CN104745665A - 具有促进骨骼生长作用的胶原肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有促进骨骼生长作用的胶原肽及其制备方法和应用，该胶原肽是将鱼皮胶原基质经除杂、胶原降解、澄清、浓缩、干燥而得。本发明方法通过酶条件的筛选、控制，以及活性的验证，确定了一种通过促进成骨细胞增殖和分化从而促进骨骼生长的胶原肽。采用该方法加工得到的胶原肽，产品色泽均匀、粉末细腻，溶解性好，无腥味和异味，具有较好的促进成骨细胞增殖和分化的活性，在食品加工领域及营养滋补保健食品方面具有良好的应用前景。

Description

具有促进骨骼生长作用的胶原肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白质生物利用加工技术领域，更具体地说是涉及一种具有促进骨骼生长作用的胶原肽及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是人类重要的营养素，通过人体消化道被蛋白酶水解为肽或氨基酸，从而被人体吸收合成新蛋白。近代的研究表明，小肽往往比氨基酸具有更好的消化吸收特性，除具有吸收利用率高（接近100%）、促进氨基酸吸收和蛋白质合成、提高免疫力、促进矿物质吸收的特点外，通常还具有一定的生理活性，对人体十分有益。

近来，随着生物技术和酶制剂工业的不断发展，酶法水解蛋白质以达到对蛋白质进行改性的应用越来越普遍。利用酶水解法已可制备出多种具有生理活性的多肽和氨基酸，这些活性肽包括抗氧化性肽、降血压肽、抑菌肽、降胆固醇肽、吗啡肽、免疫调节肽等；这些肽可以被人体充分吸收，补充人体所需的营养，调节机体功能，促进身体健康；而且因为这些肽具有优良的持水性、溶解性、渗透性及抗氧化性等特性，已被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。

借助于胶原基质本身的氨基酸组成特征，并利用蛋白酶的酶切位点选择性可实现定位水解产生特定组成和功能的活性肽。在酶法水解蛋白质的过程中蛋白酶的选择是制备胶原肽的第一关键要素，目前在实际生产中应用较多的主要包括各种微生物来源、植物来源及动物来源的蛋白酶，其中包括碱性蛋白酶、风味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等；但由于不同蛋白酶的来源、作用位点及水解条件并不相同，而且，即使是用同一蛋白酶，在采用不同的水解工艺的情形下最终的改性效果及肽生物活性往往差异极大，因此，如何辨别、甄选得到合适的酶，并配合以适度的工艺参数，是对所使用的胶原基质原料实现所需的改性效果并进而制备获得具有特定生物活性的胶原肽的最大难点。

发明内容

肽的生物活性通常与其原料来源、分子量大小、氨基酸序列等有关。大分子的胶原蛋白经过酶的适度水解后可获得不同分子量大小的胶原肽。目前研究表明胶原蛋白水解产物——胶原肽具有抗氧化、降血压等活性。而来源于胶原蛋白的肽在氨基酸组成上具有甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸（或其他氨基酸）的重复单元特征，如获得3个氨基酸残基的胶原小肽，不仅其在体内的消化吸收率可显著提高，还可能具有机体功能相匹配的其它生物活性。

