CN102925403B - 一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用 - Google Patents

Abstract

一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用，它涉及一种重组菌株的构建、表达纯化及其应用。本发明要解决现有金针菇免疫调节蛋白工程菌株表达率低，表达产物多为不溶性的包涵体，结构不确定以及菌体破碎、纯化工艺复杂不适合大规模生产应用的问题。本发明将金针菇免疫调节蛋白基因，以Transetta(DE3)作为宿主菌，构建重组菌株；再用IPTG诱导表达，通过溶菌酶法结合超声法处理后采用Ni-His·Band柱层析，Sephadex G25凝胶层析柱方法脱盐，即完成重组菌株的构建及表达纯化。其用于制备预防或治疗过敏症的药物。其纯化过程简单而快速，适于规模化发酵生产。

Description

一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用

技术领域

本发明涉及一种重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用。

背景技术

金针菇免疫调节蛋白（fungal immunomodulatory protein from flammulina velutipes，FIP-fve）是从金针菇中分离获得的非特异性免疫增强剂，对机体免疫具有双向调节作用，具有免疫调节、抗癌症、抗过敏等活性，特别是通过调节体内细胞因子含量和维持平衡的角度起到预防和治疗过敏症的目的，具有副作用小、标本兼治的优势。作为不含糖基的小分子单纯蛋白质，金针菇免疫调节蛋白方便操作与应用，是非常有前景的可应用于临床的药用蛋白，因此将其开发成抗过敏产品造福人类很有必要。

但由于金针菇生产周期长，天然FIP-fve含量极微，产率不足90mg/kg，且分离成本极高，所以通过其他生物反应器生产该蛋白是其走上应用的有效途径。目前国内外几家研究机构也对其进行了原核和真核表达，但是普遍存在原核表达率低、多数形成不溶性的包涵体或可溶性蛋白所占比例较小，不能形成正确的二级结构或以不溶性的包涵体形式存在，需要变性复性处理影响生物活性，不适合开发应用。真核表达虽然有较高的表达率和能形成糖基化结构，但是发酵工艺复杂、成本高、细胞培养诱导表达蛋白时采用甲醇等有害试剂、操作繁琐，而且表达蛋白糖基化程度过高，与天然蛋白不符，结构不确定，产物不纯，有多种不同的形式，活性难以稳定，另外因没有纯化标签，纯化工艺复杂，成本过高。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有金针菇免疫调节蛋白工程菌株表达率低，表达产物多为不溶性的包涵体，结构不确定以及菌体破碎率低、纯化工艺复杂不适合大规模生产应用的一个或多个问题，而提供一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用。

本发明的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a（+），使得获得的重组表达质粒在转化到Transetta(DE3)大肠杆菌中时能够表达金针菇免疫调节蛋白。

本发明的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建方法，是按照以下步骤进行的：

一、采用试剂盒提取金针菇总RNA；

二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT-PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA；

三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a（+）中，得到重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物；

四、将步骤三获得的重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物转入Transetta(DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株。

本发明的获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，是按照以下步骤进行的：将获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，将上述工程菌株培养到OD₆₀₀为0.8～1.0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG终浓度为0.1~0.5mM或0.5~1mM。

本发明所获得的金针菇免疫调节蛋白在制备用于预防或治疗过敏症的药物中的用途。

本发明包含以下有益效果：

与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少（产量为5mg/L，KO JL et al.,1997）或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程（“孔祥辉等，2007”）相比，本发明的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA）对应的tRNA的高表达基因工程菌株Transetta(DE3)。

本发明的可溶性重组蛋白表达率为菌体总蛋白的40%以上，比以往的表达率仅为22%左右（张介驰等，2007）提高80%以上，产量为45mg/L以上，比2009年徐贵雪等用pET-28构建的表达载体生产的重组蛋白产量(30mg/L)提高了50%以上。本发明使用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL）结合超声波法（作用时间20min）使菌体破碎率达到98%以上，比单用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL，破碎率28%）和单用超声波法（作用时间20min，破碎率40%）提高30%以上，并节约了成本；经圆二色谱测定表达蛋白二级结构，含15%的α-螺旋和38%的β折叠，比例接近天然蛋白，这是本发明的蛋白具有更好生物活性的结构基础，更具有开发应用价值。

并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3~4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本发明为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。

本发明构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。

附图说明

图1为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体酶切后的电泳图；1为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体酶切后得到的pET30a(+)和目的片段图（箭头所指为目的片段）；2为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体；M为DNA Marker DL2000；M 1为DNA Marker λ-HINDIII；

图2为能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株诱导后表达产物SDS-PAGE电泳分析图（20%SDS-PAGE）；其中，1为Marker蛋白质Mr标样Protein Ruler I (Lot#E10408 TransGenBiotect),12kD(2.0μg/5μL),20kD(0.5μg/5μL),30kD(0.5μg/5μL),40kD(1.0μg/5μL),60kD(0.5μg/5μL),80kD(0.5μg/5μL)；2为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体转化Transetta(DE3)菌株未诱导电泳图；3为pET30a-FIP-fve转化Transetta(DE3)菌株的蛋白诱导表达1.5h后的电泳图；4为pET30a-FIP-fve转化Transetta(DE3)菌株的蛋白诱导表达3.0h后的电泳图；5为pET30a-FIP-fve转化Transetta(DE3)菌株的蛋白诱导表达4.5h后的电泳图；

