CN103361393A - 一种大鲵低聚肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大鲵低聚肽的制备方法，以人工繁养的大鲵为基础原料，用动物水解蛋白酶和中性蛋白酶酶解大鲵蛋白而获得大鲵低聚肽的方法，包括预处理、酶解、纯化、酶灭活、脱苦、脱色、无菌处理、浓缩及冷冻干燥等步骤。本发明所述方法水解条件温和，可定位水解产生特定多肽，水解过程易于控制，所得产物具有易消化、易吸收，且安全性高，生产过程营养元素损失少，对环境友好等优点。可用于医药原料、药品、功能食品等。同时，此项发明工艺先进、安全、绿色环保、用途广、成本低、付加值高、适宜于工业化生产。

Description

一种大鲵低聚肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种大鲵低聚肽的制备方法，属生物活性肽领域。 

背景技术

大鲵俗称娃娃鱼，属两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是现存两栖动物中较为原始的种类。它是我国历史悠久，有长达3.5亿年的进化史，可与大熊猫相媲美的活化石，是我国传统的药用动物，早在李时珍的医药宝典《本草纲目》中记载，民间流传的药用偏方也甚多，经现代营养成份分析研究结果表明：其营养丰富，含有18种氨基酸，成分组成全面，是人体营养需求的优质蛋臼源，是“四海求之”的珍品。大鲵是一种神奇而古老的珍贵动物，长久的历史实践证明，它具有对人体许多特异的生理功能，如益智、抗衰老、提高免疫力、抗病等功能。目前，我国大鲵的人工养殖随着其苗种繁育技术的突破与推广，获得了长足的发展，其资源量得到了快速的增长，这就为珍贵资源的开发利用奠定了物质基础。近年来，人工繁养的娃娃鱼经过政府许可则可作为营养品上餐桌。

21世纪是生物多肽的世纪。目前国内出规了大鲵蛋白质粉制备的工艺和少数大鲵蛋白酶解多肽制备方法，但多为分子量偏大，其生理功能不明的产品。本发明利用较先进的可控酶解与分离方法，获得低聚肽，其分子量在1000道尔顿以下，为医药原料、新药开发及功能食品开发提供了广阔的应用前景。

随着人工繁养的成功，大鲵在学术上研究的重要意义进一步得到升华，人们对大鲵的食用价值和功效不断的认识不断深入。然而遗憾的是，称得上大鲵的深加工产品寥寥无几。有的市面上所谓大鲵多肽的产品其成分也就是大鲵蛋白质而已。由于活性肽较生物体的其他物质（含蛋白质和氨基酸），有着更多更强的活性和多样性，有专家称“21世纪将是肽的世纪”。多肽可以通过合成和提取得到，但前者的安全性备受质疑，后者存在生产成本及效率与溶剂残留方面的不足，人们对通过环境友好、绿色安全的生物技术制备多肽情有独钟。因此，近年来，国内对各种各样的多肽生物技术制备方法研究在逐步深入与发展，其中也有关于大鲵蛋白酶水解的研究，为数不多的大鲵多肽的研究其制备限于酶解条件优化，其功能限于缓解体力疲劳等方法；中国专利公开“CN102676622A”公开了“大鲵纳米肽及大鲵酒”的专利申请，从中可以看到，其方法仅仅是通过得到纳米大鲵粉经过简单的酶解得到大鲵“纳米肽”和较多的游离氨基酸，其所得产物值得商榷，其功能也不很明确。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种以人工繁养的中国大鲵为原料经可控酶解得到一种大鲵低聚肽的方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种大鲵低聚肽的制备方法，包括如下步骤

A） 预处理 

将新鲜大鲵肉经冷冻干燥处理后，将其粉碎至60目以下得大鲵肉粉；采用食用油浸提剂浸提去除脂肪，挥干溶剂，得到脱脂大鲵粉；

B）酶解

在1:1-10料水比情况下，加入复合酶，对脱脂大鲵粉进行酶解； 

C）纯化、酶灭活

将上述酶解液调节pH值调，通过离心、过滤而得到纯净的酸性水解物溶液；采用透析膜进行过滤，将过滤液进行酶灭活处理，即得大鲵低聚肽纯化液；

D） 脱苦、脱色

    向大鲵低聚肽纯化液中投入食用级活性炭，将调节pH值，进行脱苦、脱色，得到色泽透明澄清的肽液；

E） 无菌处理

    经脱苦、脱色处理好的澄清透明低聚肽液进行巴氏杀菌处理；

F）浓缩及冷冻干燥 

将低聚肽液浓缩，干燥得到成品大鲵低聚肽粉。

在本发明中，步骤A的预处理目的在于增加蛋白水解酶的作用点，加快蛋白质的酶解，而采用冻干处理和粉碎可以使其本身所含大鲵蛋白及多肽、氨基酸损失最小，采用的食用油浸提剂为正己烷。