本发明通过酶条件的筛选和控制、以及活性的验证，目的在于确定一种通过促进成骨细胞增殖和分化从而具有促进骨骼生长作用的胶原肽及其制备方法和应用。

一、本发明的第一目的，是提供一种具有促进骨骼生长的胶原肽的制备方法的技术方案。

具体的技术方案为：将鱼皮胶原基质经包括除杂、胶原降解、澄清、浓缩、干燥在内的步骤，得到胶原肽产品；其中的除杂、澄清、浓缩及干燥工艺的具体参数，可由所属领域技术人员参照现有技术并结合物料特性自行选用。本发明人通过实验分析、研究发现：鱼皮胶原降解包括了胶原纤维的吸水水化、吸水胶原微纤维的热解离、原胶原的肽键水解断裂三个过程；其中，胶原吸水水化与溶液的离子种类、浓度、强度、时间有关；胶原微纤维的热解离与物料在热解离前的水化程度、溶液离子状态、热处理的温度、时间有关；而原胶原的肽键水解断裂与所使用的酶的种类、活力、酶作用条件相关；只有上述三者的工艺条件与工艺参数有机结合，才能获得所需的胶原肽的活性。通过系列实验及数据分析，本发明人最终确定本发明中所述胶原降解步骤的具体工艺要求如下：在鱼皮胶原基质中加入其重量4～5倍、质量浓度为1～5g/L的酸溶液，均匀浸泡20～120分钟；然后加热至55～60℃并保温搅拌10～60分钟；过滤除掉滤渣，在滤液中按6000～8000U/g胶原基质添加蛋白酶，并调整pH在6.5～7.5范围内、温度50～55℃下反应7～8h；然后升温至沸腾并保持1～2min，即得。

上述胶原降解步骤中对所用酸的具体种类并无严格限定，所属领域技术人员可结合生产实际参照常规酶法水解蛋白质工艺中酸胀步骤的用酸进行自主选择，例如采用（但不限于）盐酸、醋酸、乳酸、或磷酸等；所述蛋白酶，可以选用动物蛋白酶、风味酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等商品酶制剂，优选采用包含有动物蛋白酶和风味酶的复合酶，并且二者按质量比1:1复合使用。

以下，给出所述澄清步骤的其中一种优选实施工艺：将所述胶原降解步骤制得的酶解液趁热进行粗滤（例如用滤布），再按每升滤液0.5~5.0g的添加量往该滤液中加入活性炭，然后于40～50℃保温20～25min，最后经板框过滤获得清液。

本发明采用的胶原基质源于鱼类皮组织，其获取及制备方法均有成熟工艺可循，例如可以将鱼类皮组织原料经简单预处理（如清洗、粉碎等）后直接使用。如果采用其他来源的胶原基质材料，由于动物来源不同、组织部位及特性不同，处理条件和最佳参数会具有较大的差异性。采用水产动物鱼类的皮组织作为胶原基质原料制备胶原肽，除了资源易得且丰富、无哺乳动物疫病困扰、生物安全性高等特点，经本发明人的研究发现还具有胶原基质降解敏感度高、胶原肽的转化效率高、制备得到的胶原小肽具有明确活性等优点。本发明技术方案显然有助于大大提升鱼类加工下脚料鱼皮的附加值。

二、本发明的第二目的，是提供一种具有促进骨骼生长作用的胶原肽。

本发明具有促进骨骼生长作用的胶原肽即是采用上述的胶原肽制备方法制备而得的产品。所制得的产品色泽均匀、粉末细腻，溶解性好，无腥味和异味。

进一步的测试表明，采用上述的胶原肽制备方法制备而得的本发明胶原肽产品中分子量大于1000Da的胶原肽组分所占的质量百分比不超过5%，分子量小于1000Da的胶原肽组分所占的质量比超过95%，其中分子量在1000～500Da、500～180Da及180Da以下的胶原肽组分所占的质量百分比分别为12~16%、45~48%、33~35%；同时，胶原肽产品中甘氨酸占产品总氨基酸的摩尔比为30～33%。

经细胞实验证实，本发明胶原肽产品具有明确的促进成骨细胞增殖活性，且分子量小（80%的产品分子量小于500Da，氨基酸聚合度以3～5氨基酸残基为主），蛋白纯度高。

三、本发明的第三目的，是进一步公开采用上述方法制备得到的胶原肽作为食品辅料的应用以及在制备保健食品方面的应用。

以下以实验数据及实施例相结合的方式对本发明具有促进骨骼生长作用的胶原肽及其制备方法和应用作进一步地说明。由于这些实验数据及实施例是作为介绍本发明技术方案而例举的一些较佳实施方式，因此，不应把本发明的技术方案限定于这些实施例范围之内。

