CN113151386A - 具有dpp-iv抑制功能的牡蛎肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水产动物食品加工技术领域，具体涉及具有DPP‑IV抑制功能的牡蛎肽及其制备方法和应用。本发明提供的具有DPP‑IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法包括如下步骤：以牡蛎肉为原料，将经前处理的原料经复合蛋白酶酶解制得酶解物；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。利用该方法制备得到的牡蛎肽富含序列为NHPKDST、RGDVPHI或HTSSIHS的肽，具有优异的DPP‑Ⅳ活性抑制功能，可广泛应用于特需食品和营养食品。

Description

具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及水产动物食品加工技术领域，具体涉及具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率逐年上升，已成为继癌症、心脑血管疾病之后的第3位严重危害人类健康的慢性疾病。糖尿病分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病两种类型。在糖尿病患者中，Ⅱ型患者糖尿病患者至少占患者总数的95％。目前，II型糖尿病及其并发症的预防与治疗已引起全球范围内的广泛关注。胰高血糖素样肽-1是一种肠促胰岛素，它通过刺激和保护胰岛β细胞，促进胰岛素的合成和分泌，降低餐后血糖。DPP-IV能够裂解包括胰高血糖素样肽-1和抑胃肽在内的多种肽类激素，而DPP-IV抑制剂通过抑制DPP-IV的活性，防止胰高血糖素样肽-1的裂解，从而降低II型糖尿病患者的高血糖症状。因此，可以通过研发DPP-IV抑制剂来抵抗DPP-IV对肠促胰岛素的降解，间接调节胰岛素的分泌，从而达到调节血糖的目的。目前，虽然人工合成的DPP-IV抑制剂(包括维达列汀和沙格列汀等)已应用于II型糖尿病的治疗，并具有良好的疗效，但仍易引发诸如肝功能异常和过度低血压等一系列的副作用。因此，积极开发来源于食物中的安全、天然、高效的DPP-IV抑制剂己成为急需解决的问题，来源于多种食物原料的DPP-IV抑制肽已有许多报道。至今，人们已发现来源于海藻、谷物、大豆等植物原料的酶解产物和来源于牛奶、乳清蛋白、鱼皮等动物原料的酶解产物中都广泛存在有DPP-IV抑制肽。但以牡蛎为原料的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法还未见相关的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽。本发明的另一目的是提供该牡蛎肽的制备方法和应用。
本发明以开发具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽为研究目标，针对牡蛎肉的原料特性和成分组成特点，开发以牡蛎肉为原料生产具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的工艺。牡蛎肉中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有DPP-IV抑制功能的活性肽可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分。这些都对具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的开发造成较大困难。此外，现有技术的酶解过程中，多需要添加酸碱调节pH，这不仅增加了工艺的复杂性和成本，而且，也可能会影响产品的功能特性，增加产品灰分含量。本发明在研发过程中尝试多种单一酶解和复合酶解，很多方法虽然能够获得分子量较小的肽，但是却往往很难保证具有DPP-IV抑制功能的活性肽的含量，或者，需要依赖酸碱反复调节pH。在众多方法中，本发明确定了适于牡蛎肉、在不依赖酸或碱进行pH的调节的情况下，能够保证具有DPP-IV抑制功能活性肽含量的制备工艺。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，该方法包括如下步骤：以牡蛎肉为原料，将经前处理的原料经复合蛋白酶酶解制得酶解物；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。
本发明发现，采用胰蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解牡蛎蛋白，能够显著提高酶解产物中具有DPP-IV抑制功能活性肽的含量。
优选地，所述复合蛋白酶中，胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量之比为(1-4)：1，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述风味蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g。在该配比范围内，胰蛋白酶和风味蛋白酶能够更好地配合作用，提高具有DPP-IV抑制功能活性肽的含量。
优选地，所述酶解中，所述复合蛋白酶的用量与原料蛋白的质量比为0.6-3.0％，酶解条件为45-60℃酶解1-3h。
采用上述复合酶解方法，能够将牡蛎肉蛋白充分降解为小分子肽，同时保证小分子肽中具有DPP-IV抑制功能活性肽的高含量。经鉴定，经上述酶解可获得高含量的序列为NHPKDST(Asn-His-Pro-Lys-Asp-Ser-Thr)、RGDVPHI(Arg-Gly-Asp-Val-Pro-His-Ile)、HTSSIHS(His-Thr-Ser-Ser-Ile-His-Ser)的多肽，这些多肽均具有优异的DPP-Ⅳ抑制活性。