图3为不同浓度的IPTG在温度为21℃的条件下诱导表达重组载体pET30a（+）-FIP-fve可溶性蛋白的蛋白电泳图；其中，M为蛋白Marker Protein Ruler I(Lot#E10408 TransGenBiotect),12kD(2.0μg/5μL),20kD(0.5μg/5μL),30kD(0.5μg/5μL),40kD(1.0μg/5μL),60kD(0.5μg/5μL),80kD(0.5μg/5μL);1为0.2mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；2为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；3为1.0mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；

图4为不同浓度的IPTG在温度为28℃的条件下诱导表达重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白的蛋白电泳图；其中，M为蛋白Marker Protein Ruler I (Lot#E10408 TransGen Biotect)，12kD(2.0μg/5μL),20kD(0.5μg/5μL),30kD(0.5μg/5μL),40kD(1.0μg/5μL),60kD(0.5μg/5μL),80kD(0.5μg/5μL)；1为0.2mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，2为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，3为1.0mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；

图5为不同浓度的IPTG在温度为37℃的条件下诱导表达重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白的蛋白电泳图；其中，M为蛋白Marker Protein Ruler I (Lot#E10408 TransGen Biotect)，12kD(2.0μg/5μL),20kD(0.5μg/5μL),30kD(0.5μg/5μL),40kD(1.0μg/5μL),60kD(0.5μg/5μL),80kD(0.5μg/5μL)；1为0.2mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，2为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，3为1.0mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；

图6为重组金针菇免疫调节蛋白表达、菌体裂解方法比较及纯化前后SDS-PAGE电泳结果图；1为溶菌酶+超声波裂解；2为未亲合蛋白液；3为表达菌液；4为溶菌酶裂解；5为漂洗部分；6为前洗脱的目的蛋白；7为后洗脱的目的蛋白；M为Protein Marker Protein Ruler I(Lot#E10408 TransGen Biotect)，12kD(2.0μg/5μL),20kD(0.5μg/5μL),30kD(0.5μg/5μL),40kD(1.0μg/5μL),60kD(0.5μg/5μL),80kD(0.5μg/5μL)；

图7为重组金针菇免疫调节蛋白表达及柱层析纯化前后SDS-PAGE电泳结果图；其中，1为未亲和蛋白；2为漂洗部分：3为表达菌液裂解蛋白；4为洗脱目的蛋白；

图8为圆二色谱测定的重组蛋白的二级结构图，其中，1为基线，2为计算值，3为测量值。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a（+），使得获得的重组表达质粒在转化到Transetta(DE3)大肠杆菌中时能够表达金针菇免疫调节蛋白。

本实施方式包含以下有益效果：

与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少（产量为5mg/L，KO JL et al.,1997）或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程（“孔祥辉等，2007”）相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA）对应的tRNA的高表达基因工程菌株Transetta(DE3)。

并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3~4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。

本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。

具体实施方式二：本实施方式的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建方法，是按照以下步骤进行的：

一、采用试剂盒提取金针菇总RNA；

二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT-PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA；

三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a（+）中，得到重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物；

四、将步骤三获得的重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物转入Transetta(DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株。

本实施方式包含以下有益效果：

与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少（产量为5mg/L，KO JL et al.,1997）或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程（“孔祥辉等，2007”）相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA）对应的tRNA的高表达基因工程菌株Transetta(DE3)。

并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3~4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。

本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤三中所述的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a（+）中操作步骤为：将步骤一获得的金针菇免疫调节蛋白编码cDNA以及表达载体pET30a(+)采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切后纯化回收金针菇免疫调节蛋白编码cDNA与表达载体pET30a(+)，然后采用连接酶进行连接，得到重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株金针菇免疫调节蛋白的方法，是按照以下步骤进行的：按照具体实施方式二的方法获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，将上述工程菌株培养到OD₆₀₀为0.8～1.0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG终浓度为0.1~0.5mM或0.5~1mM。

本实施方式包含以下有益效果：

与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少（产量为5mg/L，KO JL et al.,1997）或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程（“孔祥辉等，2007”）相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA）对应的tRNA的高表达基因工程菌株Transetta(DE3)。

本实施方式的可溶性重组蛋白表达率为菌体总蛋白的40%以上，比以往的表达率仅为22%左右（张介驰等，2007）提高80%以上，产量为45mg/L以上，比2009年徐贵雪等用pET-28+构建的表达载体生产的重组蛋白产量(30mg/L)提高了50%以上。本发明使用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL）结合超声波法（作用时间20min）使菌体破碎率达到98%以上，比单用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL，破碎率28%）和单用超声波法（作用时间20min，破碎率40%）提高30%以上，并节约了成本；经圆二色谱测定表达蛋白二级结构，含15%的α-螺旋和38%的β折叠，比例接近天然蛋白，这是本实施方式的蛋白具有更好生物活性的结构基础，更具有开发应用价值。

并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3~4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。

本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述的金针菇免疫调节蛋白序列如序列表Seq ID No：2所示。其它与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五不同的是：所述的分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白的操作步骤包括：

一、取按照具体实施方式二的方法获得的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株，按体积比为1:10~200的比例接种于LB液体培养基中，加入终浓度为0.01~1mM的IPTG，然后在温度为8℃~37℃，转速为80~280rpm/min的条件下诱导培养12~48h；

二、取步骤一诱导培养后的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株菌液，在转速为1000~15000rpm/min的条件下，离心0.5~10min，收集沉淀，然后将收集的沉淀重悬于10~200倍重量的PBS缓冲液中，得菌悬液；