附图说明

图1是不同酶解时间胶原肽对成骨细胞增殖的影响实验数据对比图。

具体实施方式

以下实施例中的碱性蛋白酶、动物蛋白水解酶、风味酶、胰蛋白酶，均为市售，食品级。

一、实验实施例：本实施例通过以下细胞实验及结果分析来证实本发明胶原肽具有促进成骨细胞增殖和分化的活性：

1、胶原肽制备

制备方法：将罗非鱼皮经过清洗除杂后，加入其重量4～5倍、质量浓度为1～5g/L的酸溶液，均匀浸泡20～120分钟（具体时长视所用酸溶液的种类、浓度及物料量进行调整；所述酸溶液可为盐酸、醋酸、乳酸、或磷酸。）；然后加热至55～60℃并保温搅拌10～40分钟；过滤除掉滤渣，在滤液中按8000U/g胶原基质同时添加动物蛋白酶和风味酶进行酶解，两种酶的用量均为4000U/g胶原基质，并调整pH在6.5～7.5范围内、温度50～55℃，控制酶解时间分别为5 h、8 h和22 h；之后升温至沸腾并保持1～2min；然后，将3种酶解液分别用滤布粗滤，取上清液并按每升滤液添加0.5~5.0g的活性炭，在温度为40℃的条件下脱色处理20 min；经脱色的酶解液经硅藻土板框过滤获得清液，再经蒸发、浓缩使固形物含量达到10-20%，最后在进风温度为170-185℃，出风温度为70-85℃，进料温度为20-45℃，进料速度为10-20 r/min的条件下对酶解液进行喷雾干燥，最终制得酶解时间分别为5 h、8 h和22 h的胶原肽粉（分别记为实验组H5、H8、H22）。

同时，用1%（w/w）Ⅰ型胶原酶在37℃，pH7.5的条件下酶解罗非鱼皮5.5 h制得的胶原肽粉作为对照组Hc（除酶解工艺外，其他条件同实验组）。

2、大鼠成骨细胞的提取与培养

取出生7d内的乳鼠2只，脱臼处死，用75%酒精灭菌处理后，摘下头部装入含10%双抗的PBS溶液的离心管中。在超净台内取出头部，用无菌纱布和镊子小心剔除颅骨粘附的组织及骨膜，用PBS溶液反复冲洗颅骨至发白；将颅骨转移至安瓿瓶，加入1-2 mL胰酶，封口后将小瓶放入37℃、5%CO₂培养箱消化15 min；取出安瓿瓶弃去其中的溶液，将头骨剪碎至大约1mm×1mm×1mm，加入1-2mL的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，封口后放入37℃、5%CO2培养箱消化2-3h；消化液转移至离心管中，加入5mL含20%血清、1%双抗的DMEM（低糖）培养基中止消化，1000r/min离心5min，弃上清液；加入5mL含20%血清、1%双抗的DMEM（低糖）培养基吹打混匀制成细胞悬液，转移至底面积为12.5cm2的细胞培养瓶。

每2-3d换液一次，并在倒置显微镜下观察细胞生长状况，待细胞生长至铺满培养瓶底，用胰酶溶液消化传代，传代细胞用含10%血清和1%双抗的DMEM（低糖）培养液培养。取生长良好的第3-5代细胞用于实验及细胞功能鉴定。

3、样品的配制

准确称取10.0000g胶原肽（H5、H8、H22及Hc组）溶解于10mL容量瓶，配成1.0000 g/mL母液；取适量母液加入配备好的含10%血清和1%双抗的DMEM（低糖）培养液，经过无菌的0.22 um过滤器过滤除菌，稀释成0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL的胶原肽溶液。并设置空白对照组（该组只加入等量培养液）。

4、成骨细胞增殖活性的检测

（1）方法：取第3-5代成骨细胞以5000/孔接种于24孔板，于5% CO2、37℃培养箱中孵育24 h。待细胞贴壁后，分别加入分组设置的培养基，每组设置3个复孔，每隔2d更换一次培养基，并分别于培养后的第2、4、6 d各取1板，用MTT法对细胞增殖情况进行检测，成骨细胞增殖率表示为：