本发明所述的制备方法还包括对牡蛎肉在酶解前进行前处理的步骤，现有技术中对动物肉类进行深加工时经常会使用高温处理，但是本发明发现，高温处理不仅会影响牡蛎蛋白酶解产物中具有DPP-IV抑制功能活性肽的含量，而且还会影响产品的色泽和口感。
优选地，所述前处理步骤具体包括：将牡蛎肉与水混合经剪切匀浆、超声、均质处理得到原料蛋白液。
上述前处理方法通过对牡蛎原料进行匀浆、超声、均质预处理，提高了蛋白原料与酶的接触，减少了由高温预处理引起的蛋白变性进而产生不利的产品色泽和口感。
优选地，前处理步骤中，超声的频率为60-90kHz，时间为20-30min。
利用上述特定频率的超声波处理，能够明显改善牡蛎蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。
优选地，所述均质为采用20MPa的均质机均质处理。
优选地，将原料蛋白液中原料蛋白(牡蛎蛋白)的含量调至质量百分含量7-10％，再进行酶解。
本发明所述的制备方法还包括在酶解后将所述酶解物进行灭酶处理，再进行糖化酶酶解的步骤。
优选地，所述糖化酶酶解中，所述糖化酶的用量与原料蛋白的质量比为0.9-1.6％，所述糖化酶的酶活为50,000-150,000U/g，酶解条件为45-60℃酶解0.5-2h。
所述灭酶处理为在90-100℃灭酶。
在上述糖化酶酶解并灭酶后，本发明的制备方法还包括将糖化酶酶解物经酵母发酵和活性炭处理，再于4000-5000g离心5-8分钟，收获上清液的步骤。
通过活性干酵母发酵处理，能够明显改善牡蛎蛋白肽的腥味，保证较好的产品口感和色泽，使得肽产品能够广泛应用于特需食品和营养食品。
优选地，所述酵母发酵中，酵母的用量与原料的质量比为0.1-0.2％，发酵温度为30-40℃，时间为0.5-1.5h。
在酵母发酵和活性炭处理后，所述制备方法还包括过滤和分离步骤，具体地，所述过滤和分离步骤包括：
将所述上清液先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，滤液再经过纳滤膜过滤处理，收集截留液；该步骤可去除大分子杂质并脱除小分子的盐；
将所述截留液依次经孔径为5000道尔顿和1000道尔顿的超滤膜超滤，获得分子量小于1000的蛋白肽液；该步骤先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1000道尔顿的膜将分子量小于1000道尔顿的蛋白肽分离出来；
将所述分子量小于1000的蛋白肽液先经SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰中的一个；再用RP-HPLC反相高效液相色谱分离，分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，收集7.5-12.5分钟分离的蛋白肽溶液。
经过纳米级陶瓷膜过滤的牡蛎蛋白肽产品具有溶解性好、贮藏稳定性好的优势，进一步经过纳滤膜脱除产品中无机盐，减少产品中钠离子含量，经上述过滤分离，本发明的牡蛎肽中的钠离子含量可达到0.1％左右，实现了低钠牡蛎肽的制备。
作为本发明的优选方案，所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法包括如下步骤：
(1)原料前处理：将牡蛎肉置于1.0-2.0倍的水中，组织捣碎成匀浆，高速剪切机处理2～5分钟后，利用超声波发生器经超声波(频率为60～90kH)处理20～30分钟，再经过20MPa的均质机均质处理，得到牡蛎蛋白液；
(2)酶解：调节步骤(1)中牡蛎蛋白液的蛋白含量为7-10％(质量百分含量)，按照蛋白含量质量百分比0.6-3.0％的用量加入复合蛋白酶(胰蛋白酶：风味蛋白酶的酶活单位之比为(1-40)：(0.8-25))酶解1-3h，灭酶后再加入糖化酶酶解0.5-2小时；
(3)去味：步骤(2)酶解结束后在90-100℃灭酶，加入原料重量0.1-0.2％的活性干酵母，发酵温度为30-40℃，发酵0.5-1.5h，发酵结束后加入活性炭去腥，4000-5000g离心5-8分钟，取上清液；
(4)过滤：采用陶瓷膜-纳滤膜联用过滤，去除大分子杂质和脱除小分子的盐，获得截留液；
(5)将步骤(4)截留液利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1000道尔顿的膜将分子量小于1000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(6)取分子量为小于1000的蛋白肽液，先经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰中的一个；再用RP-HPLC反相高效液相色谱分离，分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，取7.5-12.5分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(7)将步骤(6)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有具有DPP-IV抑制功能的牡蛎蛋白肽粉，通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其中NHPKDST、RGDVPHI、HTSSIHS特定蛋白肽含量≥60％。
上述制备方法以牡蛎为原料，通过对牡蛎原料进行匀浆、超声、均质预处理，提高了蛋白原料与酶的接触，减少了由高温预处理引起的蛋白变性，产生不利的产品色泽和口感，整个制备过程不添加任何酸和碱调节pH，利用复合蛋白酶进行酶解，利用陶瓷膜分离不同分子量的牡蛎肽，纳滤膜脱盐，再利用凝胶分离及反相HPLC分离技术，获得了具有特定氨基酸多肽序列(NHPKDST、RGDVPHI、HTSSIHS)的具有DPP-Ⅳ抑制功能的低钠牡蛎蛋白肽，建立一套简单高效的牡蛎蛋白肽的制备方法。
进一步地，本发明提供具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽，其由所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法制备得到。
