CN103695516B - 大鲵提取物及其制备方法 - Google Patents
大鲵提取物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103695516B CN103695516B CN201310618317.7A CN201310618317A CN103695516B CN 103695516 B CN103695516 B CN 103695516B CN 201310618317 A CN201310618317 A CN 201310618317A CN 103695516 B CN103695516 B CN 103695516B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- giant salamander
- salamander extract
- enzymolysis
- enzyme
- enzymolysis solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明公开了一种大鲵提取物及其制备方法。该方法，包括如下步骤：将离体的大鲵骨和/或肉组织制成肉糜后加水混匀，加入酶I进行酶解I后，离心取上清液得到酶解液I，向所得酶解液I中再加入酶II进行酶解II，再离心取上清液得到酶解液II，将所得酶解液II进行脱色脱臭和干燥，得到所述大鲵提取物。该方法工艺简便，条件温和，高效可控，无污染，无不良副产物，所得大鲵提取物含有18种氨基酸，具有清除超氧阴离子自由基和/或羟自由基的能力，可用于保健品、化妆品、药品等领域，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种大鲵提取物及其制备方法。
背景技术
《野生动物保护法》的形成和建立，一方面严厉打击了破坏大鲵资源以及捕杀、贩卖等一系列非法犯罪行为，另一方面，鼓励驯养繁殖和合法合理经营。目前全国办证的达几百家，国家批准建立的大鲵资源保护区有22个，现在还在扩大发展之中，大鲵在自然保护区得到较好的繁衍生息，为大鲵的保护、驯养繁殖，开发利用和可持续发展拓开了一个更广阔的空间。有关部门加大了执法力度，野生大鲵的数量正逐步增多，这为大鲵产业化的开发带来了可靠的技术保障，为人工增殖放流提供了苗种。国务院野生动物保护办公室批准极小数的养殖专业户利用人工养殖子二代以下的无繁殖能力的个体、伤残体进行科研、加工和利用，这使得从大鲵体内提取营养成分为人类服务成为可能。
传统中医和现代医学理论都认为大鲵有很高的药用价值。传统中医认为，大鲵性甘平、味淡，有补气、养血、益智、滋补、强壮等多重功效。大鲵的皮肤、肌肉、脏器、骨骼等均可入药，这足以说明其再中药学中的地位。现代医学认为，经常食用大鲵可聪明益智、延缓衰老、提高造血和免疫功能。
目前，抗氧化肽的生产制备方法和途径主要有三种：一是从自然界的生物体中提取其本身固有的各种天然抗氧化肽类物质；二是通过蛋白质降解的途径可以获得具有抗氧化活性的抗氧化肽；三是应用合成方法来制备抗氧化肽。天然生物体中存在着具有各种抗氧化活性的抗氧化肽，但生产成本较高，因生物体内的含量普遍很低很难实现大规模的生产；而合成法虽可按照人们的意愿合成任意抗氧化肽，但成本高、副反应多及残留有毒化合物，因此合成法较少用于大规模制备。目前用的最多的是酶水解法，酶能在温和的条件下进行，且可通过选择酶的种类、控制反应时间和水解度来得到抗氧化肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种大鲵提取物及其制备方法。
本发明提供的制备大鲵提取物的方法，包括如下步骤：将离体的大鲵骨和/或肉组织制成肉糜后加水混匀，加入酶I进行酶解I后，离心取上清液得到酶解液I，向所得酶解液I中再加入酶II进行酶解II，再离心取上清液得到酶解液II，将所得酶解液II加入活性炭进行脱色脱臭和干燥，得到所述大鲵提取物。
上述方法中，所用大鲵骨和/或肉组织优选为除去大鲵尾部和腹腔内脂肪及内脏组织的其他骨或肉或两者混合物。
所述肉糜与水的质量比为1:1～1:10，具体可为1:5、1:1-5或1:5-10；
所述酶I选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶Alcalse中的至少一种；
所述酶I的用量为所述肉糜加水总质量的0.2%～1%，优选0.5%～0.7%；
所述酶解I步骤中，温度为25℃～65℃，优选45℃～55℃；时间为20min～150min，优选60min～80min；pH为8～11，优选9.5～10.5；
胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶Alcalse的酶活均采用如下定义：
1U表示在pH为6.2，25℃时，每分钟水解1μmolBAEE(N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐)所需的酶量。
胰蛋白酶英文品名Trypsin，可购于Sigma公司；
木瓜蛋白酶英文品名Papainfrompapayalatex，可购于Sigma公司；
碱性蛋白酶英文品名ProteasefromBacilluslicheniformis，可购于Sigma公司。
所述酶II为风味蛋白酶，具体选自诺维信Flavourzyme500MG和诺维信Flavourzyme1000L中的至少一种；
Flavourzyme500MG和Flavourzyme1000L均购于诺维信公司，其标注活力分别为500LAPU及1000LAPU每克。其中，1LAPU（亮氨酸氨基肽酶单位）为每分钟水解1毫摩尔L-亮氨酸-对硝基苯胺所需的酶量。
