CN103509120A

CN103509120A - 一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法

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Publication number: CN103509120A
Application number: CN201210433570.0A
Authority: CN
Inventors: 郭松林; 关瑞章; 王玉; 冯建军; 林鹏; 黄文树
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: CN103509120B

Abstract

本发明公开了一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。本发明的二联重组蛋白包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明将嗜水气单胞菌的II形孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；本发明的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对多种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；本发明的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。

Description

一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一两种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。

背景技术

近20年来，我国淡水养殖鱼类出现暴发性败血症，给养殖业带来了不可估量的经济损失，研究表明该病的主要病原菌为嗜水气单胞菌和迟顿迟钝爱德华氏菌。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是鳗鲡的重要病原菌，在春夏交替时节能引起鳗鲡出血性败血症、肝肾肿大、烂鳃病、烂尾病等传染性很强的疾病，人工养殖的美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡均可发生。水产养殖业长期使用化学药物治疗该病，由于产生耐药性等原因，致使可用的安全药物越来越少。最近可见有关嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌全菌灭活苗和亚单位疫苗相关的研究，但要应用这些研究成果对鳗鲡进行免疫以预防多种病原菌的侵害，需要对鳗鲡进行多次注射操作，对鱼体伤害较大，且操作繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可作为疫苗使用的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。

本发明的另一目的在于提供该二联重组蛋白的制备方法。

本发明的一技术方案是：

一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO1的第271~544位和第1~257位所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列如SEQ ID NO1的第258~270为所示。

本发明的另一技术方案是：

一种编码所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的编码核苷酸序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO2的第831~1612位和第1~771位所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列通过一段如SEQ ID NO2的第772~810位所示的编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。

本发明的再一技术方案是：

一种表达所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，包括负载有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。

本发明的再一技术方案是：

一种表达所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，该大肠杆菌转化有负载SEQ ID NO2所示核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为pGEX-2T-His或pGEX-4T-2。

在本发明的一个优选实施方案中，所述用于表达的大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌DH5α。

本发明的再一技术方案是：

一种上述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）分别扩增编码嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO1的第271~544位和第1~257位所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO2的第831~1612位和第1~771位所示；

（2）将步骤（1）所得的两个基因序列连接在一起，得到融合基因序列；

（3）将步骤（2）所得的融合基因序列连接到原核表达载体中，构建重组表达载体；

（4）将步骤（3）中所构建的重组表达载体转化到原核宿主细胞中，并在适于表达所述融合基因的条件下培养被转化的原核宿主细胞；

（5）回收并纯化所培养的原核宿主细胞表达的融合蛋白；

（6）对步骤（5）所得的融合蛋白进行复性。

本发明的有益效果是：

1、本发明将嗜水气单胞菌的II形孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过基因工程手段连接在一起构建二联重组蛋白，该蛋白免疫鳗鲡后，能同时防御嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌的感染，相比单种外膜蛋白的免疫具有更好的免疫效果；

2、本发明的二联重组蛋白仅需对鱼体进行一次注射，即可获得对多种病原菌的免疫效果，减少了对鱼体的伤害，简化了免疫步骤；

3、本发明的二联重组蛋白的制备方法适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例2的实验结果图之一；

图2为本发明实施例2的实验结果图之二；

图3为本发明实施例3的实验结果图；

图4为本发明实施例4的实验结果图之一；

图5为本发明实施例4的实验结果图之二；

图6为本发明实施例4的实验结果图之三；

图7为本发明实施例4的实验结果图之四。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

本实施例进行本发明的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。（OMP-Arom-Edwa）的制备

（1）用下列特异性引物扩增嗜水气单胞菌的II型孔蛋白的膜外部分的核苷酸序列：正向引物B11F：

5’tcgggcggtggcggctcgggtggcggatcatccggtatcgccaagactgaatg3’（SEQ ID NO3）和反向引物B11R：5’CCGGAATTCctggatcttgtactcggtgtaggc3’（SEQ ID NO4），其中B11F包括接头区（tcgggcggtggcggctcgggtggcggatca），B11R包括EcoR I酶切位点和保护碱基（CCGGAATTC）；用下列特异性引物扩增迟钝爱德华氏菌的ompS2膜外部分的核苷酸序列：正向引物B79F：

CGCGGATCCgccggcctgaagtatggcaa（SEQ ID NO5）和反向引物B79R：acccgagccaccaccgcccgagcctataagcacgggtgaagtcattctcatc（SEQ ID NO6）其中B79F包括BamH I酶切位点和保护性碱基（CGCGGATCC），B79R包括接头区（acccgagccaccaccgcccgagcctata）。

