CN113880918A - 一种制备牡蛎多肽的方法及其在食品、药品方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备牡蛎多肽的方法及其在食品、药品方面的应用，具体涉及食品药品领域，包括牡蛎提取的蛋白小肽，分子量为1019Da，分子式为：Met‑Gly‑Phe‑Ala‑Trp‑Thr‑Cys‑Gly‑Phe，并通过下述方法制备得到，将牡蛎肉洗净、搅碎，利用复合酶Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝2：1～4：1，酶用量分别为2000～4000U/g和500～1500U/g，温度为45～55℃，PH值为7.5～9.5，酶解时间为2～5小时的条件对牡蛎进行多肽酶解；将得到的牡蛎酶解液用葡聚糖凝胶G‑25分离获得牡蛎多肽3号；本发明还涉及利用牡蛎多肽溶液或牡蛎肽Cmpd13制备牡蛎肽豆腐，作为食品、保健品和药品方面的应用。

Description

一种制备牡蛎多肽的方法及其在食品、药品方面的应用
技术领域
本发明涉及食品药品领域，具体涉及一种制备牡蛎多肽的方法及其在食品、药品方面的应用。
背景技术
随着中国国民消费升级的需要，制备营养、健康的功能食品、保健食品成为“嘴巴经济”的一股潮流，本发明将牡蛎中的多肽抗氧化活性物质进行提取，作为膳食补充剂添加进食品豆腐当中，为以后牡蛎多肽在食品产业的发展开辟新道路。
《神农本草经》中记载牡蛎作为中药，具有化痰、止汗、潜阳等功效。临床上，牡蛎在治疗失眠、慢性中耳炎、小儿多汗症等方面有一定的疗效(朱翰林，刘茜，郑思瑶等.牡蛎多肽酶解工艺抗氧化活性与相对分子质量分布研究.食品科技，2020，45(06):142-149)。据国内外已有的研究报道，牡蛎还具有增强免疫、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老等生物活性。如今，我国的卫生部门已把牡蛎列为既是药材又是食品的保健疗效物。对牡蛎多肽组分进行深入的研究与探索，将有利于其应用于医药以及保健功能食品行业。
海洋生物活性物质中肽类物质是最为庞大、且研究较为深入的一类化合物，已知的肽类物质，数目多达数万种，主要包括海洋生物活性肽与海洋肽类毒素等。肽是由两个或者是多个氨基酸通过脱水缩合的方式形成若干个肽键进行链接起来的一类化合物，地球上所有的动物体内都含有肽，它们是构成我们生命体的重要组成部分(王晨旭，张宇辰，关薇薇.海洋动物多肽的提取分离方法研究进展.广州化工，2019，47(17)，27-29+48)。生物肽是一类分子量小于6kDa的多肽，容易被胃肠道直接吸收利用。由于生物肽中的氨基酸的数量的不同，所以其结构也不同，因此其具有多种多样的生物学功能。在生物肽中有些肽的结构较为简单如寡肽二肽、三肽等，有些则结构较为复杂，如已知的环形大分子多肽等，还可通过磷酸化、糖基化或者酰基化等方式修饰活性肽(李维，兰海楠，郭风等.生物活性肽的研究进展.中国畜牧兽医，2012，39(10)：105-107.)。研究表明，将生物蛋白酶解成小分子多肽或低聚肽，其具有不需消化直接吸收、不需消耗人体能量、并且吸收速度快、优先选择吸收、在人体中合成蛋白质的速率比氨基酸快等诸多优点(葛盛东.大豆小分子多肽制备工艺和检测方法的研究.吉林大学，2008.)。生物活性肽对人体的生命活动具有极大作用，活性肽作为功能食品，保健食品，医药产品的研究是极具发展前景的(王凤山，张天民，王福清.我国多肽类药物现状与发展方向.食品与药品，2005，7(06A)：1-5.)。
发明内容
本发明的目的是采用温和、环境友好的酶解法高效、高产率的制备牡蛎蛋白小肽，摒弃传统的高温蒸煮裂解肽链的方法，利用凝胶柱层析法从牡蛎酶解液中分离提取出一种具有抗氧化活性的新蛋白肽物质Cmpd13，为九个氨基酸组成的小分子肽，其分子量为1019Da，分子式为
Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe，另一目的是开发出含有该小肽的牡蛎肽溶液规模制备方法，又一目的是开发出含有该蛋白小肽的产品及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种牡蛎提取的蛋白小肽，分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe，具体制备方法如下：
