CN110590907A

CN110590907A - 一种免疫调节肽的制备及分离纯化方法

Info

Publication number: CN110590907A
Application number: CN201911051388.7A
Authority: CN
Inventors: 汪少芸; 杨倩; 蔡茜茜; 陈旭; 田永奇
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN110590907B

Abstract

本发明提供了一种从太子参中分离纯化得到免疫调节肽的方法，该方法以太子参为原料，通过蛋白质提取、胃蛋白酶和胰蛋白酶的双步酶解，分离纯化得到特异性免疫多肽，其分子量在949 Da，其氨基酸全序列为：Tyr‑Gly‑Pro‑Ser‑Ser‑Tyr‑Gly‑Tyr‑Gly。本发明克服了现有免疫调节类药物的缺点，并且消除了公众对人工免疫调节剂的忧虑，为开发基于食品源的免疫多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定一定的理论基础。

Description

一种免疫调节肽的制备及分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种利用太子参分离纯化免疫调节肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

免疫是机体接触“抗原性异物”或“异己分子”所发生的一种特异性生理反应，其主要目的是维持机体的内稳态。免疫系统是一个由细胞、组织和器官组成的网络，用来消除潜在的有害物质，如细菌、病毒、真菌、原生动物，并阻止癌细胞的生长。在机体的生存中，免疫系统作为抵御病原体的第一道防线，在身体功能受损伤前提供保护。但是，免疫系统也受到许多因素的影响，包括压力、不健康的生活方式、病原体和抗原等都会破坏机体的免疫系统。于是，用于调节人体免疫反应的药物顺势而生，如环孢霉素、他克莫司、糖皮质激素、植物醇、马兜铃酸、石墨烯和左旋咪唑等已成功应用于人类免疫反应的调节。然而，这些药物的毒副作用和高成本限制了它们在病人中的使用，而且，大多数免疫调节药物不适合慢性或预防性使用。因此，从食物蛋白中发现新型免疫活性肽成为一种有效的治疗和预防手段。

太子参是石竹科植物孩儿参的块根，又名童参、四叶参、米参等，自清代《本草从新》开始就被记录于多本中医著作中，其属于补虚补气药，可益气健脾，生津润肺，中医治疗中多用于脾虚体弱，食欲不振，病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳。太子参的主要种植地区有福建、江苏、山东、安徽等，其中福建柘荣自清末起就有种植，且闻名国内外，有“太子参之乡”的美誉。迄今为止对于太子参的化学成分与药用功效的研究颇多，但是对于太子参蛋白酶解制备多肽还未有相关报道。

因此，本发明从太子参蛋白酶解物中制备具有特定氨基酸序列的高效免疫调节肽。该多肽可以应用于食品和保健品行业。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用太子参分离纯化免疫调节肽的方法，通过该方法得到的多肽具有特定的氨基酸序列。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明的一种免疫调节肽，氨基酸序列为Tyr-Gly-Pro-Ser- Ser-Tyr-Gly-Tyr-Gly（YGPSSYGYG），制备包括如下步骤：

（1）太子参蛋白质的提取：将太子参研磨成粉末，过60目筛，采用碱提酸沉法提取太子参蛋白质；

（2）太子参蛋白酶解物的制备：利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对太子参蛋白进行双步酶解，得到太子参蛋白酶解物；

（3）太子参蛋白酶解物的分离纯化：葡聚糖凝胶G25层析和RP-HPLC反相高效液相色谱对太子参蛋白酶解物分离纯化，收集免疫活性最高的组分冷冻干燥，并利用Nano LC-MS/MS鉴定组分的氨基酸序列。

步骤（1）中太子参蛋白质的提取如下：将太子参研磨成粉末，并按照太子参粉末质量浓度为3.0~5.0 %加入相应体积的0.1~0.3 mol/L的氢氧化钠溶液（NaOH），在45~60 °C水浴中浸提0.5~3.0 h。浸提后离心收集上清液，采用2 mol/L的盐酸（HCl）调节pH值至2.5~3.5，静置1~4 h后，离心收集沉淀冷冻干燥，得到太子参蛋白。