三、向步骤二得到的菌悬液中加入终浓度为0.1~10mg/mL的溶菌酶，在温度为30~37℃条件下孵育5~30min，得菌液；

四、将步骤三中得到的菌液置于冰浴中，在超声功率为20W~200W，间隔时间1~30s的条件下，超声处理1~50min；

五、将步骤四超声处理的菌液在温度为4℃，转速为5000~15000rpm/min的条件下，离心1~30min，收集上清液采用Ni-His·Band柱层析，然后采用Sephadex G25凝胶层析柱方法进行脱盐，用0.02M、pH为7.8的PBS进行洗脱，即获得纯化的表达蛋白溶液，完成分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白。其它与具体实施方式四或五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四至六之一不同的是：步骤二中所述的PBS缓冲液pH为8.0。其它与具体实施方式四至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四至七之一不同的是：步骤五中所述的采用Ni-His·Band柱层析，所用的Wash缓冲液为含有浓度为50mM咪唑基的Wash缓冲液、所用的洗脱缓冲液成分为500mM的咪唑、0.5M的NaCl，20mM的Tris-HCl；其中，洗脱缓冲液pH为7.9。其它与具体实施方式四至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式所获得的金针菇免疫调节蛋白在制备用于预防或治疗过敏症的药物中的用途。

本实施方式包含以下有益效果：

与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少（产量为5mg/L，KO JL et al.,1997）或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程（“孔祥辉等，2007”）相比，本实施方式的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA）对应的tRNA的高表达基因工程菌株Transetta(DE3)。

并且，由于FIP-fve天然情况下是不含糖基，因此不需要糖基化修饰，通过原核表达可以得到与天然蛋白活性相当的重组蛋白。因为大肠杆菌发酵工艺简单，具有抗生素抗性，发酵过程污染率极低。菌体离心后细胞破碎方法简便高效，不影响蛋白活性。纯化工艺中，由于重组蛋白设计了6个组氨酸纯化标签，使得纯化过程简单而快速。整个重组蛋白的生产过程只需要3~4天，适合用大型液体发酵设备进行规模化生产。本实施方式为其作为抗过敏药物及免疫调节药物或保健食品的应用提供了大规模生产与纯化技术的具体工艺。

本实施方式构建了该蛋白的原核表达载体，并且转入了含有多种真核基因密码子的基因工程菌株中，所表达的重组蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折叠所构成的二级结构，重组蛋白结构更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加稳定，实验证明重组蛋白具有较高生物活性；另外通过设计附加序列作为纯化标签，简化了分离纯化环节，更适于规模化发酵生产；为新型重组蛋白作为抗过敏药物及保健品的临床研究及产业化开发奠定基础。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是：制备用于预防或治疗过敏症的药物的方法，包括：将具体实施方式四得到的金针菇免疫调节蛋白与可药用载体混合，即制得用于预防或治疗过敏症的冻干粉针药物；其中，可药用载体为甘露醇或右旋糖酐，添加量为3%~6%。其它与具体实施方式九相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验1

本试验的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的构建及其蛋白表达纯化：

一、能够表达金针菇免疫调节蛋白基因的提取：采用TaKaRa公司的RNAiso forPolysaccharide-rich Plant Tissue试剂盒提取白B品种（由黑龙江省科学院微生物研究所提供）的金针菇总RNA；

二、能够表达金针菇免疫调节蛋白基因的PCR扩增：以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒（购买自TaKaRa公司）进行RT-PCR，得扩增产物，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用Agarose Gel DNA Purification Kit（购买自TaKaRa公司）进行纯化回收，获得了金针菇免疫调节蛋白基因；将金针菇免疫调节蛋白基因进行测序，序列提交GenBank获得序列号为GU388420.1，该序列与报道的FIP-fve基因的序列同源性100%(KO JL et al.,1997)，重组蛋白His-FIP-fve的开放读码框为510bp（如序列表Seq ID No：1所示），其编码170个氨基酸（如序列表Seq ID No：2所示），分子量为18780kDa；

三、重组表达载体pET30a（+）-FIP-fve的构建：

a、表达载体pET30a（+）的DNA提取

取1.5mL活化培养表达载体pET30a（+）的菌液，离心收集菌体，悬浮于0.35mL的STET裂解液中，加入25μL新配制的溶菌酶，振荡混合3s，将反应管置于沸水浴40s，立即取出然后离心10min，用牙签从管中取出沉淀，向上清液中加入40μL浓度为2.5mol/L的醋酸钠溶液和420μL的异丙醇，快速混合后，在-70℃温度下静置15min后，取出置于4℃，以12000r/min转速离心10min，弃上清液，收集沉淀加入1mL质量百分含量为70%的乙醇，然后在4℃温度下，以12000r/min转速离心2min，收集沉淀进行干燥，将干燥后的沉淀溶于50μL的TE中，贮存于-20℃，待用；

b、BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切

将步骤二得到的金针菇免疫调节蛋白基因，以及步骤a得到的表达载体pET30a(+)分别进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切；