上述引物B79R和B11F的接头区编码的氨基酸序列为SGGGGSGGGS，精氨酸（S）与甘氨酸（G）的特点是柔韧性好、不易断裂，两个基因片段连接后，表达产物的柔韧性好，易曝露两个外膜蛋白的抗原决定簇，使表达产物分别保持两个外膜蛋白的免疫原性。（请将该段与所提供的序列表相比对）

上述核苷酸序列的扩增条件具体如下：

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。1%琼脂糖电泳检验。

（2）将上述所得的嗜水气单胞菌的II型孔蛋白的膜外部分的核苷酸序列和迟钝爱德华氏菌的ompS2膜外部分的核苷酸序列连接在一起，得到融合基因序列，连接方法具体如下：

a将扩增到的目的序列胶回收，方法同E.Z.N.A.^TM Gel Extraction Kit使用说明书，并测定其浓度。

b采用两步法连接上述两个胶回收的目的序列（目的序列1和目的序列2）：采用梯度PCR法确定最佳退火温度，条件和体系如下：

第一步，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，55.3℃退火40s，72℃延伸4min，13个循环；4℃保存。反应体系：

第二步，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸4min，13个循环；72℃延伸，4℃保存。反应体系：

反应完成后，纯化PCR产物，即得PCR产物G-Arom-Edwa；

（3）将G-Arom-Edwa和融合表达载体pGEX-4T-2（购自GE healthcare）均用BamH Ｉ和EcoR I双酶切后在T4DNA连接酶的作用下进行连接以获得重组表达载体；

（4）将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21感受态细胞内，得重组菌BL21；用0.25mM~2.0mM的IPTG在16~37℃的温度下诱导重组菌BL21表达重组蛋白（OMP-Arom-Edwa）1.5~7小时，其中菌液初始浓度为OD₆₀₀nm=0.1~1.0。

（5）收集诱导后的重组菌BL21的菌体，进行超声波破碎，离心（4℃,10000rpm,5min）收集洗涤沉淀后，用预冷的结合缓冲液重悬沉淀并，同样条件离心后，取上清液进行纯化；将上述上清液用亲和层析柱进行结合，再用洗脱缓冲液进行表达产物的洗脱，得融合蛋白OMP-Arom-Edwa；

（6）将洗脱的OMP-Arom-Edwa用透析法进行复性，复性完成后进行冻干即得本发明的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。

实施例2

（1）将PBS空白对照、嗜水气单胞菌与迟钝爱德华氏菌二联灭活菌液和实施例1所得的本发明的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白分别用腹腔注射的方式对三组鳗鲡进行免疫，每组鳗鲡分别对应PBS对照组1、二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3，其中本发明的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白在试验前用0.01M的PBS（pH=7.4）配制成1mg/mL，将之与等量的弗氏不完全佐剂充分混匀，终浓度为0.5mg/mL；嗜水气单胞菌和迟顿爱德华氏菌分别于28℃和32℃胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养24h后，用0.01M的PBS（pH=7.4）分别配成5.0×10⁸cfu/mL的菌液（OD_595nm=0.5）后等量混匀，于混合液中加入福尔马林使之终浓度为0.4%，4℃静置24h后取少量菌液涂布于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），培养24h无菌落生长时即为嗜水气单胞菌与迟钝爱德华氏菌二联灭活菌液；PBS空白对照为0.01M PBS（pH=7.4）；每尾鳗鲡腹腔注射的液体量为0.2mL；

（2）上述三组鳗鲡免疫后28d，采用嗜水气单胞菌和迟顿爱德华氏菌(6×10⁸cfu/尾)分别进行攻毒感染。如图1所示，感染嗜水气单胞菌后PBS对照组1、二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3的鳗鲡在14d内的存活率分别为0%（全部死亡）、50%（死亡4尾）和50%（死亡4尾）；与PBS对照组1相比，二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3对鳗鲡的相对免疫保护率均为50%，卡方检验结果表明，免疫后第2d和第3d以后的免疫保护作用与对照组相比均达到显著水平（p<0.05）；如图2所示，感染迟顿爱德华氏菌后，PBS对照组1、二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3的鳗鲡在14d内的存活率分别为0%（全部死亡）、50%（死亡4尾）和37.5%（死亡3尾）；与PBS对照组1相比，二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3对鳗鲡的相对免疫保护率分别为50%和37.5%。卡方检验结果表明，免疫后第3d双表达外膜蛋白免疫组3的存活率显著（p<0.05）高于PBS对照组1，自第4d以后二联灭活菌免疫组2的免疫保护作用也显著（p<0.05）高于PBS对照组1。上述实验中，相对免疫保护率=（1-免疫组死亡率/PBS浸泡组死亡率）×100%。