(1)将牡蛎肉洗净、搅碎，利用复合酶Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝2：1～4：1，酶用量分别为2000～4000U/g和500～1500U/g，温度为45～55℃，PH值为7.5～9.5，酶解时间为2～5小时的条件对牡蛎进行多肽酶解；
(2)将步骤(1)得到的酶解液用葡聚糖凝胶G-25分离(纯水洗脱)获得牡蛎多肽3号，主要成分为Cmpd13，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe的小肽物质，用高效液相色谱纯化，获得99％纯度物质Cmpd13。
优选的，在步骤(2)得到的牡蛎多肽中加入主要成分为CaSO4的石膏0.1～0.4％、或(和)主要成分为MgCl2的卤水0.1～0.4％、或(和)葡萄糖酸内酯凝固剂0.1～0.4％(凝固剂用豆浆量2～4％的水溶解后加入豆浆，边加边搅拌，充分混合均匀)和豆浆97.5％～99.5％，冷却成型，凝固制备成凝固物，即牡蛎肽豆腐。
本发明还包括一种牡蛎提取的蛋白小肽的制备方法，包括以下的步骤：
(1)以牡蛎肉为原材料，将牡蛎在冷水中泡1～3h，取出牡蛎肉，水清洗，除去其中的泥沙，静置将多余的水分沥干，匀浆机搅碎，利用复合酶Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝2：1～4：1，酶用量分别为2000～4000U/g和500～1500U/g，温度为45～55℃，PH值为7.5～9.5，酶解时间为2～5小时的条件对牡蛎进行蛋白酶解获得多肽酶解液；
(2)将步骤(1)得到的酶解液用葡聚糖凝胶G-25或者G-50分离(纯水洗脱)获得牡蛎多肽3号，主要成分为Cmpd13，用高效液相色谱进一步纯化，可得99％纯度的小肽物质Cmpd13，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe。
优选的，在步骤(1)得到的蛋白肽物质溶液每2～4g中加入100毫升豆浆和按0.1～0.4％的量加入主要成分为CaSO4的石膏、或(和)按0.1～0.4％的量加入主要成分为MgCl2的卤水、或(和)按0.1～0.4％的量加入葡萄糖酸内酯凝固剂，凝固制备成凝固物，即牡蛎肽豆腐。
优选的，凝固物作为食品、保健品和药品方面的应用。
本发明利用复合酶解法即Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝3：1，酶用量分别为3000U/g和1000U/g，温度为50℃，PH值为9，酶解时间为3小时的条件对牡蛎进行多肽酶解，同时再利用高效液相色谱对其进行分析，再利用葡聚糖凝胶G-25分离酶解液(超纯水洗脱，1个柱体积后，每50毫升水接液一瓶；柱内径3.0厘米，长55厘米)，其中3号组分通过薄层点板发现1个纯度较好的蛋白肽点(薄层层析采用硅胶板G254，展开剂为正丁醇:乙酸:水(5:3:2))，抗氧化活性测试表明当牡蛎多肽3号浓度为2mg/ml时，DPPH自由基清除率为91.18％；牡蛎多肽3号浓度为2mg/ml时，ABTS自由基清除率为95.52％，通过LC-MS/MS分析获知牡蛎多肽3号组分主要成分为Cmpd13，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe。
牡蛎多肽粗品通过葡聚糖凝胶进行分离纯化以后，得到的牡蛎多肽3号样品进行液质分析(LC-MS/MS)，质谱图结果如图1所示；
Cmpd13分子量较大，其质谱图如下图2所示。
仪器为Waters UPLC/Q-TOF micro MS，柱温为25℃，水相选择乙酸氨水水溶液，有机相选择甲醇溶液，进行梯度洗脱，离子模式为正相，中山大学测试中心检测。
经过解析，推测Cmpd13为九个氨基酸组成的小分子肽，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe。
