CN104610430A - 利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽及其制备方法，述抗氧化多肽的氨基酸序列为：DVVKNAACG。制备方法是以灵芝为原料提取蛋白，然后采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。本发明以来自于灵芝蛋白为出发点，通过碱性蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效地实现。
Description
技术领域
本发明提供了一种灵芝蛋白的抗氧化多肽及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
食品营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营养价值，引起食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食品行业中。但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把目光转向天然抗氧化剂。α-生育酚是一种被最普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天然抗氧化剂。
多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，使蛋白质具有一定的生理功能。在人类的生命活动中，肽在体内的消化吸收优于游离的氨基酸，且有着区别于氨基酸的体内输送体系。某些短肽在提供人体生长、发育所必需的营养物质的同时，还能够防病治病，调节人体机能，这些具有生物活性的多肽被称为生物活性肽。研究发现，很多不同来源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料种子蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
灵芝(Ganoderma lucidum)属于担子菌纲多孔菌目灵芝科，是灵芝属中分布最广的物种，因其子实体中含有大量的药理成分，而被视为极珍贵的药用真菌。灵芝多肽是一类重要活性物质。 我国拥有丰富的灵芝资源， 灵芝中含有丰富蛋白质，利用现代生物技术对蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类等，通过工艺优化生物活性肽的产品得率将使得生物活性肽的研究具有更广阔的前景。
发明内容
本发明提供了一种灵芝蛋白的抗氧化多肽及其制备方法，使抗氧化活性得以高效地实现。
本发明的一种抗氧化多肽，氨基酸序列为DVVKNAACG。
本发明还提供了一种抗氧化多肽的制备方法，以灵芝为原料提取蛋白，然后采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽；所述酶解条件为：pH为8.0、温度45℃、酶解时间为9h、酶-底物配比为3000U/g；所述酶为碱性蛋白酶。所述分离纯化的手段包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。
所述分离纯化的具体步骤为：
（1）酶解产物首先利用分子量截留范围为10000Da和5000Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000Da的组分、分子量介于10000Da和5000Da的组分、分子量小于5000Da的组分；（2）收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－盐酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，将分离出来的最好的抗氧化活性组分利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含体积分数为10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至体积分数为90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积分数为43%乙腈和57%水（v/v）处的洗脱峰,得到本发明的高纯度的抗氧化多肽。利用蛋白质固相序列分析仪鉴定多肽的氨基酸序列，得到本发明的抗氧化多肽的氨基酸序列为：DVVKNAACG。
为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下：
灵芝蛋白的提取
本发明所采用的灵芝蛋白为异样发酵获得。
灵芝蛋白质提取工艺条件为：将灵芝清洗3-5次， 超声波破碎，浸提。浸提pH为 8.0，料液比为20:1（重量比）。浸提时间12h，离心10000g 20分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到灵芝蛋白。
灵芝蛋白的酶解
酶购自上海生物试剂公司（中国·上海）。
采用碱性蛋白酶酶解灵芝蛋白，蛋白浓度为30mg/ml，酶解条件取pH为8.0、温度45℃、酶解时间为9h、酶与底物比为3000U/g，用2M NaoH调节pH稳定，水解9h后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备用。
酶解产物的分离、纯化
将得到的酶解产物利用分子量截留范围为10000Da和5000Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000Da的组分、分子量介于10000Da和5000Da的组分、分子量小于5000Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行分离，以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－盐酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50（长100cm，直径2.6cm）凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集43%乙腈和57%水（v/v）处的洗脱峰，得到本发明的高纯度的抗氧化多肽。
抗氧化多肽的氨基酸序列测定
利用蛋白质固相序列分析仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定本发明的抗氧化多肽的氨基酸全序列。
抗氧化活性的测试
a. DPPH自由基清除能力的测定：
利用DPPH（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）自由基清除率测定法研究抗氧化多肽。配制浓度为1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2mL, 0.1mM 的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解样品的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517 nm处测定吸光度,吸光值越小，表明自由基清除能力越强。
清除率(%)=〔1- (Ai- Aj)/A0〕×100%
式中，A0为2 mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品溶剂，空白对照；Ai为2mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品；Aj为2mL的无水乙醇+2 mL的样品。
b. ABTS自由基清除活性的测定：
以去离子水将ABTS溶解，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入过硫酸钾，使过硫酸钾的浓度为2.45 mmol/L。之后将该溶液在室温下置于暗处过夜12～16h。将生成的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液（PBS，0.2 mol/L，pH 7.4）稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70。取0.1ml酶解液与2.9ml ABTS自由基液混合，摇匀30s，暗处反应10 min，然后在734nm下测定反应液的吸光值。以蒸馏水代替水解液作空白。
