CN106831596B - 一种制备麦角硫因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制备麦角硫因的方法，该方法以蘑菇或其下脚料为原料，经水或体积百分比浓度为5～30％的乙醇水溶液在70～95℃的温度下提取，得到的提取产物依次经过大孔树脂和聚酰胺树脂分离纯化，收集洗脱液，浓缩得到麦角硫因提取物。与现有技术相比，本发明的方法可以制备麦角硫因含量为20～98％的提取物，含量远高于现有技术中的1～5％。本发明的方法制备得到的麦角硫因能够达到产业化生产的要求，为麦角硫因提取物的进一步开发利用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及活性成分制备的技术领域，具体地涉及一种由蘑菇或其下脚料制备麦角硫因的方法。
背景技术
麦角硫因(巯基组氨酸三甲基内盐，ergothioneine，简称为EGT)是1909年在麦角中发现的一种稀有氨基酸，其分子结构如下所示。
麦角硫因是机体内的重要活性物质，但不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄取。国外研究表明它在生物体内可起到抗氧化剂作用，具有清除自由基、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能，可用于户外护肤产品、防护性的化妆品以及眼科产品的开发，也可作为谷胱甘肽理想的替代品，现在已渐渐得到更多人的关注。已有实验证明，人和动物摄入麦角硫因是安全的，且美国已有将麦角硫因作为原料开发的缓解关节疼痛，缓解炎症的膳食补充剂上市销售。麦角硫因最早在1909年从一种真菌Claviceps purpurea中被发现，后来发现在牛肝菌、蘑菇、毛头鬼伞等食用菌中能产生麦角硫因。目前麦角硫因的获得方式主要有化学合成和从天然原料的分离两类。但是化学合成的麦角硫因由于存在副产物等其他杂质而限制了其在食品、药品与保健品领域中的应用。对于采用天然来源提取的方法，专利文献报道的方法大都是利用氧化铝柱进行分离，然后通过高效液相制备分离。专利申请CN104774182A报道一种从蕈菌菌丝体发酵液中分离麦角硫因的方法，该专利申请中的方法利用超滤膜进行超滤，然后通过HILIC色谱填料进行纯化。采用现有的天然原料提取的方法存在的问题是通过现有的提取方法得到的麦角硫因提取物含量很低，一般只有1～5％左右，很难获得高含量的产品，也很难实现大规模生产。另外，蘑菇生产过程中产生的大量下脚料无法利用，造成了极大的浪费。因此，由天然原料制备麦角硫因已成为研究的新热点，提出一种高效的麦角硫因制备方法具有重要的经济和社会意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种制备麦角硫因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以蘑菇为原料，向所述原料中加入水或体积百分比浓度为5～30％的乙醇水溶液，加热提取，过滤，将滤液合并，降温至50℃以下，除去沉淀，保留水提取液的上清液或将乙醇水溶液提取得到的上清液减压浓缩，得到提取产物；
(2)将步骤(1)得到的提取产物采用大孔树脂分离吸附，先后用水和体积百分比浓度为5～50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，减压浓缩，得到大孔吸附树脂分离产物；
(3)将步骤(2)得到的大孔吸附树脂分离产物采用聚酰胺树脂吸附，先后用水和5～50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，减压浓缩，得到麦角硫因提取物。
在本发明步骤(1)中，如果采用乙醇水溶液提取，则乙醇水溶液的浓度以5～30％为宜。由于麦角硫因易溶于水，不易溶于乙醇，浓度过高会导致麦角硫因在高醇溶液中的溶解效果不佳，麦角硫因难以从原料中提取出来。除去沉淀时的温度如果高于50℃，许多杂质无法完全沉淀下来，导致提取效果不佳。另外，为了便于后续的大孔树脂分离操作，采用乙醇水溶液提取时，需要将乙醇除去后再作大孔树脂分离。
优选地，在本发明方法的步骤(1)中，所述蘑菇为榛蘑、金针菇、口蘑、鸡腿菇、海鲜菇、白玉菇柄、杏鲍菇、白蘑、猴头菇、平菇、灵芝、硫磺菌或薄皮纤孔菌中的一种或多种；更优选地，所述蘑菇为蘑菇的菌柄或菌伞、或蘑菇采摘后的下脚料。
优选地，在本发明方法的步骤(1)中，向所述原料中加入按原料质量计2～5倍质量的水或体积百分比浓度为5～30％的乙醇水溶液。
优选地，在本发明方法的步骤(1)中，所述加热提取的温度为70～95℃；更优选地，所述加热提取进行1～3次，每次1～5小时。
优选地，在本发明方法的步骤(1)中，所述过滤采用80～120目的滤网进行。
优选地，在本发明方法的步骤(2)中，所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD300型、X-5型、NKA-Ⅱ型、D101型或816型。
优选地，在本发明方法的步骤(2)中，所述梯度洗脱采用以下任一组乙醇水溶液进行：(a)5％、15％、25％、35％和50％；(b)10％、30％和50％；(c)5％、15％、30％和50％。
优选地，在本发明方法的步骤(3)中，所述梯度洗脱采用体积比百分比浓度为(a)5％、15％、35％和50％或(b)10％、20％、30％和50％的乙醇水溶液进行。
优选地，在本发明方法的步骤(1)、(2)或(3)中，所述减压浓缩的条件为：温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa。减压浓缩时，温度过高易导致产品被破坏，不利于保证产品品质的稳定。
优选地，在本发明方法的步骤(1)中，得到的提取产物的糖度为2～40。
优选地，在本发明方法的步骤(2)中，得到的大孔吸附树脂分离产物的糖度为10～40。
优选地，在本发明方法的步骤(3)中，得到的麦角硫因提取物的糖度为10～20。
各个步骤中的糖度需要适当控制，因为糖度太低会影响后面的分离操作。
优选地，本发明所述的方法还包括步骤(4)：将所述步骤(3)制备的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱吸附，然后用水和体积百分比浓度为5～35％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得到糖度为10～20的麦角硫因浓缩产物。优选地，在该步骤中，所述梯度洗脱采用以下任一组乙醇水溶液进行：(a)5％、10％、20％和35％；(b)5％、10％、15％、20％和35％；(c)5％、10％、15％、20％、25％和35％；(d)10％、15％、20％、25％和35％；(e)10％、15％、20％和25％；(f)10％、15％、25％和35％。更优选地，所述减压浓缩在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下进行。