利用复合酶酶解法探究牡蛎多肽提取分离工艺，从牡蛎中将蛋白质酶解，获得牡蛎粗多肽，利用葡聚糖凝胶和高效液相色谱分离、纯化多肽，分离纯化获得分子量在1000-3000Da的小分子多肽，与参考文献比对，综合评价复合酶提取法的提取效果。确定了有效的牡蛎多肽提取工艺为复合酶且复合酶碱性蛋白酶：胰蛋白酶配比为1：1-5：1(最佳配比3：1)，最佳温度范围为45-55℃，酶解时间为2.5-5小时，并通过DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率等四个自由基的清除率指标检测抗氧化活性，了解牡蛎粗多肽的抗氧化活性。通过抗菌实验和老鼠动物实验，了解到多肽具有一定的抗菌性和镇痛药效，为以后牡蛎多肽在医药领域和食品产业的发展提供了依据。
上述方法提取牡蛎粗多肽后进一步通过凝胶柱层析分离，高效液相色谱分析检验牡蛎小分子多肽的分离纯度。最后根据质谱分析测定上述实验中所分离出小分子多肽的分子量。除此之外，运用粗多肽上清液进行膜过滤除去杂质，随后通过测定羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、ABTS自由基等四个自由基的清除率指标，与GSH(阳性对照)、蒸馏水(空白对照)形成对照实验，来研究牡蛎多肽的抗氧化活性。结果表明通过复合酶解法获得的牡蛎粗多肽提取效率达到9.03％，分离纯化得分子量为1000-3000的小分子多肽物质，分离出了1个由9个氨基酸组成的小分子肽。并通过实验测定得出，当牡蛎粗多肽浓度达到10mg/ml时，DPPH自由基清除率为97.27％；多肽浓度为5mg/ml时，ABTS自由基清除率为98.22％，与GSH在相同浓度下的清除效率基本持平，认为其清除能力较好。但结果表明，随着浓度增加，羟基自由基与超氧阴离子自由基清除率逐渐升高，但约为GSH的清除率1/5，表明牡蛎多肽的羟基自由基清除以及超氧阴离子自由基清除率能力较弱。综合上述情况，可通过这四个指标认为牡蛎粗多肽具有较好的抗氧化活性。
在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：
本发明采用温和、环境友好的酶解法高效、高产率的制备牡蛎蛋白小肽，摒弃传统的高温蒸煮裂解肽链的方法，利用凝胶柱层析法从牡蛎酶解液中分离提取出一种具有抗氧化活性的新蛋白肽物质Cmpd13，可作为豆腐、豆花、豆干和豆浆等的添加剂，调配出具有独特海味的豆腐、豆花、豆干和豆浆系列产品，还能够利用制备的具有抗氧化活性的牡蛎多肽粉或者酶解液做辅食，成为幼儿、产妇和老年人等的康养、保健食品，为以后牡蛎多肽在食品产业的发展开辟新道路。
附图说明
图1为本发明内容中样品3液质联用谱图；
图2为本发明内容中Cmpd13分子量较大时的质谱图；
图3为本发明实施例1中DPPH自由基清除率图；
图4为本发明实施例1中羟基自由基清除率图；
图5为本发明实施例1中超氧阴离子自由基清除率图；
图6为本发明实施例1中ABTS自由基清除率图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
主要原材料：
从蓬八鲜旗舰店购买太平洋牡蛎(长牡蛎，学名Crassostrea gigas，英文名pacific oyster)，储存于-20℃下备用，使用前12小时在4℃冰箱解冻。大豆10公斤，产自东北。
主要仪器设备：
分离式磨浆机DM-ZF105-2，购自南阳市福亚商贸有限公司。匀浆机：佛山市顺德区三的电器制造有限公司；落地式离心机：Bechman J2-Hs高速冷冻离心机，产地美国；高速冷冻离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；凝胶色谱型号:Sephadex G-25，柱型号:100×3.0cm，缓冲液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(含0.16mol/L NaCl)，pH＝7.0，溶剂流速2mL/min，凝胶柱床体积约150mL；冷冻干燥机，无锡久平仪器有限公司；725N紫外分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社；电热恒温水浴锅，绍兴市苏珀仪器有限公司；分析型高效液相色谱仪Waters 2998，三重四极杆液-质联用仪(LC-MS/MS)，中山大学测试中心。