实施例3

（1）同实施例2；

（2）上述三组鳗鲡免疫后，分别采集血清进行鳗鲡血清特异性抗体效价ELISA检测（按Guo SL,Chen NH,Guan RZ,Feng JJ,Huang WS.2006.Effectsof Anti-Bursin Monoclonal Antibody on Immunosuppression in the duck(CherryValley duck).Poult Sci,2006;85:258-65.进行），如图3所示，二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3第14d和21d的抗体水平分别极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）高于PBS对照组1，至第28d，双表达外膜蛋白免疫组3抗体水平极显著（P<0.01）高于PBS对照组1，而二联灭活菌免疫组2显著（P<0.05）高于PBS对照组1。二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3在3个时间段的抗体水平均未出现显著差异。

实施例4

（1）同实施例2；

（2）上述三组鳗鲡免疫后，分别采集鳗鲡的血清、粘液、肝脏和肾脏进行溶菌酶含量检测，如图4至7所示，第14d二联灭活菌免疫组2和双表达外膜蛋白免疫组3的血清溶菌酶含量均显著（P<0.05）低于PBS对照组1；21d二联灭活菌免疫组2肝脏和肾脏的溶菌酶含量均极显著（P<0.01）高于PBS对照组1和双表达外膜蛋白免疫组3；至28d，双表达外膜蛋白免疫组3血清、粘液、肝、肾组织溶菌酶含量显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于二联灭活菌免疫组2，其中双表达外膜蛋白免疫组3的粘液、肝、肾组织溶菌酶含量显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于PBS对照组1，二联灭活菌免疫组2肝组织溶菌酶含量显著（P<0.01）高于PBS对照组1。上述实验中，溶菌酶检测方法简述如下：将配制好的应用菌液，标准应用液及所需检测的样品置32℃水浴箱中预温10min。将100μL应用菌液加入酶联板中，迅速用排枪向各孔加入血清（或粘液、脏器悬液）样品和标准品（PBS配制的2.5μg/mL溶菌酶样品）10μL，分别于30秒和4分30秒时在酶标仪上测定其OD_530nm值。计算公式：溶菌酶浓度（U/mL）＝（血清样品孔OD_4分30秒 _值－血清样品孔OD_30秒值）/（标准品孔OD_4分30秒值－标准品孔OD_30秒值）×标准品浓度（2.5μg/mL，或200Unit/mL）。

上述实施例2至实施例4中：

实验样品的采集方法具体为：鳗鲡分别于免疫后14d,21d和28d丁香酚(500ppm)麻醉采血，每组每次取5尾鳗鲡血液。每尾鳗鲡约0.5mL血液用20μL的肝素钠抗凝(0.5UI/μL)后4℃静置过夜，吸取上层血浆测定其抗体效价和溶菌酶含量，同时分离不同细胞成分进行培养与转化实验。于采血前每尾鳗鲡取粘液0.1g，采血后取肝脏和肾脏组织各0.1克，上述粘液和组织均加入0.5mL 0.01M的PBS（pH=7.4）进行匀浆，10000rpm离心后取上清，-70℃保存备用；

实验不同处理所得结果采用SPSS 13.0软件进行方差分析（Anova），同时采用多重比较（Duncan法，双尾）确定其差异显著性。数据以平均值±标准差表示(mean±S.D)后输入origin7.5软件作图。对免疫保护率结果进行卡方检验（Chi-Square,Likelihood Ratio），以确定其差异显著性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims

1.一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，其特征在于：包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO1的第271~544位和第1~257位所示。

2.如权利要求1所述的一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，其特征在于：所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列如SEQ IDNO1的第258~270位所示。

3.一种编码权利要求1所述的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，其特征在于：包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的编码核苷酸序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO2的第831~1612位和第1~771位所示。

4.如权利要求3所述的一种编码鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，其特征在于：所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列通过一段如SEQ ID NO2的第772~810位所示的编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。

5.一种表达权利要求1所述的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，其特征在于：包括负载有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的原核表达载体。

6.如权利要求5所述的一种表达鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，其特征在于：所述原核表达载体为融合表达载体。

7.一种表达权利要求1所述的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌转化有负载SEQ ID NO2所示核苷酸序列的原核表达载体。

8.如权利要求6所述的一种表达鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，其特征在于：所述原核表达载体为融合表达载体。

9.如权利要求7或8所述的一种表达鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，其特征在于：所述用于表达的大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌DH5α。

10.一种权利要求1所述的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（5）回收并纯化所培养的原核宿主细胞表达的融合蛋白；

（6）对步骤（5）所得的融合蛋白进行复性。