疫结果，FljB-4×AD2免疫血清中抗AD2抗体水平高，稀释200倍时ELISA结果大于2，与免疫佐剂Al(OH)3或Abisco联合使用时，抗体水平反而有一定程度下降，但影响效果并不显著。
表4FljB-AD2-4gH免疫血清抗体检测结果
由表4和图23可知，FljB-AD2-4gH免疫血清中抗AD2抗体水平较高，注射剂量仅为1μg/kg时，稀释200倍后抗体水平显著，二次免疫后抗体水平无显著提高，三次免疫后的抗体水平是二次免疫的3倍以上（200倍稀释）。
表5FljB-4gH-4AD2-DII免疫血清抗体检测结果（抗DII抗体）
由表5和图24可知，FljB-4×gH-4×AD2-DII免疫血清中抗DII抗体水平极高，注射剂量仅为1μg/kg时，稀释2000倍抗体水平接近2，与免疫佐剂Abisco联合使用时，免疫血清中抗DII抗体和抗AD2抗体水平显著增加。
表6不同抗原平均免疫血清抗体水平的横向比较
  200   2000   20000   80000   320000   1280000   256000
  FljB-AD1（50μg/只）   0.101   0   0   0   0   0   0
  FljB-AD2（50μg/只）   0.384   0.349   0.023   0   0   0   0
  FljB-4xAD2（50μg/只）   2.663   0.851   0.069   ---   ---   ---   ---
  FljB-AD2-4gH（1μg/只）   0.184   0.023   0   0   0   0   0
  FljB-4gH-4AD2-DII(1μg/只)   ----   1.705   0.333   0.124   0.058   0.048   0.044
由表6可知，50μg/只注射剂量下，平均免疫血清抗体水平：FljB-AD1<FljB-AD2<FljB-4×AD2；1μg/只注射剂量下，平均免疫血清抗体水平：FljB-AD2-4gH<FljB-4gH-4AD2-DII。综合使用剂量和平均免疫血清抗体水平，免疫原性：FljB-AD1<FljB-AD2<FljB-4×AD2<FljB-AD2-4gH<FljB-4gH-4AD2-DII
实验说明本发明制备的融合蛋白的免疫原性强，其中，FljB-4gH-4AD2-DII的免疫原性最强。
综上，本发明制备得到了鞭毛蛋白与人巨细胞病毒包膜糖蛋白或其多肽片段的融合蛋白，免疫原性强，可刺激机体产生大量的抗巨细胞病毒抗体，可以用于制备疫苗，预防巨细胞病毒感染引起的疾病，具有良好的临床应用前景。

Claims (1)

1.一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白，其特征在于：它包括鞭毛蛋白，以及人巨细胞病毒包膜糖蛋白或者其多肽片段；
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18或者SEQ ID NO：20所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：其核苷酸编码序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17或者SEQ ID NO：19所示。
3.SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17或者SEQ ID NO：19所示核苷酸序列。
4.一种重组质粒，其特征在于：它包括SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17或者SEQ ID NO：19所示核苷酸序列。
5.一种重组大肠杆菌Rosetta，其特征在于：它包括权利要求4所述的重组质粒。
6.一种制备权利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取权利要求5所述的重组大肠杆菌Rosetta，用IPTG诱导表达；
（2）离心，得沉淀，分离纯化，即得融合蛋白。
7.权利要求1或2所述融合蛋白在制备人巨细胞病毒疫苗中的用途。
8.一种人巨细胞病毒疫苗，其特征在于：它包含权利要求1或2所述人巨细胞病毒免疫原融合蛋白。
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