主要生物和化学试剂：
石膏，购自安琪酵母股份有限公司。葡萄糖酸内酯，购自上海麦克林生化科技有限公司。Alcalase碱性蛋白酶，诺维信公司，50万活力单位/g。无水乙醇，天津致远。胰蛋白酶，100万活力单位/g，还原性谷胱甘肽，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，磷酸盐缓冲液，邻二氮菲，乙二胺四乙酸(EDTA)，2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，NaOH试剂，硫酸亚铁，过氧化氢，Tris-HCl缓冲液，邻苯三酚，过硫酸钾等以上试剂购买自上海麦克林生化科技有限公司。纯水：实施例中用水均为纯水，使用MiniQ纯水制备系统制备。
实施例1：
以牡蛎肉为原材料，首先将牡蛎在冷水中泡2h，取出牡蛎肉，蒸馏水清洗，除去其中的泥沙，静置将多余的水分沥干，称重记录质量m0，匀浆机粉碎、匀浆后，匀浆液体积V0。根据所得匀浆液的体积，在牡蛎匀浆液中添加去离子水，料水比为1：3，加入总质量分数为0.8％的酶，其中Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝3：1，运用复合酶解法(Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝3：1)，对原材料酶解提取牡蛎多肽，并计算其多肽提取率，之后测定酶解液pH，并调节至pH＝9，打开水浴锅，将酶解液置于50℃恒温水中水浴3h，再在95℃条件下加热(防止溶液发泡)，使酶灭活，时间为15min。待酶解液冷却至室温后，进行离心操作，设定温度为4℃，在8000r/min条件下，离心20min。然后取上清液，加入无水乙醇，进行醇沉，使酶解液中的多糖析出，形成沉淀，然后将其放入4℃的冰箱中保存12h，以便析出更多的多糖沉淀。12h后取出样品，再次进行离心20min，转速为8000r/min，取其上清液。采用旋转蒸发仪将得到的上清液进行减压回收，利用真空泵形成负压在50℃下慢慢蒸馏出乙醇，从而得到多肽的粗提取液，记录体积V1。在V1中取出20ml的多肽提取液于电热鼓风干燥箱中烘干，时间为10h，得到干燥的牡蛎多肽，称重记录质量m1，随后计算多肽的粗提取率。进行高效液相分析，在操作之前先进行仪器的准备：①检查流动相和清洗溶液的容量，如果不够则及时添加；②检查色谱柱的使用是否正确，有无漏液现象发生；③打开仪器电源，在计算机上操作，使仪器开始自检，完成自检后，仪器进入待使用状态；④进一步确认仪器管路状态正常后，对管路进行流动相灌注；⑤设置好各参数，开始平衡柱子；⑥平衡完毕以后，选择各项目参数，设置流动相流速、柱温等，编辑样品参数，选择好适合的方法组；⑦设置完毕之后，将分析样品放入机器中，开始分析，等待结果。选用仪器为Waters UPLC/Q-TOF micro MS，离子模式为正负均测，柱温为25℃，水相选择乙酸氨水水溶液，有机相选择甲醇溶液，进行梯度洗脱。将牡蛎多肽粗品和样品1送到中山大学测试中心进行检测。样品经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，根据得到质谱图进行分析。
抗氧化活性测试如下，配制浓度梯度为0.25、0.5、0.75、1、5、10mg/ml的牡蛎多肽提取液，采用还原型谷胱甘肽(GSH)作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照，通过下列4个指标来对多肽进行抗氧化活性测定。分别取2ml牡蛎多肽和GSH，加入2ml 0.1mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，充分混匀，避光反应1h，温度为37℃。用4ml 50％的无水乙醇对设备进行调零，之后将反应液在517nm处测定吸光值，记录为A。再用无水乙醇代替DPPH溶液，重复以上操作步骤，记录数据为As。用无水乙醇代替样品，重复以上步骤，记录数据为A0。计算DPPH自由基清除率