优选地，本发明的方法还包括步骤(5)：将步骤(4)制备的麦角硫因浓缩产物采用Sephadex LH-20柱进行层析纯化，用体积百分比浓度为5～25％的甲醇水溶液进行等浓度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，将洗脱液减压浓缩、冷冻干燥，得到麦角硫因。优选地，在该步骤中，所述等浓度洗脱采用体积百分比浓度为5％、10％、15％、20％或25％的甲醇水溶液进行；更优选地，所述减压浓缩在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下进行。
与现有技术相比，本发明提供的方法可以制备麦角硫因含量为20～98％的提取物，所得提取物能够达到工业化生产的要求，为麦角硫因提取物的进一步开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法中使用的原料来源于多种真菌蘑菇品种以及蘑菇的多个部位，例如榛蘑、金针菇、口蘑、鸡腿菇、海鲜菇、白玉菇柄、杏鲍菇、白蘑、猴头菇、平菇、灵芝、硫磺菌、薄皮纤孔菌等菌种的菌柄、菌伞以及这些蘑菇采摘后的下脚料等，都可以作为提取麦角硫因的原料；其中，榛蘑、白蘑、杏鲍菇、鸡腿菇、口蘑、海鲜菇和金针菇是提供麦角硫因成分较好的植物原料。通过本发明的方法可以大大降低生产成本，减少资源浪费和环境污染，具有巨大的经济效益。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是根据本发明实施例4的方法制备得到的麦角硫因的HPLC图谱；
图2是根据本发明实施例4的方法制备得到的麦角硫因的ESI-MS图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
麦角硫因的HPLC检测方法的条件：
色谱柱：Kromasil 100-5NH2柱(250mm×4.60mm，E36056)
检测波长：254nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
流动相：乙腈-5mmol/L醋酸铵(80∶20)
进样量：20μL。
实施例2
(1)提取：在100g榛蘑中加入500g的水，在95℃下温浸提取3次，提取时间分别为3、2、1小时，过滤，滤网的目数为120，将滤液合并，静置降温至温度低于50℃，弃去沉淀，得上清液；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中得到的上清液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为5％、15％、25％、35％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将洗脱液合并，然后在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，糖度为40，得到大孔树脂分离产物；
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物∶水＝1∶5，质量比)，采用聚酰胺树脂吸附，然后用水、体积百分比浓度为5％、15％、35％、50％的乙醇水溶液进行洗脱，通过分析型HPLC检测分析，收集富含麦角硫因的洗脱液，得到的洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为10，麦角硫因的含量为51.3％。
实施例3
本实施例包括四个步骤，其中步骤(1)至(3)同实施例2，步骤(4)操作如下。
(4)ODS中低压柱层析分离：通过步骤(3)聚酰胺分离得到的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱进行吸附，用水、体积百分比浓度为5％、10％、20％、35％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每25ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液，然后在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为10的麦角硫因浓缩产物。用实施例1的方法测定，麦角硫因的含量为80.1％。
实施例4
本实施例包括五个括步骤，其中步骤(1)至(4)同实施例3，步骤(5)操作如下。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：步骤(4)得到的麦角硫因浓缩产物采用SephadexLH-20柱层柱进行吸附，然后用体积百分比浓度为5％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液，洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为20的浓缩产物，然后经冷冻干燥得到麦角硫因(127mg)。
利用HR-Q-TOF-MS技术进行质谱测定并与文献数据进行对照，鉴定了根据上述方法分离得到的单体化合物为我们的目标化合物——麦角硫因。在此基础上利用标准品(美国CHROMDEX公司购买)进行标定，测定麦角硫因的含量为98％。阳离子ESI-MS中给出了准分子离子峰[M]+230.0881，与麦角硫因标准品的分子量相符。
实施例5
(1)提取：在1kg杏鲍菇中加入3kg的水，在70℃下温浸提取2次，每次3小时，过滤，滤网的目数为80，将滤液合并，然后静置至温度低于50℃，弃沉淀，得上清液；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中得到的上清液经D101型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将其合并，然后在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到大孔树脂分离产物，糖度为40；
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物∶水＝1∶4，质量比)，采用聚酰胺树脂进行吸附，用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，然后在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为10，麦角硫因的含量为61.2％。
实施例6
本实施例包括四个步骤，其中步骤(1)至步骤(3)同实施例5，步骤(4)操作如下。
(4)ODS中低压柱层析分离：将经步骤(1)至步骤(3)分离得到的麦角硫因提取物用ODS中低压柱进行吸附，用水、体积百分比浓度为5％、10％、20％、35％的乙醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，糖度为20，得到的麦角硫因浓缩产物，含量为81.3％。
实施例7
本实施例包括五个步骤，其中步骤(1)至步骤(4)同实施例6，步骤(5)操作如下。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的麦角硫因浓缩产物用Sephadex LH-20柱层析进行吸附，然后用体积百分比浓度为25％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为10的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因纯品(83mg)。