。

（2）检测结果与分析：

下表1及附图1分别是采用上述方法检测得到的不同酶解时间胶原肽对成骨细胞增殖的影响实验数据对比表及实验数据对比图。由于根据MTT法检测原理，活细胞中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能；二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的甲臜，利用酶联免疫检测仪在492 nm波长处测定其光吸收值，即可间接反映活细胞数量；在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数目成正比，因此，由附图1可知，随着培养时间的延长，细胞的数量逐渐增多，细胞增长速度比较快，且相对稳定，说明在实验期间细胞处于对数增长期。而由表1可以看出，胶原肽质量浓度对细胞增殖有较大的影响，H5、H8促进细胞增殖的作用受浓度影响很大，随着浓度加大，其对细胞增殖的促进作用显著增强；浓度为0.1 mg/mL时，H5和H8均对成骨细胞增殖无明显促进作用；浓度为1 mg/mL时，H8促进成骨细胞增殖作用非常显著，H8对成骨细胞的增殖率在第2d为148.66%，第4d达到136.29%，第6d达到140.35%，与阳性对照组的促进效果接近，而H5虽然也对成骨细胞增殖有一定的促进作用，但与H8和Hc相比还存在较大的差距；当浓度为10 mg/mL，H5和H8对成骨细胞增殖表现出极显著的促进作用，增殖率最高可达191.23%，促进效果甚至优于阳性对照组，第6d的增殖率与阳性对照组相比有显著差异。

上述实验表明，在胶原肽质量浓度为1 mg/mL时，H8、H22和阳性对照组对成骨细胞增殖的促进作用相对接近，考虑到生产中的能源及时间的消耗，H8是较佳选择。

表1 胶原肽对成骨细胞增殖率的影响(n=9，±s)

注: * 表示与对照组差异显著(p＜0.05) ，**表示与对照组差异极显著(p＜0.01)

5、成骨细胞分化活性的检测

原理：碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞的一种外酶，它的表达活性是成骨细胞分化的一个明显特征。

（1）方法：取第4代成骨细胞，细胞密度与分组同细胞增殖实验，每隔2d更换一次培养基，并分别于培养后的第2、4、6d各取1板，用移液器移取100uL培养基上清液于96孔板，放于-20℃冰箱保存，集中至第7d取出按照碱性磷酸酶检测试剂盒的说明对ALP活性进行检测，ALP活力表示为：

。

（2）检测结果及分析：

下表2是采用上述方法检测得到的不同酶解时间胶原肽对成骨细胞分化的影响实验数据对比表。由表2可见，与空白对照组相比，第2 d时各浓度都对成骨细胞分化活性有一定的促进作用，且浓度越大促进作用越明显。浓度大于1 mg/mL的H5和H22对细胞分化具有显著促进作用。第4 d时，各组对成骨细胞分化活性的调节作用不一，有些产生积极的促进作用，也有些产生了抑制作用，其中浓度为10 mg/mL的H22对成骨细胞分化活性具有显著促进作用，而Hc对细胞分化却产生了抑制作用，其中0.1 mg/mL和10 mg/mL的抑制作用显著。第6 d时，3种胶原肽及Hc在浓度为10 mg/mL时对成骨细胞分化活性具有促进作用，其中H8和Hc组具有显著促进作用，其他浓度各组对成骨细胞分化的促进作用不明显。

综合各组的实验结果可以推断出，H5、H8及H22对成骨细胞的分化具有一定的促进作用，但仅在浓度大于1 mg/mL才具有显著促进作用，浓度为0.1 mg/mL时，可能产生一定的抑制效果。三种胶原肽对成骨细胞分化促进效果无显著差异，可能是由于三者之间氨基酸组成较为接近。

表2 胶原肽对成骨细胞ALP活性的影响(n=3，±s)

注:*表示与对照组差异显著(p＜0.05)，**表示与对照组差异极显著(p＜0.01)

以上实验中，所使用的DMEM（低糖）培养液、血清、青链霉素混合液、PBS、胰酶、Ⅰ型胶原酶、碱性磷酸酶测定试剂盒、噻唑兰（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），均为市购取得。所使用的DMEM培养基通过在DMEM中加入血清及青链霉素混合液配制而得；MTT溶液的配制：称取0.0500g的MTT，用10mL的PBS将其完全溶解，使其浓度为5mg/mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存，2周内有效（在配制和保存的过程中，用铝箔纸包住离心管）；0.1%Ⅰ型胶原酶溶液的配制：称取0.1000g的Ⅰ型胶原酶溶于100ml的PBS中，经0.22μm 微孔滤膜过滤除菌后，分装冷藏。