其中，金针菇免疫调节蛋白基因酶切反应条件：先加入BamHⅠ在30℃温度下，酶切1.0h后，再加入EcoRⅠ在37℃温度下，酶切1.0h，然后将酶切的金针菇免疫调节蛋白基因在65℃水浴进行酶灭活10min，然后采用饱和酚试剂抽提，取上层液体，加入3倍体积预冷的0~4℃无水乙醇，在4℃温度下放置1h后，在转速为12000r/min的条件下离心15min，收集沉淀，沉淀用质量百分含量为75%预冷乙醇洗涤一次，然后离心，再用灭无菌水溶解，得到酶切后的金针菇免疫调节蛋白基因，将其连接到同样酶切并纯化的pET30a（+）质粒（购买自Amersham Pharmacia Biotech公司）上，构建重组质粒pET30a（+）-FIP-fve。

其中，pET30a（+）质粒的酶切纯化反应为：将表达载体pET30a(+)先加入BamHⅠ在30℃温度下，酶切1.0h后，再加入EcoRⅠ在37℃，酶切1.0h，向反应液中加入3倍体积的DB Buffer（购买自TaKaRa公司）均匀混合，转移至Spin Column（购买自TaKaRa公司）中，在转速为12000r/min的条件下，离心1min，收集滤液，然后加入Spin Column中重复离心1次，弃滤液，收集沉淀；分别用500μL的Rinse A（购买自TaKaRa公司）和700μL的RinseB（购买自TaKaRa公司）清洗，然后在转速为12000r/min的条件下离心30s，弃滤液，收集沉淀；在Spin Column膜的中央处加入25μL温度为60℃的灭菌蒸馏水，室温静置1min，然后在转速为12000r/min的条件下离心1min，洗脱酶切后的pET30a（+）质粒。

c、连接

将步骤b酶切后的pET30a（+）质粒和金针菇免疫调节蛋白基因，按目的片段：载体=5:1摩尔比混合，在T₄DNA连接酶的作用下，在16℃连接反应24h，得到重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物；

四、金针菇免疫调节蛋白基因工程重组菌株的构建：通过热激转化法将pET30a-FIP-fve转入Transetta(DE3)大肠杆菌（购买自TransGen Biotech公司，商品编号CD801）中，取0.001~1mL的转化培养物涂于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，在37℃温箱中培养过夜，同时取另外两管不含重组子的培养物分别涂于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板和不含卡那霉素的LB琼脂平板上作对照，次日观察各平板中菌落的生长情况，若对照平板中含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板未长菌落，不含卡那霉素的LB琼脂平板上长有菌落，则取涂转化菌的含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板长出的单菌落接种于5mL的LB培养基中，置于37℃空气浴摇床振荡培养过夜，即得金针菇免疫调节蛋白基因工程重组菌株；

五、阳性重组子的筛选、鉴定及表达鉴定

d、重组载体pET30a（+）-FIP-fve的PCR鉴定

取1μL步骤四得到的金针菇免疫调节蛋白基因工程重组菌株，用灭菌去离子水稀释500～1000倍后，取1μL做模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

PCR扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性50s，60℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

采用T7启动子引物（上海生工公司通用的引物）对FIP-fve基因进行双脱氧末端终止法测序，测序工作由上海生工公司完成，FIP-fve基因序列如序列表Seq ID No：1所示；

e、重组载体pET30a（+）-FIP-fve的酶切鉴定

在步骤四中转化后过夜培养的含50μg/mL Kan的LB琼脂平板上，任意挑取6个单菌落接种于10mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养10h，采用常规碱法提取质粒，然后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切进行鉴定，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1所示），结果为目的片段大小为342bp，表明FIP-fve已经连接至载体pET30a（+）质粒上；于-70℃冰箱中冻存阳性重组子菌种待用；

f、重组载体pET30a（+）-FIP-fve的原核诱导表达与纯化

在含50μg/mL卡那霉素的LB培养液100mL中按接种量为1%的比例分别加入上述验证含有表达载体pET30a（+）-FIP-fve的Transetta(DE3)大肠杆菌，于37℃，180r/m的条件下振荡培养，测OD₆₀₀，直至对数期后期OD₆₀₀为0.8～1.0时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，在温度为28℃，转速为180rpm/min的条件下诱导培养36h；二、取步骤一诱导培养后的金针菇免疫调节蛋白基因工程菌株菌液，在转速为15000g的条件下，离心5min时间，收集沉淀，然后将收集的沉淀重悬于10~200倍重量的PBS缓冲液中，得菌悬液；三、向步骤二得到的菌悬液中加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶（Sigma–Aldrich），在温度为37℃条件下孵育20min，得菌液；四、将步骤三中得到的菌液置于冰浴中，在超声功率为200W，间隔时间5s的条件下，超声处理20min；五、将步骤四超声处理的菌液在温度为4℃，转速为15000g的条件下，离心1~30min，收集上清液过0.45nm的微孔滤膜后采用Ni-His·Band柱层析，即完成重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白表达及纯化，将得到的重组载体pET30a（+）-FIP-fve表达的重组蛋白中加入终浓度3%~4%的右旋糖酐，在-196℃用冻干机进行冻干；

其中，步骤四中所述的热激转化法将pET30a-FIP-fve转入Transetta(DE3)大肠杆菌具体步骤如下：

将冻存的Transetta(DE3)大肠杆菌（购买自TransGen Biotech公司，商品编号Cat.No.CD801）按1：100的接种量接种于2mL的LB液体培养基中，在37℃摇床过夜震荡培养；取1mL活化菌种接种于100mL的LB液体培养基中，在37℃摇床培养1.5~2h，然后将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min，弃去上清，收集沉淀用10mL预冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~30min后，在4℃下3000g离心10min，弃去上清，收集沉淀加入4mL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，即得Transetta(DE3)大肠杆菌感受态细胞悬液，分装于1.5mL灭菌EP管中，每管加Transetta(DE3)大肠杆菌感受态细胞200μL，置于冰上直接用于转化；