步骤（2）中太子参蛋白酶解物的制备如下：太子参蛋白浓度为1.0~3.0 w/v %、pH为1.0~2.0、温度35~45 ℃、酶解时间为4.0~6.0 h、加入8.0~10.0 w/w %的胃蛋白酶进行酶解，反应结束后，调节pH至6.5~7.5，加入8.0~10.0 w/w %的胰蛋白酶，酶解2.0~4.0 h，反应结束后，立即放置于沸水浴中煮沸10~20 min，终止反应，反应后的溶液离心收集上清液冷冻干燥，得到太子参蛋白酶解产物。

步骤（3）中太子参蛋白酶解物的分离纯化具体操作如下：将步骤（2）中所述太子参蛋白酶解液进行分离纯化，葡聚糖凝胶G25以去离子水作为洗脱液，上样量为5mL，流速为0.3 mL/min，检测波长为214 nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的免疫活性，收集得到免疫活性最高的组分进行反相高效液相色谱分离；反相高效液相色谱的分离以含体积分数0.05 %三氟乙酸的浓度梯度为0~55 v/v%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100 μL，流速为1 mL/min，检测波长为214 nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的免疫活性，收集得到免疫活性较高的组分冷冻干燥；利用Nano LC-MS/MS鉴定组分的氨基酸序列。利用Nano LC-MS/MS鉴定组分的氨基酸序列，得到如权利要求1所述的免疫调节肽的氨基酸序列为：Tyr-Gly-Pro-Ser- Ser-Tyr-Gly-Tyr-Gly。

步骤（3）中免疫活性的测定具体操作如下：免疫活性以促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖活性进行评价。取小鼠脾淋巴细胞悬浮液加入96孔板，以磷酸盐缓冲液为空白对照，样品终浓度分别为10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。加样品后置于37 °C 5% CO₂培养箱中培养不同时间后，每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（5 mg/mL），继续培养4 h，离心弃上清后加入200 μL二甲亚砜，低速震荡10 min，检测570 nm处吸光值。

本发明的有益效果在于：本发明立足于现有免疫调节药物的毒副作用及高成本等缺点，致力于寻找一种天然的免疫调节剂，以太子参为出发点，着眼于胃蛋白酶和胰蛋白酶的双步酶解的过程控制，制备具有特定肽链长度的活性多肽，使得免疫活性得以高效的实现。本发明采用的酶解技术简单高效，能对酶解产物进行活性跟踪从而达到定向酶切，避免了成本浪费，得到的多肽具备免疫活性，为其应用于食品和保健品行业提供理论基础。

附图说明

图1为太子参蛋白酶解物的G25洗脱图（A）及各组分的免疫活性（B）。

图2为RP-HPLC洗脱图（A）及各组分的免疫活性（B）。

图3为F7总离子流图。

图4为免疫调节肽的肽指纹图谱。

图5为免疫调节肽的促增殖活性。

具体实施方式

实施例1

本发明的免疫调节肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Pro-Ser- Ser-Tyr-Gly-Tyr-Gly。

制备方法如下：

第一步：利用中药粉碎机将太子参粉碎成粉末，过60目筛；称取5.0 g太子参粉末，加入100 mL 0.3 mol/L的氢氧化钠溶液，52.1 ℃下浸提1.5 h，10,000 rpm离心20 min后取上清液，采用2 mol/L的盐酸调节pH至2.5，静置1 h，5,000 rpm离心20 min，取沉淀，冷冻干燥即为太子参蛋白。

第二步：称取太子参蛋白10.0 g，加入100 mL去离子水，调节pH至2.0，加入0.8 g胃蛋白酶，置于37 ℃中酶解5.0 h后，调节pH至7.0，加入0.8 g胰蛋白酶，置于37 ℃中酶解3.0 h，置于沸水浴中煮沸10 min，10,000 rpm离心20 min，取上清，冷冻干燥即为太子参蛋白酶解物。