实施例8
(1)提取：在1000g鸡腿菇中加入4000g的体积百分比浓度为5％的乙醇水溶液，在70℃下温浸提取1次，浸提3小时，过滤，滤网的目数为100，滤液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，糖度为10，得到麦角硫因提取产物；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)得到的麦角硫因提取产物用水分散(麦角硫因提取产物与水的质量比为1∶3)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经AB-8型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将其合并。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到大孔树脂分离产物，糖度为40；
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物与水的质量比为1∶4)，然后采用聚酰胺树脂进行吸附，用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为10，麦角硫因含量为42.3％。
实施例9
本实施例包括四个步骤，其中步骤(1)至步骤(3)同实施例8，步骤(4)操作如下。
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过步骤(3)聚酰胺分离得到的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱吸附，然后用水、体积百分比浓度为5％、10％、15％、20％、35％的乙醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因浓缩产物，糖度为10，麦角硫因含量为62.7％。
实施例10
本实施例包括五个步骤，其中步骤(1)至步骤(4)同实施例9，步骤(5)操作如下。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有麦角硫因浓缩产物用SephadexLH-20柱层析吸附，然后用体积百分比浓度为15％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为20的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因纯品32mg。
实施例11
(1)提取：在100g白蘑中加入200g的体积百分比浓度为10％的乙醇水溶液，在70℃下温浸提取1次，浸提5小时，过滤，滤液合并。在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下将滤液减压浓缩，得到麦角硫因提取产物，糖度为10。
(2)大孔树脂吸附分离：将步骤(1)得到的麦角硫因提取产物用水分散(麦角硫因提取产物与水的质量比为1∶3)，静置2小时，弃去沉淀，上清液用816型大孔树脂吸附，然后用水、体积百分比浓度为5％、15％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将其合并。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到大孔树脂分离产物，糖度为40。
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物与水的质量比为1∶4)，然后采用聚酰胺树脂进行吸附，用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为10，麦角硫因含量为53.7％。
(4)ODS中低压柱层析分离：通过步骤(3)聚酰胺分离得到的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱吸附，然后用水、体积百分比浓度为5％、10％、15％、20％、25％、35％的乙醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因浓缩产物，糖度为10，麦角硫因含量为89.7％。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将步骤(4)得到的麦角硫因浓缩产物采用SephadexLH-20柱层析吸附，用体积百分比浓度为10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为20的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因的纯品(18mg)。
实施例12
(1)提取：在500g口蘑中加入2500g的体积百分比浓度为30％的乙醇水溶液，在70℃下温浸提取3次，浸提5小时，过滤，滤液合并，静置至温度低于50℃，弃沉淀，得上清液；上清液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩至无乙醇，糖度为40，得到麦角硫因提取产物；
(2)大孔树脂吸附分离：将步骤(1)得到的麦角硫因提取产物分散至水中(麦角硫因提取产物与水的质量比为1∶10)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经X-5型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过结合分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将其合并，然后在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到大孔树脂分离产物，糖度为20。
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物与水的质量比为1∶4)，然后采用聚酰胺树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为20，麦角硫因含量为37.2％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过步骤(3)得到的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱进行吸附，用水、体积百分比浓度为10％、15％、20％、25％、35％的乙醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因浓缩产物，糖度为10，麦角硫因含量为78.1％。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)得到的麦角硫因浓缩产物用Sephadex LH-20柱层析吸附，然后用体积百分比浓度为25％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为20的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因纯品(12mg)。