所述酶II的用量为所得酶解液I质量的0.2%～1%，优选0.5%～0.7%；
所述酶解II步骤中，温度为45℃～65℃，优选45℃-55℃；时间为10min-60min，优选25min～35min；pH值为6～9，优选6.5～7.5；
所述离心步骤中，搅拌转速均为100r/min-300r/min。
所述活性炭的用量为所得酶解液II质量的0.1%～0.6%，优选0.3%～0.5%；
脱色脱臭的总时间为10min～30min，优选15min～20min。
所述方法还包括如下步骤：
在所述干燥步骤之后，将所得产物用流动相溶解过滤后，利用高效液相色谱进行分离，收集保留时间为9.387-9.401min、10.003-10.172min和10.882-10.955min的三组流分，即为所述大鲵提取物；
所述三组流分的保留时间具体可为9.387-9.393min、10.003-10.054min、10.882-10.901min或为9.393-9.401min、10.054-10.172min和10.901-10.955min；
所述用高效液相色谱进行分离中，所用色谱柱的型号为TsKgelG2000SWXL；所用色谱柱的高为300mm，直径为7.8mm；
所用流动相为由体积比为30：70：0.1的乙腈、水和三氟乙酸组成的混合液；
检测波长为UV280nm；
流速为1ml/min；
柱温30℃；
所述产物与流动相的用量比为5mg：1ml；
所述过滤步骤中，所用滤膜的孔径为0.45μm；
按照上述方法制备得到的大鲵提取物，也属于本发明的保护范围。
所述大鲵提取物的平均分子量为847.13-911.39，具体为888.39、847.13-888.39或888.39-911.39；
所述大鲵提取物中含有谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的至少一种。
另外，以大鲵提取物为活性成分的产品及大鲵提取物或所述产品在清除超氧阴离子自由基和/或羟自由基中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述产品具有清除超氧阴离子自由基和/或羟自由基的能力。
本发明提供的大鲵提取物制备方法，工艺简便，条件温和，高效可控，无污染，无不良副产物，所得大鲵提取物含有18种氨基酸，具有清除超氧阴离子自由基和/或羟自由基的能力，可用于保健品、化妆品、药品等领域，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为大鲵提取物分子量测定试验所用标准品的HPLC图谱。
图2为标准品的相对分子质量的对数与保留时间所绘制的标准曲线。
图3a、3b、3c分别为实施例1、2、3所得大鲵提取物在不同浓度下的清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。下述实施例所用胰蛋白酶英文品名Trypsin，购于Sigma公司；木瓜蛋白酶英文品名Papainfrompapayalatex，购于Sigma公司；碱性蛋白酶英文品名ProteasefromBacilluslicheniformis，购于Sigma公司；Flavourzyme500MG和Flavourzyme1000L均购于诺维信公司。
下述实施例所用离体的大鲵肉组织均为宰杀机构宰杀后的丢弃物，也即除去大鲵尾部和腹腔内脂肪及内脏组织的其他肉。
实施例1、
将离体的大鲵肉组织制成肉糜后加水，肉糜和水的质量比为1：10，混匀，加入酶I碱性蛋白酶Alcalase进行酶解I，碱性蛋白酶Alcalase的用量为肉糜和水总质量的0.2%，酶解温度为45℃，酶解时间为60min，酶解pH值为10，搅拌速度为100r/min；
将所得酶解液I中再加入酶II风味蛋白酶进行酶解II，风味蛋白酶的用量为酶解液I质量的0.2%，酶解温度为45℃，酶解时间为30min，酶解pH值为7，离心（搅拌速度为100r/min）取上清液得到酶解液II，再加入活性炭进行脱色脱臭，用量为酶解液II质量的0.3%，处理时间15min，冷冻干燥得大鲵提取物。
对所得大鲵提取物按照如下方法进行检测：
用高效液相色谱法HPLC检测大鲵提取物的分子量分布。色谱条件：色谱柱采用TsKgelG2000SWXL（300mm×7.8mm），流动相为乙腈：水：三氟乙酸=30：70：0.1(v/v/v)，检测波长为UV280nm，流速为1ml/min，柱温30℃。
将标准样品牛血清蛋白（Mr67000）、维生素B12（Mr1335）、氧化型谷胱甘肽（Mr614）配成混标，每种物质含量均为5mg/ml，按照上述色谱条件进行HPLC试验。
图1为标准样品的HPLC图谱，根据三种标准样品的相对分子质量和洗脱时间，绘制相对分子质量对数与标准样品洗脱时间的关系曲线（图2）。直线的回归方程为：y=-0.4088x+7.1261，R2=0.9998。式中，x代表洗脱时间，y代表分子量对数。
表1大鲵提取物保留时间及分子量
以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜（0.45μm）过滤后进行HPLC测定。根据HPLC图谱分析得到结果见表1，可以看出该大鲵提取物样品主要包括三个组分峰，洗脱时间分别为10.955min、10.172min、9.401min，根据标准曲线计算出各峰的分子量分别为444.32、928.51、2042.90，根据峰面积计算该三种物质分别占44.68%、29.5%、17.58%，三者共占91.76%。计算该大鲵提取物的平均分子量为847.13。
