CN104497102B - 一种预防和治疗神经系统疾病的猪脑多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪脑多肽，该多肽的分子量在1000～4000道尔顿，多肽中含亮氨酸19％～21％、赖氨酸16％～18％、谷氨酸16％～18％，丙氨酸11％～13％、精氨酸9％～11％，天冬氨酸7％～9％，缬氨酸6％～8％、异亮氨酸6％～8％。本发明的多肽具有良好的自由基清除能力。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质多肽领域，具体涉及一种从猪脑中提取的多肽及其制备方法。
背景技术
随着世界人口老龄化，神经细胞毒性损伤导致的疾病也越来越多。特别是像阿尔兹海默病(即老年性痴呆)、帕金森病(PD)等类型的疾病，目前尚没有其病理特征治疗的药物和方法。对于老年痴呆，虽然有些安神、醒脑、镇静的药物具有一定的缓解病症的作用，但疗效并不显著，美国FDA通过治疗老年性痴呆的药物主要有乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂两类，这两类药物仅对中晚期老年性痴呆患者的痴呆症状有所轻度改善和延缓痴呆进展，并无法治愈。大量研究资料表明，肽类可增加记忆能力，具有神经保护作用，通过动物实验证实，在治疗神经损伤方面有良好效果。在神经退行性病变的组织培养中表现出显著地神经保护作用。
神经系统疾病是一个长期慢性疾病，发病过程中特征不明显，常常被忽略导致神经细胞不可逆的损伤，以至于危及生命。因此研发一种天然健康，具有预防神经系统损伤的多肽粉就非常有实用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪脑多肽，该多肽的分子量在1000～4000道尔顿，多肽中含亮氨酸19％～21％、赖氨酸16％～18％、谷氨酸16％～18％，丙氨酸11％～13％、精氨酸9％～11％，天冬氨酸7％～9％，缬氨酸6％～8％、异亮氨酸6％～8％。
本发明的多肽，是通过以下的方法制备的：
(1)分离提取：取猪脑，加入5％的乙醇水溶液，5％乙酸调pH值至3～5，捣碎，过滤，重复上述操作一次，取滤渣，得胶状物；
(2)水解：取步骤(1)胶状物，控制pH值在7.0～10.0，加入胰蛋白酶，37℃保温5～7小时，90℃加热灭活酶，控制pH值在6.5～7.5、温度在50～60℃，加入木瓜蛋白酶，以速度100～300r/min搅拌0.5～1.5小时，进行反应，保温5～10小时，煮沸5～60min，灭活酶，结束反应，过滤，5000～10000r/min离心，收集上清液，过滤，减压干燥得干粉；。
(3)纯化：取干粉，置于阴离子交换柱，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱，在波长238nm处测定吸光度，以吸收峰来收集洗脱液，浓缩，干燥，得猪脑多肽。
根据本发明的多肽，所述猪脑为新鲜或冷冻猪脑。
根据本发明的多肽，所述步骤(2)中控制溶液pH值具体实施为：0.1～2.0mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0～10.0；0.1～2.0mol/L盐酸溶液调pH值至6.5～7.5。
根据本发明的多肽，所述步骤(2)中胰蛋白酶占步骤(1)胶状物重量比为0.3％～0.7％，优选0.5％，木瓜蛋白酶用量为胶状物重量的0.1％～0.5％，优选0.3％。
根据本发明的多肽，所诉步骤(3)中阴离子交换柱填料为DEAE sepharose FF，所洗脱下来的多肽组分为阴离子交换柱中的第2、3、4吸收峰的洗脱组分。
根据本发明的多肽，所诉步骤(3)中氯化钠的浓度为0.1～1.0mol/L。
根据本发明的多肽，所诉步骤(3)中干燥的温度为50℃～55℃。
本发明的多肽对神经细胞培养液中NO及NOS的影响试验表明能够明显降低细胞NO含量及抑制NOS活性。清除自由基试验表明所述多肽有良好的自由基清除能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述。
实施例1
取猪脑，加入5％的乙醇水溶液，5％的乙酸水溶液调pH值为4、捣碎，过滤，重复一次，取滤渣，得胶状固形物。取胶状固形物1kg，控制ph值在8.2，加入5g胰蛋白酶，37℃保温6小时，90℃加热灭活蛋白酶，控制pH值在7.1，温度在55℃，加入5g木瓜蛋白酶，以速度300r/min搅拌1.5小时，进行反应，保温6小时；煮沸30min，灭活酶，结束反应，过滤。8000r/min离心，收集上清液。取离心液，微孔滤膜过滤，减压干燥，得干粉，置于阴离子交换柱(DEAEsepharose FF)，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在波长238nm处测定吸光度，收集第2、3、4个吸收峰的洗脱液，浓缩，干燥，得多肽。
实施例2