清除率(%)= (A0- Aj)/A0×100%
式中，A0为2.9 mL ABTS试剂与0.1 mL蒸馏水混合液的吸光值；Aj为2.9 mL ABTS试剂与0.1 mL酶解液混合液的吸光值。
c. 抗脂质体过氧化活性的测定
用等体积新鲜的鸡蛋卵黄和磷酸缓冲液（pH7.4，0.1mol/L）混合，使用前稀释25倍并用磁力搅拌机搅拌均匀。在试管中分别加入2.4ml卵黄稀释液、2.4ml 25mmol/L FeSO4·H2O、200μL水解液样品，混匀后在37℃下水浴4h，加入0.8ml 50%三氯乙酸和2ml TBA，混匀后在95℃恒温30min。冷却至室温后，8000r/min离心20min，取上清液于532nm下测定吸光值。以蒸馏水代替水解液作为空白。
抑制率(%)=〔(A0- Aj)/A0〕×100%
式中，A0为空自对照组的吸光度；Aj为样品组的吸光度。
本发明立足于寻找一种天然高效的抗氧化剂，以来自于灵芝蛋白为出发点，通过碱性蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效地实现。
附图说明
图1为抗氧化多肽的RP-HPLC图谱；
图2为纯化的抗氧化多肽清除DPPH自由基的“量-效”关系曲线。
图3为纯化的抗氧化多肽清除ABTS自由基的“量-效”关系曲线。
图4为纯化的抗氧化多肽抑制Fe2+诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应的“量-效”关系曲线。
具体实施方式
以灵芝为原料提取蛋白，然后使用碱性蛋白酶对其进行酶解，蛋白浓度为30mg/ml，pH为8.0、温度45℃、酶解时间为9h、酶-底物配比为3000U/g；将得到的酶解产物利用分子量截留范围为10000Da和5000Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于8000Da的组分、分子量介于10000Da和5000Da的组分、分子量小于5000Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行分离，以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－盐酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50（长100cm，直径2.6cm）凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，得到本发明的高纯度的特异性抗氧化多肽。
本发明采用的仪器、检测手段如下：
本发明应用超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱、RP-HPLC反相高效液相色谱等多种分离纯化手段，实现具有显著活性的抗氧化多肽的高效分离纯化。
利用蛋白质固相测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定纯化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。
为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例：
实施例1
称取7.5克灵芝蛋白用去离子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L NaoH将其pH调节至8.0。先将该溶液水浴加热到45℃，接着再按照酶-底物配比为3000U/g的比例加入相应量的酶，酶解时间为9小时。接着在沸水浴中灭酶15分钟，冷却后再4000rpm离心15分钟。收集上清液备用。
将上清液用分子量截留范围为10000Da和5000Da的超滤膜进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000Da的组分、分子量介于5000Da和10000Da的组分、分子量小于5000Da的组分，并测定其抗氧化活性。分子量小于5000Da的组分具有最好的抗氧化活性。
收集分子量小于5000Da的组分，用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行再进一步的分离，以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－盐酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量，收集各峰并测定抗氧化活性。
将分离出来的抗氧化活性最明显的组分峰用Sepadex G-50凝胶过滤色谱（长20cm，直径1.6cm）再进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量。收集各峰并测定抗氧化活性。
将分离出来的最好的抗氧化活性组分利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集43%乙腈和57%水（v/v）处的洗脱峰,得到本发明的高纯度的特异性抗氧化多肽，如图1所示。 P峰为该抗氧化多肽的色谱峰。得到高纯度的抗氧化肽。
纯化后的抗氧化多肽具有较强的抗氧化能力，由图2、图3和图4可以看出，它具有较强的清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂质过氧化反应的能力。
利用蛋白质固相测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定纯化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列为：DVVKNAACG。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽，其特征是：所述抗氧化多肽的氨基酸序列为：DVVKNAACG。
2.一种权利要求1所述的利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽的制备方法，其特征是：以灵芝为原料提取蛋白，然后采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。
3.根据权利要求2所述的利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽的制备方法，其特征是：所述酶解条件为：pH为8.0、温度45℃、酶解时间为9h、酶-底物配比为3000U/g；所述酶为碱性蛋白酶。
4.根据权利要求2所述的利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽的制备方法，其特征是：所述分离纯化的手段包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。
5.根据权利要求2所述的利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽的制备方法，其特征是：所述分离纯化的具体步骤为：（1）酶解产物首先利用分子量截留范围为5000Da和10000Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10000Da的组分、分子量介于10000Da和5000Da的组分、分子量小于5000Da的组分；（2）收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH8.0Tris－盐酸缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含体积分数为10%乙腈和90%水的混合液开始，至体积分数为90%乙腈和10%水的混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积分数为43%乙腈和57 %水处的洗脱峰,得到抗氧化多肽。
6.根据权利要求2所述的利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽的制备方法，其特征是：灵芝蛋白质提取方法为：将灵芝清洗3-5次，超声波破碎，浸提。浸提pH为 8.0，料液比为20:1；浸提时间12h，离心10000g 20分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到灵芝蛋白。
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