所得结果为，大鲵提取物平均分子量为847.13。
按照如下方法测定该大鲵提取物的羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率：
将冷冻干燥而得的大鲵提取物配制成不同浓度的样品，进行抗氧化测定，所用方法为羟自由基清除试验和超氧阴离子自由基清除试验。
羟自由基清除试验方法：取0.5mL0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1mL0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.40）和0.5mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5mL0.75mmol/L硫酸亚铁溶液（FeSO4），混匀后，加入0.5mL0.01%双氧水（H2O2），于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值，所得数据为损伤管吸光度A损伤。未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5mL0.01%双氧水，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光度值A未损伤。样品管以0.5mL样品代替损伤管中的0.5mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管中的吸光度A样品。按照下式计算样品对·OH的清除率：
清除率I（%）=100%×（A样品-A损伤）/（A未损伤-A损伤）
超氧阴离子自由基清除试验方法：在一系列的试管中加入2.8mL0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2），然后加入0.1mL不同浓度的样品溶液，混合均匀，于25℃水浴中保温10min，然后加入25℃水浴预温的3mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混匀后迅速加入干燥的石英比色皿中，在325nm下每隔半分钟测定一次OD值，反应4.5min结束。以0.1mol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品，作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按照下式计算样品对超氧阴离子自由基的清除率。
清除率I（%）=100%×（V对照-V样品）/V对照
式中：
V对照：对照组邻苯三酚自氧化速率（ΔOD/min）
V样品：样品组邻苯三酚自氧化速率（ΔOD/min）
试验结果见图3a。
所得结果显示：从图3a中可以看出大鲵提取物对两种自由基均具有较高的清除作用。从而证明大鲵提取物具有抗氧化活性作用。
按照如下方法测定该大鲵提取物氨基酸组成：
参照GB/T5009.124-2003，对大鲵提取物进行处理分析，得到大鲵提取物的氨基酸组成，见表2。
表2实施例1所得大鲵提取物的氨基酸组成
所得结果为：大鲵提取物的氨基酸组成含量由高到低的顺序依次为：谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸。
由上可知，大鲵提取物平均分子量为847.13，氨基酸组成含量较高的氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸。
实施例2
将离体的大鲵肉组织制成肉糜后加水，肉糜和水的质量比为1：1，混匀，加入酶IAlcalase碱性蛋白酶进行酶解I，Alcalase碱性蛋白酶的用量为肉糜和水总质量的0.6%，酶解温度为55℃，酶解时间为80min，酶解pH值为10，搅拌速度为150r/min；
将所得酶解液I中再加入酶II风味蛋白酶进行酶解II，风味蛋白酶的用量为酶解液I质量的0.6%，酶解温度为50℃，酶解时间为30min，酶解pH值为7，离心（搅拌速度为150r/min）取上清液得到酶解液II，再加入活性炭进行脱色脱臭，用量为酶解液II质量的0.5%，处理时间15min，冷冻干燥得大鲵提取物。
对所得大鲵提取物按照如下方法进行检测：
用高效液相色谱法HPLC检测大鲵提取物的分子量分布。色谱条件：色谱柱采用TsKgelG2000SWXL（300mm×7.8mm），流动相为乙腈：水：三氟乙酸=30：70：0.1(v/v/v)，检测波长为UV280nm，流速为1ml/min，柱温30℃。
将标准样品牛血清蛋白（Mr67000）、维生素B12（Mr1335）、氧化型谷胱甘肽（Mr614）配成混标，每种物质含量均为5mg/ml，按照上述色谱条件进行HPLC试验。
图1为标准样品的HPLC图谱，根据三种标准样品的相对分子质量和洗脱时间，
绘制相对分子质量对数与标准样品洗脱时间的关系曲线（图2）。直线的回归方程为：y=-0.4088x+7.1261，R2=0.9998。式中，x代表洗脱时间，y代表分子量对数。
表3大鲵提取物的保留时间及分子量
以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜（0.45μm）过滤后进行HPLC测定。根据HPLC图谱分析得到结果见表3，看出大鲵提取物样品主要包括三个组分峰，洗脱时间分别为10.901min、10.054min、9.393min，根据标准曲线计算出各峰的分子量分别为467.49、1037.59、2058.52，根据峰面积计算该三种物质分别占44.61%、29.1%、17.56%，三者共占92.27%。计算该大鲵提取物的平均分子量为888.39。