进一步的，在本发明中，步骤B所述的复合酶为动物水解蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1-2，优选3：1.4进行混合形成；所述复合酶优选采用热水预处理，热水用量为复合酶粉质量的10-50倍，温度为30-45℃，预处理时间为10-15分钟；加入的复合酶10万活力单位，加入量为原料的0.1-0.5%；所述酶解条件为pH=7.5、40-55℃条件下酶解2-6小时。

进一步的，在本发明中，步骤C所述pH值调为4.0-4.5，使未水解的蛋白质达到等电点而沉淀；所述透析膜为截留1000道尔顿分子量的可再生纤维素透析膜；酶灭活处理条件为100℃下恒温15min。

进一步的，在本发明中，步骤D所述食用级活性炭的投入量为大鲵低聚肽纯化液质量的8-12%；脱苦、脱色的条件为pH调至3.0-3.5，温度控制在40-45度，作用0.5-2h。

进一步的，在本发明中，步骤E所述巴氏杀菌的温度控制在62-65℃。

此外，在本发明中，步骤F所述浓缩为真空旋转蒸发仪上进行薄膜浓缩，干燥为真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥。

本发明的有益效果在于：采用方法所提取出的分子量在1000道尔顿以下的大鲵低聚肽粉，较合成多肽粉与其它提取多肽粉而言，水解条件温和，可定位水解产生特定多肽，水解过程易于控制，所得产物具有易消化、易吸收，且安全性高，生产过程营养元素损失少，对环境友好等优点。可用于医药原料、药品、功能食品等。同时，此项发明工艺先进、安全、绿色环保、用途广、成本低、付加值高、适宜于工业化生产。

附图说明

图1为本发明的所述方法的工艺流程图。

具体实施方式

实施例一

1 预处理 

将人工繁养鲜活大鲵宰杀后，取新鲜大鲵肉经冷冻干燥处理后，在0℃下将其粉碎至60目，得大鲵肉粉，将其投入其质量3倍的食用油浸提剂正己烷浸提去除脂肪，挥干溶剂，得到脱脂大鲵粉。

2 酶解

  将动物水解蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1进行混合形成复合酶，在1:3料水比情况下，加入10万活力单位复合酶，加入量为原料的0.2%；复合酶粉采用热水预处理，热水用量为复合酶粉质量的20倍，温度为35℃，预处理时间为10分钟；预处理后搅匀过滤，加入到酶解体系，酶解条件为pH=7.5、40℃条件下酶解2小时。

3 纯化、酶灭活

将上述酶解液pH值调为4.0，使未水解的蛋白质达到等电点而沉淀，通过离心、过滤而得到纯净的酸性水解物溶液。采用截留1000道尔顿分子量的可再生纤维素透析膜进行过滤，将过滤液在80℃下恒温15min进行酶灭活处理，即得大鲵低聚肽纯化液。

4 脱苦、脱色

    向大鲵低聚肽纯化液中投入其质量的8%的食用级活性炭，将pH调至3.0，温度控制在40度，作用0.5h，利用活性炭的吸附进行脱苦、脱色，得到色泽透明澄清的肽液。

5 无菌处理

    经脱苦、脱色处理好的澄清透明低聚肽液在62-65℃下进行巴氏杀菌处理，以最大限度减少其营养元素的损失。

6 浓缩及冷冻干燥 

将低聚肽液置于真空旋转蒸发仪上进行薄膜浓缩，然后迅速取出，于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥得到成品大鲵低聚肽粉。

实施例二

1 预处理 

将人工繁养鲜活大鲵宰杀后，取新鲜大鲵肉经冷冻干燥处理后，在-2℃下将其粉碎至80目，得大鲵肉粉，将其投入其质量2.5倍的食用油浸提剂正己烷浸提去除脂肪，挥干溶剂，得到脱脂大鲵粉。

2 酶解

  将动物水解蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1.2进行混合形成复合酶，在1:3.5料水比情况下，加入10万活力单位复合酶，加入量为原料的0.4%；复合酶粉采用热水预处理，热水用量为复合酶粉质量的30倍，温度为40℃，预处理时间为12分钟；预处理后搅匀过滤，加入到酶解体系，酶解条件为pH=7.5、40℃条件下酶解2.5小时。

3 纯化、酶灭活

将上述酶解液pH值调为4.5，使未水解的蛋白质达到等电点而沉淀，通过离心、过滤而得到纯净的酸性水解物溶液。采用截留1000道尔顿分子量的可再生纤维素透析膜进行过滤，将过滤液在90℃下恒温15min进行酶灭活处理，即得大鲵低聚肽纯化液。

4 脱苦、脱色

    向大鲵低聚肽纯化液中投入其质量的10%的食用级活性炭，将pH调至3.2，温度控制在40度，作用1.0h，利用活性炭的吸附进行脱苦、脱色，得到色泽透明澄清的肽液。

5 无菌处理

    经脱苦、脱色处理好的澄清透明低聚肽液在62-65℃下进行巴氏杀菌处理，以最大限度减少其营养元素的损失。

6 浓缩及冷冻干燥 

将低聚肽液置于真空旋转蒸发仪上进行薄膜浓缩，然后迅速取出，于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥得到成品大鲵低聚肽粉。

实施例三

1 预处理 

将人工繁养鲜活大鲵宰杀后，取新鲜大鲵肉经冷冻干燥处理后，在-4℃下将其粉碎至80目，得大鲵肉粉，将其投入其质量2倍的食用油浸提剂正己烷浸提去除脂肪，挥干溶剂，得到脱脂大鲵粉。

2 酶解

  将动物水解蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1.4进行混合形成复合酶，在1:3料水比情况下，加入10万活力单位复合酶，加入量为原料的0.5%；复合酶粉采用热水预处理，热水用量为复合酶粉质量的25倍，温度为45℃，预处理时间为15分钟；预处理后搅匀过滤，加入到酶解体系，酶解条件为pH=7.5、50℃条件下酶解2小时。

3 纯化、酶灭活

将上述酶解液pH值调为4.5，使未水解的蛋白质达到等电点而沉淀，通过离心、过滤而得到纯净的酸性水解物溶液。采用截留1000道尔顿分子量的可再生纤维素透析膜进行过滤，将过滤液在100℃下恒温15min进行酶灭活处理，即得大鲵低聚肽纯化液。

4 脱苦、脱色

    向大鲵低聚肽纯化液中投入其质量的9%的食用级活性炭，将pH调至3.5，温度控制在45度，作用0.5h，利用活性炭的吸附进行脱苦、脱色，得到色泽透明澄清的肽液。

5 无菌处理

    经脱苦、脱色处理好的澄清透明低聚肽液在62-65℃下进行巴氏杀菌处理，以最大限度减少其营养元素的损失。

6 浓缩及冷冻干燥 

将低聚肽液置于真空旋转蒸发仪上进行薄膜浓缩，然后迅速取出，于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥得到成品大鲵低聚肽粉。

 

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (10)

1.一种大鲵低聚肽的制备方法，包括如下步骤：

A） 预处理 

将新鲜大鲵肉经冷冻干燥处理后，将其粉碎至60目以下得大鲵肉粉；采用食用油浸提剂浸提去除脂肪，挥干溶剂，得到脱脂大鲵粉；

B）酶解

在1:1-10料水比情况下，加入复合酶，对脱脂大鲵粉进行酶解； 

C）纯化、酶灭活

将上述酶解液调节pH值调，通过离心、过滤而得到纯净的酸性水解物溶液；采用透析膜进行过滤，将过滤液进行酶灭活处理，即得大鲵低聚肽纯化液；

D） 脱苦、脱色

    向大鲵低聚肽纯化液中投入食用级活性炭，将调节pH值，进行脱苦、脱色，得到色泽透明澄清的肽液；

E） 无菌处理

    经脱苦、脱色处理好的澄清透明低聚肽液进行巴氏杀菌处理；

F）浓缩及冷冻干燥 

将低聚肽液浓缩，干燥得到成品大鲵低聚肽粉。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤A采用的食用油浸提剂为正己烷。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤B所述的复合酶为动物水解蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1-2，优选3：1.4进行混合形成。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述复合酶优选采用热水预处理，热水用量为复合酶粉质量的10-50倍，温度为30-45℃，预处理时间为10-15分钟。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中加入的复合酶10万活力单位，加入量为原料的0.1-0.5%；所述酶解条件为pH=7.5、40-55℃条件下酶解2-6小时。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中步骤C所述pH值调为4.0-4.5；所述透析膜为截留1000道尔顿分子量的可再生纤维素透析膜；酶灭活处理条件为100℃下恒温15min。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤D所述食用级活性炭的投入量为大鲵低聚肽纯化液质量的8-12%；脱苦、脱色的条件为pH调至3.0-3.5，温度控制在40-45度，作用0.5-2h。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤E所述巴氏杀菌的温度控制在62-65℃。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中步骤F所述浓缩为真空旋转蒸发仪上进行薄膜浓缩，干燥为真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备的大鲵低聚肽。

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