6、胶原肽的相对分子质量分布及氨基酸组成检测

（1）采用高效液相色谱法对不同酶解时间胶原肽的相对分子质量分布进行检测

采用高效凝胶过滤色谱法进行测定：用流动相溶解样品，配制至上样浓度。吸取2 mL于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，用微孔过滤膜过滤后供进样。

测定条件：采用高效液相色谱仪Waters 600（配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件），用TSKgel 2000 SW_XL（300mm×7.8mm）色谱柱，在流动相为乙腈/水/三氟乙酸=45/55/0.1（V/V），柱温30℃的条件下，以0.5 mL/min的流速进样。检测波长为220 nm。

分子量校正曲线所用标准品：细胞色素C（MW12384）、杆菌酶（MW1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）

检测结果及分析：下表3是采用上述方法检测得到的不同酶解时间胶原肽相对分子质量分布数据表。由表3可以看出，随着酶解程度的加深，相对分子质量小的胶原肽组分所占比重增大。H5、H8和H22的平均相对分子质量分别为351.39 Da、324.67 Da、253.06 Da，其中相对分子质量小于1000 Da的比例分别为94.73%、95.56%、97.58%，都高于Ⅰ型胶原酶水解组Hc（89.28%）。H5、H8中相对分子质量介于180 Da与1000 Da组分所占比重最大，达到约47%，高于Ⅰ型胶原酶水解组的37.68%。当酶解时间延长至22h，水解程度进一步加剧，相对分子质量介于180 Da与1000 Da之间的小肽含量降低，相对分子质量小于180 Da的组分显著提高，说明此时大部分胶原降解为氨基酸或二肽。同活性实验相对照可以发现，随着胶原肽相对分子质量的降低，其对成骨细胞增殖分化的活性逐渐增强。

表3 不同酶解时间胶原肽相对分子质量分布

（2）采用氨基酸自动分析仪对17种常见氨基酸及羟脯氨酸和羟赖氨酸的含量进行测定

检测方法：精确称取胶原肽，加入6 mol/L盐酸110℃水解24 h后，蒸干盐酸，定容。水解液用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成检测。除常规17种氨基酸检测外，还增测羟脯氨酸和羟赖氨酸。

检测结果及分析：下表4是检测得到的不同酶解时间胶原肽的氨基酸组成数据表。由表4可以看出，总体而言4种酶解情况下得到的胶原肽的氨基酸组成比较接近，含有19种氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸。其中甘氨酸含量最高，达到约30%，并检测到胶原蛋白的特征氨基酸-羟脯氨酸和羟赖氨酸。此外，从表4还可以看出，随着水解时间的延长，水解产物中脯氨酸的含量逐渐降低，羟脯氨酸含量增多。

表4 不同酶酶解时间胶原肽的氨基酸组成

以上实验证明：本发明方法制得的胶原肽产品具有在促进成骨细胞增殖和分化的活性，表明其适合作为食品辅料的应用以及在保健食品方面的应用，具有作为食品辅料以及作为保健功能因子在制备保健食品中的新用途。

二、实施例2：胶原肽的制备

主要包括如下步骤：

1、新鲜鱼皮去除鱼鳞和粘附的鱼肉，洗净；

2、胶原降解：往步骤1准备好的物料中加入其重量4～5倍、质量浓度为1～5g/L的酸溶液，均匀浸泡20～120分钟；然后加热至55～60℃并保温搅拌10～60分钟；过滤除掉滤渣，在滤液中按6000～8000 U/g胶原基质添加蛋白酶，并调整pH在6.5～7.5范围内、温度50～55℃下反应7～8h；然后升温至沸腾并保持1～2min。所述酸溶液可为盐酸、醋酸、乳酸、或磷酸。