所得结果为，大鲵提取物的平均分子量为888.39。
按照如下方法测定该大鲵提取物的羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率：
将冷冻干燥而得的大鲵提取物配制成不同浓度的样品，进行抗氧化测定，所用方法为羟自由基清除试验和超氧阴离子自由基清除试验。
羟自由基清除试验方法：取0.5mL0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1mL0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.40）和0.5mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5mL0.75mmol/L硫酸亚铁溶液（FeSO4），混匀后，加入0.5mL0.01%双氧水（H2O2），于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值，所得数据为损伤管吸光度A损伤。未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5mL0.01%双氧水，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光度值A未损伤。样品管以0.5mL样品代替损伤管中的0.5mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管中的吸光度A样品。按照下式计算样品对·OH的清除率：
清除率I（%）=100%×（A样品-A损伤）/（A未损伤-A损伤）
超氧阴离子自由基清除试验方法：在一系列的试管中加入2.8mL0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2），然后加入0.1mL不同浓度的样品溶液，混合均匀，于25℃水浴中保温10min，然后加入25℃水浴预温的3mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混匀后迅速加入干燥的石英比色皿中，在325nm下每隔半分钟测定一次OD值，反应4.5min结束。以0.1mol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品，作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按照下式计算样品对超氧阴离子自由基的清除率。
清除率I（%）=100%×（V对照-V样品）/V对照
式中：
V对照：对照组邻苯三酚自氧化速率（ΔOD/min）
V样品：样品组邻苯三酚自氧化速率（ΔOD/min）
试验结果见图3b。
所得结果显示：从图3b中可以看出大鲵提取物对两种自由基均具有较高的清除作用。从而证明大鲵提取物具有抗氧化活性作用。
按照如下方法测定该大鲵提取物氨基酸组成：
参照GB/T5009.124-2003，对大鲵提取物进行处理分析，得到大鲵提取物的氨基酸组成，见表4。
表4实施例2所得大鲵提取物的氨基酸组成
所得结果为：大鲵提取物的氨基酸组成含量由高到低的顺序依次为：谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、胱氨酸、酪氨酸、色氨酸。
由上可知，大鲵提取物具有抗氧化活性，平均分子量为888.39，氨基酸组成含量较高的氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸。
实施例3
将离体的大鲵肉组织制成肉糜后加水，肉糜和水的质量比为1：5，混匀，加入酶I碱性蛋白酶Alcalase进行酶解I，碱性蛋白酶Alcalase的用量为肉糜和水总质量的1.0%，酶解温度为30℃，酶解时间为120min，酶解pH值为10，搅拌速度为250r/min；
将所得酶解液I中再加入酶II风味蛋白酶进行酶解II，风味蛋白酶的用量为酶解液I质量的1.0%，酶解温度为55℃，酶解时间为30min，酶解pH值为9，离心（搅拌速度为150r/min）取上清液得到酶解液II，再加入活性炭进行脱色脱臭，用量为酶解液II质量的0.5%，处理时间20min，冷冻干燥得大鲵提取物。
对所得大鲵提取物按照如下方法进行检测：
用高效液相色谱法HPLC检测大鲵提取物的分子量分布。色谱条件：色谱柱采用TsKgelG2000SWXL（300mm×7.8mm），流动相为乙腈：水：三氟乙酸=30：70：
0.1(v/v/v)，检测波长为UV280nm，流速为1ml/min，柱温30℃。
将标准样品牛血清蛋白（Mr67000）、维生素B12（Mr1335）、氧化型谷胱甘肽（Mr614）配成混标，每种物质含量均为5mg/ml，按照上述色谱条件进行HPLC试验。
图1为标准样品的HPLC图谱，根据三种标准样品的相对分子质量和洗脱时间，
绘制相对分子质量对数与标准样品洗脱时间的关系曲线（图2）。直线的回归方程为：y=-0.4088x+7.1261，R2=0.9998。式中，x代表洗脱时间，y代表分子量对数。
表5大鲵提取物的保留时间及分子量
以流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜（0.45μm）过滤后进行HPLC测定。根据HPLC图谱分析得到结果见表5。可以看出大鲵提取物样品主要包括三个组分峰，洗脱时间分别为10.882min、10.003min、9.387min，根据标准曲线计算出各峰的分子量分别为475.92、1088.61、2070.32，根据峰面积计算该三种物质分别占44.66%、29.2%、17.57%，三者共占91.43%。计算该大鲵提取物的平均分子量为911.39。