热激转化步骤：将已制备好的Transetta(DE3)感受态细胞置于冰上静置30min后，向其中一管内加入2.0μL冰浴30min后的重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物，混匀，另外两管加入2.0μL冰浴30min后的LB液体培养基，然后将置于冰上的这三支灭菌EP管在42℃温度下热休克90s，随后迅速放入冰浴中静置2min，再加入200μL灭菌的LB液体培养基，37℃条件下，150rpm/min摇动培养1h，即完成转化；

其中，Ni-His·Band柱层析具体操作如下：

操作条件为：Ni-His·Band柱层析（型号为No.70239-3,购自Novagen公司）纯化操作始终保持在4℃环境下进行，使用的是一次能够纯化80mg目的蛋白的10mL实用聚丙烯层析空柱管（购自深圳逗点生物技术有限公司），由医疗级的聚丙烯为原料，制成的低溶解度、清洁无毒、能耐受酸碱和一般有机溶剂且不与生物分子结合的聚丙烯管，另外柱子下部出口处采用高分子聚乙烯亲和层析柱用筛板（购自深圳逗点生物技术有限公司）作为柱层析柱子下面的过滤板，柱子下方出口细管处连接一个直径4mm，长5~100cm的胶管，胶管下面接DWD-1紫外检测仪（上海金达生化仪器有限公司），检测柱层析洗脱溶液在280nm的吸光度值，从而根据吸光度值进行目的蛋白的收集工作。空柱管中装入10mL Ni-His·Band树脂（购买自Novagen公司），装柱后排除气泡，用3倍体积灭菌去离子水清洗树脂，通过5倍体积1×离子化缓冲液（50mM NiSO₄）将树脂离子化，用3倍体积1×结合缓冲液平衡树脂柱，待结合缓冲液下降至层析介质表面，小心加入制备好的抽提物，流速为每小时10倍床体积；

Ni-His·Band柱层析具体步骤为：用10倍床体积1×结合缓冲液进行清洗、再用6倍体积1×漂洗缓冲液洗和6倍体积1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白；同时用紫外检测仪检测洗脱液，当吸光度值为0.010以上时进行目的蛋白的收集工作，所得溶液通过Sephadex G25凝胶层析柱方法脱盐，再用0.02M、pH为7.8的PBS洗脱，获得纯化的表达蛋白溶液，即完成重组金针菇免疫调节蛋白表达及纯化；其中，1×结合缓冲液是由0.5M NaCl、20mM Tris-HCl和10mM imidazole组成，1×结合缓冲液pH为7.9；1×漂洗缓冲液是由0.5M NaCl、50mMimidazole和20mM Tris-HCl组成，1×漂洗缓冲液的pH为7.9；1×洗脱缓冲液是由500mMimidazole、0.5M NaCl和20mM Tris-HCl组成，1×洗脱缓冲液的pH为7.9。

本试验步骤二中的RT-PCR反应体系（10μL）如下：

RT反应流程：（30℃反应15min，42℃反应35min，99℃反应6min，5℃反应10min）循环1次；

本试验的金针菇免疫调节蛋白基因的BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切体系：

本试验的表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切体系：

本试验的连接反应体系如下：

本试验步骤五中的酶切检测重组载体pET30a（+）-FIP-fve的电泳图如图1所示，由图1可知，其中1为重组载体pET30a（+）-FIP-fve酶切后电泳图；2为重组载体pET30a（+）-FIP-fve；

1、对本试验通过Ni-His·Band柱层析纯化后的重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白（His-FIP-fve重组蛋白）的表达量进行检测：

对本试验重组载体pET30a（+）-FIP-fve的大肠杆菌Transetta(DE3)菌株原核诱导表达，同时设置重组载体pET30a（+）-FIP-fve的大肠杆菌Transetta(DE3)菌株的未诱导表达蛋白作为对照；在加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L后，在诱导表达不同时间（1.5h,3.0h和4.5h）分别取1.0ml培养液置于1.5ml无菌离心管中离心2min,用100μl无菌水重悬细胞后，加入4×蛋白上样缓冲液(北京诺博莱德科技有限公司,商品编号：P0171)，制备SDS-PAGE供试品，用12%分离胶和5%浓缩胶，以29：1体系进行SDS-PAGE电泳，上样量为5μL，电压为8V/cm,电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，取下分离胶，用考马斯亮蓝染色液染色1.5h，然后用脱色固定液脱色，通过凝胶成像系统扫描，结果见图2，其中，图2中1为分子量Marker；2为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体转化Transetta(DE3)菌株未诱导菌体总蛋白；3为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体转化Transetta(DE3)菌株IPTG诱导表达1.5h的菌体总蛋白；4为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体转化Transetta(DE3)菌株IPTG诱导表达3.0h的菌体总蛋白；3为重组pET30a(+)-FIP-fve表达载体转化Transetta(DE3)菌株IPTG诱导表达4.5h的菌体总蛋白；箭头指向为表达的目的重组蛋白；通过凝胶成像系统（Biolmaging Systems,USA）扫描后用LabWorks软件分析表达的重组目的蛋白表达率为40%（即占菌体总蛋白的40%）。

由图2可知重组载体pET30a（+）-FIP-fve在大肠杆菌Transetta(DE3)中在温度为37℃，终浓度为0.2mmol/L IPTG的诱导4.5h下，经凝胶成像系统软件分析重组蛋白表达量占菌体总蛋白40%以上。