3、澄清：取滤液。具体可采用滤布过滤、和/或硅藻土板框过滤、和/或离心澄清，并可添加活性炭进行脱色。

4、浓缩、干燥：将上一步骤获得的滤液用所属领域的常规方法进行浓缩、干燥，即得成品胶原肽粉。

制得的胶原肽平均理化指标为：水分含量6.45%，蛋白质含量93.28%，胶原蛋白42.31%，灰分3.73%，粗脂肪0.02%；产品色泽均匀、粉末细腻，溶解性好，无腥味和异味。而采用上一实施例提及的成骨细胞增殖活性检测方法及分化活性检测方法对制得的胶原肽粉进行检测，确认其成骨细胞增殖率和分化促进率分别为120～135%和120～132%，确实具有较好的促进成骨细胞增殖和分化的活性。而采用氨基酸自动分析仪对产品中的17种常见氨基酸及羟脯氨酸和羟赖氨酸的含量进行测定时，确认质量百分数80%左右的组分的分子量在500Da以下，为典型的小肽，氨基酸残基数量在3~5之间；小肽富含甘氨酸，所占摩尔比在30～33%。

本实施例在实验过程中尝试采用了不同蛋白酶如碱性蛋白酶、动物蛋白酶、风味酶、木瓜蛋白酶，测试表明水解度达到5.75%－10.37%，而胶原肽理化指标及细胞实验数据与上一实施例中的接近但稍低于上一实施例。

三、实施例3：胶原肽的制备

本实施例的技术方案与实施例2基本相同，其不同之处在于所用蛋白酶为动物蛋白酶和风味酶，两者按质量比1:1复合使用。

通过进行不同数据的交叉试验，水解度测试结果表明：采用动物蛋白酶和风味酶复合酶水解，水解度平均达到14.52%。

细胞实验及氨基酸组成检测表明：采用本实施例方法制备获得胶原肽粉与上一实施例的相比，500Da～180Da范围的小分子肽的比重较上一实施例稍大，其成骨细胞增殖和分化效果更好。

四、实施例4：胶原肽的制备

本实施例的技术方案与实施例2基本相同，其不同之处在于澄清步骤具体采用如下技术工艺：将所述胶原降解步骤制得的酶解液趁热用滤布粗滤，按每升滤液添加0.5~5.0g的活性炭，然后于40～50℃保温20～25min，再经硅藻土板框过滤获得清液。

Claims (10)

1.具有促进骨骼生长作用的胶原肽的制备方法，其特征在于是将鱼皮胶原基质经包括除杂、胶原降解、澄清、浓缩、干燥在内的步骤，得到胶原肽产品；其中的胶原降解步骤具体采用如下工艺：在鱼皮胶原基质中加入其重量4～5倍、质量浓度为1～5g/L的酸溶液，均匀浸泡20～120分钟；然后加热至55～60℃并保温搅拌10～60分钟；过滤除掉滤渣，在滤液中按6000～8000U/g胶原基质添加蛋白酶，并调整pH在6.5～7.5范围内、温度50～55℃下反应7～8h；然后升温至沸腾并保持1～2min，即得。

2.根据权利要求1所述的胶原肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶采用动物蛋白酶和风味酶，两者按质量比1:1复合使用。

3.根据权利要求2所述的胶原肽的制备方法，其特征在于：所述澄清，是将所述胶原降解步骤制得的酶解液趁热进行粗滤，再按每升滤液加入0.5~5.0g的活性炭，然后于40～50℃保温20～25min，最后经板框过滤获得清液。

4.根据权利要求1至3之一所述的胶原肽的制备方法，其特征在于：所述酸溶液为盐酸、醋酸、乳酸、或磷酸。

5.具有促进骨骼生长作用的胶原肽，其特征在于：是采用如权利要求1至3之一所述的方法制备而得的产品。

6.根据权利要求5所述的胶原肽，其特征在于：产品中分子量大于1000Da的胶原肽组分所占的质量百分比不超过5%，分子量小于1000Da的胶原肽组分所占的质量比超过95%，其中分子量在1000～500Da、500～180Da及180Da以下的胶原肽组分所占的质量百分比分别为12~16%、45~48%、33~35%；同时，胶原肽产品中甘氨酸占产品总氨基酸的摩尔比为30～33%。

7.如权利要求5所述的具有促进骨骼生长作用的胶原肽作为食品辅料的应用。

8.如权利要求6所述的具有促进骨骼生长作用的胶原肽作为食品辅料的应用。

9.如权利要求5所述的具有促进骨骼生长作用的胶原肽作为保健功能因子在制备保健食品中的应用。

10.如权利要求6所述的具有促进骨骼生长作用的胶原肽作为保健功能因子在制备保健食品中的应用。