取猪脑，加入5％的乙醇水溶液，5％的乙酸水溶液调pH值为4、捣碎，过滤，重复一次，取滤渣，得胶状固形物。取胶状固形物1kg，控制ph值在8.2，加入7g胰蛋白酶，37℃保温5小时，90℃加热灭活蛋白酶，控制pH值在7.1，温度在55℃，加入3g木瓜蛋白酶，以速度300r/min搅拌1小时，进行反应，保温5小时；煮沸30min，灭活酶，结束反应，过滤。8000r/min离心，收集上清液。取离心液，微孔滤膜过滤，减压干燥，得干粉，置于阴离子交换柱(DEAEsepharose FF)，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在波长238nm处测定吸光度，收集第2、3、4个吸收峰的洗脱液，浓缩，干燥，得多肽。
实施例3
取猪脑，加入5％的乙醇水溶液，5％的乙酸水溶液调pH值为4、捣碎，过滤，重复一次，取滤渣，得胶状固形物。取胶状固形物1kg，控制ph值在8.9，加入3g胰蛋白酶，37℃保温7小时，90℃加热灭活蛋白酶，控制pH值在7.1，温度在55℃，加入1g木瓜蛋白酶，以速度300r/min搅拌1.5小时，进行反应，保温9小时；煮沸30min，灭活酶，结束反应，过滤。8000r/min离心，收集上清液。取离心液，微孔滤膜过滤，减压干燥，得干粉，置于阴离子交换柱(DEAEsepharose FF)，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在波长238nm处测定吸光度，收集第2、3、4个吸收峰的洗脱液，浓缩，干燥，得多肽。
测试实施例1：NO含量及NOS活性检测
采用多肽对神经细胞培养进行干预，对培养液中NO含量及NOS活性进行检测，与正常对照组和模型组进行对比，
实验方法：
(1)细胞培养
取人神经母细胞用0.25％的胰蛋白酶2-3ml，置于37℃恒温水浴箱中振荡消化10min，加入含有10％胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹打未消化的组织块，调整细胞密度约为1×105/ml，吸出细胞悬液放入培养瓶中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。传代后的细胞接种子96孔培养板中，每孔200μl，待细胞重新长满汇合后，用于以下实验。
(2)Aβ25-35蛋白前处理
将Aβ25-35蛋白用超纯水配制成浓度为500μmol/L的溶液，在37℃培养箱中放置7天，分装至EP管中，-20℃保存备用。
(3)样品制备
将接种于96孔培养板中处于对数生长期的细胞，随机分为3组，设对照组，模型组，多肽组，对照组添加20μl培养基，模型组加10μl浓度为500μmol/L的Aβ25-35蛋白溶液及10μl培养基，多肽组加10μl浓度为500μmol/L的Aβ25-35蛋白溶液及10μl培养基配制的多肽溶液。置于培养箱中，收集48小时、72小时两个时间点的细胞培养液，1000r/min离心10min，取上清液分别用NO试剂盒、NOS试剂盒进行NO、NOS的检测。
实验结果：
经过多肽干预后，多肽组NO含量及NOS活力与同时间点模型组相比明显降低。特别是72小时时多肽组NO含量及NOS活力较同时间点模型组明显降低。
表1 多肽对神经细胞培养液中NO的影响(μmol/L，n＝3，)
| 组别 | 多肽浓度mg/ml | 48h | 72h |
| 多肽组1(实施例1) | 0.04 | 108.75±9.12 | 111.32±10.25 |
| 多肽组2(实施例2) | 0.04 | 106.47±8.92 | 112.15±9.89 |
| 多肽组3(实施例3) | 0.04 | 107.98±7.95 | 111.75±9.57 |
| 正常对照组 | —— | 97.57±8.56 | 99.22±11.23 |
| 模型组 | —— | 182.26±10.45 | 226.28±19.27 |
表2 多肽对神经细胞培养液中NOS活力的影响(μmol/L，n＝3，)
| 组别 | 多肽浓度mg/ml | 48h | 72h |
| 多肽组1(实施例1) | 0.04 | 6.39±0.63 | 8.56±0.57 |
| 多肽组2(实施例2) | 0.04 | 6.58±0.58 | 8.69±0.68 |
| 多肽组3(实施例3) | 0.04 | 6.09±0.59 | 8.61±0.66 |
| 正常对照组 | —— | 5.97±0.61 | 6.19±0.73 |
| 模型组 | —— | 10.11±1.87 | 11.27±1.77 |
测试实施例2：清除超氧阴离子能力测定
本实验采用邻苯三酚自氧化法测定样品清除超氧阴离子自由基(·O2 -)的活性。
实验过程：
取浓度为20mg/ml的多肽样品溶液0.2ml，加入ph8.2，50mmol/L的Tris-HCl缓冲液4.5ml，蒸馏水4ml，混匀，置于27℃保温10min，作为试剂A；取0.3ml 10mmol/L的HCl溶液配制的浓度为6mmol/L的邻苯三酚溶液，置于25℃下保温10min，作为试剂B；以试剂A与0.3ml10mmol/L的HCl溶液的混合液作为空白调零后，将试剂A与试剂B迅速混合，在320nm处测定3min吸光度的变化，回归求出吸光度变化斜率K1。以蒸馏水代替多肽样品溶液作为对照样品重复上述过程得出吸光度变化的斜率为K0；