2、对本试验通过Ni-His·Band柱层析纯化后的重组载体pET30a（+）-FIP-fve（His-FIP-fve重组蛋白）的可溶性蛋白进行检测：

1）IPTG及诱导温度对蛋白表达量的影响

将本试验得到的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株15%甘油保存液（菌体浓度为10%）按1:100的接种量接种于LB液体培养基中；

设计不同的诱导表达条件：IPTG浓度为0.2mM，0.5mM，1.0mM；诱导时菌体培养温度分别为21℃，28℃，37℃，诱导时间36h；

然后，取5mL菌液置于灭菌10mL离心管中在15000rpm/min条件下离心10min，菌体沉淀用1ml pH为8.0，浓度为0.2mM的PBS缓冲液重悬，菌悬液中加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，在温度为37℃条件下孵育20min，然后置于冰浴中，进行超声波处理，超声仪功率为200w，超声5s，间隔5s，共处理20min，然后在转速为12000rpm/min条件下离心15min，取上清，得到菌体总可溶性蛋白，接着用Ni-His·Band进行mini-纯化，按照纯化试剂盒说明书操作：

在1.5mL离心管中加入300μL树脂悬液，离心后，用300μL灭菌去离子水清洗后对树脂进行离子化（1×离子化缓冲液200μL），用1×结合缓冲液300μL进行平衡，加入上述得到的全部菌体裂解液上下颠倒离心管几次，轻柔混匀树脂和抽提物，孵育5min。在1000rpm/min条件下离心1min，弃上清。1×结合缓冲液450μL清洗树脂3次，再用1×漂洗缓冲液450μL漂洗树脂2次，最后用1×洗脱缓冲液（450μL）洗脱目的蛋白，取10μL目的蛋白进行SDS-PAGE电泳；Marker:Protein Ruler I(Lot#E10408 TransGen Biotect),12kD(2.0μg/5μL),20kD(0.5μg/5μL),30kD(0.5μg/5μL),40kD(1.0μg/5μL),60kD(0.5μg/5μL),80kD(0.5μg/5μlL)；

上述试验所采用的超声波仪型号为CU33，超声波处理器型号为GEX 500，购买自PGC公司。

对不同条件的IPTG及诱导温度产生的可溶性蛋白进行检测，结果如图3、图4和图5所示：

图3为不同浓度的IPTG在温度为21℃的条件下诱导表达重组载体pET30a（+）-FIP-fve可溶性蛋白的蛋白电泳图；1为0.2mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；2为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；3为1.0mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；

图5为不同浓度的IPTG在温度为37℃的条件下诱导表达重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白的蛋白电泳图；其中，1为0.2mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，2为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带，3为1.0mM的IPTG诱导蛋白表达后的条带；

由图3、图4和图5可知，在温度为28℃，0.2mmol/L IPTG诱导36h条件下得到的可溶性蛋白最多。

2）细胞破碎方法对蛋白表达量的影响

具体实验如下：用总计容量1L的表达菌株用0.2mM的IPTG在28℃条件下诱导培养36h，然后于12000rpm/min离心10min，取菌体沉淀重悬于50mL pH为8.0，浓度为0.2mM的PBS缓冲液中。

设计3组，第1组为单用溶菌酶组，作用浓度0.1mg/mL，作用温度37℃，作用时间20min，随后吸取菌液稀释后在显微镜检测其破碎率为28%；第2组为单用超声波组，菌悬液置于冰浴中，超声仪功率为200w，超声5s,间隔5s,共处理20min，随后吸取菌液稀释后在显微镜检测其破碎率为40%；第3组在菌悬液中加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，作用温度37℃，作用时间20min，然后进行超声波处理，置于冰浴中，超声仪功率为200w，超声5s，间隔5s，共处理20min，随后吸取菌液稀释后在显微镜检测其破碎率为98%；

溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL）结合超声波法（作用时间20min）使菌体破碎率达到98%以上，比单用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL，破碎率28%）和单用超声波法（作用时间20min，破碎率40%）提高30%以上，因此，采用溶菌酶法与超声波法相结合，会起到更好的效果。

上述试验所采用的超声波仪型号为CU33，超声波处理器型号为GEX 500，购买自PGC公司。

对细胞破碎后的可溶性蛋白表达量进行检测，结果图6为重组金针菇免疫调节蛋白表达及纯化前后SDS-PAGE电泳结果图；1为溶菌酶+超声波裂解的表达菌液蛋白；2为未亲和的菌体蛋白；3为表达菌液总蛋白；4为溶菌酶裂解后的表达菌液蛋白；5为漂洗液部分蛋白；6为前洗脱的目的蛋白；7为后洗脱的目的蛋白；菌体破碎最佳条件为：溶菌酶方法结合超声波方法；

3）采用上述试验1）和试验2）优化后得到的重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白（His-FIP-fve重组蛋白），采用试验1中的方法进行Ni-His·Band柱层析，对得到的蛋白进行检测：