实施例13
(1)提取：在500g海鲜菇中加入2000g的体积百分比浓度为20％的乙醇水溶液，在70℃下温浸提取1次，浸提3小时，过滤，滤液合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取产物，糖度为20；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)得到的麦角硫因提取产物用水分散(麦角硫因提取产物与水的质量比为1∶4)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经HPD-100型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将洗脱液合并。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到大孔树脂分离产物，糖度为40；
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物与水的质量比为1∶4)，然后用聚酰胺树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为10，麦角硫因含量为29.2％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将步骤(3)得到的麦角硫因提取物用ODS中低压柱进行吸附，然后用水、体积百分比浓度为10％、15％、20％、25％的乙醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因浓缩产物，糖度为20，麦角硫因含量为51.3％；
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的麦角硫因浓缩产物用Sephadex LH-20柱层析吸附，用体积百分比浓度为20％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为10的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因纯品(8.9mg)。
实施例14
(1)提取：在500g金针菇中加入2500g的体积百分比浓度为15％的乙醇水溶液，在70℃下温浸提取1次，浸提5小时，过滤，滤液合并，并在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，糖度为20，得到麦角硫因提取产物。
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中得到的麦角硫因提取产物用水分散(麦角硫因提取产物与水的重量比为1∶4)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经HPD300型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将其合并。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，糖度为40，得到大孔树脂分离产物。
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物与水的质量比为1∶4)，采用聚酰胺树脂吸附，然后用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，糖度为10，得到麦角硫因提取物，含量为32.9％。
(4)ODS中低压柱层析分离：将步骤(3)得到的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱进行吸附，用水、体积百分比浓度为10％、15％、25％、35％的乙醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得到麦角硫因浓缩产物，糖度为20，含量为57.2％。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的麦角硫因浓缩产物采用SephadexLH-20柱层析进行吸附，然后用体积百分比浓度为10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为10的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因的纯品(21mg)。
实施例15
(1)提取：在1kg平菇中加入5kg的体积百分比浓度为10％的乙醇水溶液，在70℃下温浸提取1次，浸提5小时，过滤，滤液合并，然后在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取产物，糖度为10；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)得到的麦角硫因提取产物用水分散(麦角硫因提取产物与水的质量比为1∶1)，静置2小时，弃去沉淀，上清液经NKA-II型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液，将其合并。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到大孔树脂分离产物，糖度为15；
(3)聚酰胺树脂分离：将步骤(2)得到的大孔树脂分离产物分散至水中(大孔树脂分离产物与水的质量比为1∶4)，然后采用聚酰胺树脂进行吸附，用水、体积百分比浓度为10％、20％、30％、50％的乙醇水溶液洗脱，通过分析型HPLC检测，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因提取物，糖度为10，麦角硫因含量为27.3％；
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过步骤(3)聚酰胺分离得到的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱吸附，然后用水、体积百分比浓度为10％、15％、20％、25％、35％富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到麦角硫因浓缩产物，糖度为20，麦角硫因含量为49.8％；
(5)Sephadex LH-20纯化：将(4)中得到的麦角硫因浓缩产物采用Sephadex LH-20柱吸附，用体积百分比浓度为10％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过分析型HPLC检测，以麦角硫因纯品作为对照品，收集富含麦角硫因的洗脱液。洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下减压浓缩，得到糖度为15的浓缩产物，经冷冻干燥得到麦角硫因纯品(5mg)。
Claims (17)