本发明的制备方法可获得高含量的序列为NHPKDST、RGDVPHI或HTSSIHS的多肽，这些多肽具有优异的DPP-Ⅳ抑制活性。
优选地，所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽含有质量百分含量≥60％的功能肽，所述功能肽的序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。
本发明还提供具有DPP-IV抑制功能的多肽，其具有如SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。
本发明通过实验验证，SEQ ID NO.1-3所示的多肽均具有较高的DPP-Ⅳ抑制活性。
本发明提供所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽或所述具有DPP-IV抑制功能的多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。
优选地，所述药品或所述食品具有预防或治疗受益于DPP-IV抑制的疾病的功能。
所述受益于DPP-IV抑制的疾病包括但不限于糖尿病。
本发明还提供含有所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽或所述具有DPP-IV抑制功能的多肽的药品、食品或食品添加剂。
所述药品、食品或食品添加剂除含有所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽或所述具有DPP-IV抑制功能的多肽外，还可含有药品或食品领域允许的辅料。
本发明的有益效果在于：本发明以牡蛎肉为原料制备牡蛎肽，利用本发明的制备方法制备得到的牡蛎肽中分子量小于1000的肽的比例为80％以上，其中序列为NHPKDST、RGDVPHI或HTSSIHS的肽的含量为60％以上，该牡蛎肽产品具有优异的DPP-Ⅳ活性抑制功能，IC50值小于0.7mg/mL，序列为NHPKDST、RGDVPHI或HTSSIHS的肽也具有优异的DPP-Ⅳ活性抑制功能，可广泛应用于特需食品和营养食品。
本发明开发的牡蛎蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，产品灰分含量低。本发明的制备方法还具有高效、简单的优势。
附图说明
图1为本发明实施例1中牡蛎蛋白肽的检测图。
图2为本发明实施例2中牡蛎蛋白肽的检测图。
图3为本发明实施例3中牡蛎蛋白肽的检测图。
图4为本发明实施例1中牡蛎蛋白肽的LC-MS图。
图5为本发明实施例2中牡蛎蛋白肽的LC-MS图。
图6为本发明实施例3中牡蛎蛋白肽的LC-MS图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的胰蛋白酶、风味蛋白酶和糖化酶的活性单位含量分别为100,000U/g、180,000U/g和120,000U/g。
以下实施例中，反相HPLC的分离条件具体如下：
液相系统：岛津LC-16；
检测器：紫外检测器220nm；
流动相：A-含0.1％TFA的水溶液为流动相A，B-含0.1％TFA的乙腈溶液；
柱子：Cosmosil 5C18-PAQ column(4.6×250mm,Nacalai Tesque,Kyoto,Japan)；
流速：1mL/min；
洗脱程序：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B。
实施例1具有DPP-Ⅳ抑制功能的牡蛎蛋白肽的制备方法(1)
本实施例提供一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的牡蛎蛋白肽的制备方法，具体如下：
(1)将牡蛎肉置于2.0倍符合饮用水卫生标准的水中，组织捣碎成匀浆，高速剪切机处理2分钟后，利用超声波发生器经超声波(频率为60kHz)处理30分钟，再先经过20MPa的均质机均质处理，得到牡蛎蛋白液；
(2)调节步骤(1)中牡蛎蛋白液的蛋白含量为7％，加入蛋白总量为0.6％的胰蛋白酶和风味蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1:1)，在45℃条件下酶解3h，灭酶后加入0.9％的糖化酶，在45℃酶解1h；
(3)步骤(2)酶解结束后灭酶，加入1‰活性干酵母在30℃发酵1.5h，然后加入0.3％的活性炭去腥，温度控制在60℃；
(4)采用陶瓷膜-纳滤膜联用过滤，陶瓷膜去除大分子杂质，纳滤膜脱除小分子的盐以及呈鲜味物质，取截留液；
(5)将步骤(4)截留液进行冷冻干燥，得到牡蛎蛋白肽粉；
(6)将步骤(5)得到的牡蛎蛋白肽粉溶解，利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1000道尔顿的膜将分子量小于1000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(7)取分子量为小于1000的蛋白肽液，先经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牡蛎蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，取10.8-12.4分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(8)将步骤(7)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牡蛎蛋白肽粉；牡蛎蛋白肽的检测结果如图1所示；利用LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定(图4)，其中氨基酸序列为NHPKDST的肽的含量为66.1％。