第三步：称取太子参蛋白酶解物100 mg，加入5 mL去离子水，搅拌直至完全溶解，8,000 rpm离心20 min，取上清，过0.22 μm滤膜，利用葡聚糖凝胶G25进行分离纯化：以去离子水作为洗脱液，流速为0.3 mL/min，检测波长为214 nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的免疫活性，测定得到的各峰的洗脱曲线（图1A）和免疫活性测定（图1B）。

第四步：收集得到免疫活性最高的组分G3进行反相高效液相色谱分离：称取G3200 mg，加入5 mL去离子水，充分溶解后过0.22 μm滤膜，上样量为100 μL。反相高效液相色谱的分离以含体积分数0.05 %三氟乙酸的浓度梯度为0~55 v/v%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，流速为1 mL/min，检测波长为214 nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的免疫活性，测定得到的各峰的洗脱曲线（图2A）和免疫活性（图2B）。

第五步：收集得到免疫活性较高的组分F7，冷冻干燥后利用Nano LC-MS/MS鉴定组分的氨基酸序列。利用Nano LC-MS/MS鉴定组分的氨基酸序列，其总离子流图如图3所示，再利用MS/MS鉴定28.15 min离子峰，得到其氨基酸全序列为（如图4所示）：Tyr-Gly-Pro-Ser-Ser-Tyr-Gly-Tyr-Gly（分子量为949 Da），即为本发明的免疫调节肽。

第六步：免疫活性以促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖活性进行评价。取小鼠脾淋巴细胞悬浮液加入96孔板，以磷酸盐缓冲液为空白对照，样品终浓度分别为10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。加样品后置于37 °C 5% CO₂培养箱中培养不同时间后，每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（5 mg/mL），继续培养4 h，离心弃上清后加入200 μL二甲亚砜，低速震荡10 min，检测570 nm处吸光值（图5）。

测定免疫调节肽的促脾细胞增殖活性如图5所示。本发明免疫调节肽在刺激时间为72 h，浓度为100 μg/mL时达到最大刺激指数1.40。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种免疫调节肽的制备及分离纯化方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Gly Pro Ser Ser Tyr Gly Tyr Gly

1 5

Claims

1.一种免疫调节肽，其特征在于：所述免疫调节肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Pro-Ser-Ser-Tyr-Gly-Tyr-Gly。

2.一种如权利要求1所述的免疫调节肽制备方法，其特征在于：以太子参为原料，对其进行蛋白质提取，并利用蛋白酶酶解蛋白质，分离纯化得到免疫多肽。

3.根据权利要求2所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白质提取的具体步骤为：将太子参研磨成粉末，过60目筛，并按照太子参粉末质量浓度为3.0~5.0 %加入0.1~0.3 mol/L的氢氧化钠溶液，然后在45~60 °C浸提0.5~3.0 h；浸提后离心收集上清液，采用2 mol/L的盐酸调节上清液pH值至2.5~3.5，沉降1~4 h后，离心后冷冻干燥得到太子参蛋白。

4.根据权利要求2所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述酶解的具体步骤为：太子参蛋白浓度为1.0~3.0 w/v %、pH为1.0~2.0、温度35~45 ℃、酶解时间为4.0~6.0h、添加8.0~10.0 w/w %的胃蛋白酶进行酶解，酶解反应结束后，调节pH至6.5~7.5，加入8.0~10.0 w/w %的胰蛋白酶，酶解2.0~4.0 h，反应结束后，立即放在沸水浴中煮沸10~20 min，终止反应，离心收集上清，得到免疫调节肽酶解产物。

5.根据权利要求2所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：利用葡聚糖凝胶G25层析和RP-HPLC反相高效液相色谱分离酶解产物，并监控分离组分的免疫活性，收集具有最佳免疫活性的组分；葡聚糖凝胶G25的分离以去离子水作为洗脱液，上样量为5mL，流速为0.3 mL/min，检测波长为214 nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的免疫活性，收集得到免疫活性最高的组分进行反相高效液相色谱分离；反相高效液相色谱的分离以含体积分数0.05 %三氟乙酸的浓度梯度为0~55 v/v%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100 μL，流速为1 mL/min，检测波长为214nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的免疫活性，收集得到免疫活性较高的组分；利用Nano LC-MS/MS鉴定组分的氨基酸序列。