Figure BDA0003363001590000091
配置pH＝7.4的磷酸缓冲液0.4ml，按顺序先加入0.6ml5mmol/L的邻二氮菲溶液，加入0.6ml样品，再加入0.6ml 15mmol/L的EDTA和0.6ml 5mmol/L的硫酸亚铁，最后加入0.8ml 0.1％的过氧化氢，在37℃条件下恒温反应1h。用0.4ml磷酸盐缓冲液和3.2ml去离子水对设备进行调零之后，于536nm处测定反应液的吸光值，记录为A(样)。用蒸馏水代替样品，重复以上步骤，记录为A(损伤管)。用蒸馏水代替过氧化氢，同样地重复以上步骤，记录为A(未损伤管)。计算羟基自由基的清除率
Figure BDA0003363001590000092
分别取样品稀释液2ml，加入蒸馏水3ml，Tris-HCl缓冲液4.5ml，邻苯三酚溶液0.5ml，恒温(25℃)反应20min，每30s在325nm处测定吸光值，记录为A(样)。再用Tris-HCl缓冲液代替样品，重复以上步骤，记录A(空白)，计算
Figure BDA0003363001590000093
配置ABTS储备液——7mmol/L的ABTS和4.9mmol/L的过硫酸钾1：1混匀，避光15h(室温)。用无水乙醇对ABTS储备液进行稀释，使其在734nm处的吸光值为0.7，为ABTS工作液。用1ml无水乙醇和1ml蒸馏水对设备进行调零，调零完毕后，取20uL样品和2ml ABTS工作液，室温调节下避光反应30min，在734nm处测量吸光值，记录为As。蒸馏水代替样品，重复以上步骤，记录为Ac，计算ABTS自由基的清除力
Figure BDA0003363001590000094
计算结果如下：
通过上述操作所得数据，得到牡蛎多肽粗提取液120ml，取20ml进行烘干得到2.53g干燥粗多肽，计算得到牡蛎多肽的粗提取率为9.03％。
表1 DPPH自由基清除率
Figure BDA0003363001590000101
DPPH自由基清除率如图3所示。
从上述结果我们可以看出，牡蛎多肽的DPPH自由基清除率随浓度增加而升高，当浓度为10mg/ml的时候，DPPH自由基清除率为97.27％，接近GSH的清除率，这表明当牡蛎多肽的浓度在10mg/ml左右时，其DPPH自由基清除率达到最高，与GSH清除能力相当。
表2羟基自由基清除率
Figure BDA0003363001590000102
Figure BDA0003363001590000111
羟基自由基清除率入图4所示。
从上述结果我们可以看出，牡蛎多肽的羟基自由基清除率随着浓度增加而逐渐升高，但远小于GSH的清除率，表明牡蛎多肽的羟基自由基清除能力较弱。
表3超氧阴离子自由基清除率
Figure BDA0003363001590000112
Figure BDA0003363001590000121
超氧阴离子自由基清除率入图5所示。
从上述结果我们可以看出，牡蛎多肽的超氧根离子自由基清除率随着浓度增加而逐渐升高，清除能力大约为GSH的五分之一。
表4 ABTS自由基清除率
Figure BDA0003363001590000122
Figure BDA0003363001590000131
ABTS自由基清除率如图6所示。
从上述结果我们可以看出，牡蛎多肽的ABTS自由基清除率随着浓度增加而逐渐升高，当浓度达到5mg/ml的时候，其ABTS自由基清除率为98.22％，接近GSH，这表明当牡蛎多肽的浓度在5mg/ml左右时，其ABTS自由基清除率达到最高，从5mg/ml开始，牡蛎多肽的清除能力与GSH清除能力相当。
综上所述，通过与GSH形成的结果进行对照，可以看出牡蛎多肽在DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、ABTS自由基清除率等指标，结果表明，牡蛎多肽有一定的抗氧化作用，其DPPH自由基清除能力在浓度为10mg/ml时达到与GSH相当；其ABTS自由基清除能力在浓度为5mg/ml时达到与GSH相当，而羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率则较弱。