本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的牡蛎蛋白肽。实施例2具有DPP-Ⅳ抑制功能的牡蛎蛋白肽的制备方法(2)
本实施例提供一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的牡蛎蛋白肽的制备方法，具体如下：
(1)将牡蛎肉置于1.5.0倍符合饮用水卫生标准的水中，组织捣碎成匀浆，高速剪切机处理5分钟后，利用超声波发生器经超声波(频率为90kHz)处理30分钟，再先经过20MPa的均质机均质处理，得到牡蛎蛋白液；
(2)调节步骤(1)中牡蛎蛋白液的蛋白含量为10％，加入总量为0.8％的胰蛋白酶和风味蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为2:1)酶解3h，灭酶后再加入1.2％的糖化酶酶解，在55℃酶解1.5h。
(3)步骤(2)酶解结束后灭酶，加入1.5‰活性干酵母在35℃发酵1.5h，酶解结束后加入0.6％的活性炭去腥，吸附温度控制在70℃；
(4)过滤：采用陶瓷膜-纳滤膜联用过滤，陶瓷膜去除大分子杂质，纳滤膜脱除小分子的盐以及呈鲜味物质，取截留液；
(5)将步骤(4)截留液进行冷冻干燥，得到牡蛎蛋白肽粉；
(6)将步骤(5)得到的牡蛎蛋白肽粉溶解，利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1000道尔顿的膜将分子量小于1000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(7)取分子量为小于1000的蛋白肽液，先经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牡蛎蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，取11.5-12.5分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(8)将步骤(7)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牡蛎蛋白肽粉；牡蛎蛋白肽的检测结果如图2所示；利用LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定(图5)，其中氨基酸序列为RGDVPHI的肽的含量为68.1％。
本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的牡蛎蛋白肽。实施例3具有DPP-Ⅳ抑制功能的牡蛎蛋白肽的制备方法(3)
本实施例提供一种具有DPP-Ⅳ抑制功能的牡蛎蛋白肽的制备方法，具体如下：
(1)将牡蛎肉置于1.0倍符合饮用水卫生标准的水中，组织捣碎成匀浆，高速剪切机处理2-5分钟后，利用超声波发生器经超声波(频率为90kHz)处理20分钟，再先经过20MPa的均质机均质处理，得到牡蛎蛋白液；
(2)调节步骤(1)中牡蛎蛋白液的蛋白含量为10％，加入蛋白总量为1％的胰蛋白酶和风味蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶的比例为4:1)酶解3h，灭酶后再加入1.6％的糖化酶，在60℃酶解2h；
(3)步骤(2)酶解结束后灭酶，加入2‰活性干酵母发酵2h，酶解结束后加入0.8％的活性炭去腥，吸附温度控制在70℃；
(4)过滤：采用陶瓷膜-纳滤膜联用过滤，陶瓷膜去除大分子杂质，纳滤膜脱除小分子的盐以及呈鲜味物质，取截留液；
(5)将步骤(4)截留液进行冷冻干燥，得到牡蛎蛋白肽粉；
(6)将步骤(5)得到的牡蛎蛋白肽粉溶解，利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1000道尔顿的膜将分子量小于1000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(7)取分子量为小于1000的蛋白肽液，先经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牡蛎蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取7.5-8.8分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(8)将步骤(7)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牡蛎蛋白肽粉；牡蛎蛋白肽的检测结果如图3所示；利用LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定(图6)，其中氨基酸序列为HTSSIHS的肽的含量为65.3％。
实验例牡蛎蛋白肽的DPP-Ⅳ抑制活性测定
试验样品：样品1-3分别为实施例1-3步骤(8)制备的具有特定功能的牡蛎蛋白肽粉，样品4为由实施例1步骤(1)所得的牡蛎蛋白液直接经过冷冻干燥得到的牡蛎蛋白粉，样品5为实施例1步骤(5)得到的牡蛎蛋白肽粉，样品6为实施例1步骤(6)得到的牡蛎蛋白肽粉，样品NHPKDST、RGDVPHI、HTSSIHS分别为人工合成的氨基酸序列为NHPKDST、RGDVPHI、HTSSIHS的多肽。
以上各样品的DPP-Ⅳ抑制能力按照如下方法进行测定：
将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH 8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL 1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A样品-A样品空白对照)/(A阴性对照-A阴性空白对照)}×100
A样品：样品反应液在405nm处的吸光值A；
A样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A；
A阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值；
A阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值。
DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制时肽的浓度。
从表1可以看出，实施例1-3制备得到的牡蛎蛋白肽具有非常好的DPP-IV抑制活性(IC50小于0.7mg/mL)。
表1牡蛎蛋白肽的DPP-IV抑制试验结果
Figure BDA0003023755170000121
Figure BDA0003023755170000131
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 安徽国肽生物科技有限公司
<120> 具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽及其制备方法和应用
<130> KHP211111133.4
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn His Pro Lys Asp Ser Thr
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Gly Asp Val Pro His Ile
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Thr Ser Ser Ile His Ser
1 5

Claims (10)

1.具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以牡蛎肉为原料，将经前处理的原料经复合蛋白酶酶解制得酶解物；
所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶中，胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量之比为(1-4)：1，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述风味蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g。
3.根据权利要求1或2所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述酶解中，所述复合蛋白酶的用量与原料蛋白的质量比为0.6-3.0％，酶解条件为45-60℃酶解1-3h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述前处理包括：将牡蛎肉与水混合后经剪切匀浆、超声、均质处理得到原料蛋白液；
优选地，所述超声的频率为60-90kHz，时间为20-30min。
5.根据权利要求1～4任一项所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于，将所述酶解物进行灭酶处理，再进行糖化酶酶解；
优选地，所述糖化酶酶解中，所述糖化酶的用量与原料蛋白的质量比为0.9-1.6％，所述糖化酶的酶活为50,000-150,000U/g，酶解条件为45-60℃酶解0.5-2h。
6.根据权利要求5所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于，在所述糖化酶酶解后先进行灭酶处理、酵母发酵和活性炭处理，再于4000-5000g离心5-8分钟分离并收获上清液；
所述发酵中，酵母的用量与原料的质量比为0.1-0.2％，发酵温度为30-40℃，时间为0.5-1.5h；
优选地，所述制备方法还包括：
将所述上清液先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，滤液再经过纳滤膜过滤处理，收集截留液；
将所述截留液依次经孔径为5000道尔顿和1000道尔顿的超滤膜，获得分子量小于1000的蛋白肽液；
将所述分子量小于1000的蛋白肽液先经SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱分离，分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，收集7.5-12.5分钟分离的蛋白肽溶液。
7.具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽，其特征在于，其由权利要求1～6任一项所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽的制备方法制备得到；
优选地，所述具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽含有质量百分含量≥60％的功能肽，所述功能肽的序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。
8.具有DPP-IV抑制功能的多肽，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。
9.权利要求7所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽或权利要求8所述的具有DPP-IV抑制功能的多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用；
优选地，所述药品或所述食品具有预防或治疗受益于DPP-IV抑制的疾病的功能。
10.含有权利要求7所述的具有DPP-IV抑制功能的牡蛎肽或权利要求8所述的具有DPP-IV抑制功能的多肽的药品、食品或食品添加剂。
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