计算清除超氧阴离子的能力：
实验结果：
本发明多肽超氧阴离子清除率测得结果为：实施例1为84.21％、实施例2为83.29％、实施例3为82.93％。
测试实施例3：清除二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)能力测定
实验过程：
将2ml浓度为20mg/ml的多肽样品溶液与2ml浓度为0.1mmol/L的DPPH·-乙醇溶液混匀置于试管中，静置30min后，以无水乙醇作为参比测定其吸光度Ax；在对照液中，以2ml无水乙醇代替多肽液，静置30min后，以无水乙醇作为参比测定其吸光度A0；取相同浓度的多肽样品溶液2ml和2ml的无水乙醇混匀，以无水乙醇作为参比测定其本底吸光值Ax0。
计算清除二苯代苦味酰基自由基的能力：
实验结果：
本发明多肽二苯代苦味酰基自由基清除率测得结果为：实施例1为97.39％、实施例2为98.57％、实施例3为99.35％。
测试实施例4：多肽氨基酸成分测定
实验方法：采用柱前衍生，高效液相法测定多肽氨基酸组成含量
色谱条件：
仪器：安捷伦(Agilent)1260高效液相色谱仪；色谱柱：waters C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱温40℃，波长360nm，流速1.5ml/min；流动相：A为0.14mol/L乙酸钠水溶液(0.05％三乙胺以醋酸调PH值至6.4)，加60ml乙腈混匀。B为50％乙腈；按下列表梯度洗脱
样品水解：取多肽粉100mg，置于水解管中，加入6mol/L盐酸1～2ml，加入少量新蒸馏苯酚，抽真空，充满氮气，重复3次，放在110℃下水解22小时，水解完毕后，55℃减压干燥，水复溶。
氨基酸衍生：取10μl稀释的氨基酸标准溶液或样品水解液，加入PH9.1的0.1mol/L硼酸缓冲液10μl，加入1mg/ml的2，4-二硝基氯苯10μl、沸水浴加热1小时，流动相A稀释至1ml，进样。
实验结果：
采用外标法计算氨基酸含量，本发明多肽氨基酸主要成分测得结果为：
| 氨基酸种类 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 亮氨酸 | 19.3％ | 20.8％ | 20.1％ |
| 赖氨酸 | 17.5％ | 16.8％ | 16.1％ |
| 谷氨酸 | 16.3％ | 17.0％ | 17.6％ |
| 丙氨酸 | 12.7％ | 11.2％ | 11.9％ |
| 精氨酸 | 9.7％ | 9.2％ | 10.6％ |
| 天冬氨酸 | 8.8％ | 8.2％ | 7.3％ |
| 缬氨酸 | 6.5％ | 7.1％ | 7.7％ |
| 异亮氨酸 | 6.7％ | 7.8％ | 6.4％ |
| 其他氨基酸 | 2.5％ | 1.9％ | 2.3％ |
比较实施例1
分别采用不同的酶进行酶解(酶用量占猪脑固形物重量均为0.5％)，比较酶解后产品的清除自由基性能及NOS抑制性能
采用的酶及对应获得的产品如表中所示：
结果表明，采用木瓜蛋白酶+胰蛋白酶的产品自由基清除性能明显优于其他酶，并且产品一氧化氮合成酶(NOS)活力抑制能力明显高于其他产品。
Claims (6)
1.一种猪脑多肽，其特征在于，该多肽的分子量在1000～4000道尔顿，多肽中含亮氨酸19％～21％、赖氨酸16％～18％、谷氨酸16％～18％，丙氨酸11％～13％、精氨酸9％～11％，天冬氨酸7％～9％，缬氨酸6％～8％、异亮氨酸6％～8％。
2.权利要求1所述的猪脑多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)分离提取：取猪脑，加入5％的乙醇水溶液，5％乙酸调pH值至3～5，捣碎，过滤，重复上述操作一次，取滤渣，得胶状物；
(2)水解：取步骤(1)胶状物，调节pH值在7.0～10.0，加入胰蛋白酶，37℃保温5～7小时，90℃加热灭活酶，控制pH值在6.5～7.5、温度在50～60℃，加入木瓜蛋白酶，以速度100～300r/min搅拌0.5～1.5小时，进行反应，保温5～10小时，煮沸5～60min，灭活酶，结束反应，过滤，5000～10000r/min离心，收集上清液，过滤，减压干燥得干粉；
(3)纯化：取步骤(2)干粉，置于阴离子交换柱，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱，在波长238nm处测定吸光度，以吸收峰来收集洗脱液，浓缩，干燥，得猪脑多肽。
3.根据权利要求2所述猪脑多肽的制备方法，步骤(2)中所述的胰蛋白酶用量为步骤(1)胶状物重量的0.3％～0.7％。
4.根据权利要求3所述猪脑多肽的制备方法，步骤(2)所述的胰蛋白酶用量为步骤(1)胶状物重量的0.5％。
5.根据权利要求2所述猪脑多肽的制备方法，步骤(2)所述的木瓜蛋白酶用量为步骤(1)胶状物重量的0.1％～0.5％。
6.根据权利要求5所述猪脑多肽的制备方法，步骤(2)所述的木瓜蛋白酶用量为步骤(1)胶状物重量的0.3％。
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