实施例2：
采用0.22um的滤膜对牡蛎多肽的提取液进行过滤，除去一些不溶性杂质，再进行层析。滤膜过滤之后，利用Sephadex-G25的凝胶过滤柱(45x3.0cm)进行凝胶柱层析。装柱完成后，使用移液枪加入样品，沿着柱子内壁缓慢旋转，后打开柱子流出口，等待样品慢慢渗入凝胶床中。当样品加完以后，再缓慢用去离子水冲洗柱子内壁，然后重新打开流出口，使样品液全部渗入凝胶床当中，之后添加去离子水，将储液球装满，然后调节流出口控制流速，以1ml/min的速度进行洗脱，全组分进行收集大约9个柱体积，分管保存，得到多肽流出液。将得到的不同组分多肽流出液，使用旋转蒸发仪浓缩至8ml左右，得到精制溶液，置于-20℃冰箱保存，24h后将已经凝固的样品放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，48h后取出，3号样品瓶纯化得到牡蛎多肽冻干粉Cmpd13。通过凝胶柱层析、高效液相色谱分析，检验牡蛎小分子多肽的分离纯度。最后根据质谱分析测定上述实验中所分离出小分子多肽的分子量，鉴定方法同实施例1。随后通过测定羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、ABTS自由基等四个自由基的清除率指标，与GSH(阳性对照)、蒸馏水(空白对照)形成对照实验，来研究牡蛎多肽Cmpd13的抗氧化活性，测试方法同实施例1。结果如下：
表5四种抗氧化模型下牡蛎多肽Cmpd13的自由基清除率测试结果(GSH阳性对照，蒸馏水空白对照，2mg/mL浓度)
Figure BDA0003363001590000141
抗氧化活性测试表明当牡蛎多肽Compd13浓度为2mg/ml时，DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和ABTS自由基清除率分别为94.55％、51.44％、93.67％和96.65％，通过LC-MS/MS分析获知牡蛎多肽Cmpd13，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe。
实施例3：
制作带牡蛎多肽豆腐的过程如下，选取五斤黄豆去除杂质，将大豆放入水中浸泡(水：干豆＝3：1)，至豆瓣易被手指掐断，大豆表面无皱皮、比较光亮。浸泡时间为8h-12h之间，水的温度要求介于17-25℃之间。采用分离式磨浆机DM-ZF105-2将黄豆与水体积比按1：4磨浆(除去泡黄豆吸的水)。通电加热设备，将豆浆加热到95℃及以上，并保持5min。(90℃时加入干豆重0.1％-0.3％消泡剂)。再按黄豆比重的5％加入牡蛎粗多肽粉。豆浆倒入标记好的模具内(850mL/个)，当豆浆温度冷却到85℃以下(GDL不会发生热分解)时按0.25％：0.25％的量加入溶解好的凝固剂石膏和葡萄糖酸内酯(凝固剂用豆浆量3％的水溶解后加入豆浆，边加边搅拌，充分混合均匀)。冷却成型，翻转后即可取出制备好的牡蛎多肽豆腐，又称牡蛎海豆腐。
实施例4：
制作带牡蛎多肽豆浆的过程如下，选取五斤黄豆去除杂质，将大豆放入水中浸泡(水：干豆＝3：1)，至豆瓣易被手指掐断，大豆表面无皱皮、比较光亮。浸泡时间为8h-12h之间，水的温度要求介于17-25℃之间。采用分离式磨浆机DM-ZF105-2将黄豆与水体积比按1：4磨浆(除去泡黄豆吸的水)。通电加热设备，将豆浆加热到95℃及以上，并保持5min。(90℃时加入干豆重0.1％-0.3％消泡剂)。再按黄豆比重的5％加入牡蛎粗多肽粉，当豆浆温度冷却到55℃以下后可以热喝，也可以冰箱中冷却至20℃以下后喝冷饮。
实施例5：