所得结果为，大鲵提取物的平均分子量为911.39。
按照如下方法测定该大鲵提取物的羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率：
将冷冻干燥而得的大鲵提取物配制成不同浓度的样品，进行抗氧化测定，所用方法为羟自由基清除试验和超氧阴离子自由基清除试验。
羟自由基清除试验方法：取0.5mL0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1mL0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.40）和0.5mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5mL0.75mmol/L硫酸亚铁溶液（FeSO4），混匀后，加入0.5mL0.01%双氧水（H2O2），于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值，所得数据为损伤管吸光度A损伤。未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5mL0.01%双氧水，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光度值A未损伤。样品管以0.5mL样品代替损伤管中的0.5mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管中的吸光度A样品。按照下式计算样品对·OH的清除率：
清除率I（%）=100%×（A样品-A损伤）/（A未损伤-A损伤）
超氧阴离子自由基清除试验方法：在一系列的试管中加入2.8mL0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2），然后加入0.1mL不同浓度的样品溶液，混合均匀，于25℃水浴中保温10min，然后加入25℃水浴预温的3mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混匀后迅速加入干燥的石英比色皿中，在325nm下每隔半分钟测定一次OD值，反应4.5min结束。以0.1mol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品，作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按照下式计算样品对超氧阴离子自由基的清除率。
清除率I（%）=100%×（V对照-V样品）/V对照
式中：
V对照：对照组邻苯三酚自氧化速率（ΔOD/min）
V样品：样品组邻苯三酚自氧化速率（ΔOD/min）
试验结果见图3c。
所得结果显示：从图3c中可以看出大鲵提取物对两种自由基均具有较高的清除作用。从而证明大鲵提取物具有抗氧化活性作用。
按照如下方法测定该大鲵提取物氨基酸组成：
参照GB/T5009.124-2003，对大鲵提取物进行处理分析，得到大鲵提取物的氨基酸组成，见表6。
表6实施例3所得大鲵提取物的氨基酸组成
所得结果为：大鲵提取物的氨基酸组成含量由高到低的顺序依次为：谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸。
由上可知，大鲵提取物具有抗氧化活性，平均分子量为911.39，氨基酸组成含量较高的氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸。
Claims (12)
1.一种制备大鲵提取物的方法，包括如下步骤：将离体的大鲵骨和/或肉组织制成肉糜后加水混匀，加入酶I进行酶解I后，离心取上清液得到酶解液I，向所得酶解液I中再加入酶II进行酶解II，再离心取上清液得到酶解液II，将所得酶解液II进行脱色脱臭和干燥，得到所述大鲵提取物；
所述大鲵提取物中含有谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的至少一种；
所述酶I选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalse碱性蛋白酶中的至少一种；
所述酶I的用量为所述肉糜和水总质量的0.2％～1％；
所述酶解I步骤中，温度为25℃～65℃；时间为20min-150min；pH为8～11；
所述酶II选自诺维信Flavourzyme500MG和诺维信Flavourzyme1000L中的至少一种；
所述酶II的用量为所得酶解液I质量的0.2％～1％；
所述酶解II步骤中，温度为45℃～65℃；时间为10min-60min；pH值为6～9。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肉糜与水的质量比为1:1～1：10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶I的用量为所述肉糜和水总质量的0.5％～0.7％；或者，
所述酶解I步骤中，温度为45℃～55℃；时间为60min～80min；pH为9.5～10.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶II的用量为所得酶解液I质量的0.5％～0.7％；或者，