对本试验通过Ni-His·Band柱层析纯化后的重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白（His-FIP-fve重组蛋白），用15%的SDS-PAGE（上样量为5μL）进行检测，电压为8V/cm，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，取下分离胶，用考马斯亮蓝染色液染色1.5h，然后用脱色固定液脱色，在凝胶成像系统（Biolmaging Systems,USA）扫描，扫描结果如图4所示；根据条带的面积和颜色深浅经软件LabWorks软件分析计算其纯度为97%以上，并且收集所有含目的蛋白溶液通过蛋白质定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit，Pierce)测定蛋白含量，以BSA为标准品，根据标准曲线Y=276.5x,其中，Y为OD值，x为样品蛋白浓度(μg/mL)，通过测定得到的重组载体pET30a（+）-FIP-fve蛋白（His-FIP-fve重组蛋白）溶液的OD值（三次测定结果的平均值）计算得到溶液的蛋白浓度，最后根据蛋白溶液量计算，结果为1L重组菌株诱导培养液能收获45mg的重组载体pET30a（+）-FIP-fve表达的可溶性蛋白。

其中，重组载体pET30a（+）-FIP-fve表达的可溶性蛋白检测结果如图7所示，图7为重组金针菇免疫调节蛋白表达及纯化前后SDS-PAGE电泳结果图；其中，1为未亲和的杂蛋白；2为漂洗液部分蛋白：3为表达菌液溶菌酶+超声波裂解的蛋白；4为洗脱目的蛋白；M为ProteinRuler I；

由图7可知，在温度为28℃，0.2mmol/L IPTG诱导36h条件下得到的可溶性蛋白最多，通过溶菌酶法+超声波发破碎菌体,破碎率98%以上，能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株的重组蛋白表达率为菌体可溶性蛋白的40%以上，通过His柱层析纯化，1×漂洗缓冲液是由0.5M NaCl、50mM imidazole和20mM Tris-HCl组成,最终可以纯化得到收率高达45mg/L的重组蛋白，重组蛋白经凝胶成像系统软件分析纯度达到97%以上。

将本试验通过Ni-His·Band柱层析纯化得到的His-FIP-fve重组蛋白冻干粉经圆二色谱测定分析，结果如图8所示，由图8可知，本试验的表达载体pET30a（+）-FIP-fve表达的重组蛋白His-FIP-fve在Transetta(DE3)大肠杆菌菌体内得到了正确折叠，形成了低含量α-螺旋（15%）和高含量β-折叠（38%）的二级结构，并且具有β-转角结构，相应比例和天然蛋白相似，特别是α-螺旋（15%）和β-折叠（38%）的形成表明重组蛋白从蛋白二级结构上具备了有完全生物学活性的前提条件。

对本试验得到的能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株通过不同条件诱导表达金针菇免疫调节蛋白，来考察诱导表达条件对蛋白可溶性表达量的影响，具体操作如下：

3、对本试验通过Ni-His·Band柱层析纯化后的重组蛋白His-FIP-fve蛋白进行抗敏试验检测：

将本试验通过Ni-His·Band柱层析纯化得到的重组蛋白His-FIP-fve蛋白经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后经皮下注射形式注入小鼠体内；

具体试验过程：小鼠40只（昆明种小鼠，SPF级,吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供：合格证号：SCXK（吉）2006-0007），雌雄各半，随机分5组，每组8只，分别为低剂量组（5mg/kg）、中剂量组（10mg/kg）、高剂量组（20mg/kg）、阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组采用市售的多功能免疫增强剂乌体林斯（草分支杆菌F.U.36），购于人民同泰药店，规格1.72μg/1mL/支，按照说明书换算成小鼠使用剂量，原液稀释50倍后每只小鼠注射0.5mL；阴性对照组：每天注射生理盐水0.5mL。各组小鼠按实验设计所设剂量注射给药，每天1次，每次0.5mL/只，连续给药3天，于末次给药1小时后摘眼球采血，收集血液，室温凝固2h，然后在转速为1000r/min的条件下离心10min取血清，分装后在-20℃冷冻保存。小鼠血清中各种细胞因子含量通过小鼠酶联免疫试剂盒测定（试剂盒购买自美国的BiosourceInternational,Camarillo,CA,USA，Mouse-γ Interferon ELISA Kit,No.E0900004;Mouse-Interleukin 2ELISA Kit,No.E0900141;Mouse-Interleukin 4 ELISA Kit,No.E0900003），均采用96孔板，按说明书操作，用酶标仪(ELX800;Bio-Tek,Winooski,VT,USA)在450nm测定OD值。ELISA实验数据用ELISA数据处理软件建立标准曲线，并计算各细胞因子含量。对于各组得到的细胞因子含量用临床医师统计学助手V3.0分析软件进行两样本均数t检验，结果如表1所示，低剂量组小鼠血清中IFN-γ的含量与空白对照组差异极显著（p<0.01），表明重组蛋白具有明显的促进小鼠体内产生细胞因子IFN-γ的作用，并且促进IFN-γ生成的活性（p<0.01）比市售的阳性药物（p<0.05）要更强一些，结果见表1。同样方法测定小鼠血清中IL-2含量与空白对照组差异极显著（p<0.01），表明重组蛋白具有明显的促进小鼠体内产生细胞因子IL-2的作用，并且促进IL-2生成的活性（p<0.01）比市售的阳性药物（p<0.05）要更强一些，结果见表2。

采用上述同样方法测定小鼠血清中IL-4含量与空白对照组差异不显著（p>0.05），与市售的阳性药物结果（p>0.05）一致（见表3）；由于IL-4在过敏患者体内的含量常常升高，这是过敏反应的症状之一，结果表明重组蛋白（His-Fip-fve）不会使小鼠体内细胞因子IL-4增加。