简易、低成本制作牡蛎多肽豆腐、豆干的过程如下，选取五斤黄豆去除杂质，将大豆放入水中浸泡(水：干豆＝3：1)，至豆瓣易被手指掐断，大豆表面无皱皮、比较光亮。浸泡时间为8h-12h之间，水的温度要求介于17-25℃之间。采用分离式磨浆机DM-ZF105-2将黄豆与水体积比按1：4磨浆(除去泡黄豆吸的水)，然后再把酶解好的牡蛎肉酶解液直接加入机器中磨浆。迅速通电加热设备，将豆浆加热到95℃及以上，并保持5min，获得牡蛎粗多肽豆浆(95℃时加入干豆重0.1％-0.3％消泡剂)。把上述豆浆倒入标记好的模具内(850mL/个)，当豆浆温度冷却到85℃以下(GDL不会发生热分解)时按0.25％：0.25％的量加入溶解好的凝固剂石膏和葡萄糖酸内酯(凝固剂用豆浆量3％的水溶解后加入豆浆，边加边搅拌，充分混合均匀)。冷却成型，翻转后即可取出制备好的牡蛎多肽豆腐，又称牡蛎海豆腐。以上是简便制作牡蛎多肽豆浆和牡蛎多肽豆腐的方法。豆腐采用风干机风干或者晒干得到豆干。
实施例6：
广州新海医院康复医疗中心(自愿原则)选择6人，每人连续3天，每日约100克牡蛎豆腐进食，按表6评定标准评价，评价结果如表7：
Figure BDA0003363001590000161
Figure BDA0003363001590000171
Figure BDA0003363001590000181
表6豆腐感官评价评分标准及含义
数据处理如下，利用Excel对数据进行处理及统计学分析，试验得到的豆腐感官评定统计结果见表7，其中每一项分值均为6名感官评价员所打出分值的平均值。
表7豆腐的感官评定统计结果
Figure BDA0003363001590000182
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (5)

1.一种牡蛎提取的蛋白小肽，其特征在于：分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe，具体制备方法如下：
(1)将牡蛎肉洗净、搅碎，利用复合酶Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝2：1～4：1，酶用量分别为2000～4000U/g和500～1500U/g，温度为45～55℃，PH值为7.5～9.5，酶解时间为2～5小时的条件对牡蛎进行多肽酶解；
(2)将步骤(1)得到的酶解液用葡聚糖凝胶G-25分离获得牡蛎多肽3号，主要成分为Cmpd13，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe的小肽物质，用高效液相色谱纯化，获得99％纯度物质Cmpd13。
2.根据权利要求1所述的一种牡蛎提取的蛋白小肽，其特征在于：在步骤(2)得到的牡蛎多肽中加入成分为CaSO4的石膏0.1～0.4％、成分为MgCl2的卤水0.1～0.4％、葡萄糖酸内酯凝固剂0.1～0.4％和豆浆97.5％～99.5％，冷却成型，凝固制备成凝固物，即牡蛎肽豆腐。
3.一种如权利要求2所述的牡蛎提取的蛋白小肽的制备方法，其特征在于：包括以下的步骤：
(1)以牡蛎肉为原材料，将牡蛎在冷水中泡1～3h，取出牡蛎肉，水清洗，除去其中的泥沙，静置将多余的水分沥干，匀浆机搅碎，利用复合酶Alcalase碱性蛋白酶：胰蛋白酶＝2：1～4：1，酶用量分别为2000～4000U/g和500～1500U/g，温度为45～55℃，PH值为7.5～9.5，酶解时间为2～5小时的条件对牡蛎进行蛋白酶解获得多肽酶解液；
(2)将步骤(1)得到的酶解液用葡聚糖凝胶G-25或者G-50分离获得牡蛎多肽3号，主要成分为Cmpd13，用高效液相色谱进一步纯化，可得99％纯度的小肽物质Cmpd13，其分子量为1019Da，分子式为Met-Gly-Phe-Ala-Trp-Thr-Cys-Gly-Phe。
4.根据权利要求3所述的一种牡蛎提取的蛋白小肽的制备方法，其特征在于：在步骤(1)得到的蛋白肽物质溶液每2～4g中加入100毫升豆浆和按0.1～0.4％的量加入成分为CaSO4的石膏、按0.1～0.4％的量加入成分为MgCl2的卤水、按0.1～0.4％的量加入葡萄糖酸内酯凝固剂，凝固制备成凝固物，即牡蛎肽豆腐。
5.根据权利要求4所述的凝固物作为食品、保健品和药品方面的应用。
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