所述酶解II步骤中，温度为45℃-55℃；时间为25min～35min；pH值为6.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心步骤中，搅拌转速均为100r/min-300r/min；或者，
所述脱色脱臭步骤中，所用脱水脱臭剂为活性炭；或者，
所述活性炭的用量为酶解液II质量的0.1％～0.6％；或者，
脱色时间为10min～30min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述活性炭的用量为酶解液II质量的0.3％～0.5％；或者，
脱色时间为15min～20min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：
在所述干燥步骤之后，将所得产物用流动相溶解过滤后，利用高效液相色谱进行分离，收集保留时间为9.387-9.401min、10.003-10.172min和10.882-10.955min的三组流分，即为所述大鲵提取物；
所述用高效液相色谱进行分离中，所用色谱柱的型号为TsKgelG2000SWXL；所用色谱柱的高为300mm，直径为7.8mm；
所用流动相为由体积比为30：70：0.1的乙腈、水和三氟乙酸组成的混合液；
检测波长为UV280nm；
流速为1ml/min；
柱温30℃；
所述产物与流动相的用量比为5mg：1ml；
所述过滤步骤中，所用滤膜的孔径为0.45μm。
8.权利要求1-7任一所述方法制备得到的大鲵提取物。
9.根据权利要求8所述的大鲵提取物，其特征在于：所述大鲵提取物的平均分子量为847.13-911.39；或者，
所述大鲵提取物中含有谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的至少一种。
10.以权利要求8或9所述大鲵提取物为活性成分的产品。
11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于：所述产品为具有清除超氧阴离子自由基和/或羟自由基的能力的产品。
12.权利要求8或9所述大鲵提取物或权利要求10或11所述产品在清除超氧阴离子自由基和/或羟自由基中的应用；
所述清除为非治疗目的的清除。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310618317.7A CN103695516B (zh) | 2013-11-28 | 2013-11-28 | 大鲵提取物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310618317.7A CN103695516B (zh) | 2013-11-28 | 2013-11-28 | 大鲵提取物及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103695516A CN103695516A (zh) | 2014-04-02 |
| CN103695516B true CN103695516B (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=50357179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310618317.7A Active CN103695516B (zh) | 2013-11-28 | 2013-11-28 | 大鲵提取物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103695516B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232715A (zh) * | 2014-08-20 | 2014-12-24 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种蛋白低聚肽的制备方法 |
| CN104206641B (zh) * | 2014-08-25 | 2017-08-29 | 张家界金鲵生物工程股份有限公司 | 一种大鲵蛋白多肽粉及其制备方法 |
| CN109385457B (zh) * | 2018-11-07 | 2022-02-11 | 四川大学 | 一种具有抗氧化活性的大鲵美拉德肽的制备方法 |
| CN110628554A (zh) * | 2019-11-04 | 2019-12-31 | 茅台学院 | 一种抗氧化大鲵肽酱香酒及其制备方法 |
| CN114073754A (zh) * | 2020-08-18 | 2022-02-22 | 清华大学 | 大鲵骨粉提取物、制备方法及其应用 |
| CN112063481A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-11 | 茅台学院 | 一种富含氨基酸的大鲵酒制备方法 |
| CN113115853A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-07-16 | 张家界民康生物科技有限公司 | 人工养殖子二代大鲵肽冻干粉制备方法及其产品 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103361393A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-23 | 四川龙王洞生态农业开发有限公司 | 一种大鲵低聚肽的制备方法 |