表1重组蛋白对小鼠血清中IFN-γ含量的影响

表2重组蛋白对小鼠血清中IL-2含量的影响

表3重组蛋白不同剂量组对小鼠血清中IL-4含量的影响

另外，对上述柱层析纯化得到的重组蛋白His-FIP-fve蛋白进行抗过敏实验，具体步骤如下：用卵白蛋白（OVA）腹膜内免疫BALB/C鼠，在第1d和第7d各一次，然后在实验第4d开始每隔1天，给予小鼠口服200μg的重组蛋白（His-Fip-fve），对照组口服pH为8.0，浓度为0.1mM的PBS，总共给药5次，在试验第15天测定卵白蛋白（OVA）特异抗体和细胞因子的变化，同时观察小鼠免疫综合症状，血浆组织胺含量和肠的组织与解剖学变化。

结果发现：试验组动物的OVA特异抗体IgE的应答反应明显减弱，而TH1细胞所产生的细胞因子（IFN-γ和IL-2）显著增加。

经ELISA方法测定小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-2含量发现重组蛋白具有显著提高小鼠血清中细胞因子Interleukin-2和interferon gamma的作用。而这两种细胞因子均具有抗过敏作用，符合免疫疗法治疗过敏症的原理。而体内IL-4的升高是过敏常见的表现症状，因此重组蛋白可以通过显著增加细胞因子IFN-γ和IL-2含量及相对抑制IL-4的增加来起到抗过敏的作用。因此，表达的重组蛋白可选择性地刺激Th1细胞产生IL-2和IFN-γ，同时产生对过敏原的特异免疫反应，而不会刺激Th2细胞分泌IL-4。

结论：本试验的重组蛋白His-FIP-fve蛋白可以作为预防过敏性疾病的免疫制品，可用于抗过敏的预防及治疗领域。

Claims (5)

1.获得金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于：

按照以下步骤获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的Transetta(DE3)大肠杆菌重组菌株，所述能够表达金针菇免疫调节蛋白的Transetta(DE3)大肠杆菌重组菌株包含有插入了编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA的大肠杆菌表达质粒pET30a（+），使得获得的重组表达质粒在转化到大肠杆菌中时能够表达金针菇免疫调节蛋白：

一、采用试剂盒提取金针菇总RNA；

二、以步骤一提取的金针菇总RNA为模板，通过反转录PCR试剂盒进行RT-PCR，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的cDNA；

三、将步骤二得到的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a（+）中，得到重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物；

四、将步骤三获得的重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物转入Transetta(DE3)大肠杆菌中，获得能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株；

将上述重组菌株培养到OD₆₀₀为0.8～1.0，然后加入IPTG诱导金针菇免疫调节蛋白表达，最后分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；其中，所述的IPTG终浓度为0.2～1mM，

所述的分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白的操作步骤包括：

（一）、取所述能够表达金针菇免疫调节蛋白的Transetta(DE3)大肠杆菌重组菌株，按体积比为1:10～200的比例接种于LB液体培养基中，加入终浓度为0.2～1mM的IPTG，然后在温度为8℃～37℃，转速为80～280rpm的条件下诱导培养12～48h；

（二）、取步骤（一）诱导培养后的金针菇免疫调节蛋白基因重组菌株菌液，在转速为1000～15000rpm的条件下，离心0.5～10min，收集沉淀，然后将收集的沉淀重悬于10～200倍重量的PBS缓冲液中，得菌悬液；

（三）、向步骤（二）得到的菌悬液中加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，在温度为37℃条件下孵育20min，得菌液；

（四）、将步骤（三）中得到的菌液置于冰浴中，在超声功率为200W，间隔时间5s的条件下，超声处理20min；

（五）、将步骤（四）超声处理的菌液在温度为4℃，转速为5000～15000rpm的条件下，离心1～30min，收集上清液采用Ni-His·Band柱层析，然后采用SephadexG25凝胶层析柱方法进行脱盐，用0.02M、pH为7.8的PBS进行洗脱，即获得纯化的表达蛋白溶液，完成分离和纯化表达的金针菇免疫调节蛋白；

其中，所述的金针菇免疫调节蛋白序列如序列表Seq ID No：2所示。

2.根据权利要求1所述的获得金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于步骤三中所述的编码金针菇免疫调节蛋白的cDNA插入大肠杆菌表达质粒pET30a（+）中操作步骤为：将步骤二获得的金针菇免疫调节蛋白编码cDNA以及表达载体pET30a(+)采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切后纯化回收金针菇免疫调节蛋白编码cDNA与表达载体pET30a(+)，然后采用连接酶进行连接，得到重组载体pET30a（+）-FIP-fve连接产物。

3.根据权利要求1所述的获得金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于步骤（二）中所述的PBS缓冲液pH为8.0。

4.根据权利要求1所述的获得金针菇免疫调节蛋白的方法，其特征在于步骤（五）中所述的采用Ni-His·Band柱层析，所用的Wash缓冲液为含有浓度为50mM咪唑基的Wash缓冲液、所用的洗脱缓冲液成分为500mM的咪唑、0.5M的NaCl，20mM的Tris-HCl；其中，洗脱缓冲液pH为7.9。

5.制备用于预防或治疗过敏症的药物的方法，包括：按照权利要求1-4中任一项的方法获得金针菇免疫调节蛋白，将得到的金针菇免疫调节蛋白与可药用载体混合，即制得用于预防或治疗过敏症的冻干粉针药物；其中，可药用载体为甘露醇或右旋糖酐，添加量为3%～6%。