1.一种制备麦角硫因提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以蘑菇原料，向所述原料中加入水或体积百分比浓度为5～30％的乙醇水溶液，加热提取，过滤，将滤液降温至50℃以下，除去沉淀，保留水提取液的上清液或将乙醇水溶液提取得到的上清液减压浓缩，得到麦角硫因提取产物；
(2)将所述步骤(1)得到的麦角硫因提取产物采用大孔树脂吸附，先后用水和体积百分比浓度为5～50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含麦角硫因洗脱液，减压浓缩，得到大孔树脂分离产物；
(3)将所述步骤(2)得到的大孔树脂分离产物采用聚酰胺树脂吸附，先后用水和体积百分比浓度为5～50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，减压浓缩，得到麦角硫因提取物；
(4)将所述步骤(3)制备的麦角硫因提取物采用ODS中低压柱吸附，然后用水和体积百分比浓度为5～35％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得到糖度为10～20的麦角硫因浓缩产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述梯度洗脱采用以下任一组体积百分比浓度的乙醇水溶液进行：(a)5％、15％、25％、35％和50％；(b)10％、30％和50％；(c)5％、15％、30％和50％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述梯度洗脱采用体积比百分比浓度为(a)5％、15％、35％和50％或(b)10％、20％、30％和50％的乙醇水溶液进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述蘑菇为榛蘑、金针菇、口蘑、鸡腿菇、海鲜菇、白玉菇柄、杏鲍菇、白蘑、猴头菇、平菇、灵芝、硫磺菌或薄皮纤孔菌中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为蘑菇的菌柄或菌伞、或蘑菇采摘后的下脚料。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，向所述原料中加入按原料质量计2～5倍质量的水或体积百分比浓度为5～30％的乙醇水溶液。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述加热提取的温度为70～95℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述加热提取进行1～3次，每次1～5小时。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述过滤采用80～120目的滤网进行。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD300型、X-5型、NKA-Ⅱ型、D101型或816型中的一种或多种。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)、(2)或(3)中，所述减压浓缩的条件为：温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，得到的麦角硫因提取产物的糖度为2～40；在所述步骤(2)中，得到的大孔树脂分离产物的糖度为10～40；在所述步骤(3)中，得到的麦角硫因提取物的糖度为10～20。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述梯度洗脱采用以下任一组体积百分比浓度的乙醇水溶液进行：(a)5％、10％、20％和35％；(b)5％、10％、15％、20％和35％；(c)5％、10％、15％、20％、25％和35％；(d)10％、15％、20％、25％和35％；(e)10％、15％、20％和25％；(f)10％、15％、25％和35％。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述减压浓缩在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下进行。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5)：将步骤(4)制备的麦角硫因浓缩产物采用Sephadex LH-20柱进行层析纯化，用体积百分比浓度为5～25％的甲醇水溶液进行等浓度洗脱，收集富含麦角硫因的洗脱液，将洗脱液减压浓缩、冷冻干燥，得到麦角硫因。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所述等浓度洗脱采用体积百分比浓度为5％、10％、15％、20％或25％的甲醇水溶液进行。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所述减压浓缩在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa的条件下进行。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (5)
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| JP2008110988A (ja) * | 2006-04-10 | 2008-05-15 | Manabu Nukina | エルゴチオネインの製造方法 |
| CN102978121A (zh) * | 2011-09-06 | 2013-03-20 | 天津市科曼思特医药科技发展有限公司 | 一种微生物转化法生产麦角硫因的方法 |
| CN104749263A (zh) * | 2013-12-26 | 2015-07-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 麦角硫因的检测方法 |
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Non-Patent Citations (4)
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| HPLC 法测定不同品种蘑菇中麦角硫因的含量;张翠，等;《食品工业科技》;20131231;第34卷(第23期);第307-310页，第309页表6 |
| 大孔吸附树脂去除金针菇粗多糖中蛋白的研究;古静燕，等;《食品工业》;20160331;第37卷(第3期);第51-53页，第1页第一节材料和方法，第3页第三节结论 |
| 氧化铝柱层析从双孢菇菇柄中提取麦角硫因;周念波，等;《安徽农业科学》;20101231;第38卷(第27期);第14842-14843页，第14842页第1.2节 |
| 金针菇下脚料多糖脱色工艺及其抑菌活性;陈义勇，等;《食品研究与开发》;20160630;第37卷(第12期);第82-86页，第82页摘要 |
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