-
2013
- 2013-11-28 CN CN201310618317.7A patent/CN103695516B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103361393A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-23 | 四川龙王洞生态农业开发有限公司 | 一种大鲵低聚肽的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 大鲵肉酶解产物的制备及其抗氧化性的研究;王文莉等;《河北渔业》;20120920(第9期);第4页左栏结论部分 * |
| 大鲵黏液低聚糖肽的制备、性质和生物活性及应用研究;曲敏;《中国博士学位论文全文数据库》;20121215;摘要第II页第3段 * |
| 酶法水解大鲵蛋白的工艺研究;马小燕等;《中国酿造》;20091115(第11期);第92页摘要部分和第93页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103695516A (zh) | 2014-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103695516B (zh) | 大鲵提取物及其制备方法 | |
| US10869948B2 (en) | Composition of collagen peptide and elastin peptide, method of producing the same and use thereof | |
| Ding et al. | Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation | |
| Yi et al. | Structural features and immunomodulatory activities of polysaccharides of longan pulp | |
| CN107822948B (zh) | 具有晒后修护、抗氧化、美白功效的组合物及其制备方法 | |
| CN108125892A (zh) | 一种海洋生物保湿抗衰老化妆品组合物 | |
| Zhang et al. | Purification and identification of antioxidant peptides from millet gliadin treated with high hydrostatic pressure | |
| CN103275181B (zh) | 一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途 | |
| CN106666484B (zh) | 鲟鱼复合粉、鲟鱼骨酒及应用 | |
| Yuan et al. | Anti-inflammatory and antioxidant activity of peptides from ethanol-soluble hydrolysates of sturgeon (Acipenser schrenckii) cartilage | |
| CN110613644A (zh) | 含大麻二酚纳米乳的护肤乳液及其制备方法 | |
| CN105254716B (zh) | 一种韭菜籽抗氧化六肽及其制备方法与应用 | |
| Zeng et al. | Anti-oxidant, hemolysis inhibition, and collagen-stimulating activities of a new hexapeptide derived from Arthrospira (Spirulina) platensis | |
| CN102660615B (zh) | 一种抗氧化肽及其制备方法 | |
| WO2018105919A2 (ko) | 마린 콜라겐을 함유한 석류음료 및 이의 제조방법 | |
| CN110577976A (zh) | 一种绿豆低聚肽粉及其制备方法 | |
| CN101962402B (zh) | 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN107812016B (zh) | 一种美洲大蠊提取物、制备方法及其在免疫调节中的应用 | |
| CN101530455A (zh) | 一种从淡豆豉中提取抗氧化活性物质的方法 | |
| CN107960526A (zh) | 胶原蛋白粉及其生产工艺 | |
| CN102417509B (zh) | 海星中提取的三种化合物在促进骨折愈合方面用途和制备方法 | |
| CN103864891A (zh) | 一种韭菜籽抗氧化三肽及其制备与应用 | |
| CN109232714A (zh) | 一类用于促胶原分泌的超短肽及其应用 | |
| CN103735654A (zh) | 一种具有双向免疫调节作用的中药提取物和用途 | |
| Xin et al. | Antipyretic and anti-inflammatory activities of Thais luteostoma extracts and underlying mechanisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |