CN105385740A - －种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法。一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，包括以下步骤：清洗、干燥、粉碎、加稀碱液、微波处理1、粗过滤、酶解1、微波处理2、酶解2、微波处理3、灭酶活、脱色、微滤、超滤、浓缩和喷雾干燥。本发明提取的桑叶蛋白多肽的方法具有收率高、纯度高、溶剂消耗少、成本低和易于工业化生产的优点。本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法。
背景技术
桑树为桑科多年生落叶小乔木植物，原产于中国和朝鲜，全球约有16种，我国约有11种，分布在全国大部分地区，以长江流域尤其江浙一带为多。隨着东桑西移，广西种桑连续十年居全国第一。据统计，2014年，广西蚕桑产业再创历史新高，实现“六个第一”。一是桑园面积285万亩，约占全国的四分之一，连续9年位居全国首位，其中广西自主选育的“桂桑优”和“桑特优”系列杂交桑品种占广西桑园面积的75％以上；二是蚕种饲养量705万张，约占全国的45％，连续10年位居全国首位，其中广西自主选育的“两广二号”、“桂蚕2号”等蚕品种占广西饲养总量的95％以上；三是蚕茧产量34万吨，约占全国的二分之一，连续10年位居全国首位；四是桑蚕丝产量4.06万吨，约占全国的四分之一，连续5年位居全国首位；五是蚕农售茧收入125.66亿元，连续4年超百亿元；六是亩桑产茧量达120公斤，为全国平均水平的2倍以上。种桑养蚕巳成为广西农村一项支柱产业。
桑树的叶子不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素以及Ca、Fe、Mn、Zn等矿物质，而且富含人体所必需的各种生理活性物质，具有降血糖、降血脂、降血压、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等作用，从而引起世界各国科学家广泛关注，并对桑树的叶子的有效成分开展深入研究，发现桑树的叶子的有效成分在以下诸多方面具有神奇的作用。
桑叶的营养成分分析结果表明：每100g桑叶干物质中约含有可溶性碳水化合物25g、植物蛋白15-34g、纤维素14.4g、果胶12g、有机酸3.5g、阿拉伯聚糖7.4g、戊聚糖3.8g、粗脂肪6.15-9.8g。同时还含有黄酮类、多糖类、生物碱、挥发油、植物甾醇、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid)等生理活性物质。桑叶的营养价值、药用价值、保健品价值极高。
桑叶中蛋白质和氨基酸含量丰富，其蛋白质的氨基酸组成大体与脱脂大豆粉一致，氨基酸模式与人体相近，有利于机体吸收。其中谷氨酸含量丰富，高达23.23mg/g，它在维护脑组织功能、糖代谢及蛋白质答谢中有着重要地位，而且是生成γ-氨基丁酸的前体物质。同时，开发桑叶蛋白可以缓解当今世界蛋白质资源严重短缺的矛盾，对于增进人体健康有着十分重要的意义。
由桑叶中蛋白质酶解获得的活性肽，是目前功能性植物叶蛋白多肽研究最活跃的领域之一。充分利用桑叶丰富蛋白质资源，利用现代生物酶解技术可以将桑叶中蛋白质转化为小分子的蛋白质片段和具有生物活性的小肽。小分子桑叶蛋白肽不仅有很好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快，蛋白质利用率高，具有低抗原性，不会产生过敏反应。微波辅助生物酶解技术反应条件温和、易操作、能耗低、酶解时间短(传统方法1/5)，不用溶剂,产品安全、品质好,对改善了蛋白质的适口性，提高了消化率有积极作用。
因此，将桑叶中蛋白质酶解成具有生物活性的肽类物质，为优质饲料、食品、医药、保健品行业提供丰富肽类物质，造福人类。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜桑叶，经清洗，干燥后，粉碎至100目，得到桑叶粉；
(2)取桑叶粉按固液比1:15加入稀碱液，并添加稳定剂，调pH值为8.5，至微波提取装置加热至55℃，在此温度下保持1h，200目尼龙布粗过滤得到桑叶提取粗滤液；
(3)酶解1：将上述的桑叶提取粗滤液降至室温，调其pH值为8.5，按底物质量的3％加入胰蛋白酶，充分搅拌，启动微波提取装置加热20min，温度控制在55℃，得到第一次酶解液；
(4)酶解2：待第一次酶解液降至常温，再调整其pH值至7.6，按底物质量2％加入多肽复合酶，充分搅拌，再次启动微波提取装置加热10min，温度控制在55℃，当pH值降至7.2时，酶解完成；
(5)待酶解完成后，再次启动微波提取装置加温至90℃，维持10min，灭酶活即完成；
(6)在灭酶活的桑叶蛋白酶解液中按底物3％加入活性炭，搅拌均匀，在70℃保持1h，然后使用三足离心机滤去沉渣，滤液再经过陶瓷微滤膜过滤、超滤纤维膜过滤与浓缩，合并浓缩液得到桑叶蛋白多肽浓缩液；
(7)将所得蛋白多肽浓缩液，经真空喷雾干燥，即得到桑叶蛋白多肽。
作为优选，步骤(2)中所述的稀碱液为NaOH溶液，其加入量可使料液的pH值调至8.5-9.0弱碱性；所述的稳定剂为亚硫酸氢钠，其加入量为桑叶粉质量的0.1-0.2％。
作为优选，步骤(3)和步骤(4)中的酶解温度为55℃。
作为优选，步骤(3)中所述的酶解需控制pH值≥7.5。
作为优选，步骤(4)中所述的多肽复合酶为碱性酶、中性酶或风味酶。
作为优选，步骤(2)、(3)、(4)和(5)中所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW。
作为优选，步骤(6)中所述的三足离心机的过滤布为200目。
作为优选，步骤(6)中所述的微滤陶瓷膜为能截留15000-20000分子量的陶瓷膜；所述的超滤纤维膜分别为能截留2000-10000分子量的纤维膜。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的方法改进桑叶蛋白质的酶解工艺与技术，解决桑叶蛋白质不易被动物消化吸收问题，通过釆用微波辅助酶解技术制备具有生物活性的寡肽，不仅提高桑叶蛋白的消化吸收率，而且扩大桑叶蛋白应用领域，使桑叶从单纯养蚕拓展到畜禽饲料、饲料添加剂到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长桑蚕产业链，全面提高桑蚕产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动－带一路建设有重大意义。
2.本发明微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法具有收率高、纯度高、溶剂消耗少、成本低和易于工业化生产的优点。
3.本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
附图说明
图1为本发明微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜桑叶，经清洗，干燥后，粉碎至100目，得到桑叶粉；
(2)取桑叶粉按固液比1:15加入稀碱液，并添加稳定剂，调pH值为8.5，至微波提取装置加热至55℃，在此温度下保持1h，200目尼龙布粗过滤得到桑叶提取粗滤液；所述的稀碱液为NaOH溶液，其加入量可使料液的pH值调至8.5弱碱性；所述的稳定剂为亚硫酸氢钠，其加入量为桑叶粉质量的0.1％；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(3)酶解1：将上述的桑叶提取粗滤液降至室温，调其pH值为8.5，按底物质量的3％加入胰蛋白酶，充分搅拌，启动微波提取装置加热20min，温度控制在55℃，得到第一次酶解液；酶解温度为55℃；酶解需控制pH值7.5；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(4)酶解2：待第一次酶解液降至常温，再调整其pH值至7.6，按底物质量2％加入多肽复合酶，充分搅拌，再次启动微波提取装置加热10min，温度控制在55℃，当pH值降至7.2时，酶解完成；酶解温度为55℃；所述的多肽复合酶为碱性酶；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(5)待酶解完成后，再次启动微波提取装置加温至90℃，维持10min，灭酶活即完成；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(6)在灭酶活的桑叶蛋白酶解液中按底物3％加入活性炭，搅拌均匀，在70℃保持1h，然后使用三足离心机滤去沉渣，滤液再经过陶瓷微滤膜过滤、超滤纤维膜过滤与浓缩，合并浓缩液得到桑叶蛋白多肽浓缩液；所述的三足离心机的过滤布为200目；所述的微滤陶瓷膜为能截留15000-20000分子量的陶瓷膜；所述的超滤纤维膜分别为能截留2000-10000分子量的纤维膜；
(7)将所得蛋白多肽浓缩液，经真空喷雾干燥，即得到桑叶蛋白多肽。
实施例2：
一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜桑叶，经清洗，干燥后，粉碎至100目，得到桑叶粉；
(2)取桑叶粉按固液比1:15加入稀碱液，并添加稳定剂，调pH值为8.5，至微波提取装置加热至55℃，在此温度下保持1h，200目尼龙布粗过滤得到桑叶提取粗滤液；所述的稀碱液为NaOH溶液，其加入量可使料液的pH值调至9.0弱碱性；所述的稳定剂为亚硫酸氢钠，其加入量为桑叶粉质量的0.2％；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(3)酶解1：将上述的桑叶提取粗滤液降至室温，调其pH值为8.5，按底物质量的3％加入胰蛋白酶，充分搅拌，启动微波提取装置加热20min，温度控制在55℃，得到第一次酶解液；酶解温度为55℃；酶解需控制pH值9.5；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(4)酶解2：待第一次酶解液降至常温，再调整其pH值至7.6，按底物质量2％加入多肽复合酶，充分搅拌，再次启动微波提取装置加热10min，温度控制在55℃，当pH值降至7.2时，酶解完成；酶解温度为55℃；所述的多肽复合酶为中性酶；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(5)待酶解完成后，再次启动微波提取装置加温至90℃，维持10min，灭酶活即完成；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(6)在灭酶活的桑叶蛋白酶解液中按底物3％加入活性炭，搅拌均匀，在70℃保持1h，然后使用三足离心机滤去沉渣，滤液再经过陶瓷微滤膜过滤、超滤纤维膜过滤与浓缩，合并浓缩液得到桑叶蛋白多肽浓缩液；所述的三足离心机的过滤布为200目；所述的微滤陶瓷膜为能截留15000-20000分子量的陶瓷膜；所述的超滤纤维膜分别为能截留2000-10000分子量的纤维膜；
(7)将所得蛋白多肽浓缩液，经真空喷雾干燥，即得到桑叶蛋白多肽。
实施例3：
一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜桑叶，经清洗，干燥后，粉碎至100目，得到桑叶粉；
(2)取桑叶粉按固液比1:15加入稀碱液，并添加稳定剂，调pH值为8.5，至微波提取装置加热至55℃，在此温度下保持1h，200目尼龙布粗过滤得到桑叶提取粗滤液；所述的稀碱液为NaOH溶液，其加入量可使料液的pH值调至8.8弱碱性；所述的稳定剂为亚硫酸氢钠，其加入量为桑叶粉质量的0.15％；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(3)酶解1：将上述的桑叶提取粗滤液降至室温，调其pH值为8.5，按底物质量的3％加入胰蛋白酶，充分搅拌，启动微波提取装置加热20min，温度控制在55℃，得到第一次酶解液；酶解温度为55℃；酶解需控制pH值8.0；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(4)酶解2：待第一次酶解液降至常温，再调整其pH值至7.6，按底物质量2％加入多肽复合酶，充分搅拌，再次启动微波提取装置加热10min，温度控制在55℃，当pH值降至7.2时，酶解完成；酶解温度为55℃；所述的多肽复合酶为风味酶；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(5)待酶解完成后，再次启动微波提取装置加温至90℃，维持10min，灭酶活即完成；所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW；
(6)在灭酶活的桑叶蛋白酶解液中按底物3％加入活性炭，搅拌均匀，在70℃保持1h，然后使用三足离心机滤去沉渣，滤液再经过陶瓷微滤膜过滤、超滤纤维膜过滤与浓缩，合并浓缩液得到桑叶蛋白多肽浓缩液；所述的三足离心机的过滤布为200目；所述的微滤陶瓷膜为能截留15000-20000分子量的陶瓷膜；所述的超滤纤维膜分别为能截留2000-10000分子量的纤维膜；
(7)将所得蛋白多肽浓缩液，经真空喷雾干燥，即得到桑叶蛋白多肽。
实施例4：传统叶蛋白的提取方法
桑叶蛋白提取的最佳工艺条件为：在温度60℃下，以质量分数0.7％的NaOH溶液为浸提剂，浸提时问20min，料液比为1：4，于pH2-3酸沉絮凝，沉淀干燥即得桑叶蛋白，叶蛋白提取率为4.42/100g。
以碱性蛋白酶制备桑叶蛋白水解肽的工艺：桑叶蛋白底物浓度为5％(w/v)，40℃水浴溶解30min，以碱性蛋白酶为桑叶蛋白水解用酶，添加量为8000U/g，于55℃、pH8.0-9.0条件下水解4h，调节pH至3.0以下，离心，取上清液，脱盐，干燥，得桑叶蛋白水解肽。
表1本发明提取方法的有益效果
从表1可知，传统方法不可避免使用较大量酸碱及溶剂，而且工序复杂，耗时长，提取率低，杂质多等弱点和不足；而本发明釆用微波辅助与膜过滤技术，不需溶剂，酸碱用量少，酶解时间短，转化率高，且为下一步制备多肽创造更好条件。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (8)
1.一种微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取新鲜桑叶，经清洗，干燥后，粉碎至100目，得到桑叶粉；
(2)取桑叶粉按固液比1:15加入稀碱液，并添加稳定剂，调pH值为8.5，至微波提取装置加热至55℃，在此温度下保持1h，200目尼龙布粗过滤得到桑叶提取粗滤液；
(3)酶解1：将上述的桑叶提取粗滤液降至室温，调其pH值为8.5，按底物质量的3％加入胰蛋白酶，充分搅拌，启动微波提取装置加热20min，温度控制在55℃，得到第一次酶解液；
(4)酶解2：待第一次酶解液降至常温，再调整其pH值至7.6，按底物质量2％加入多肽复合酶，充分搅拌，再次启动微波提取装置加热10min，温度控制在55℃，当pH值降至7.2时，酶解完成；
(5)待酶解完成后，再次启动微波提取装置加温至90℃，维持10min，灭酶活即完成；
(6)在灭酶活的桑叶蛋白酶解液中按底物3％加入活性炭，搅拌均匀，在70℃保持1h，然后使用三足离心机滤去沉渣，滤液再经过陶瓷微滤膜过滤、超滤纤维膜过滤与浓缩，合并浓缩液得到桑叶蛋白多肽浓缩液；
(7)将所得蛋白多肽浓缩液，经真空喷雾干燥，即得到桑叶蛋白多肽。
2.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的稀碱液为NaOH溶液，其加入量可使料液的pH值调至8.5-9.0弱碱性；所述的稳定剂为亚硫酸氢钠，其加入量为桑叶粉质量的0.1-0.2％。
3.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中的酶解温度为55℃。
4.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酶解需控制pH值≥7.5。
5.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的多肽复合酶为碱性酶、中性酶或风味酶。
6.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)和(5)中所述的微波提取装置的频率为2450MHZ，功率为20KW。
7.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的三足离心机的过滤布为200目。
8.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备桑叶蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中所述的微滤陶瓷膜为能截留15000-20000分子量的陶瓷膜；所述的超滤纤维膜分别为能截留2000-10000分子量的纤维膜。
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